专利名称：eIF-5A在杀死多发性骨髓瘤细胞上的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及凋亡特异性真核起始因子(eucaryotic initiation factor) ("elF-5A")和编码的多核苷酸相同杀死多发性骨髓瘤细胞以及其 它癌细胞的相同用途。本发明涉及凋亡特异性elF-5 A或被称为"凋亡特异 性elF-5A"或"elF-5Al"以及elF-5A2异构体在抑制多发性骨髓瘤、杀死多 发性骨髓瘤细胞和抑制和/或杀死其它癌细胞生长上的用途。
背景技术：
凋亡是遗传学编程的细胞事件，它的特征在于明确的形态学特 点，如细胞皱缩，染色质浓缩，细胞核断裂，以及细胞膜起泡。Kerr等 (1972) Br. J. Cancer, 26, 239-257; Wyllie等(1980)Int. Rev. Cytol.， 68, 251-306。它在正常的组织发育和体内稳态中发挥重要作用，并且，凋亡 程序的缺陷被认为导致了从神经变性和自身免疫性疾病到肿瘤的多种 人类疾病。Thompson (1995) Science, 267, 1456-1462; Mullauer等 (2001)Mutat Res, 488, 211-231。尽管已充分表征了凋亡细胞的形态学 特征，调节这一过程的分子途径才刚刚开始阐明。 与凋亡相关的另一种关键的蛋白，是由肿瘤阻抑基因p53编码 的蛋白。该蛋白是能调节细胞生长的转移到录因子，并且诱导受到损伤 和遗传学上不稳定的细胞的凋亡， 一般认为是通过上调Bax进行的。Bold 等(1997) Surgical Oracology， 6, 133-142; Ronen等，1996; Schuler & Green (2001) Biochem. Soc. Tra71s., 29, 684-688; Ryan等(2001) Curr. Opin. Cell Biol., 13, 332-337; Z6mig等(2001) Biochem. Biophys. Acta, 1551, Fl-F37。 凋亡途径的改变，被认为在包括癌症的多种疾病过程中发挥关键作用。Wyllie等(1980)Int. Rev. Cytol.， 68, 251-306: Thompson (1995) Science, 267, 1456-1462; Sen & D'Incalci (1992) FEBS Letters, 307， 122-127; McDonnell等(1995)Seminars in Cancer and Biology, 6, 53-60。 对癌症发生和进展的研究，传统上一直集中在细胞增殖方面。不过，凋 亡在肿瘤发生中的重要作用最近业已明确。实际上，对凋亡的了解，大 多是利用肿瘤^jt型获得的，因为在肿瘤细胞中凋亡的控制总是以某种方 式改变的。Bold等(1997)Surgical Oncology, 6, 133-142。
细胞因子也参与了凋亡途径。生物系统的调节需要细胞间相互
作用，而细胞间交互作用通常涉及到许多种细胞因子。许多种类的细胞
在响应多种刺激时都产生细胞因子，它是介导因子(mediators)。细胞因 子是多效性分子，它可对多种不同细胞产生多种不同的作用，尤其在调 节免疫反应及造血细胞增殖和分化中起重要作用。根据细胞因子具体种 类、相对浓度和其它介导因子的存在与否，细胞因子对靶细胞的作用可 以促进细胞存活、增殖、活化、分化或凋亡。 已知脱氧肌苷合成酶(DHS)和含有8-羟-2， 7， 10-三氨基癸酸真 核翻译起始因子-5A(elF-5A),在包括细胞生长和分化的很多细胞过程中 发挥重要作用。肌苷是一种独特的氨基酸，存在于所有检查过的真核细 胞和古细菌中，但不存在于真细菌中，而elF-5A是唯一已知的含有8-羟 -2, 7, 10-三氨基癸酸的蛋白。Park(1988) J. Biol. Chem., 263, 7447-7449; Schtimann & Klmk (1989) System. Appl. Microbiol., 11, 103-107; Bartig 等(1990) System. Appl. Microbiol., 13, 112-116; Gordon等(1987a)J. Biol. Chem., 262， 16585-16589。活性elF-5A是通过两个翻译后步骤形成的 第一个步骤是，通过脱氧肌苷合成酶的催化，将亚精胺的4-氨基丁基部 分转移到移到前体elF-5A的特殊赖氨酸的a-氨基上，形成脱氧肌苷残基； 第二个步骤包括通过脱氧肌苷合成酶羟化酶使该4-氨基丁基部分羟基 化，以便形成8-羟-2, 7, 10-三氨基癸酸。 elF-5A的氨基酸序列在不同物种之间是相当保守的，并且在 elF-5A中的8-羟-2， 7， 10-三氨基癸酸残基周围的氨基酸序列存在严格的 保守性，这表明，这种修饰对于存活来说可能是重要的。Park等 (1993)Biofactors, 4， 95-104。这一々b殳得到了有关发现的进一步支持， 即到目前为止，均存在于酵母中的elF-5A的两种同工型的失活，或DHS 基因的失活，能催化它们的失活的第一个步骤，阻断细胞分裂。Schmer
5等(1991)Mo1. Cell. Biol., 11， 3105-3114; Sasaki等(1996) FEBS Lett., 384， 151-154; Park等(1998) J. Biol. Chem., 273, 1677-1683。不过，消耗酵 母中的elF-5A蛋白，仅仅导致了总体蛋白合成的小的减弱，这表明elF-5A 可能是mRNA的特定亚型的翻译所必须的，而不是蛋白总体合成所必须 的。Kang等(1993),"起始因子elF-5A消耗对细胞增殖和蛋白合成的影 响"，Tuite， M.(ed.), Protein Synthesis and Targeting in Yeast, NATO Series H。最近有关能结合elF-5A的配体拥有高度保守的基序的发现，也支持 了elF画5A的重要作用的观点。Xu & Chen(2001) J. Biol. Chem., 276， 2555-2561。另外，发现修饰过的elF-5A的8-羟-2, 7, 10-三氨基癸酸残 基是与RNA的序列特异性结合所必须的，并且结合不会提供对核糖核酸 酶的保护作用。 另夕卜，elF-5A的细胞内消耗，导致了特定mRNAs在细胞核中的 明显积累，它表明elF-5A可能负责特殊类型的mRNAs从细胞核到细胞质 的穿梭运输。Liu & Tartakoff (1997) Supplement to Molecular Biology of the Cell, 8, 426a.AbstractNo.2476, 37th American Society for Cell Biology Annual Meeting。 elF-5A在核孔相关的核内丝上的积累，以及它与一4殳细 胞核输出受体的相互作用，进一步暗示了elF-5A是核质穿梭蛋白，而不 是多核糖体的成分。Rosorms等(1999) J. Cell Science, 112, 2369-2380。
eIF-5A的第 一种cDNA是在1989年由Smit-McBride等克隆的，从 这时候起，业已从包括酵母，大鼠，鸡胚胎，苜蓿和番茄在内的各种真 核生物中克隆了elF-5A的cDNA或基因。Smit-McBride等(1989a) J. Biol. Chez., 264, 1578-1583; Schmer等(1991)(酵母)；Sano, A.(1995) in Imahon， M.等(eds)， Polyamine, Basic and Clinical Aspects, VNU Science Press， The Netherlands, 81画88(大鼠)；Rinaudo & Park (1992) FASEB J., 6， A453(鸡胚胎)；Pay等(1991) Plant Mol. Biol., 17, 927画929(苜蓿)；Wang 等(2001)J. Biol. Chem., 276, 17541-17549(番茄)。 多发性骨髓瘤是一种渐进性和致命性的疾病，其特征为在骨髓 中恶性血浆细胞(malignant plasma ells)的扩张和溶骨损伤的出现。多发 性骨髓瘤是浆细胞无法医治但可治疗的 一种癌。浆细胞是免疫系统的重 要部分，其产生免疫球蛋白(抗体)以帮助对抗感染和疾病。多发性骨髓 瘤特征在于在骨髓中异常浆细胞过多的数量和完整的单克隆免疫球蛋 白(IgG、 IgA、 IgD或IgE; "M-蛋白")或Bence-Jones蛋白(游离单克隆轻链)的生产过剩。低血鈣症、贫血症、肾损害增加对细菌感染的敏感性和减 少正常免疫球蛋白的产生是多发性骨髓瘤常见的临床表现。此外，多发 性骨髓瘤的特征常常为通常存在于骨盆、脊柱、肋骨和头骨中的弥散性 骨质疏松症。 多发性骨髓瘤的传统治疗包括化疗、干细胞移植、伴随干细胞 移植的高剂量化疗和抢救治疗。化疗包括用Thalomid⑧(反应停)、硼替佐 米、Aredm⑧(伯米膦酸)、类固醇和Zometa㊣(唑来膦酸)。然而，许多化 疗药物对活性分离的非癌细胞如骨髓、胃和肠粘膜和毛嚢细胞有毒性。 因此，化疗可能导致血细胞数量的降低、恶心、呕吐、腹泻和落发。
传统的化疗或标准剂量的化疗一般是患有多发性骨髓瘤病人 的初级或初步治疗。病人也可以接受化疗以准备高剂量化疗和干细胞移 植。前导性治疗(在干细胞移植之前的传统化疗)可用于减少移植前的肿 瘤负担。 一些化疗药物由于对骨髓细胞较小毒性比其它药物更适于前导 性治疗，并导致骨髓干细胞的更多生长。适于前导性治疗的化疗药品的 实例包括地塞米、 沙利度胺/地塞米水> 、VAD(长春新碱、 Adriamycin⑧(阿霉素)和地塞米+>的组合物)和DVd(聚乙二醇化的脂质 体阿霉素(Doxi1⑧，Caelyx⑧)、长春新碱和减少日程的地塞米松组合物)。
多发性骨髓瘤的标准疗法是美法仑与强的松(一种皮质甾类药) 结合达到50%的响应率。不幸地，美法仑是一种烷化剂，不太适于前导 性治疗。在多发性骨髓瘤的治疗，特别是在那些不能忍受化疗的老年病 人中有时单独使用皮质甾类(特别是地塞米松)。此外，地塞米松单独或
与其它药物结合用于前导性治疗。前导性治疗中最普遍使用VAD,但近 来DVd业已在前导性治疗中显示出有效性。硼替佐米最近已被批准用于 多发性骨髓瘤的治疗，但其非常有毒。然而，现有疗法都没有提供治愈 的明显潜力。 发明概述 本发明提供了 一种抑制癌细胞生长和/或杀死癌细胞的方法。 本发明还提供了 一种抑制或减緩癌细胞转移到移能力的方法。抑制癌症 生长包括减小肺瘤的尺寸、减緩肺瘤的生长，还可以包括完全緩解肺瘤 症状。癌症可以为癌或肿瘤，包括但不限于结肠癌、结肠直肠腺癌、膀 胱癌、宫颈腺癌和肺癌。本发明的方法包括elF-5A的给药，优选人elF-5Al对患有所述癌症的患者(哺乳动物，优选人)给药。尽管优选 elF-5Al，还可以使用elF-5A2异构体。通过本领域已知的任何适宜的方 法将elF-5A输送至需要的患者体内。可以作为棵DNA输送，如生物学 上适宜的介质中DNA输送，以及通过IV或皮下注射或任何其它生物学 上适宜的输送装置来输送。另外的，可以在载体如腺病毒载体中输送 elF-5A。另外地，可以在脂质体或任何其它适宜的"载体"中输送DNA, 其提供将DNA输送至靶癌症细胞。还可以将elF-5A直接递送至肿瘤的 位置。本领域技术人员将能够确定输送elF-5A治疗方案的剂量和时间。
elF-5Al和elF-5A2是已知的，其在4支早的共同未决申请如 09/909,796 (U.S.6,867,237); 10/341,647(准许)；10/200,148; 10/277,969; 10/383,614; 10/792,893; 11/287,460; 10/861,980; 11/134,445; 11/184,982; 11/293,391; 6(V749,604;和60/795,168中描述，所有的在此引入本文作 为参考。因为elF-5A在种类中是高度保守的，任意elF-5A可在本发明、 人、鼠、小鼠、狗等中使用。优选地，人elF-5A被用来治疗人等。elF-5A 同时包括突变种，只要该突变种能够上调或增加elF-5A的表达，并且因 此抑制了生长的癌症或杀死癌细i包。 本发明还提供一种激活细l包内MAPK/SAPK信号途径的方法， 即通过向所述细胞提供核苷酸编码的elF-5Al。 elF-5Al多核苷酸和 elF-5Al蛋白为如上所述。 本发明还提供可用于杀死骨髓瘤细胞的药物组合物，其包含编 码elF5A的多核苷酸。elF5A可以是elF5Al、 elF5A2或变异elF5Al。优 选地elF5A是elF5Al。组合物进一步可包括输送媒介。该输送媒介可以 是但不限于载体、质粒、脂质体或树状大分子(dendrimer)。
本发明还提供一种elF5A(优选elF5Al)制备药物以杀死患有多 发性骨髓瘤病人多发性骨髓瘤细胞的方法。 本发明进一步提供了一种杀死多发性骨髓瘤细胞的方法，其包 括对骨髓瘤细胞给药含有编码elF5A的多核苷酸(polynucleotide encoding elF5Al )的组合物，其中所述组合物杀死多发性骨髓瘤细月包。 elF5Al可以是一种突变体，其中该突变体已具有保守的赖氨酸转化为另 一种氨基酸，并且其中所述突变体不能肌苷化(hypusmated)。在治疗方 法中有用的组合物如这里描述。 本发明进一步提供一种杀死多发性骨髓瘤细胞的方法，除了组
8合物包含编码elF-5Al的多核苷酸，其中组合物还包含提供的针对 elF-5Al的siRNA。 siRNA下调elF-5Al的内源性表达，因此下调了 IL-6 的表达，其依次导致骨髓瘤细胞凋亡。包含elF-5Al siRNA的组合物可 以静脉内给药或在一种输送媒介如载体、质粒、脂质体或树状大分子范 围内给药。 附图简述 图l显示通过遗传毒性压力和一氧化氮来增力口elF-5Al表达。A) 在正常结肠成纤维细胞中用0.5昭/ml放射菌素D处理0、 1、 4、 8和24小时 的elF5A表达的DNA印迹(上面板)和蛋白印迹(下面板)分析。用elF5A、 p53和p-肌动蛋白的抗体来探测蛋白印迹。B)在RICO细胞中用3mM的硝 普酸钠处理O、 2、 4、 8和24小时的elFSA表达的DNA印迹(上面板)和蛋白 印迹(下面板)分析。用elF5A和|3-肌动蛋白的抗体来探测蛋白印迹。
图2显示elF5Al表达的抑制在细胞增殖上没有影响。A)在用 elF5Al siRNA或对照siRNA转染72小时后从HT-29分离细胞裂解物的 蛋白印迹。显示出两个独立试-睑的蛋白印迹。用elF5A和(3-肌动蛋白的 抗体探测印迹。B)使用XTT细胞增殖测试来检测用elF5Al siRNA转染 细胞的代谢活动。用对照siRNA或elF5Al siRNA转染前将HT-29细胞 接种在96孔平板上。转染二十四小时之后，在检测代谢活动之前让放 线菌素D(10]ig/ml)未处理或处理细力包48小时。数值为一式四份完成两 个实验的平均值，并对设定为值1的0小时对照获得的数值标准化。C) 用对照siRNA或elF5Al siRNA转染的HT-29细月包的增殖性能与用50|nM GC7培养72小时的细胞比较。用BrdU来检测细胞增殖。该值表示n=4 的平均±标准误差(SE),并对i殳定为值1的GC7(+)血清样品数值标准化。 星号(*)表示通过配对斯氏t检验认为与对应的对照值显著不同的值 (pO.Ol)。 D)XTT和E)BrdU结合用对照siRNA或elF5Al siRNA转染的 HT-29细胞转染从转染日(0天)直到第5天改变转染的细胞增殖检测。设 定为值1的0天。 图3显示elF5Al响应放线菌素D调节p53的表达。用对照 siRNA(C)或elF5Al siRNA(5A-l)转染RKO细胞。转染后72小时后，细胞 用0.5昭/ml放线菌素D处理0、4、 8或24小时。A)细胞裂解物用针对elF5Al 、 p53或p-肌动蛋白的抗体印迹蛋白印迹。结果代表了三个独立实验。B)蛋白印迹中相对强度的p53绘图，其对相应的肌动蛋白条带较小标准化。 该值表示n-3的平均土标准误差(SE)。 图4显示人elF5Al的超表达不依赖于p53诱导细胞凋亡。用 pHM6-LacZ、 pHM6 elF5A或pHM6-elF5AA37(C-端点37个氨基酸的截断) 转染RKO细胞(A)或RKO-E6细胞(B)。转染后四十八小时，使用TUNBL 方法固定并标记细胞。核用Hoescht33258染色，并且标记的细月包用萸光 显微镜术观察。染为明亮绿色的细胞记^f故细胞凋亡。Hoescht-染色的核 用于检测总细胞数目。值是『4(A)或r^3(B)的平均土标准误差(SE)。星 号(*)表示通过配对斯氏t检验认为与对应的对照(pHM6-LacZ)显著不同 的值(p0.02)。 C)收集用0.5ng/ml放线菌素D处理0、 4、 8或24小时后RKO 和RKO-E6细胞的蛋白印迹。用RKO和(3-肌动蛋白的抗体来探测蛋白印 迹。 图5显示结肠癌细l包中腺病毒构建诱导细胞凋亡。A)用 Ad-LacZ(L)、 AdelF5Al(5A)或Ad-elF5A(K50A)(K50A)转染HT-29细胞七 十二小时后，从中分离细胞裂解物蛋白印迹。B)细胞裂解物的2-D凝胶 电泳分离用GC7或DFO转染七十二小时或用腺病毒构建转染后七十二 小时的HT-29细胞，然后用针对elF5A的抗体进行蛋白印迹。除了裂解 物分离了 7昭的蛋白，还从腺病毒转染细胞超表达elF5A中分离了 0.3貼 的蛋白。C)Toppanek用腺病毒构建转染HT-29细胞四十八小时后染色 TONEL。 Bottom panel:在相同区域进行细胞核的Hoechst-染色。所有 相片采用400 x放大率。该结果代表3个独立的实验。D)用腺病毒构建 转染HT-29细胞四十八小时后的细胞凋亡百分率。值是n=3的平均±标 准误差(SE)。 E)用腺病毒构建转染HT-29细胞四十八小时后的XXT细 胞增殖实验。值是n=4的平均±标准误差(SE)。 图6显示用elF5A腺病毒构建转染HT-29细胞染色的膜联蛋白 V和PI。 A)膜联蛋白-FITC和碘化丙啶(PI)标记用elF5A腺病毒构建转染 四十八小时后HT-29细胞的柱形图。B)用腺病毒构建转染或用细胞凋亡 谦导剂、放射菌素D或Brefeldm A处理二十四、四十八和七十二小时 后，通过标记膜联蛋白V和流式细胞计数分析检测HT-29细胞凋亡百分 率。值是n=4的平均±标准误差(# of events〉5000)。
图7显示elF5A萤光免疫才企-睑法定位。用IFN-和TNF-cx(A)刺 激HT-29细胞中elF5A蛋白的亚细胞定位或通过间接免疫荧光^^测放射
10菌素D(B)。 Hoechst 33258用于核染色。A)HT-29细胞未处理或用 TNF-a[(-)TNF-a]刺激0分钟、10分钟或30分钟之前用lFN-y灌注。Top panel: elF5Al的萤光免疫检验法检测。middle panel:在相同的区域进 行细胞核Fioechst-染色。bottom panel:合并图像。B)HT-29细胞未处理 或用放射菌素D处理0.5小时、1.5小时或4小时。Top panel: elF5Al 的萤光免疫4全-睑法4全测。middle panel:在相同的区域进4亍细J包核 Fioechst-染色。bottom panel:合并图像。所有相片采用400 x》文大率。 该结果代表3个独立的实验。 图8显示elF5Al响应放线菌素D调节p53的表达。RKO-E6 细胞不表达p53。 A)RKO或RKO-E6细胞用0.5jig/ml放线菌素D处理1 、 4、 8或24小时。使用蛋白印迹收集和分析细胞裂解物用于p53超表达。 B)用对照siRNA(C)、 elF5A siRNA(5A-l)或靶向elF5A(5A-2)不同区域的 第二 elF5A siRNA转染RKO细胞。转染后72小时后，细胞用0.5|ig/ml 放线菌素D处理0、 4、 8或24小时。A)细胞裂解物用针对elF5A、 p53 或P-肌动蛋白的抗体印迹蛋白印迹。结果代表了三个独立实验。
图9显示细l包凋亡中肌苦化elF5Al的聚积。该图提供了用i丈 线菌素D(A)或Fas抗体激动剂(B)处理时间为1-24小时，继之以用针对 elF5A的抗体进行蛋白印迹，从HT-29细胞中分离细胞裂解物的2-D凝 胶电泳。
图10显示用Ad-elF5Al或Ad-elF5Al(K50A)(Ad-elF5AlM)转 染诱导HT-29结肠直肠腺癌细胞内的细胞凋亡。该图提供了用腺病毒构 建转染二十四、四十八和七十二小时或用细胞凋亡诱导剂、；改射菌素D 或Brefeldm A处理后，通过标记膜联蛋白V和流式细胞计数分析;险测 HT-29细胞凋亡百分率。值是n=2的平均±标准误差(# of events〉5000)。
图11显示用Ad-elF5Al或Ad-elF5A2转染诱导HTB-9膀胱癌 细胞内的细胞凋亡。该图提供了用腺病毒构建转染二十四、四十八和七 十二小时或用细胞凋亡诱导剂、放射菌素D或Brefeldm A处理后，通 过标记膜联蛋白V和流式细胞计数分析检测HTB-9细胞凋亡百分率。值 是n=2的平均±标准误差(# of events>5000)。 图12显示用Ad-eIF5Al或Ad-eIF5A2转染诱导HTB-4膀胱癌 细胞内的细胞凋亡。该图4是供了用腺病毒构建转染二十四、四十八和七 十二小时或用细胞凋亡i秀导剂、放射菌素D或Brefeldm A处理后，通过标记膜联蛋白V和流式细胞计数分析检测HTB-4细胞凋亡百分率。值 是n=2的平均±标准误差(# of events〉5000)。 图13显示用Ad-elF5Al或Ad-elF5Al(K50A)(Ad-elF5AlM)转 染诱导HTB-4膀胱癌细胞内的细胞凋亡。该图提供了用腺病毒构建转染 二十四、四十八和七十二小时后HTB-4细胞XTT增殖分析的结果。值 是11=2的平均土标准误差。 图14显示用Ad-elF5Al或Ad-elF5Al(K50A)(Ad-elF5AlM〉转 染诱导HTB-9膀胱癌细胞内的细胞凋亡。该图提供了用腺病毒构建转染 二十四、四十八和七十二小时后HTB-9细胞XTT增殖分析的结果。值 是n二2的平均土标准误差。 图15显示用Ad-elF5Al或Ad-elF5Al(K50A)(Ad-elF5AlM〉转 染诱导HTB-1膀胱癌细胞内的细胞凋亡。该图提供了用腺病毒构建转染 二十四、四十八和七十二小时后HTB-1细i包XTT增殖分析的结果。 <直 是r^2的平均土标准误差。 图16显示用Ad-elF5Al或Ad-elF5Al(K50A)(Ad-elF5AlM〉转 染诱导UMUC-3膀胱癌细胞内的细胞凋亡。该图提供了用腺病毒构建转 染二十四、四十八和七十二小时后UMUC-3细胞XTT增殖分析的结果。 值是n=2的平均±标准误差。 图17显示用Ad-elF5Al或Ad-elF5Al(K50A)(Ad-elF5AlM)转
染诱导HeL子宫颈腺癌细胞内的细胞凋亡。该图提供了用腺病毒构建转 染二十四、四十八和七十二小时后HeL细胞XTT增殖分析的结果。值 是n-2的平均±标准误差。 图18显示用Ad-elF5Al、 Ad-elF5Al(K50A)(Ad-elF5AlM)或 Ad-elF5A2转染诱导HTB-4细胞内的PARP切割。该图提供了使用 PARP、 elF5A和|3-肌动蛋白抗体从腺病毒构建转染四十八或七十二小时 后HTB-4细胞中分离细胞裂解物蛋白印迹的结果。 图19显示用Ad-elF5Al、 Ad-elF5Al(K50A)(Ad画elF5AlM)或 Ad-elF5A2转染不诱导HTB-1细胞内的PARP切割。该图提供了4吏用 PARP、 elF5A和(3-肌动蛋白抗体从腺病毒构建转染四十八或七十二小时 后HTB-4细胞中分离细胞裂解物蛋白印迹的结果。 图20显示在A549肺癌细胞中的elF5Al超表达激活 MAPK/SAPK信号途径。在增加几倍转染(MOl)的情况下用Ad-elF5Al(5A)转染细胞。用Ad-Lac(L)转染细胞作为对比。转染四十/\ 小时后，用EGF处理细胞30分钟并收集细胞裂解物用于蛋白印迹。
图21显示在A549肺癌细胞中的elF5Al超表达激活 MAPK/SAPK信号途径。用Ad-elF5Al(5A)或50MOI的Ad-Lac(L)转染细 胞。转染6、 24、 48或72小时后，用EGF处理细胞30分钟并收集细胞 裂解物用于蛋白印迹。 图22显示不能肌苷化的elF5Al超表达激活MAPK/SAPK信号 途径。在增加几倍转染(M01)的情况下用Ad-elF5Al(M)转染A549细胞。 用Ad-elF5Al(5A)和Ad-LacZ(Lac)转染细胞作为对比。在有或没有MEK 抑制剂U1026的存在下孵化细胞。转染四十八小时后，用EGF处理细 胞30分钟并收集细胞裂解物用于蛋白印迹。 图23显示elF5Al超表达和A549肺癌细胞内突变体elF5Al(5A) 增加p53的表达。在增加几倍转染(M01)的情况下用Ad-elF5Al(M)转染 A549细胞。用Ad-elF5Al(5A)和Ad-LacZ(Lac)转染细胞作为对比。在有 或没有MEK抑制剂U1026的存在下孵化细胞。转染四十八小时后，用 EGF处理细胞30分钟并收集细胞裂解物用于蛋白印迹。
图24显示elF5Al或突变体elF5Al(5A)超表达降低了通过 Matrigel 细胞外基质侵入A549肺癌细胞的能力。用腺病毒构建转染二 十四后，在无血清的培养基中将A549细胞接种于MatngelTM涂渍的 transwdl。含血清培养基放置在底部孔板中作为一种化学引诱剂。接种 二十四小时后，已经通过transwell底部表面侵入的细胞一皮染为透明的紫 罗兰色，在光学显微镜下通过细胞计数来检测每个区域细胞的平均数 量。计算每个样品的六个区域的最小值。 图25显示实验II的结果在B16F10-负载C57BL/6小鼠中的 elF5Al显著降4氐了肺肿瘤负荷。将200,000 B16F10细胞注入六周龄 C57BL/6小鼠的尾部静脉。在笫2、 4、 7、 11、 16、 21、 26和31天将负 载有LacZ基因(作为DNA对照)或elF5Al质粒DNA注入尾部静脉。使 用三种不同浓度的DNA: 1 x (3.3mg/kg), 0.1 x (0.3mg/kg)和2 x (6.6mg/kg)。小鼠接受PBS代替B16F10细胞作为阴性对照，同时B16F10-负载小鼠接受PBS而不是质粒DNA注入作为阳性对照。当小鼠接近死 亡时，牺牲它们，将肺取出并照像。 图26显示实马全II的结果在B16F10-负载C57BL/6小鼠中的elF5Al显著降低了肺重量。将200,000 B16F10细胞注入六周龄C57BL/6 小鼠的尾部静脉。在第2、 4、 7、 11、 16、 21、 26和31天将负载有LacZ 基因(作为DNA对照)或elF5Al质粒DNA注入尾部4争脉。使用三种不同 浓度的DNA: 1 x (3.3mg/kg), 0.1 x (0.3mg/kg)和2 x (6.6mg/kg)。小鼠接 受PBS代替B16F10细胞作为阴性对照，同时B16F10-负载小鼠接受PBS 而不是质粒DNA注入作为阳性对照。当小鼠接近死亡时，牺牲它们， 将肺取出并称重。 图27显示实验I1的结果在B16F10-负载C57BL/6小鼠中的 elF5Al显著降低了 VEGF表达。将200,000 B16F10细胞注入六周龄 C57BL/6小鼠的尾部静脉。在第2、 4、 7、 11、 16、 21、 26和31天将负 载有LacZ基因(作为DNA对照)或elF5Al质粒DNA注入尾部静脉。使 用三种不同浓度的DNA: 1 x (3.3mg/kg)， 0.1 x (0.3mg/kg)和2 x (6.6mg/kg)。小鼠接受PBS代替B16F10细胞作为阴性对照，同时B16F10-负载小鼠接受PBS而不是质粒DNA注入作为阳性对照。当小鼠接近死 亡时，牺牲它们，将肺取出并称重。 一旦检测了肺重量，冷冻肺并在以 后用于VEGFELISA。肺组织在裂解物緩冲液中沉底，用ELISA检测裂 解物中存在的VEGF。 图28显示实验III的结果通过DNA和DOTAP的络合改善 了 elF5Al基因治疗的抗肺瘤效能。将50,000个B16F10细月包注射入6 周龄C57BL/6小鼠(O天)的尾部静脉。在第7、 14和21天注射之前质粒 DNA载有LacZ基因(作为DNA对照)或与DOTAP络合的elF5Al。接受 无质粒DNA的DOTAP注射的无肿瘤小鼠用作DOTAP影响的对照。在 第25天处死小鼠，移去肺并照相。 图29显示实验III的结果通过DNA和DOTAP的络合改善 了 elF5Al基因治疗的抗胂瘤效能。将50,000个B16F10细胞注射入6 周龄C57BL/6小鼠(天O)的尾部静脉。在第7、 14和21天注射之前质粒 DNA载有LacZ基因(作为DNA对照)或与DOTAP络合的elF5Al 。接受 无质粒DNA的DOTAP注射的无胂瘤小鼠用作DOTAP影响的对照。在 第25天处死小鼠，移去肺并称重。 图30显示实验IV的结果AD-elF5Al注射诱导了 B16F0和 B16F10中的细月包凋亡。将50，000个B16F0或B16F10皮下注射入 C57BL/6小鼠的右肋。当胂瘤达到约4mm直径(B16细^^注射后10-12天)将50^1 PBS的1 x 109pfuAd-5Al注射入肺瘤。48小时后处死小鼠， 切除肿瘤、固定、干燥嵌入石蜡。根据制造商说明用TUNEL(Promega) 将各自细胞胂瘤类型(Ad-5A1-1和Ad-5Al-2)的两个区域染色。对于每个 细胞类型，包括阴性对照载玻片(Ad-5Al-neg)中不考虑TUNEL反应的 TdT酶。 图31显示实验V的结果AD-elF5Al的注射显著延迟了肺瘤 的生长。对B16-F10皮下将1 x 109pfu的Ad-elF5Al或Ad-LacZ或緩沖 液的等同体积注射入C57BL/6。当肺瘤达到约8mm直径时发生第一天 的治疗，并表示为天0。小鼠在第一个三天中每天注射，然后每间隔一 天注射直至小鼠死亡。当肺瘤大小在一个方向上超过15至16mm时小 鼠死亡。在每一个组中有3只小鼠。用Ad-elF5Al处理第1组小鼠 (1-1,1-2,1-3)，用Ad-LacZ注射第2组小鼠(2-l,2-2,2-3)以及第3组小鼠 (3-l,3-2,3-3)仅仅接受緩冲液。使用测径器每天测定肿瘤大小并用于估算 月中瘤体积。 图32显示实验V的结果AD-elF5Al的注射显著增加了存活。 对B16-F10皮下将1 x I09pfu的Ad-elF5Al或Ad-LacZ或緩冲液的等同 体积注射入C57BL/6。当肺瘤达到约8mm直径时发生第一天的治疗， 并表示为天0。小鼠在第一个三天中每天注射，然后每间隔一天注射直 至小鼠死亡。当肿瘤大小在一个方向上超过15至16mm时小鼠死亡。 在每一个组中有3只小鼠。用Ad-elF5Al处理第1组小鼠(l-l,1-2,1-3), 用Ad-LacZ注射第2组小鼠(2-l,2-2,2-3)以及第3组小鼠(3-l,3-2,3-3)仅仅 接受緩冲液。 图33显示elF-5Al增加在A549肺癌细胞中p53抑癌基因蛋白 的积聚和磷酸化。 图34显示elF-5Al增加在A549肺癌细胞中的p53 mRNA浓度。
图35显示p53浓度的增加依赖于在A549肺癌细胞中p53转录活性。 图36显示TNFR1 mRNA浓度在A549肺癌细胞中不被elF-5Al
转染所调节。 图37显示在A549肺癌细胞中elF-5Al诱导细胞凋亡和^吏用 MEK抑制剂增加elF-5Al诱导细胞凋亡的数量。 图38显示elF-5Al的假设模型在MAPK/SAPK途径和在A549肺癌细l包中细^9包凋亡的影响。 图39显示elF-5Al在肿瘤生长(在小鼠异种移植模型)抑制上优 于elF-5A2。 图40显示elF-5Al在延长小鼠存活(在小鼠异种移植才莫型 (B16-FO黑素瘤细胞))上优于elF-5A2。 图41显示elF-5Al增加与用对照的有或没有IL-6处理的细月包
相比较，增加了死亡或即将死亡细胞的数量。 图42提供了 eIF-5A2的序列。 图43提供了 elF-5Al siRNA的定位和序列。 图44提供了具有人elF-5A2的elF-5Al siRNA核酸序列比对。 图45提供了具有人elF-5A2的elF-5Al siRNA氨基酸序列比对。 图46A和46B提供了 elF-5Al siRNA的定位和序列。
发明详述 真核翻译起始因子5Al(elF5Al)业已假定作为核质穿梭蛋白的 功能，其涉及促进与细胞增殖相关mRNA亚型的翻译。然而，elF5Al 也被定义作为细胞凋亡调节剂(Taylor等，Invest Ophthalmol Vis Sci;3568-76(2004))和能够调节p53表达的前细胞凋亡蛋白(Li等,(2004)J Biol Chem.;279:49251-49258;及该文献的图23)。肿瘤抑制蛋白p53在调 节细胞周期延滞和响应应激和DNA损伤的细胞凋亡中起重要作用。尽 管elF5Al的超表达能够上调癌细胞系中p53表达(Li等,(2004)J Biol Chem.;279:49251-49258;及该文献的图23), elF5Al的超表达还能够诱导 癌细胞系中的细胞凋亡(Taylor等，(2006)Journal of Molecular and Cellular Biology,Feb 9 2006(decision pending)),意指elF5Al通过多重才几 制诱导细月包凋亡。 elF5Al的表达与细胞凋亡相关联。用拓朴异构酶抑制剂放射菌 素D(图IA)处理正常结肠成纤维细胞的蛋白印迹显示elF5Al蛋白表达与 p53同时在放射菌素D引发二十四小时后被上调。RKO细胞由于暴露在 一氧化氮(NO)-给体、SNP中遭受凋亡，此外上调elF5Al蛋白表达(图IB)。 在这些条件下elF5Al不增加RNA转录浓度，表明作为mRNA转录调节 的结果是积聚elF5Al蛋白(图IA和IB)。这些结果表明elF5Al可涉及由于遗传毒性应激或 一 氧化氮产生的细胞凋亡。 已经长期建议在细胞增殖中对elF5Al的需要，部分由于DHS 和DHH抑制剂诱导细胞周期延滞和凋亡的报道和肌苷化elF5Al必须 要求维持细胞生长的结论。然而，可以确定通过4吏用siRNA的elF5Al 表达特异性抑制对细胞生长没有影响。在HT-29细胞中elF5Al表达抑 制>卯％对5天周期的细胞增殖没有影响(图2A-E)。然而，DHS抑制剂 GC7对这些细胞的生长具有深刻的影响(图2C)。这些结果表明了 elF5Al 不为细胞生长所需要。此外，感兴趣的事实是elF5Al的抑制能够部分 保护HT-29细胞不受放射菌素D诱导的细胞毒性影响(图2B),进一 步维 持与遗传毒性应激的细胞凋亡相关的elF5Al。 elF5Al siRNA保护细胞避免细胞凋亡的能力促使在p53表达 上影响elF5Al蛋白抑制的检查。除了在应激条件下，具有功能性p53 蛋白的RKO细胞不会聚集。放射菌素D处理二十四小时后，用siRNA 对elF5Al的抑制能够阻止69%的p53蛋白聚集(图3A和3B),表明在基 因应激中elF5Al需要p53的正确表达。针对elF5Al具有不同序列的第 二siRNA也能够阻止响应放射菌素D(图8B)的p53上调，这表明该效果 不是siRNA的非特异效果。然而，elF5Al能够在RKO细胞(具有功能性 p53)和RKO-E6细l包(不具有功能性p53;图8A)(图4A和4B)中诱导细 胞凋亡，表明elF5Al同样可以通过p35-独立的机制诱导细胞凋亡。
腺病毒构建表达elF5Al或在保守赖氨酸(K)(位置50)中包含一 个点突变的elF5Al，其需要肌苷突变体(elF5Al(K50A》构建。点突变4吏 得赖氨酸变为丙氨酸(A)。 HT-29细胞的感染在这些细胞(图5C和5D和 图6)中的构建诱导细胞凋亡或大大降低细胞生活能力(图5E)。使用二维 凝胶电泳来检测elF5Al由于用Ad-elF5Al或Ad-elF5Al(K50A)(图5B) 感染聚集的elF5Al类型。正如所料，在AD-elF5Al(K50A)感染后聚集 未改性的elF5Al。用AD-elF5Al感染导致未改性和脱氧月几苷-改性 elF5Al的聚集上戏剧性的增加，表明DHS和DHH活性不够"几苷化由病 毒(图5B)产生的多数elF5Al蛋白。这些结果强烈表明未改性的elF5Al 和脱氧肌苦-改性elF5Al可能是导致细胞凋亡的形式。还不清楚肌苷化 elF5Al是否具有这种能力。 核质穿梭功能已经建议用于elF5Al，然而，已报道elF5Al 主要在细胞质中表达(Shi等，Exp Cell Res.,225:348-356(1996b))。核质穿梭蛋白也期望具有核定位。因为在细胞凋亡中已发现elF5Al的功能， 所以研究细胞凋亡中elF5Al定位的变化。通过两种不同的才几制经由 IFN-y和TNF-a处理的死亡受体活性和经由放射菌素D处理的遗传毒性， 在HT-29中诱导细胞凋亡。间接免疫荧光显示elF5Al定位在未处理、 生长的细胞(图7)细胞质中。然而，细胞凋亡刺激素非常迅速刺激elF5Al 从主要细胞质定位移动至主要核定位(图7A和7B)。在10分钟内对于 IFNy/TNF处理的细胞(图7A)和90分钟内对于放射菌素D处理的细胞(图 7B), elF5Al定位中发生的移动非常迅速。这些结果表明在通过死亡受 体活性和遗传毒性应激诱导细胞凋亡中具有核功能的elF5Al。
为了阐明未改性、脱氧肌苷-改性或涉及细胞凋亡的elF5Al的 肌苷-改性型，用2-D凝胶电泳检测细胞凋亡中elF5Al聚集的形式。用 放射菌素D(遗传毒性应激)刺激或用4十对Fas的促进抗体(agomstic antibody)培养(死亡受体途径)刺激诱导TH-29细胞经受凋亡。在1-24小 时范围的不同时间点收集细胞裂解物，然后通过elF5Al抗体(图9)用2D-凝月交电泳和蛋白印迹分析。在未处理的细胞中，与文献中4艮道的一致， elF5Al蛋白主要是肌普形式。在改变治疗的开始1小时，但在改变治疗 的消失24小时，细胞诱导剂刺激以肌苷的脱氧肌苷化形式存在的增加。 处理2个小时后还观察到未改性elF5Al的聚集。与脱氧肌苷和/或未改 性elF5Al —致的结果涉及调节细l包凋亡。 在不同癌细胞系中检定elF5Al、elF5Al(K50A)(突变体elF5Al) 和elF5A2 i秀导细J包凋亡和抑制增殖的能力。elF5Al和elF5Al(K50A)能 够诱导结肠癌细胞系HT-29(图5、 6和IO)和膀胱癌细月包系HTB-9(图11) 及HTB-4(图12)中的细胞凋亡。此外，用腺病毒表达elF5A2可以诱导 膀胱癌细月包系HTB-9(图11)和HTB-4(图12)中的细月包凋亡。Ad-elF5Al 或Ad-elF5Al(K50A)和Ad-elF5A2能够抑制膀胱癌细胞系HTB-4(图13)、 HTB-9(图14)、 J82HTB-1(图15)和UMUC-3(图16)的生长。这些病毒构 建也能够抑制HeLa宫颈腺癌细胞的生长(图17)。通过响应Ad-elF5Al 或Ad-elF5Al(K50A)和Ad-elF5A2感染的PARP切割也可^见察到HTB-4 中的细胞凋亡(图18)。 PARP正常涉及DNA修补、DNA稳定性和其它 细胞功能，在早期细胞凋亡中通过caspase家族构件切割。PARP的 caspase切除的斥佥测已证明是细胞凋亡的 一个标志。Lazebmk Y.等，Nature 371,346-347(1994)。这些结果表明在细胞凋亡期间事实上elF5Al和elF5A2可能具有众多的功能。此外，elF5Al的变异体形式能够延滞生 长和诱导不同细胞系的凋亡。当由于DHS和DHH的限制活性将 Ad-elF5Al引入细胞时，野生型elF5Al(和elF5A2)诱导细胞凋亡的能力 可以与存在的肌苷化和未改性的elF5Al相关(图5B)。最近的一份净艮告 已显示为了外源的elF5Al在细胞中以肌苷化形式超表达，DHS和DHH 必须在相同的细胞中超表达(Park等,2006,PNAS;103(l):51-56)。这些结果 认为DHS和DHH抑制剂以抑制细胞生长的能力可以不预期减少所需细 胞增殖的肌苷化elF5Al，但是作为替代可以预期为未改性的(DHS抑制 剂)或肌苷化未改性的(DHH抑制剂)elF5Al,其在细胞中依次？I发细胞周 期停滞和/或细胞凋亡。此外感兴趣的是注意到已发现DHS在细胞系中 超表达(Clement等,2006,FEBS J;273(6):l 102-14)，并且确定DHS作为癌 症转移中扩增基因的signature set之一 (Ramaswams等，2003,Nat Genet;33,49-54)。该信息的一种可能解释是某些癌细胞超表达DHS为了 阻止由于未改性或肌苷化elF5Al聚集引发的细胞凋亡(当引发细胞至 经受细胞凋亡时显示聚集，参见图9)。由于超表达的DHS,癌细胞可减 少由于遗传毒性应激引起的细胞凋亡和通过肌苷化和由此"安全"形式 的其它应^t物。 为了阐明哪条信号途径受elF5Al超表达所影响，检验促细胞 分裂素活化蛋白激酶(MAPK)/应激活化蛋白激酶(SAPK)[MAPK/SAPK] 途径的活化以响应在A549肺癌细胞中感染的Ad-elF5Al或 Ad-elF5Al(K50A)。三条主要的MAPK途径是ERK MAPK途径、p38 MAPK途径和JNK SAPK途径。ERK MAPK途径是主要由响应致有丝分 裂刺激物例如生长激素如表皮生长因子(EGF)引发，并支持宽范围肿瘤 的生长和存活。p38 MAPK途径由响应细胞应激、紫外线、生长因子消 退和促炎细胞因子而激活。经由磷酸化的p38的活化导致转录因子例如 p53的^I酸^m其可以依次导致p53增加的活性或稳定性。如同炎症， p38的活化涉及预凋亡和抗凋亡途径。JNK/SAPK途径介导响应细胞的 应激包括紫外线、DNA损害和促炎细胞因子，并导致转录因子如c-jun 的石舞酸化和增加的活性。JNK途径的J敫活可以导致许多细l包的反应包4舌 生长、转化和凋亡。JNK途径看上去是在A549细胞中EGF-诱导生长的 最初效应因子途径(Bosl等，1997, JBC: 272:33422-33429)。具有 Ad-elF5Al的A549细胞感染诱导所有三种这些途径的活化。用ERK刺激30分钟，在A549细月包中用增加数量的Ad-elF5Al感染，导致增加ERK和它的下游耙p90RSK的磷酸化作用/活化作用，同时未;寿酸4t的ERK的数量保持不变(图20)。在以一剂量应答方式响应中还观察到Ad-elF5Al磷酸化/活化的p38和磷酸化/活化的JNK的强力上调(图20)。Ad-elF5Al感染的一次过程显示了感染后维持ERK、 p38和JNK途径的活化24至72小时(图21)。发现了在响应用未肌苷化变异体Ad-elF5Al、Ad-elF5Al(K50A)(图22)感染这些途径的活化中剂量响应的增加。感兴趣的是注意到使用MEK1抑制剂、U1026抑制ERK的活化，还抑制了JNK的活化(图22)，确定在这些细l包中，JNK一皮活4匕响应于ERK活化<(Bost等,1997, JBC:272:33422-33429)。与此相反，MEKI抑制剂一贯导致增加的p38活化响应于Ad-elF5Al或Ad-elF5Al(K50A)感染，其表明了ERK途径的活化负调节响应于elF5Al的p38途径活化作用(图22)。
图38提供了在MAPK/SAPK途径和在A549肺癌细J包中elF-5Al影响的一种假想才莫型。elF5Al(野生型或不能肌苷化的突变体)(K50A)的超表达诱导A549细胞的凋亡。elF5Al的超表达也伴有MAPK/SAPK途径包括p38、 JNK和ERK的增加。elF5Al的超表达i秀导p53蛋白水平的增加，包括增加p53的磷酸化形式，其与p53增加的稳定性和活性相联系。在p53的该增加取决于MEK/ERK途径的活性和p53转录活性。然而，MEK/ERK途径的抑制和JNK途径的较低程度抑制导致用elF5Al诱导细胞凋亡的增强。这些结果表明了 elF5Al可用于为了在癌细胞诱导凋亡的治疗以及增加MEK抑制剂类抗癌药物的癌细胞杀死能力。 Ad-elF5Al和Ad-elF5Al(K50A)在p53表达和石舞酸化上的作用可参见图23。野生型和变异体elF5Al的超表达导致p53蛋白超表达以剂量响应度方式的增加(图23)。对于elF5Al的两种形式，还^见察到在丝氨酸15上p53磷酸化的增加(图23)。对于Ad-elF5Al(K50A),还观察到在丝氨酸46上p53磷酸化的增加。通过几种激酶包括ATM、 ATR和p38在丝氨酸15上可以磷酸化p53,该改性降低了 MDM2结合p53和靶向p53用于泛素化的能力，并且从而促进p53的聚集和功能性活动。通过不同激酶包括PKCAIeUa和p38在p53丝氨酸46上磷酸化p53,该改性增加p53对预凋亡启动子的亲合力并被认为对p53诱导凋亡是重要的。
胂瘤的侵入和转移是一个复杂过程，其需要肿瘤细胞去适应依附降解周围细胞外基质的能力，在第二位点转移和增殖的能力和最终促
进血管生成以维持增加生长的能力。基膜是邻接胞外基质(ECM)的薄片，其围绕每一个器官并作为大分子和细胞的屏障。可用再造ECM(MatrigelTM>々8pm膜涂渍transwell和染色细胞来测定肺瘤细胞的侵入，其能够穿透该层并达到响应于趋化性刺激的膜另一侧。A549肺癌细胞是高度侵略性的，并能够分泌蛋白如基质metaloprotease,其是能够消化ECM组分的明胶酶。检验在A549细胞的侵入上elF5Al超表达的效果，Ad-elF5Al和Ad-elF5Al(K50A)的感染显著减少侵入Matrigel 涂渍transwell的细胞数量(图24)。 到目前为止提出的结果存在用elF5Al来治疗肿瘤的可能性可以有治疗益处。因此，在小鼠中使用试验性转移的模式。在实验II中，试验性转移开始于用高度侵略性的小鼠黑素瘤细胞系B16F10(天O)注射小鼠。将质粒DNA编码LacZ基因(作为DNA对照)或elF5Al在第2、4、7、 11、 16、 21、 26和31天注射入尾部静脉。使用DNA的三个不同浓度1 x(3.3mg/kg)、 0.1 x(o.33mg/kg)和2x(6.6mg/kg)。当小鼠濒死时，对它们实施安乐死，移去肺并照相(图25)。当小鼠用质粒DNA编码elF5Al治疗小鼠时，观察到在胂瘤负载中剂量-响应度减小(图25和26)。尽管2 x剂量看起来比1 x剂量的效率低一些，但是在0.1 x剂量和1 x
剂量之间在肿瘤负载上观察到有显著的减小。肿瘤宏观上生长的能力取决于新血管(血管生成)的形成。血管内皮细胞生长因子(VEGF)是一种细胞因子，其通过许多胂瘤细胞分泌，是促进肿瘤血管生成的关键因素。从负载肺的B16F10的细胞裂解物在实验II中分离，并通过ELISA分析用于VEGF表达(图27)。在接受elF5Al质粒DNA的小鼠中，VEGF水平上有显著的、剂量响应的减小，表示elF5Al可以调节VEGF。
在实验III中，用尾部静脉注射B16F10细胞的试验性转移的模式再次使用，但这次用DOTAP络合质粒DNA以增加DNA在血清中的半衰期，并增加肺肿瘤对质粒的摄取。在第7、 14和21天注射DNA/DOTAP络合物。当小鼠濒死时，对它们实施安乐死，移去肺并照相(图28)。当与接受LacZ质粒DNADOTAP络合物的小鼠相比较时，用elF5Al质粒DNADOTAP络合物(图29)治疗的小鼠在肺重量上有平均60%的减少。
为了确定是否elF5Al处理诱导在黑素瘤肺瘤中的细l包凋亡，负载B16F0或B16F10皮下胂瘤的小鼠用Ad-eiF5Al(实验IV)进行尾部静脉注射。四十八小时后切除肺瘤，石蜡灌封并切片，切片组织用TUNEL染色，显示Ad-elF5Al诱导肺瘤细胞的凋亡(图30)。实-验V设计用来确定瘤内注射的Ad-elF5Al诱导细胞凋亡是否将导致减少皮下B16F10肿瘤的肿瘤生长并延长存活。将B16F10细胞注射入C57BL/6小鼠的肋部。当肺瘤大小达到直径约8mm时，它们用Ad-LacZ、 Ad-elF5Al或緩沖液瘤内注射。小鼠在第一个三天中每天注射，直至当肿瘤大小在一个方向上超过15至16mm时，在这个点时处死小鼠。使用测径器每天测定胂瘤大小并用于估算胂瘤体积。当用AD-elF5Al处理小鼠时显著延迟了肿瘤的生长(图31)。仅仅接受了緩冲液注射的小鼠在开始治疗后存活时间的最大值为4-6天，而接受了 Ad-LacZ注射的小鼠在开始治疗后仅仅存活了 4天。接受了 Ad-elF5Al注射的小鼠在治疗后至少存活8天，并且在治疗后差不多存活了 25天，表明了用Ad-elF5Al治疗可以导致在患有肿瘤小鼠的存活上惊人的改善(图3"。 所以,本发明提供了一种抑制癌生长的方法。本发明还提供了一种抑制或减緩癌细胞转移能力的方法。抑制癌生长包括减少肺瘤的大小、减少肺瘤的生长，还可以包括肺瘤的完全免除，抑制癌生长也意指
杀死癌细l包。该癌可以{壬<可癌或肺瘤，包括:j旦不限于结肠癌、结肠直肠
腺癌、膀胱癌、宫颈&t癌和肺癌。 本发明的方法包括对患者(哺乳动物，优选人)给药多核苷酸编码的elF-5A,优选人elF-5Al，优选具有所述癌的elF-5Al登录号为NM001970(参见图44)。也可以使用elF刁A2的异构体(即登录号NM020390)，尽管优选elF-5Al。可以通过任何本领域公知的合适方法输送elF-5Al。它可以作为棵DNA输送，如生物学上适宜的介质中DNA输送，以及通过IV或皮下注射或任何其它生物学上适宜的输送装置来输送。另外的，可以在载体如腺病毒载体中输送elF-5A。
另外地，可以在脂质体或任何其它适宜的"载体"中输送DNA，其提供将DNA(或质粒或表达载体)输送至靶癌症细胞。参见实例，Luo,Dan等,Nature Biotechnology,Vo1.18, Jan.2000, pp.33-37对合成DNA输送系统的综述。虽然本发明人已较早说明了 elF-5Al对正常组织是无毒的(参见未决申请11/293,391, 2005年11月28日提交，其在此全部引入作为参考)，优选一种输送系统(与elF5A多核苷酸/质粒/表达载体的直接给 药相比较)。优选的输送系统提供了有效量的elF-5A至肿瘤或癌细胞群， 而且优选提供了靶输送-至肺瘤或癌细胞群。因此，优选通过毫微米大小 的载体如脂质体、树状大分子或类似无毒的纳米颗粒来输送elF-5A的核 普/质粒-表达载体。此外，赋形剂优选保护elF5A核苷酸/质粒/表达载体 以免过早清除或以免引起免疫反应，同时输送有效量的elF5A核苷酸/ 质粒/表达载体至肿瘤或细胞群。可举例的载体可从与elF5A核苷酸/质 粒/表达载体相关的简单纳米颗粒延伸到更复杂的聚乙醇化载体如具有 配体附着于表面以靶向特异细胞受体的聚乙醇化脂质体。
脂质体和聚乙醇化脂质体为本领域所公知。在常规的脂质体 中，输送的分子(例如药物小分子、蛋白、核苷酸或质粒)包含在脂质体 的空穴中。本领域技术人员将理解这里还有可用于分子输送的"秘密"靶 向和阳离子脂质体。参见例如，Hortobagyi,Gabnei，N.等，J. Clinical Oncology,Vol.l9,Issue 14(July)2001:3422-3433和Yu,Wei等，Nucleic Adds Research.2004,32(5);e48.脂质体可以静脉内注射，并可以改性以使 它们的表面更亲水(通过向双分子层加入己二酸乙二醇"聚乙醇化")，其 增加了它们在血液中的循环时间。这些被称为"秘密"脂质体，作为载体，
特别对亲水(水溶性)抗癌药如阿霉素和米托蒽醌有用。更进一步，对于 靶细胞的特异结合性能，如肿瘤细胞、特异性分子如抗体、蛋白、肽等 输送脂质体可以与附着在脂质体表面。例如，存在于癌细月包受体的抗体 用于粑向癌细胞的脂质体。在靶向多发性骨髓瘤、叶酸、II-6或转铁蛋 白的情况下，例如，可用于靶向多发性骨髓瘤细胞的脂质体。
树状大分子也为本领域所公知，它提供了一种优选的输送媒 介。参见例如 Marjoros,Istvan,J,等，"PAMAM Dendrimer隱Based Multifunctional Conjugate for Cancer Therapy Synthesis. Characterization, 和 Functionality, " Biomaceonolecules, Vol.7,No.2006;572-579, 和 Marjoros,Istvan,J,等,J.Med.Chem, 2005.48,5892-5899用于树状大分子的 论述。 eIF-5A也可以直接输送至肺瘤的位置。本领域的技术人员能够 确定eIF-5A输送治疗方案的剂量和时间长短。 本发明的另一个实施方案提供了 一种在多发性骨髓瘤细胞中 诱导细胞凋亡的方法。多发性骨髓瘤是一种产生高水平炎症细胞因子类
23型的骨髓癌，其可以导致骨骼损坏和胂瘤发展。细胞因子IL-1B和IL-6
作为一种生长因子用于骨髓瘤细胞。 腺病毒载体构建包含编码elF-5A的多核苷酸(全长编码区)的 腺病毒载体结构被给药至多发性骨髓瘤细胞系、KAS6/1细胞。KAS6/1 细胞系产生于 Mayo Clinic , 并在 Westendorf,JJ.等， Leukemia(1996)10,866-876中报道。该细胞系从患有侵略性多发性骨髓 瘤病人的分离物中直接产生。本发明人已证明当含elF-5A的腺病毒构建 对KAS 6/1细胞给药，快死或死细胞(留下少量活的癌细i包)(在图41中 "WT"所示)的数量增加与已用单独的对照载体(指的是图1的"CTL")处 理的细胞比较。参见图41。用因子5A1处理癌细胞死去大约90%,与 之相比未处理的细胞为约25%。所以，本发明的一个实施方案提供了一 种用提供的编码elF5A的多核苷酸上调elF-5A的表达以杀死骨髓瘤细胞 的方法，其导致多发性骨髓瘤细胞死亡。 此外，IL-6与对照(意指"CTL+ILW)和eIF_5A构建(意指图41 中的"WT+II-6")—起给药。IL-6是作为骨髓瘤细胞的生长因子的细胞因 子。这些结果说明了即使当IL-6与elF-5A构建共同给药，还能达到增 加细胞凋亡。参见图41。这表明Factor 5A1不仅能够杀死骨髓瘤细胞， 还能够在IL-6存在的情况下消除骨髓瘤细胞。该发现在使用标准治疗如 地塞米松在IL-6存在下骨髓瘤细胞中4艮难诱导细胞凋亡。
此外，具有突变体elF-5A(K50A)(由于在位点59将保守赖氨酸 置换为另一个氨基酸而不能肌苷化)的腺病毒构建也是单独给药("MUT，，) 或与IL-6("MUT + IL-6")联合给药。这些结果显示与对照细胞相比，甚至 在IL-6的存在下，突变体elF-5A也能够增加细胞凋亡。参见图41。因 此，本发明的一个实施方案提供了一种通过给予突变体elF-5Al杀死骨 髓瘤细胞的方法，所述突变体不能肌苷化。突变体elF-5Al引起在未肌 苷化elF-5Al表达的增加，其增加了在骨髓瘤细胞中的细胞死亡。
因为IL-6作为骨髓瘤细^^的一种生长因子，下调IL-6的表达 也提供了 一种杀死骨髓瘤细胞的方法。本发明人已显示针对eIF-5A1 (参 见siRNA构建的图43和46A和46B)的siRNA不仅下调elF-5Al的内源 性表达，而且下调各种促炎细胞因子表达。因此，本发明的一个实施方 案提供了一种杀死骨髓瘤细胞的方法，其通过给予针对细胞凋亡特异性 elF-5A的siRNA以下调内源性IL-1B的表达，依次下调IL-6的表达,其
24依次提供较少的IL-6作为骨髓瘤细胞的生长因子。通过下调IL-6的表 达,可用的IL-6减少，这对骨髓瘤细胞的继续生长和存活^:必须的。
在另一个实施方案中，编码elF-5A的多核苷酸和针对elF-5Al 的siRNA —起给药以提供骨髓瘤细胞中增加的细月包凋亡。优选地编码 elF-5Al的多核苷酸在诸如如腺病毒载体的载体中给药，因此siRNA不 抑制外原性elF-5Al的表达。例如，siRNA靶向3'UTR,但多核苷酸编 码的外原性elF-5Al优选包含完全开放读框(ORF)，因此没有3'UTR被 siRNA革巴向。合适的siRNA构建在共同未决申请11/287,460; 11/134,445; 11/184,982和11/293,391中早已描述，其在此全部引入作为参考。也参 见涂43和46A和46B。 elF-5Al在骨髓瘤细l包中表达并导致细月包死亡。 此外，elF-5Al siRNA降低elF-5A的内源性表达，其依次下调IL-6的表 达,依次增加在骨髓瘤细^9包的细l包死亡。在该方法中，如上述描述的突变 体elF-5A也可用于载体构建。 本发明还提供杀死多骨髓瘤细胞的联合治疗。组合物包含编码 elF5A的多核苷酸，优选地elF5Al与标准治疗一起给药。elF5A组合物 可在传统治疗之前、之中或之后给药。elF5A可作为药物组合物来给药， 或用以上讨i仑的delivery vehicle《合药。 实施例
实施例1:体外实-验
化学制品 DHS抑制剂Nl-脒基-l,7-二氨基庚烷(GC7; Bioscarch Technologies)在浓度为50pM下使用。放射菌素D(Calbiochem)在 1.0nM/ml下使用。从Sigma购买硝普钠和去铁草酰胺并分别在3mM和 500pM浓度下使用。 细胞培养和处理 用于细胞增殖和elF5A定位研究的人结肠腺癌细胞系，HT-29 是乂人Anita Antes(University of Medicine and Dentistry of New Jersey)4寻到 的一份礼物。在补充有ImM丙酮酸钠、10mM HEPE和10%胎牛血清 (FBS)的RPMI 1640中培养HT-29细胞。从American Type Culture Collection获得所有其它的细月包系。CCD112Co是常^见的结肠成纤维细
25胞系。RKO是包含野生型p53的人结肠癌细胞系(CRL-2577)。 RKO-E6 细胞系(CRL-2578)衍生于RKO细胞系。它包含一种稳定完整的人乳头 状瘤病毒E6致癌基因，因此缺乏可评估功能的p53肺瘤抑制蛋白。RKO、 RK〇-E6、 A549和细胞系CD112Co在2mM L-谷氨酸酯和Earle平衡盐 溶液(调节至包含1.5g/L石友酸氢钠、O.lmM非必需氨基酸、lmM丙酮酸 钠并补充10。/。FBS)调节的Modified Eagle Minimum Essential Medium中 生长。在37。C、含有5%(:02的潮湿环境培养细胞。 克隆和质粒的构建 根据粘附细胞制造商的规程使用GenEli)te Mammalian RNA质 粒小量提取(Sigma),从RKO细胞分离的总RNA中用RT-PCR克隆人 elF5A。 4吏用的引物为正向，5'-CGAGTYGGAATCOAAGCCTC-3';和 反向5'-GGTTCAGAGGATCACTGCTG-3'。得到的532碱基对产物被亚 克隆入pGEM-T Easy(Promega)和序列化。得到的质粒用作使用该引物的 模板正向，5'-GCCAAGCTTAATGGCAGATGATGATTTGG-3';和反向 5'-CCTGAATTCCAGTTATTTTGCCATGG画3',并且PCR产物亚克隆入 HimdIIl和pHM6(标记有[HA]血球凝集素；Roche Molecular Biochemical) 的EcoRl位点以产生pHM6-elF5A载体。使用以下引物通过PCR产生 elF5A(pHM6-elF5AA37)的C-末端击夹失构建正向， 5'-GCCAAGCTTAATGGCAGATGGATTGG-3';和反向5'-GCCGAATTCT CCCTC AGGCAGAGAAG-3'。得到的PCR产物亚克隆入pHM6载体。 pHM6-LacZ载体(Roche Molecular Biochemical)用于最优化转染并作为 在细胞凋亡转染影响的对照。 DNA印迹 在6-孔平板上接种RKO细胞用于汇集，用1.0pM/ml的放射菌 素D处理0、 1、 4或8小时。使用GenEh)te Mammalian RNA质粒小 量提取(Sigma)从细胞分离总RNA,在1.2 %琼脂糖/曱醛凝胶上分馏15昭 RNA。才艮据确定的方法用elF5A的与3'-非转译区(3'-UTR)同源的32p-标 记cDNA探测该膜。使用以下引物通过从PCR细胞得到的RT-PCR克隆 用于DNA印迹的elF5A 3'-UTR cDNA:正向，5'-GAGGAATTCGCT GTTGCAATCAAGGC-3'; 和反向5'-TTTAAGCTTTGTGTCGGGGAGAGAGC-3'。使用以下引物通过RF-PCR克隆用于DNA印迹用作对照的 卩-肌动蛋白cDNA:正向，5'-GATGATATCGCCGCGCTCGT-3';和反向 5 '-GT AGATGGGCAC AGTGTGGGTG画3'。 质粒的转染和细胞凋亡的招r观'J 使用根据制造商推荐的规程Lipofectamine 2000(Invitrogen)将 质粒DNA瞬时转染RKO和RKO-B6。转染四十八小时后，根据制造商 的规程使用DNA Fragmentation Detection Kit(致癌基因研究产物)通过末 端脱氧核苷酸转移到移酶介导的dUTP-毛地黄毒普末端标记(TUNEL)才企 测含片段DNA的凋亡细胞。为了荧光显微分析，根据Taylor等(2004) 描述的方法将细胞在8孔培养载玻片上转染，用4%曱醛固定然后用 TUNEL标记并用Hoescht 33258染色。 siRNA的转染 所有的siRNA购自Dharmacon。 elF5A siRNA,其耙向elF5A mRNA(登记号BCO85015)的3'UTR,具有以下的序列有义链， 5'画GCUGGACUCCUCCUACACAdTdT-3';及反义链，3'-dTdTCGACC UGAGGAGGAUGUGU-5'。针对elF5A的第二 siRNA具有以下序列有 义链，5'陽AGGAAUGACUUCCAGCUGAdTdT-3';及反义链，3'誦dTdTUC CUUACUGAAGGUCGACU-5'。使用的对照siRNA具有elF5A-特异 siRNA的反向序列，与任何已知的人基因产物不具有同 一性。对照siRNA 具有以下序列，有义链，5'-ACACAUCCUCCUCAGGUCGdTdT-3';及反 义链，3'- dTdTUGUGUAGGAGGAGUCCAGC-5'。使用Lipofectamine 2000 将siRNA12转染细胞并用于增殖研究或用于蛋白印迹。 蛋白印迹 使用沸腾的裂解物緩冲液[2。/。SDS, 50mM Tris-HCl(pH7.4)]分 离蛋白印迹的蛋白。使用Bicinchonmic Acid试剂盒(Sigma)检测蛋白浓 度。在12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分馏5貼总蛋白并转入聚偏氟乙烯 膜。使用的第 一抗体是抗elF5A( BD Transduction Laboratories;小鼠IgG) 和抗卩肌动蛋白(致癌基因，小鼠IgM),它们都为5%牛奶中1:20,000的 稀释度。第二抗体是抗小鼠IgM-HRP(致癌基因)。使用增强的增敏化学发光法(ECL, Amersham Biosdences)显现抗体蛋白蛋白络合物。elF5A 检测后，根据ECL Plus蛋白印迹检测系统提供的说明剥离印迹并用抗卩 肌动蛋白抗体再探查以确定相等的负载。 使用在MAPK裂解物緩沖液[10mMTris-pH7.4， 2%SDS， 10% 甘油]中收集的裂解物，进行A549细胞的裂解物蛋白印迹用于 MAPK/SAPK的途径分析。在10%SDS- PAGE凝胶上分离10樣i克裂解 物并转移到PVDF膜上。在PBS的5%非脱脂牛奶中封闭膜1小时，PBS 洗涤并在4。C、振荡下用第一抗体在5%BSA/PBS-T中为1: 1000培养。 MAPK/SAPK(P-p38、 p38、 P-JNK、 JNK、 P-ERK、 ERK、 p90RSK)购自 Cell Signaling,并以类似的方式使用。 2-D凝胶电泳 对于2-D凝胶电泳，在冷裂解物緩冲液(7M脲，2M石克脲，30mM Tns, 4%CHAPS,蛋白酶抑制剂混合物)中收集HT-29细胞裂解物，超 声处理和用离心法清除碎片。使用Bradford法检测蛋白浓度。根据制造 商i兌明用 Ettan IPGphor Isoelectric Focusing System (Amersham Biosciences)进行一维等电聚焦。在室温下与细胞裂解物一起在再水合i爰 冲液(8M脲，2%CHAPS, 0.2DTT, 0.5% pH4-7 IPG緩冲液，0.002% Broraophenol blue)再水合immobiline DryStrips(7cm pH4隱7; Amersham Biosciences) 12小时。在500V下进行等电聚焦30分钟、1000V下进行 30分钟和在5000V下进行1小时和40分钟。然后用SDS-PAGE分离在 IPG带凝胶上的蛋白，并转移到PVDF膜(Amersham Biosciences)。使 用elF5A抗体(BD Biosciences)进行蛋白印迹。 腺病毒的产生 腺病毒(腺病毒5血清型，El,E3-deleted)表达人elF5A或承受 单个点突变(K50A50)[elF5A(K50A)]的elF5A,其使用AdMaxTMHi-IQ系 统(Microbix Biosystems公司，多伦多，加拿大)阻止肌苷化构建。在elF5A cDNA中使用PCR产生位点特异性突变。使用质粒DNA作为才莫板通过 PCR扩增elF5A cDNA,并连接在腺病毒穿梭载体pDC516(io)的Smal 位点上。PCR引物的序列为正向，5'-GCCAAGCTTAATGGCAG ATGATTTGG-3';和反向5'-CCTGAATTCCAGTTATTTTGCCATGG-3'。
28在E.coli DH5a中繁殖腺病毒基因组质粒载体pBHGfrt(del)El,3FLP和穿 梭载体，并使用QmgenEndoFreePlasmidMega试剂盒纯化。5jag各自腺 病毒基因组质粒pBHGfrt(del)El,3FLP和穿梭载体，在60mm培养板上 用Microbix Biosystems Inc.推荐的CaCl2方法转染pDC516(io)-elF5A或 pDC516(io)-elF5A(K50A)到60-80 %融合的293-IQ细胞(Microbix Biosystems)。在37。C下培养7-10天后出现斑点，并且得到的腺病毒颗 粒[Al-elF5A和Al-elF5A(K50A)]在293-IQ细胞中扩增。根据Microbix Biosystems公司提供的规程用CsCl梯度超速离心制备纯的、高的滴定度 原料。腺病毒载体表达LaxZ(Ad-LacZ,腺病毒5血清型，El,E3-deleted) 购自Qbiogene(California, CSA)，在这些实验中作为对照和报告子。用 与Ad-elF5A和Ad-elF5A(K50A)病毒同样的方法扩增和纯化Ad-LacZ腺 病毒。 腺病毒感染和annexin V标记 在100mm组织培养平板中以1 x 106细胞每平板接种HT-29、 HTB-9或HTB-4,第二天在5mlRPMI 1640+2% FBS中以3000个感染单 位/每细胞用腺病毒感染。在4小时后向细胞加入额外的培养基，FBS的 浓度达到10%。转染二十四、四十八或七十二小时后，根据制造商说明 (BD Biosciences)用Annexinx V-FITC洗涤和染色，通过胰蛋白酶作用分 离细胞。使用焚光检测的488nm氩激光源和滤波器通过流动血细胞计数 器(Coulter Epics XL-MCL)将细胞分类，并用WmMDI 2.8分析该数据。
以3000个感染单位/每细胞用腺病毒感染HT-29细胞，并使用1500 个感染单位/每细胞进行A549细胞实验。 增殖实-验 使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)在96孔平板上用siRNA感 染HT-29细胞。使用BrdU细胞增殖试剂盒(Roche Applied Science)来检 测增殖细胞的新陈代i射活动。根据制造商"i兌明使用BrdU细胞增殖试剂 盒(Roche Applied Science)来检测DNA合成。为了在腺病毒感染后进行 XTT测定，在96孔平一反在每孔接种5000细胞。4吏用未处理的细月包作为 阴性对照和放射菌素D处理的细胞作为阳性对照，第二天各自用 Ad-laZ、 Ad-elF5A和Ad-elF5A(K50A)(Ad-elF5A)感染细胞。加入XTT
29培养基并用A690nm检测A475nm作为参考。
间接免疫荧光 在聚-L-赖氨酸涂敷的玻璃盖玻片上培养HT-29细胞。用200 单位干扰素y(IFN-y, Roche Applied Science)培养亚融合细胞16小时， 然后用TNF-(100ng/ml; Leinco Technologies)培养30分钟至16小时。用 3%的甲醛(不含曱醇；Polysciences Inc.)固定处理过的细胞20分钟，用 PBS洗涤5分钟两次和用包含100mM甘氨酸的PBS洗涤5分钟一次， 用0.2。/。在PBS中TritonX-100permeabilize4分钟。然后使用标准规程标 记细胞用于免疫荧光。第一抗体是在l: 250稀释液中培养抗elF5A(BD Transduction Laboratories;小鼠IgG)10分钟。第二抗体在1: 200稀释 液中使用1小时的抗小时LgG-AlexaFluor 488(分子探针)。标记完抗体 后，核用Hoescht 33258染色，并且标记的细胞用荧光显微镜术观察。 MatrigelTM细胞侵入分析 每细胞1500感染单元将腺病毒感染至A549细胞并培养24小 时。然后用胰岛素分离细胞，无血清培养基洗涤，并在无血清培养基中 以30,000细月包每孔4妻种于transwell(Falcon 8.0pm细胞培养插入物)，其 已纟至用15|ig MatrigelTM Basement Membrane Matrix( BD Biosciences)予贞 涂渍。将含10% FBS的培养基放置于底孔(24孔平板的孔，其中transwell 处于休眠中)，细胞再培养24小时。培养后，从transwell的上室除去培 养基，移去transwell并放置在包含500微升龙胆紫的24孔平板的孔中。 在染色剂中培养transwell 20分钟，然后用浸在一烧杯水的transwell反 复洗涤。预湿的棉拭用于从transwell的顶面上刮落细胞。将细胞转移到 transwell的底面，通过光学显微术、照相观察，计算每区域转移的细胞 数量。参见图24。 统计学 Student's t-test用于统计分析。通过置信水平大于95%(p<0.05)
检测显著性。 实施例2:体内试-验
小鼠和肿瘤的确立 从Charles River,Quebec,Canada购买的Cb7BL/6小鼠为5-7周 龄。在开始试验前让小鼠适应环境一周。从ATCC购买的B16F10鼠黑 素瘤细月包并在DMCM-10%FBS。用PBS洗涤细^^两次，用台盼兰染色 检测细胞存活力。对于试验性代谢试-验(试验II和III),通过将B16F10 细胞尾部静脉注射入6周龄小鼠以确立黑素瘤肿瘤。在PBS中稀释 B16F10细胞至1 x 10S活力细胞/ml。经尾部静脉将200^1细胞注射入每 只小鼠。对于皮下胂瘤试-验(试马全IV和V),通过皮下将500,000个B16F10 细胞注射入10-14周龄小鼠的右肋部。在试验的结束(当小鼠濒死或肿瘤 超过预确定的大小)，通过吸入C02对小鼠实施安乐死。 实施例3:试马全II
质粒DNA的构建和纯化 从InvivoGen,San Diego,USA购买缺失CpG 二核普酸的 pCpG-lacZ表达载体。通过首先消化带有Ncol和Nhel的质粒，分离3.1 kb 的pCpG载体主链(/人而除去LacZ编码序歹'J)将HA-标记的elF5Al cDNA 亚克隆入pCpG-lacZ载体,并与含有HA标记(pCpG-HA5Al)的elF5Al的 PCR扩增cDNA连接。PCR引物为elF5Al正向HA-5A1正向 5'匿GCTCCATGGATGTACCCATACGACGTCCC隱3';和elF5Al反向 5'-CGCGCTAGCCAGTTATTTTGCCATCGCC-3'。在含有25pg/ml zeocin 的LB或2XYT培养基中培养的E.coliGT115中扩增pCpG-lacZ和 pCpG-HA5Al 。通过QIAGEN Endofree Plasmid Giga kit萃取质粒。用在 260nm的UV吸收和琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度。 质粒DNA的尾部静脉注射(实马全II): 将溶于1 x PBS(基于体重为约200jil)的质粒DNA注射入天数 为2、 4、 7、 11、 16、 21、 26、 31的小鼠尾部l争脉。质粒DNA的浓度 为660ng/pl对2 x (6.6mg/kg)、330ng/W对1 x (3.3mg/kg)和3.3ng/pl对0.1 x (0.33mg/kg)。 体重和肺称重 在尾部l争脉注射或每周一和周五测定体重。当它们濒死时(嗜
31睡的、呼吸困难)，使用C02对小鼠实施安乐死，并移去肺、称重、照
相、冷冻并在-70。C下储存。参见图25-27。
VEGPELISA: 用PBS洗涤收集的肺组织，在干水中冷冻并在-7(rC下4诸存。 从研磨的肺组织中分离蛋白裂解物。50pg的肺组织用于检测在小鼠肺中 使用MouseVEGF免疫测定试剂盒(R&D Systems, Inc. Minneapolis, USA) 的VEGF浓度。 实施例4:实-睑III 质粒DNA/DOTAP络合物的注射 将BI6F10黑素瘤细胞(200]！1 PBS/小鼠的50,000个细胞)、质粒 DNA和包含质粒DNA纯化的50吗无内毒素试剂盒的DNA载体络合物 尾部静脉注射入6周龄小鼠，并将80jig DOTAP尾部静脉注射入7、 14 和21天龄的小鼠。小鼠在第25天被处死。移去肺、称重、照相。参见 图28-29。 实施例5:实-验IV 腺病毒构建和TUNEL的注射 将500,000个B16F0或B16F10细月包皮下注射入10周龄 C578L/6小鼠的右肋。当胂瘤达到约4mm直径(B16细胞注射后10-12 天)将50WPBS的1 x 109pfuAd-5Al注射入肺瘤。48小时后处死小鼠， 切除胂瘤、固定、干燥灌入石蜡。根据制造商说明用TUNEL(Promega) 将各自细胞肺瘤类型(Ad-5Al-l和Ad-5Al-2)的两个区域染色。对于每个 细胞类型，包括阴性对照载玻片(Ad-5Al-neg)中不考虑TUNEL反应的 TdT酶。参见图30。 实施例6:实-验V
肺瘤的确立 将500,000个B16F10细胞(在100^1 PBS中)皮下注射入14周 龄C578L/6小鼠的右肋。每天检查肺瘤形成的进程直至肿瘤大小达到直 径约8mm。
32
腺病毒注射 当肿瘤大小达到直径约8mm时开始处理。将1 x 109斑点形成 单位(pfu)或Ad-elF5Al注射入小鼠。注射分布在肿瘤的三个位点。小鼠 在第一个三天中每天注射，然后每间隔一天注射直至小鼠死亡。当肿瘤 大小在一个方向上超过15至16mm时小鼠死亡。<51仅小鼠接受的緩冲 液仅仅所述緩冲液中腺病毒是悬浮的(10mM Tns-HCl pH7.4, 10mM MgCl2, 10%甘油)。使用测径器(卡钳)每天测定胂瘤大小并使用下面等 式计算肿瘤体积
肿瘤体积(mm3^I^W"0.52 这里I^长度，W-宽度(总是较短的方向) 参见图31和32。 实施例7: 用腺病毒表达LacZ(Lac)或elFSAl(5A)感染A549肺癌细月包。 感染四小时后，用含DMSO、 10pM p38抑制剂SB2U35HU (Calbiochem)、 10pM JNK抑制剂II(Calbiochem)、 IOjiM MEK抑制剂U1026(Calbiochem) 或30pM p53抑制剂Pifithrm-a(Calbiochem)的培养基置换该培养基。四 十八小时后，用EGF处理细胞30分钟并收集细胞裂解物。使用针对总 p53(p53)或在丝氨酸15[P-p53(serl5)]上磷酸化的p53或在37[P-p53(ser37)] 上磷酸化的p53的抗体在裂解物上进行蛋白印迹。参见图33。
图33所示的结果显示感染48小时后Ad-eIFSAl i秀导p53的聚 集。该图也显示感染48小时后Ad-eIFSAl诱导p53的磷酸化；由MEK 的抑制剂抑制p53的聚集和磷酸化；由p53活性的抑制剂抑制p53的聚 集和磷酸化；eIFSAl刺激p53的MEK依赖性磷酸化；以及eIFSAl刺 激p53的p53依赖性;舞酸化。 实施例8: 用月泉病毒表达LacZ(Ad-LacZ)或eIFSAl(Ad陽eIFSAl)感染A549 肺癌细胞。四十八小时后，从该细胞中分离总RNA。 Real Time PCR使 用GAPDH作为对照基因检测p53的水平和bax mRMA转录水平。p53 引物是5'-CGCTGCTCAGATAGCGATGGTC画3'(5'-引物)和5'-CTTCT
33TTGGCTGGGGAGAGGAG-3'(3'-引物)[这些p53引物序列取自于Li等， (2004).A Novel elF5A/complex Functions as a Regulator of p53 and p53隱dependent Apoptosis, J Biol Chem, 27949251-49258]。参见图34,其 显示在mRNA水平上eIFSAl的超表达诱导p53的聚集，此外没有^见察 在bax的作用。 实施例9: 用A良病毒表达LacZ(Ad-LacZ)或eIFSAl(Ad-eIFSAl)感染A549 肺癌细胞。四小时后，用含DMSO 、 IOjiM的MEK抑制剂 U1026(Calbiochem)或30pM p53抑制剂Pifithrm-a(Calbiochem)的培养基 置换培养基。四十八小时后，从细胞中分离总RNA。 Real Time PCR使 用GAPDH作为对照基因检测p53的水平和bax mRMA转录水平。p53 引物是5'-CGCTGCTCAGATAGCGATGGTC-3'(5'-引物)和5'-CTTCTTT GGCTGGGGAGAGGAG-3'(3'-引物)[这些p53引物序列取自于Li等， (2004).A Novel elF5A/complex Functions as a Regulator of p53 and p53-dependentApoptosis, J Biol Chem, 27949251-49258]。参见图34,其 显示p53的eIFSAl依赖性聚集依赖于p53转录活性，在响应eIFSAl中 发生的p53上调导致增加了 p53 mRNA的转录。 实施例10: 用&良病毒表达LacZ(Ad-LacZ)或eIFSAl(Ad-eIFSAl)感染A549 肺癌细胞。四小时后，用含DMSO 、 lO)aM的MEK抑制剂 U1026(Calbiochem)或30pM p53抑制剂Pifithrin-a(Calbiochem)的培养基 置^灸培养基。四十/\小时后，/人细月包中分离总RNA。 Real Time PCR使 用GAPDH作为对照基因检测p53的水平和bax mRMA转录水平。TNFR1 引物是TNFR1-F 5'ATCTCTTCTTGCACAGTGG3'和 TNFR1國F 5'CAATGGAGTAGAGCTTGGAC3'。参见图36,其显示用Ad-eIFSAl感 染上调TNFR1 mRNA的水平，TNFR1 mRNA的聚集部分依赖于MEK。 该TNFR1 mRNA聚集依赖于p53的转录活性。 实施例11 用腺病毒表达LacZ(Lac)或elFSAl(5A)感染A549肺癌细月包。
34四小时后，用含DMSO、 IO^iM的p53抑制剂SB203580(Calbiochem)、 lO^M的JNK抑制剂II(Calbiochem) 、 10jiM的MEK抑制剂 U1026(Calbiochem)或30|iM p53抑制剂Pifithrm-a(Calbiochem)的培养基 置换培养基。四十八小时后，收集细胞，用Annexin/PI染色(BD Bioscience),然后用流式细胞计分析检测经受凋亡细胞的百分比。参见 图37。 图37显示感染48小时后Ad-eIFSAl诱导细胞凋亡；JNK的抑 制增加了 eIFSAl诱导的细胞凋亡；MEK的抑制增加了 eIFSAl诱导的 细月包凋亡，以及p53的抑制减少了 eIFSAl诱导的细J包凋亡。 实施例12 用50,000个B16-F0黑素瘤细胞皮下注射入小鼠。当肿瘤达到 约5 x 5mm(65mm3)的大小时停止肿瘤内注射。将稀释在50-100pl的 PBS/10。/。甘油緩冲液或单独緩沖液(组l)的1 x 109 pfu的Ad-lacZ(组2)、 Ad-elF5 Al(组3)或Ad-elF5 A2(组4)每隔 一 天注射到该肺瘤的三个位点(每 个肺瘤)。每隔一天检测胂瘤的大小直到每隔另一天，直到当肿瘤细胞达 到10%的体重时小鼠死亡。参见图39。 实施例13 用50,000个B16-F0黑素瘤细胞皮下注射入小鼠。当肿瘤达到 约5 x 5mm(65mm3)的大小时停止胂瘤内注射。将稀释在50-100)il的 PBS/10。/。甘油緩冲液或单独緩沖液(组l)的1 x 109 pfu的Ad-lacZ(组2)、 Ad-elF5Al(组3)或Ad-elF5A2(组4)每隔一天注射到该胂瘤的三个位点(每 个肿瘤)。当肿瘤细胞达到10%的体重时小鼠死亡。参见图40。 实施例14:多发性黑素瘤 在第0天，用3000个IFU/细胞野生型或突变elF5a(不能被肌 苷化-保守赖氨酸突变)腺病毒载体构建感染KAS 6/1多发性黑素瘤细胞 4小时。在感染后培养基中建立需要或不需要IL-6存在的三个复制品。 除了 KAS细胞被接种用于对照(未被感染)。 在第2和第4天，进行MTT和annexm/PI测定。收集上清液。 该结果在图41中显示。
3权利要求
1.一种用于杀死包含编码eIF5A的多核苷酸的骨髓瘤细胞的组合物。
2. 如权利要求1所述的组合物，其中所述elF5A选自由elF5Al、 elF5A2或突变体elF5Al所组成的组。
3. 如权利要求2所述的组合物，其中所述elF5A是elF5Al。
4. 如权利要求3所述的组合物,其中组合物进一步包含输送媒介。
5. 如权利要求4所述的组合物，其中所述输送媒介选自由载体、质 粒、脂质体或树状大分子所组成的组。
6. 如权利要求5所述的组合物，其中所述输送媒介是载体。
7. 如权利要求6所述的组合物，其中所述输送媒介是腺病毒载体。
8. 如权利要求5所述的组合物，其中所述输送媒介是脂质体。
9. 如权利要求5所述的组合物，其中所述输送媒介是树状大分子。
10. eIFA用于制造药物以杀死患有多发性骨髓瘤患者中多发性骨髓 瘤细胞的用途。
11. 如权利要求10的elF5A的用途，其中所述elF5A是elF5Al、 elF5A2或突变体elF5Al，其中所述突变体elF5Al具有已转化为丙氨酸 或任何其它氨基酸的保守赖氨酸，并且其中所述突变体不能肌苷化。
12. —种杀死多发性骨髓瘤细胞的方法，该方法包括对骨髓瘤细胞 给药含有编码elF5A的多核苦酸的组合物，其中所述组合物杀死多发性 骨髓瘤细月包。
13. 如权利要求12所述的方法,其中所述elF5Al是一种突变体，其 中所述突变体具有已转化为丙氨酸或任何其它氨基酸的保守的赖氨酸， 并且其中所述突变体不能肌苷化。
14. 如权利要求12所述的方法，其中所述组合物包含载体。
15. 如权利要求14所述的方法，其中所述载体是腺病毒载体。
16. 如权利要求12所述的方法，进一步包含给药针对elF-5Al的 siRNA,其中所述siRNA下调elF-5Al的内源性表达，并且其中所述下 调elF-5Al的表达下调IL-6的表达，以及其中IL-6的所述下调杀死多发 性骨髓瘤细胞。
17. —种在患有多发性骨髓瘤患者中诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的 方法，所述方法包含给药如权利要求3所述的组合物，其中所述组合物中的elF5Al诱导多发性骨髓瘤细胞的凋亡。
18. 如权利要求17所述的方法，其中所述组合物为静脉内给药。
19. 如权利要求17所述的方法，其中所述组合物进一步包含脂质体。
20. 如权利要求17所述的方法，其中所述组合物进一步包含树状大 分子。
21. —种杀死多发性骨髓瘤细胞的方法，其包含给药如权利要求3 所述的组合物，以及进一步给予传统的多发性骨髓瘤治疗。
全文摘要
本发明涉及真核起始因子5A和编码真核起始因子5A的多核苷酸在抑制癌细胞生长和抑制转移到移中的用途。在一个优选的实施方案中，eIF-5A1用于杀死多发性骨髓瘤细胞。
文档编号A61K38/43GK101568347SQ200680052718
公开日2009年10月28日 申请日期2006年12月13日 优先权日2005年12月13日
发明者C·泰勒, J·E·汤普逊 申请人:森尼斯科技术公司