专利名称：：包含肽的抗癌剂的制作方法包含肽的抗癌剂
背景技术：
：本发明涉及免疫调节肽。在吞噬细胞例如嗜中性粒细胞和单核细胞中表达的曱酰肽受体家族(曱酰肽受体(FPR)和甲酰肽受体样1(FPRL1))在宿主对抗病原体感染中起到重要的作用(1,2)。已知这些受体与百日咳毒素敏感的Gi蛋白偶联(l,2)。FPR的激活诱导GPY亚MGoti亚基上解离，而该PY-亚基介导磷脂酶CP或磷^醇3-激酶的激活(1，2)。这些效应分子的激活诱导复杂的下游信号传导，从而导致趋化移动、脱颗粒和超氧化物产生等多种细胞反应。大多数完全激动剂诱导多种复杂的细胞信号传导，这些信号传导最终引起复杂的免疫反应。在这些免疫反应中，有很多是宿主细胞正确行使清除侵入病原体的功能所必需的，而某些反应则AiL^^应中不需要的副作用。在药物开发领域，降低和消除候选药物的副作用已经成为一个热门话题。为了达到这个目标，多个研究组已经在试图通过多种方法对特定受体开发选择性的免^^应调节剂或选择性的拮抗剂(3，4)。已经从内源性的物质或人工合成的物质中鉴定了多种FPR的激动剂(1，2)。所述激动剂包括细菌肽(N-曱酰-曱硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(fMLF))、HIV-^M结构域(T20和T21)以及源自宿主的激动剂鹏联蛋白I和A&42)(5-7)。之前，本发明人已经报道过一种刺激单核细胞和嗜中性粒细胞等白细胞的合成肽配体Trp-Lys-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(在下文中称为"WKYMVm")(8-11)。Le等人证明了WKYMVm可结合甲酰肽受体(FPR)和曱酰肽受体样l(FPRLl)(12)。由于WKYMVm是对绝大部分的受体有高亲和力的短肽，它可以作为一种有用的物质用于研究FPR-或FPRLl-介导的信号传导。然而，为特定受体开发选择性的免疫调节剂或选择性的拮抗剂的研究以及筛选分子多样性的研究仅涉及小的化合物并且迄今为止十分有限，因此一直有鉴定新的化合物的需求。
发明内容本发明的一个实施方案提供了一种抗癌剂，所述抗癌剂包含g,列选自于SEQIDNO:4、SEQIDNO:11及其组合的肽。所述抗癌剂用于抑制起源于结肠、胰、乳房、肺、脑、前列腺、鳞状细胞、淋巴样细胞或白细胞的癌。本发明的另一个实施方案提供一种在需要它的患者中抑制癌细胞增殖或者增加癌细胞凋亡的方法，包含将有效量的选自于SEQIDNO:4、SEQIDNO:11及其组合的M酸序列或其类似物给予需要它的患者，以在所述患者中抑制癌细胞增殖或者增加癌细胞的凋亡。将有效量的选自于SEQIDNO:4、SEQIDNO:11及其组合的^Jj^列或其类似物给予所述需要它的患者。所述增殖被抑制或者凋亡增加的癌细胞为结肠癌细胞。所述增殖纟皮抑制或者凋亡增加的癌细胞选自于起源于胰、乳房、肺、脑、前列腺、鳞状细胞、淋巴样细胞或白细胞的癌细胞。本发明的另一个实施方案提供一种用于抑制癌细胞增殖或者增加癌细胞凋亡的药物组合物，包含选自于SEQIDNO:4、SEQIDNO:11及其组合的M酸序列或其类似物，以及可药用的载体、稀释剂或赋形剂。通过以下的叙述并结合附图本发明的其他特征和优点将是显而易见的，其中同样的附图标记在其整个附图中指的是相同或相似的部分。被引入说明书并且作为说明书组成部分的附图阐明了本发明的实施方案，并且与说明书一起用于解释本发明的原理。图1A和IB分别显示WK丽m、本发明的肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WK丽m(SEQIDNO:11)、WK丽E(SEQIDNO:16)、WK丽R(SEQIDNO:18))或fMLF对表达FPR的RBL-2H3细胞(图1A)或表达FPRL1的RBL-2H3细胞(图1B)中的[Ca2+]i的影响;图2A和2B分别显示WK丽m、本发明的肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WK丽m(SEQIDNO:11)、WK丽E(SEQIDNO:16)、WK丽R(SEQIDNO:18))和fMLF置换1251标记的WK丽m与FPR或FPRL1结合；图3A、3B和3C显示WKYMVm、本发明的肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WK丽m(SEQIDNO:11)、WKYMVE(SEQIDNO:16)、WKYMVR(SEQIDNO:18))、fMLF和wkymvm对表达FPR或FPRL1的RBL-2H3细胞中的ERK磷酸化的影响；图4A、4B和4C显示WK丽m、本发明的肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKRMVm(SEQIDNO:11)、WKYMVE(SEQIDNO:16)、WKYMVR(SEQIDNO:18))、fMLF和wkymvm对表达FPR或FPRL1的RBL-2H3细胞中的Akt磷酸化的影响；图5A和5B显示WKYMVm通过升高胞内4丐刺激表达FPR或FPRL1的RBL-2H3细胞的胞吐作用；图6A和6B显示WK丽m、本发明的肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKRMVm(SEQIDNO:11)、WKYMVE(SEQIDNO:16)、WKYMVR(SEQIDNO:18))、fMLF和wkymvm对N-曱酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(fMLF)对所述肽诱导的[Ca2+]i升高的胞吐作用的影响；图7A和7B显示WKYMVm通过PI3K和MEK活性刺激表达FPR或FPRL1的RBL-2H3细胞的^^匕移动；图8A和8B显示WKYMVm、;^发明的肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKRMVm(SEQIDNO:11)、WKYMVE(SEQIDNO:16)、WKYMVR(SEQIDNO:18))、fMLF和wkymvm对趋化性的影响；图9A和9B显示WRYMVm(SEQIDNO:4)和WKRMVm(SEQIDNO:11)减弱CT26注射小鼠的肿瘤生长；图IOA和lOB显示WRYMVm(SEQIDNO:4)减弱EL4注射小鼠的肿瘤生长；图11A和11B显示低剂量的WRYMVm(SEQIDNO:4)在CT26模型中是最有效的；和图12A和12B显示WRYMVm(SEQIDNO:4)与长#_新碱的组合试验增强了抗肿瘤作用。具体实施例方式曱酰肽受体(FPR)和甲酰肽样1受体(FPRL1)在免M应中发挥重要功負fe。本发明提供了衍生自WKYMVm的肽。多种肽可以刺激FPR或FPRLl导致钙的升高，但是本发明的肽例如WKGMVm(SEQIDNO:1)、WK丽m(SEQIDNO:11)和第6位D-Met(6thD-Met)被取代的肽仅在表达FPRLl的细胞而不在表达FPR的细胞中引起4丐升高。使用125I-WOMVm的竟争性测定显示，不但多种肽可引起表达FPR的细胞中的钙升高，而且WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKRMVm(SEQIDNO:11)和第6位D-Met被取代的Jikii可以竟争"51-WKYMVm与FPR的结合。不同于磷脂酶C介导的钙升高，WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKRMVm(SEQIDNO:11)和第6位D-Met被取代的肽可以刺激细胞外调节的蛋白激酶(ERK)和Akt在表达FPR的细胞中的激活。对于WKYMVm的功能性效果而言，该li^FPR细胞中通过Ca"和ERK途径分别刺,颗粒和细胞的趋化性。然而，WKGMVm、WKRMVm和第6位D-Met被取代的肽等肽刺激FPR细胞仅诱导趋化移动而不诱导脱颗粒。综上可知，本文首次证明了FPR作为一种重要的化学引诱物受体，可以被不同的肽g己体以Si体特异的方式差异性地调节。根据一个实施方案，本发明的舦包括选自于SEQIDN0:1至SEQIDNO:24的M酸序列或SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的^L衍生的物质。所述SEQIDNO:1至SEQIDNO:24如下Trp-Lys-Gly-Met-Val-D-Met-NH2(WKGMVm;SEQIDNO:1)，Trp"Lys-Tyr-Met-Gly-D-Met-NH2(WKYMGm;SEQIDNO:2》Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Gly-NH2(WKYMVG;SEQIDNO:3)，Trp-Arg-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(WRYMVm;SEQIDNO:4)，Trp-Glu-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(WEYMVm;SEQIDNO:5),Trp-His-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(WHYMVm;SEQIDNO:6〉,Trp-Asp-Tyr-Met-Va!-D-Met-NH2(WDYMVm;SEQIDNO:7)，Tn>Lys-His-Met-Val-D-Met-NH2(WKHMVm;SEQIDNO:8),Trp-Lys~Glu-Met-Val-D-(WKEMVm;SEQIDNO:9)，Trp-Lys-Trp-Met-Va-D-Met-NH2(WKWMVm;SEQIDNO:10)，Trp-Lys-ArgMet-\^l-D"Met-NH2(WKRMVm;SEQIDNO:")，Trp-Lys-Asp-Met-Val-D画MeWMH2(WKDMVm;SEQIDNO:12)，Trp-Lys画Phe-Met-Va卜D-Met-NH2(WKFMVm;SEQIDNO:13)，Trp-Lys-Tyr-Met-Tyr-D-Met-NH2(WKYMYm;SEQIDNO:14),Trp-Lys-Tyr-Met-(Phe/Trp)-D-Met-NH2(WKYM(F/W)m;SEQIDNO:15),Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Glu-NH2Tn>Lys-Tyr-Met-Val-Val-NH2Trp-Lys-Tyr-Met-Val-Arg-NH2Trp-Lys-Tyr-Met-yal-Trp-NH2Trp-Lys-Tyr-Met-Va,2(WKYMV;SEQIDNO:20)，Lys-Tyr-Met-Val-D-Met-NH2(KYMVm;SEQIDNO:21)，Lys-Tyr-Met-Val-NH2(KYMV;SEQIDNO:22)，Tyr-Met-Va!-D-Met-NH2(YMVm;SEQIDNO:23)，和Met-Val-D-Met-NH2(MVm;SEQIDNO:24)。SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽以分离的和基本纯化的形式存在。所述肽包含的氨基酸残基的一个羧基上可任选地带有一个-冊2!^l代。本发明的肽具有至少一种以下的性质(a)通过人单核细胞或嗜中性粒细胞诱导超氧化物产生；(b)通itAJf周血单核细胞或嗜中'l^^立细胞诱导胞内钙升高；(c)结合甲酰肽受体或甲酰肽受体样1;(d)在体外诱导人单核细胞或嗜中性粒细胞的趋化移动；(e)诱导表达曱酰肽受体的细胞或表达甲酰肽受体样1的细胞脱颗粒；(f)通过甲酰肽受体的激活或甲酰肽受体样1的激活刺激胞外信号调节的蛋白激酶磷酸化；和(g)通过甲酰肽受体的激活或甲酰肽受体样1的激活刺激Akt磷酸化。根据另一个实施方案，本发明提供一种药物组合物，它包含M酸序列选自于SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽；或者由M酸序列选自于SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽衍生的物质。包含所述肽或所述物质作为活性成分的组合物可以包含多于一类的选自于盐水、緩冲盐水、葡萄糖、水、甘油和乙醇的药物稀释剂，但所述稀释剂不限于这些。根据服药目的和具体疾病可以以不同的方式给予所述组合物。应理解，实际给予的活性成分的量应该根据多种相关因素确定，包括需要治疗的病症，患者症状的严重程度，同时Jl用的其他药物(例如化学治疗剂)，所述(WKYMVE;SEQIDNO:16》，(WKYMW;SEQIDNO:17),(WKYMVR;SEQIDNO:18)，(WKYMVW;SEQIDNO:19)，患者个体的年龄、性别、体重，饮食，服药时间，选择的给药途径以及所述组合物的比例。所述组合物可以单个日剂量或者分为l-3次的日剂量给予，然而给药的剂量和给药途径可才艮据疾病的类型和严重程度进行调节。包含本发明的肽或物质的组合物可以通过口月l或肠胃外途径给药。肠胃外服药意思是通过口服之外的途径给予药物，包括直肠给药、静脉内给药、J^M内给药和肌内给药、动脉内给药、经皮给药、鼻内给药、pM、眼部给药以及皮下给药。可以将包含所述肽或物质的药物制剂制备成口服剂型、注射液或局部用制剂等任何形式。所述制剂可以被优选制备成口服和注射给药(真溶液、悬液或乳剂)的形式，并且最优选是口服形式例如片剂、胶嚢、软胶嚢、液体药剂、丸剂、颗粒剂等等。在制备所述制剂过程中，可以在无任何赋形剂的情况下将所述肽填充进软胶嚢中，或者将所述肽与载体混合或用载体稀释后形成适当的制剂。合适的载体的实例为淀粉、水、盐水、#氏(Ringer's)溶液、葡萄糖等。WRYMVm(SEQIDNO:4)或WKRMVm(SEQIDNO:11)的泰^^序列的肽可以大大降低小鼠胂瘤模型(CT26、EL4)的肿瘤生长。另夕卜，低剂量的WRYMVm降低肿瘤的效果最好，而较高剂量却没有效果。当WRYMVm用于与抗癌药物M新碱組合治疗癌症的时候，显示了抑制肿瘤大小和提高存活率的协同效应。根据本发明的另一个实施方案，提供了一种与治疗白细胞数量变化或激活状态改变相伴随或由其引起的病症的方法。所述方法包含给予需要这种治疗的宿主有效治疗量的#^酸序列选自于SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽，或者由M酸序列选自于SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽f斤生的物质。所述病症可以是细菌、支原体、酵母菌、真菌、病毒的感染或炎症。根据本发明的另一个实施方案，提供了一种增加白细胞数量或提高白细胞激活状态的方法。所述方法包含给予需要更大量白细胞或更高白细胞激活状态的宿主有效治疗量的M酸序列选自于SEQIDN0:1至SEQIDNO:24的肽，或者由M酸序列选自于SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽f汙生的物质。根据本发明的另一个实施方案，提供了一种在需要这种治疗的患者中诱导白细胞胞外钓升高的方法。所述方法包含给予所述患者lL^酸序列选自于SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽，所使用的量有效于治疗性地或预防性地达到这种"i秀导效果或脱敏效果。根椐本发明的另一个实施方案，提供了一种在需要这种治疗的患者中诱导人单核细胞或嗜中性粒细胞产生超氧化物的方法。所述方法包含给予所述患者^J^酸序列选自于SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽，或者由氨基酸序列选自于SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽衍生的物质，所使用的量有效于治疗性地或预防性地达到这种诱导效果或脱敏效果。根据本发明的另一个实施方案，提供了一种在需要这种治疗的患者中诱导人外周血单核细胞趋化移动的方法。所述方法包含给予所述患者M酸序列选自于SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽，或者由^J^酸序列选自于SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽衍生的物质，所使用的量有效于治疗性地或预防性地达到这种诱导效果或脱敏效果。根据本发明的另一个实施方案，提供了一种在需要这种治疗的患者中诱导表达曱酰肽受体或曱酰肽受体样l的细胞脱颗粒的方法。所述方法包含给予所述患者#^酸序列选自于SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽，或者由M酸序列选自于SEQIDNO:l至SEQIDNO:24的肽衍生的物质，所使用的量有效于治疗性地或预防性地达到这种诱导效果或脱敏效果。根据本发明的另一个实施方案，提供了一种在需要这种治疗的患者的表达甲酰肽受体的细胞或表达曱酰肽受体样1的细胞中用WKYMVm分别竟争肽与甲酰肽受体或曱酰肽受体样1的结合的方法。所述方法包含给予所述患者M酸序列选自于SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽，或者由M酸序列选自于SEQIDNO:l至SEQIDNO:24的肽衍生的物质，所使用的量有效于治疗性地或预防性地达到这种资导效果或脱敏效果。根据本发明的另一个实施方案，提供了一种在需要这种治疗的患者中刺激表达曱酰肽受体或曱酰肽受体样1的细胞胞外信号调节的蛋白激酶的方法。所述方法包含给予所述患者M酸序列选自于SEQIDNO:1至SEQIDN0:24的肽，或者由^J^酸序列选自于SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽衍生的物质，所使用的量有效于治疗性地或预防性地达到这种诱导效果或脱敏效果。根据本发明的另一个实施方案，提供了一种在需要这种治疗的患者中刺激表达曱酰肽受体或甲酰肽受体样1的细胞的Akt的方法。所述方法包含给予所述患者M酸序列选自于SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的肽，或者由氨基酸序列选自于SEQIDNO:l至SEQIDNO:24的肽衍生的物质，所使用的量有效于治疗性地或预防性地达到这种诱导效杲或脱敏效果。在上述实施方案中，所述被治疗的宿主或患者可以具有以下疾病引起的障碍感染特别是巨细胞病毒感染、类风湿性关节炎、莱姆关节炎、痛风、脓毒病综合征、高热症、溃疡性结肠炎、小肠结肠炎、骨质疏松症、牙周病、肾小球肾炎、慢性非传染肺部炎症、结节病、吸烟肺、肉芽肿形成、肝纤维化、肺纤维化、移植排斥移植物抗宿主疾病、慢性髓细胞样白血病、急性髓细胞样白血病、肿瘤性疾病、哮喘支气管炎、I型胰岛素依赖型糖尿病、动脉硬化、动脉粥样硬化、银屑病、慢性B淋巴细胞白血病、常见变异型免疫缺陷病、弥散性血管内凝血、全身性硬化症、脑脊髓炎、肺炎症、高IgE综合征、癌症转移、癌生长、过继免疫治疗、获得性呼吸窘迫综合征、败血病、再灌注综合征、手术后炎症、器官移植或脱发。本发明提供了一种分离的核苷酸，所述核苷酸编码包含SEQIDN0:1至SEQIDNO:24的M酸序列的肽。本发明提供了一种包含分离的核苷酸载体,所述核苷酸编码包含SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的絲酸序列的肽。本发明提供了一种包含选自于SEQIDNO:1至SEQIDNO:24的氨基酸序列的多肽。通过参考下面的实施例更详细地解释本发明。然而，这些实施例无*何都不能被解释为对本发明范围的限制。实施例中使用的材料以及方法材料9-芴曱氧絲(Fmoc)絲酸来自Millipore(Bedford,MA)。Rapidamide树脂购自Dupont(Boston,MA)。外周血单核细胞(PBMC)分离培养基(Histopaque-1077)、细胞色素c和fMLF购自Sigma(St.Louis,M0)。Fura-2戊乙酰氧曱基酯(fura-2/AM)购自MolecularProbes(Eugene,OR)。RPMI1640来自LifeTechnologies(GrandIsland,NY)。透析的胎牛血清和添加的牛血清购自HycloneLaboratoriesInc.(Logen，UT)。PTX、GF109203X和PD98059购自Calbiochem(SanDiego,CA)。LY294002购自BI0M0Lresearchlaboratories,Inc.(PolymouthMeeting,PA)。通过上文描述的固相法(8，9)合成所述肽。简而言之，在rapidamide支持树脂上合成肽并且依照标准的9-芴曱氧皿/叔丁基方法将肽组装于酸敏感的交联剂上。通过前述的M酸分析(8)确认所述肽的组合物。使用如上述的添加了20%的FBS和200g/ml的G418的DMEM培养RBL-2H3细胞、表达FPR的RBL-2H3细胞以及表达FPRL1的RBL-2H3细胞(13)。RPMI1640来自InvitrogenCorp.(Carlsbad,CA)。透析的胎牛血清和添加的牛血清来自HycloneLaboratoriesInc.(Logen,UT)。CpG寡脱氧核苷酸(0DN)(具有完整的硫代磷酸骨架的5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-30由GenotechInc.(Daejon，Korea)合成。斧;#*腐藉务在37X:和5%C02湿润空气中将CT26、EL4保持在添加了20%(体积/体积)的热失活胎牛血清的RPMA1640培养基中。对于动物实验，细M冷冻保藏物重新生长之后it4亍2-5次传代。用0.25%的4^蛋白酶和0.03%的EDTA^J且织培养瓶上分离对数生长期的CT26细胞。用PBS洗涤并悬浮CT26和EL4，随即进行注射。絲,發无特异病原体的雄性Balb/c小鼠和C57/BL6小鼠购自HyoChangBioscience(Taegu，Korea)。所有小鼠在韩国UniversityofUlsan的ImmunomodulationResearchCenter的动物设施中在无特异病原体的^f^下饲养并且在6-8周龄的时候使用。在第0天分别将CT26和EL4皮下注射Balb/c小鼠和C57/BL6小鼠。从第6天开始每4天全身给予WRYMVm(SEQIDN0:4)和CpG0DNGiJt注射；200jul),而对照组被给予PBS或100jug/小鼠的CpG0M。在每次注射肽或CpG0DN的同一天提前8小时经腹腔注射给予M新碱。在接种后每2天^^)数字变化测径器测定肺瘤块。肿瘤体积被计算为[长x宽x高xtt/6]。死亡日期记录为小鼠由于胂瘤而自然死亡的日期或者在频死状态处死小鼠的日期，或者是当测到的肿瘤宽达到20mm(在该宽度下肿瘤不再会消退)的日期。结a示为10只小鼠/组的平均SE。在图9-12中，本表示与载体(PBS)处理的对照得到的值相比p<0.01，"表示与载体(PBS)处理的对照得到的值相比p<0.05。实施例l:嗜中性粒细胞的分离外周血白细胞浓缩物由UlsanRedCrossBlood(Ulsan，Korea)馈赠。依照上述的葡，沉降、红细胞的低渗裂解和淋巴细胞分离介质梯度的标准方法(9)分离人嗜中性粒细胞。然后立即使用所述分离的人嗜中性粒细胞。实施例2:M人嗜中性粒细胞中超氧化物形成的影响测定了肽WKYMVm、SEQIDNO:1-24的#wkymvm对人嗜中性粒细胞中超氧化物形成的活性。如上所述，使用微量滴定96-:UlELISA读数器(Bio-Tekinstruments，EL312e，Winooski，VT)(14)，通过测定细胞色素c的还原而定量超氧阴离子的形成。将所iiA嗜中性粒细胞(每个96-孔板的孔中lxl06细胞/100jal的RPMI1640培养基)与50jiM的细胞色素c在37。C预孵育1分钟，然后与指定浓度的肽孵育。每1分钟测量一次550nm的光吸收值，共测量5分钟，超氧化物形成被测量为在ilL5^^中期间内光吸收的变化值。通过至少4次独立实验，选择在每个位置具有活性氨基酸的肽。这些结果显示于表l中。以多种浓度的肽WKYMVm刺激嗜中性粒细胞导致以浓度依赖的方式形成超氧化物，表明100nM的所述肽活性最大(数据未显示)。虽然WRYMVm(SEQIDNO:4)、WEYMVm(SEQIDNO:5)、WKFMVm(SEQIDNO:13)和KYMVm(SEQIDN0:21)等某些肽刺激了细胞中超氧化物形成，但是多种肽的100nM的浓度对超氧化物形成活性仅有较弱的活性。表I:M人嗜中性粒细胞中超氧化物形成的影响1<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>通过监测细胞色素c的还原测定超氧化物形成。处理的肽浓度为100nM。还测定了浓度为iojiM的^t超氧化物形成的影响。结果显示于表n中。在10HM的浓度下，除wkymvmO卜的所有肽所刺激的超氧化物形成强度与WK丽m的一样。在所述肽之中，WK爾m(SEQIDN0:10)、WKFMVm(SEQIDNO:13)和WKYMVW(SEQIDNO:19)显示了比WKYMVm更强的活性。表n:toj"人嗜中性粒细胞中超氧化物形成的影响'SEQ1DNO序列b02-(rtmo，/1C)S细胞)SEQIDNO序列02'(nmol/10s细胞)WKYMVnvNH239.0±3.5813WKFMVm-NH260.2±5.571WKGMVm-NH237.6±4.5714WKYMYm-NH242.9±3.342WKYMGm媽27.3±2.6115WKYM(F/W)m-NHi!45.6±7.763WKYMVG-NH227.3±1.4016WKYMVE-NH233.6±6.434WRYMVm-NH238.2±6,5417WKTMW-NH236.3±2.295WEYMVm-NH235.3±2.8818WKYMVR-NH244.8±3.656WHYMVm-NH220.7±7.851956.8±4-307WDYMVm-NH237.3±5.6620WKYMV-NH225.6±2.208W圆Vm媽39.3±4.1021KYMVm-NH249.2±5.829WKEMVm洲239.2±4.7122KYMV-NH235.4±2.1310WKWMVm-NH2胡.0±12.1023YMVm-NHz41,8±3.4611WKRMVm-NW241.7±8.32MVm-NH242.4±2.4712WKDMVm-NHi37.3±2.780通过监测细胞色素c的还原测定超氧化物形成。处理的肽浓度为10|iM。实施例3:所述Jlbt表达FPR或FPRL1的RBL-2H3细胞中[Ca2+]i升高的效应测定了肽WKYMVm、SEQIDNO:1-24的肽和wkymvoi对表达FPR的RBL-2H3细胞中[Ca21i升高的活性。用10jiM的每种肽刺'g达FPR的RBL-2H3细胞并测定[Ca2+]i。使用fura-2/AM通过Grynkiewicz的荧光光度法(15)确定[Ca"]i的水平。简言之，在新配制的无血清RPMI1640培养基中将制名"得到的细胞与3pM的fura-2/AM在37匸持续搅拌孵育50分钟。在无Ca"的洛克(Locke，s)溶液(154mMNaCl、5.6mMKC1、1.2mMMgCl2、5mMHEPES、pH7.3、10mM葡萄糖和0.2mMEGTA)中以2x106个细胞作为一份用于每次测定。测定了在340nm和380nm的双激发波长以及500nm的发射波长下的荧光变化，并且将校准的荧光率转换成[Ca21"监测所述升高的[Ca2+]i的峰值水平。结果显示于表m和图ia中。数据4^三次独立的实验。表IE.肽对表达FPR的RBL-2H3细胞中胞内钙升高的影响a<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>a通过负载有fura-2的细胞监测胞内钙的升高。在表达FPR的RBL-2H3细胞中，肽WKYMVm以浓JL依赖的方式诱导[Ca2+]i升高，在300nM附近显示最大活性(数据未显示)。WKYMVm对FPR细胞中[Ca2+]i升高活性的EC5。是47nM(表m)。在本发明的肽中，WHYMVm、WK丽m(SEQIDNO:10)和WKFMVm(SEQIDNO:13)与肽WKYMVm相比显示了与FPR的更强亲和力，而其他的肽都不如WKYMVm的活性强(表m)。特别地，直至用20jaM浓度的WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKYMGm(SEQIDNO:2)和第6位D-Met被取代的肽进行处理，都对表达FPR的RBL-2H3细胞中的[Ca2+]i升高没有影响(表HI和图1A)。N末端或C末端截短的^bjiFPR细胞中也没有使[Ca21i升高的活性(表m)。这些结果表明Ty和D-Me是FPR激活[Ca2+]i升高的关键。测定了肽MYMVm、SEQIDNO:1-24的肽和wkymvm对表达FPRL1的RBL-2H3细胞中[Ca勺i升高的影响。用10|nM的每种似'J、^达FPRL1的RBL-2H3细胞并测定[Ca'+]i。使用与上述的相同的方法测定[Ca^i的水平。监测所述升高[Ca'+]i的峰值水平。结果显示于表IV和图IB中。数据代表三次独立的实验。在表达FPRL1的RBL-2H3细胞中，浓度为10nM的WXYMVm显示最大活性(数据未显示)。WKYMVm对FPRL1细胞中[Ca2+]i升高活性的ECm)是0.6nM(表IV)。与FPR细胞不同，所有肽对于FPRL1细胞中[Ca2+]i升高都是有活性的(表IV)。某些肽例如WR丽m(SEQIDNO:4)、WK丽m(SEQIDNO:10)、WK歴m(SEQIDNO:13)、WKYMYm(SEQIDNO:14)和WKYM(F/W)m(SEQIDNO:15)显示了与FPRLl的较高的亲和性(表IV)。在FPR细胞中不能影响[Ca";h升高的WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKYMGm(SEQIDNO:2)和第6位D-Met被取代的肽在FPRLl细胞中也显示了升高[Ca21i的活性，并且与FPRLl的亲和性稍低(表IV和图IB)。N末端或C末端截短的肽在FPRLl细胞中也刺激[Ca21i升高(表IV)。这些结M明Ty一和D-Me^对于FPRLl激活产生的[Ca2+]i升高比对于FPR激活产生的[Ca2+]i升高的重要性低。表IV.肽对表达FPRLl的RBL-2H3细胞中胞内钙升高的影响aSEQ旧NO序列EC50(nM)SEQIDNO序列EC50WKYMVm-NH20.60±0.09013WKFMVm-NH20.23±0.0421.WKGMVn>NHii21_32±2.10414WKYMSrm-NH20_29±0.0612W,Gm-NH218.11±1.30815WKYM(RW)n>NH20-12土0,.CM53WKYMVG-NH25945.8±176.10016WKYMVE-NH2502.B7±64.9654WRYMVm-NH20.12±0.01017WKYMW-NH21259.15±95.7505WEYMVm-NH25.23±0.19618WKYMVR-NHa177.52±26.0356WHYMVm-NH20.72±0.07519WKYMVW-NH2194.48±19.2107W薩Vm媽14.28±1.22520WK/MV-NH2917.85±45.6108WKHMVm媽1.94±0,26821KYMVm-NH23.01±0.232928.30".35422.>3000010WKWMVm-NH20.16±0.02723YMVm-NH217.15±0.88911WKRMVm-NH22.06±0.25624MVm-NH2>3000O12WKDMVm-NHz8.73±1,210wkymvm-NHa无活性通过负载有fura-2的细胞监测胞内钙的升高。实施例4:W["I]WK丽m与FPR或FPRLl的结合的影响在发现某些肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WK丽m(SEQIDNO:11)和D-Met6取代的肽)不能诱导胞内钩升高之后，检测了所述肽是否能结合FPR。监测所述肽替换125I-标记的WKYMVm与FPR或FPRLl结合。在存在或不存在增加量的未标记的WKYMVm或SEQIDNO:1-24的肽的情况下，将表达FPR的RBL-2H3细胞与[125I]WKYMVm孵育。使用以前报道的方法的改进(16)进行配体结合分析。所ii^文射性;^f匕的WK丽mC标记的)购自NENLifesciences(Boston,MA)。简言之，将表达FPR或FPRL1的RBL-2H3细胞以每孔1x105个细胞接种于24-孑Ul中并且过夜培养。用封闭緩冲液(RPMI中33mMHEPES、pH7.5、0.1%BSA)将所述细胞封闭2小时^，在存在或不存在50nM的未标记的肽的务降下将单浓度的1251-标记的WK丽m加入到结合緩冲液(含有0.1%BSA的PBS)的细胞中，并且在41C持续搅拌孵育3小时。然后用水中预冷的结合緩冲液洗涤所述样品5次，在每个孔中加入200jil的裂解緩沖液(20mMTris、pH7.5、1%曲通X-IOO)。在室温下裂解20分钟后收集裂解液。用Y射线计数器测定结合的1251-标记的WKYMVm的放射性。配体结合分析的结果显示于图2A和2B中(2A:表达FPR的RBL-2H3细胞，2B:表达FPRL1的RBL-2H3细胞)。如图2A和2B所示，不但未标记的WKYMVm而且还有WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKRMVm(SEQIDNO:ll)和WK丽m的D-Me^取代肽都以浓度依赖的方式抑制[mi]WKYMVm的结合。这些结^明，虽然WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKRMVm(SEQIDNO:11)或WKYMVm的D-Met6取代肽可以结合FPR,但是所有这些肽都不能诱导表达FPR的RBL细胞中细胞内钙的升高。实施例5:肽对表达FPR或FPRL1的RBL-2H3细胞中ERK磷酸化的影响i)用肽刺激细胞将培养的RBL-2H3细胞分成2xl(^个细胞的等份，并且用指定浓度的WKYMVm和本发明的肽刺激所述细胞指定长的时间。用1|LiM的WKYMVm刺激表达FPR或FPRL1的RBL-2H3细胞达不同时间(图3A)。在用ljaM的WKYMVm处理前，将两种细胞与栽体或100ng/ml的PTX(24小时)、50juM的LY294002(15分钟)、5的GFX(15^^钟)、10|iMBAPTA/AM(60分钟)或50jiMPD98059(60分钟)预孵育(图3B)。用10nM的本发明的肽分别刺激表达FPR或FPRL1的RBLH3细胞2分钟或5分钟(图3C)。在刺激后用无血清RPMI洗涤细胞并iL^裂解緩冲液(20mMH印es、pH7.2、10%甘油、150niMNaCl、1。/。曲拉通X-100、50mMNaF、1mMNa3V04、10|ag/ml亮肽素、10jig/ml抑肽酶和1mM苯甲磺酰氟)中裂解。通过离心(12，000xg，15分钟，4'C)将不溶于洗涤剂的物质沉淀，取可溶的上清液部分于-80。C保存或者立即使用。使用Bradford蛋白测定试剂确定所述裂解物中的蛋白浓度。ii)电泳和免疫印迹分析#^#样品(30g蛋白)进行10%SDS-PAGE并且用M酸-ERK抗体通过免疫印迹分析确定磷酸化的ERK。通过添加浓缩的样品緩冲液制备用于电泳的蛋白样品。然后使用Laemmli描述的緩沖系统(17)通过10%SDS-聚丙烯自皿分离所述样品的组分。在电泳之后，用抗ERK2抗体进行蛋白印迹分析以确定这些实验中使用了相同量的样品。将所述蛋白印迹到硝酸纤维素膜上。然后通过与含有5%的脱脂奶粉的TBS(Tris緩冲的盐水、0.05%土温20)孵育封闭所述硝酸纤维素膜。随后将所述膜与抗磷酸-ERK抗体、抗磷酸-Akt抗体或抗Akt抗体孵育并用TBS洗涤。对于PKC易位测定，使用一种PCK同工酶特异的抗体进行孵育。所^与1:5000稀释的偶联辣根itlU匕物酶的山羊抗兔IgG或山羊抗小鼠IgG抗体孵育后，使用增强化学发光险测系统显影抗原-抗体复合物。iii)结果评估了所述肽经由FPR或RPRL1对细胞信号传导的对表达FPR或FPRL1的RBL-2H3细胞影响，结果显示于图3A至3C中。图3A至3C的结果>(^3次独立的实验。因为某些肽可以结合FPR而不能刺激PLC介导的钙升高，因4测了它们对独立于某些GPCR下游中的PLC的其他信号传导(ERK和Akt)的影响。用1jiMWKYMVm刺激表达FPR或FPRL1的RBL-2H3细胞诱导了ERK短暂的激活，并JL^肽处理后2分钟或5分钟分别出现了最大活性(图3A)。当在WKYMVm刺激前用数种抑制剂预处理表达FPR或FPRL1的RBL-2H3细胞的时候，WKYMV迈诱导的ERK激活对PTX和PD98059是敏感的，这表明所述事件是PTX-敏感的G蛋白和MEK依赖的(图3B)。PI3K抑制剂(LY294002)、PKC抑制剂(GF109203X或Ro-31-8220)或者钩螯合剂(BAPTA/AM)的预处理不会影响WKYMVm诱导的ERK激活(图3B)。这说明该事件不絲于PI3K、Ca'+和PKC激活。因》M艮明显WKYMVm似乎可以通过独立的信号传导途径裔导[Ca2+]i升高和ERK激活。用抗磷酸-ERK抗体通过蛋白印迹分析检测本发明的肽对ERK激活的影响。与细胞内钩升高活性不同，所述肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WK丽m(SEQIDNO:11)、WK丽R(SEQIDNO:18)和WK丽E(SEQIDNO:16))刺激表达FPR的RBL-2H3细胞中ERK的磷酸化(图3C)。由于已经清楚所述肽不影响PLC介导的[Ca^升高活性，所以这是非常有意义的结果。用WKYMVm和本发明的肽剌激表达FPRL1的RBL-2H3细胞时，大多数肽也引起FPRL1细胞中ERK的磷酸化(图3C)。这个结果与前面的结果即所有肽都能刺激表达FPRL1的细胞中细胞内钙升高是一致的(图IB)。实施例6:Jlbt表达FPR或FPRL1的RBL-2H3细胞中Akt磷酸化的影响已知化学引诱受体的激活可通过PI3K诱导Akt的激活(19)。依照与实施例5中的相同的方法，进行所述肽对细胞的刺激、电泳和免疫印迹分析。用1HM的WKYMVm刺激表达FPR或FPRL1的RBL-2H3细胞达不同时间(图4A)。在用1/iM的WKYMVm处理前，将两种细胞与载体或100ng/ml的PTX(24小时)、50jaM的LY29麵(15分钟)、5pM的GFX(15分钟)、10pMBAPTA/AM(60分钟)或50pMPD98059(60分钟)预醉育(图4B)。用10pM的WKYMVm和本发明的肽分别刺激表达FPR和FPRL1的RBL2H3细胞2分钟或5分钟(图4C)。4W^样品(30jag蛋白)进行10%SDS-PAGE并且用抗磷酸-Akt抗体通过免疫印迹分析确定磷酸化的Akt。用抗Akt抗体进行蛋白印迹分析以确定这些实验中使用了相同量的样品。结果显示于图4A至4C中。图4A至4C的结果代表3次独立的实验。WKYMVm刺'激在表达FPR和FPRL1的RBL-2H3细胞中显示了以时间依赖的方式诱导的Akt磷酸化(图4A)。WKYMVm诱导的Akt磷酸化对PTX和LY294002敏感而对GFX和BAPTA/AM不敏感，表明是PTXj感的G蛋白和MEK依赖的(图4B)。不仅WK丽m而且本发明的肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WK丽m(SEQIDNO:11)、WK丽E(SEQIDN0:16)和WK丽R(SEQIDN0:18))对表达FPR的RBL-2H3细胞的刺激引起了Akt的磷酸化(图4C)。WKYMVm和本发明的肽也刺激表达FPRL1的RBL-2H3细胞中Akt的磷酸化(图4C)。这些结果与所述lb叶两种类型的细胞中ERK的磷酸化是一致的(图3C)。由于WKYMVm诱导的ERK和Akt激活是由PI3K激活介导的，看起来(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WK丽m(SEQIDNO:11)、WK丽E(SEQIDNO:16)和M丽R(SEQIDNO:18))似乎可以成功诱导位于FPR下游的PI3K^h导的信号传导。实施例7:肽对胞吐作用的影响颗粒分泌^J巴大细胞的最重要的功能之一(20)。如上所述，通过测定P-己糖胺酶分泌检测了WKYMVm对颗粒分泌的影响(18)。简言之，在24孔组织培养板中过夜培养表达FPR或FPRL1的RBL-2H3细胞(2xlo7孔)。用Tyrode緩冲液(137mMNaCl、12mMNaHC03、5.6mM葡萄糖、2.7mMKC1、lmMCaCl2、0.5mMMgCi2、0.4mMM2P0"0.lg/100mlBSA和25mMHEPES,pH7.4)洗涤所述细胞两次并且用每种肽刺激所述细胞。用多种浓度WKYMVm处理表达FPR或FPRL1的RBL-2H3细胞(图5A)。在不存在或存在10nMBAPTA/AM时将1mM的WKYMVm用于刺激两个细胞系(图5B)。在刺激后20分钟通过将所述培养板置于水上终止所述反应。通过将50ji1的上层清液或细胞裂解液与25p1含5mM对硝基苯-N-乙酰-P-D-葡萄糖酰胺(p-nitrophenyl-N-acety卜P-D-glucosamide)的0.1M;f檬酸钠緩冲液(pH3.8)在37X:孵育2小时确定分泌到培养基中的p-己糖胺酶。在孵育结束时加入50p1的0.4MNa2C03。监测405nm的吸光度。结果显示于图5A和5B中。数据是三个重复进行三次的实验的一个代表的平均值土S.E.。数值(平均值±S.E.)#^示为细胞中存在的总p-己糖胺酶的百分数。用多种浓度的WKYMVm刺激表达FPR或FPRL1的RBL-2H3细胞引起以浓度^S的方式释放P-己糖胺酶(图5A)。用100nM或10nM的!1激表达FPR或FPRL1的RBL-2H3细胞分别显示最大活性(图5A)。现已报道了细胞内钙升高对于RBL-2H3等肥大细胞中的颗粒分泌是至关重要的(18，20)。也已经证明在所述肽刺激前的BAPTA/AM处理对胞内钓的螯合几乎完全抑制了WKYMVm诱导的颗粒分泌(图5B)。肽诱导而不能被它们中的某些肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKRMVm(SEQIDNO:11)、D-Me取代肽)诱导)，检测了这些肽对RBL细胞中颗粒分泌的影响。用10pM的每种肽处理表达FPR(图6A)或FPRL1的RBL-2H3细胞(图6B)。如上文所述地测定肽诱导的p-己糖胺酶的分泌。数据是三个各进行三次的实验的一个4化的平均值±S.E.。当用肽(WK丽m、WKGMVm(SEQIDNO:1)、WK薩m(SEQIDNO:11)、WK丽E(SEQIDNO:16)、WK丽R(SEQIDNO:18))刺激FPR细胞的时候，除WKGMVm-:lM义肽、WK丽m-^l代肽和D-Met6-取代肽"卜的一些取代肽使得出现了颗粒的分泌(图6A)。WKGMVm(SEQIDNO:1)、WK丽m(SEQIDNO:11)、D-Me取代肽不影响表达FPR的RBL-2H3细胞的颗粒分泌(图6A)。这些结果与前文的结果即WKGMVm(SEQIDNO:1)、WK丽m(SEQIDNO:11)、D-Met6取代肽不能诱导细胞内钙释放完全一致(图1A)。与表达FPR的RBL-2H3细胞不同，除fMLF和wkymvm之夕卜的所有肽(WK丽m、WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKRMVm(SEQIDNO:11)、WKYMVE(SEQIDNO:16)、WK丽R(SEQIDNO:18))刺激表达FPRLl的RBL-2H3细胞的颗粒分泌(图6B)。这也与前文的结果即所述肽刺激表达FPRLl的RBL-2H3细胞中细胞内钙的升高完全一致(图IB)。实施例8:^细胞^^匕性的影响使用多孔小室测定法(改良的Boyden小室测定法)(NeuroprobeInc.,Gaithersburg，MD)进行趋化性测定(18)。简言之，将聚碳酸酯滤器(孔径为8pm)用50ng/ml的大鼠I型^f、(CollaborativeBiomedicals)的HEPES緩冲的RPMI1640培养基预包被。将干的包被好的滤器安置于包含不同浓度肽的96孔小室上。以无血清RPMI中1x1(f细胞/ml的浓度将表达FPR或FPRLl的RBL-2H3细胞悬浮于RPMI中，并且将25p1的悬浮'胁到96孑L趋化性小室的上层孔中。在37t:孵育4小时后，将未移行的细胞刮除，将移行通过所述滤器的细胞脱水、固定并用苏^J晴(Sigma,St.Louis,MO)染色。然后随M择该孔的5个高倍视野(HPF)(400x)计数染色的细胞。图7A显示所i^^化性测定的结果。用1WKYMVm对载体、50jiM的LY294002(15分钟)和50jiM的PD98059(60分钟)预处理的细胞进行趋化性测定，结果显示于图7B中。通过在高倍视野(400x)中计数确定移行细胞的数目。数据表示为三个独立实^r各进行三次的平均值±SE。现已报道了WKYMVm可以诱导吞谨细胞例如单核细胞和嗜中性粒细胞的趋化移动(11)。Le等证明了WKYMVm诱导的细胞趋化性是通过与FPR和FPRLl的结合(12)。与预期一致，WKYMVm在表达FPR或FPRLl的RBL-2H3细胞中显示了钟形浓度依赖的趋化移动的活性(图7A)。所述WKYMVm诱导的细M化对LY294002和PD98059是敏感的(图7B)。这些结果i兑明WKYMVmi秀导的细胞趋化是PI3K依赖的和MEK依赖的。WKYMVm通过PI3K活性和MEK活性刺激表达FPR或FPRLl的RBL-2H3细胞的趋化移动。本发明的肽对表达FPR或FPRLl的RBL-2H3细胞的细胞趋化的影响被测定。每种肽都以多种浓度用于测定表达FPR或FPRLl的RBL-2H3细胞的趋化分析。通过在高倍视野(400x)中计数确定移行细胞的数目。数据表示为2个独立实验各进行三次的平均值±SE。在表达FPR的RBL-2H3细胞中，不仅WKYMVm而且还有所述取代肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WK丽m(SEQIDNO:11)、WK丽E(SEQIDNO:16)和WK丽R(SEQIDNO:18))诱导了细絲化(图8A)。诱导趋化所需的所述取代肽的浓度高于所需的WKYMVm的浓度(图8B)。在参与取代肽诱导的趋化信号传导途径上，PI-3激酶和MEK介导的信号传导的参与情况被测试。当将表达FPR的RBL细胞用LY294002或PD98059预处理的时候，WKYMVm和所述取代肽诱导的RBL细胞移动几乎完全被抑制(图7B，数据未显示)。在表达FPRL1的RBL-2H3细胞中，WKYMVm和所述肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKRMVm(SEQIDNO:11)、WK丽E(SEQIDNO:16)和WKYMVR(SEQIDNO:18))也诱导了浓度絲的细胞趋化(图8B)。在本发明中首次证明了不同配体对FPR调节会导致不同的细胞信号传导和机能。为了证明FPR的配体特异性调节，制备了在表l中列出的多种肽，有效的FPR配体。在所述肽中，WKGMVm-(SEQIDNO:1)、WKRMVm-(SEQIDNO:11)和D-Me取代肽与FPR结合仅诱导PI-3激#导的Akt激活和MEK介导的ERK激活，从而产生所述细胞的趋化移动。这些肽不影响细胞内钓升高。由于肽WKYMVm不仅刺激ERK激活而且刺激细胞内钙升高从而导致趋化和脱颗粒，这说明FPR可以被不同配体进行不同的调节。最近的几项报道已经证明某些GPCR可以被不同配体调节(21，22)。在GPCR的配体特异性调节的过程中，已经表明不同配体可诱导受体的不同构象变化并且诱导所述受体与某些效应分子或G蛋白选择性偶联。在表m和图1A中，已经证明WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKRMVm(SEQIDNO:ll)和D~Met6取代肽不能刺激表达FPR的RBL-2H3细胞中PLC介导的细胞内钙升高。然而，这些肽能够刺激表达FPR的RBL-2H3细胞中ERK和Akt的磷酸化(图3C)。在WKYMVm和本发明的肽介导的细胞信号传导中，通过PLC-p激活的PI水解可诱导细胞内钙升高，而MEK和PI3激酶的激活分别介导了ERK和Akt的磷酸化。由于已经清楚这些结果，显然肽配体与FPR的结合似乎可诱导FPR的构象变化，并且所述构象变化似乎可提供受体与G蛋白介导的PLC-P或G蛋白介导的PI-3激酶的偶联。由于不能诱导细胞内钙升高的某些本发明的肽(WKGMVm(SEQIDNO:1)、WKRMVm(SEQIDNO:11)和D-Me1;6取代肽)可以通过PI-3激SI^赖的途径刺激ERK磷酸化，因此所述肽似乎可与FPR结合并且诱导PI-3激酶和MEK介导的信号传导的激活所需要的构象变化，从而产生RBL-2H3细胞的趋化移动。现已报道了甲酰肽受体家族的两个不同受体FPR和FPRL1在先M^A应中发挥重要的功能(l，2)。迄今为止，已经报道了包括甲酰肽脂氧素A4在内的多种不同的配体源可与FPR或FPRL1结合(l)。Le等报道了WKYMVm可以与FPR和FPRL1结合(12)。在本发明中，发明人证明用其他M酸取代Ty一或D-Me消除了FPR的PLC介导的细胞内钙升高活性，而不消除FPRL1的PLC^^导的细胞内钩升高活性(图1)。这个结a明Ty和D-Me^对于通过FPR的PLC激活是至关重要的，而对于通过FPRL1的PLC激活不是至关重要的。M个结果可以推论出FPR和FPRL1的配体结合位点是不同的。包括FPR在内的GPCR通过与异源三聚体的G蛋白结合可诱导胞内信号传导，并且许多研究组已经试图揭示参与G蛋白偶联的受体的关键性4J^酸戎基(23,24)。对于FPR，Miettinen等构建了35种突变FPR并且检测了突变对FPR的G蛋白偶联和细胞信号传导的影响。才艮据所^JL献，S63、D71、R123和C124/C126对于G蛋白与FPR偶^bl重要的(24)。在所述突变体中，不能介导钙运动的R123A突变体可以诱导通过fMLF的ERK磷酸化(24)。也定非活性形式的所述受体的1键网络(24)。在所述推断中，配体与受体^:引起所述氢键网络的改变，并且某些^J^酸^例如DRY基序中的精氨酸4皮暴露而能与G蛋白相互作用(24)。已经发现WKGMVm等某些肽能够谦导ERK磷酸化而不能诱导钩运动。确定WKYMVm或WKGMVm(SEQIDNO:l)与FPR的结合是否诱导所述受体的不同构象变化将是重要的；即虽然WKYMVm可以诱导FPR的构象变化包括所述DRY基序的氩键合的改变，但是WKGMVm(SEQIDNO:l)仅引起所述受体的不同的构象变化而不影响DRY氬键合。对于FPRL1的情况，它虽然也包含DRY基序(FPRL1中的DRC)，但它在G蛋白偶联中的功能还没有被检测到。在这些结果中，不仅WKYMVm而JL^有WKGMVm(SEQIDN0:1)可诱导表达FPRL1的RBL细胞中的钓运动(图IB)。这些结果表明WKYMVm或WKGMVm(SEQIDNO:1)不影响FPR或FPRL1中DRY基序的氬键合。其他的结合口袋(bindingpocket)将参与所述肽的结合，并且作为下一步工作鉴定参与WKYMVm或WKGMVm(SEQIDNO:l)与FPR不同结合模式的g将是重要的。迄今为止，尚无报道说某些天然配体可以不同地调节FPR。在免疫系统中对脱颗粒或趋化移动进行不同的调节将是更精细调节所需要的。按照这种观点，本发明中对差异性调节FPR的配体的鉴定是重要的。实施例9:WRYMVm在注射CT26的小鼠中抑制肿瘤生长为了评估免疫调节肽Trp-Arg-Tyr-Met-Val-D-Met-C0NH2(WRYMVm;(SEQIDN0:4))的抗肿瘤效果，在Balb/c小鼠才莫型中测试了CT26结肠癌。A^接种肿瘤细胞后的第6天开始每两天测定肿瘤块的大小。如图9A和9B所示，给予2jig/小鼠的WRYMVm在第22天时成功地抑制了肿瘤块的生长(PBS对照的50%)。给予100pg/小鼠的CpG寡，氧核苷酸(ODN)被测试用于比较，但是所述CpGODN处理组对肿瘤生长没有显示出任何的效果。这个结M明免疫调节肽WRYMVm对于CT26肿瘤的抑制有显著效果。实施例10:WRYMVm在注射EL4的小鼠中抑制肿瘤生长为了确认WRYMVm的抗肿瘤效果，测试了另外一种肿瘤模型EL4淋巴细胞。将EL4(2x105细胞/小鼠)经皮下注射至C57/BL6小鼠以形成EL4的肿瘤块。如图10A和10B所示，WRYMVm能够抑制EL4的肿瘤块。这个结果与用CT26的实验一致。总之，WRYMVm在小鼠模型中很明显具有抑制肿瘤生长的效果。实施例ll:低剂量的WRYMVm在CT26模型中最有效为了揭示WRYMVm的有效肿瘤抑制剂量，将0.1jag/小鼠、0.25pg/小鼠和llig/小鼠的WR丽m给予CT26/Balb/c模型。如图11A和11B所示，0.1lig/小鼠的处理组显示了最高的肿瘤抑制效力。值得注意的是，lnig/小鼠的剂量对肿瘤的抑制效杲有所降低。这个结果强烈M明WRYMVm是通过十分敏感的机制实现抗肿瘤功能的，而所述机制在高浓度时是不敏感的。在白细胞的趋化移动中很容易出现类似的现象。考虑到WRYMVm的靶受体FPRL1与趋化移动事件相关的事实，可得出结论WRYMVm诱导的抗肿瘤效应可能源自于白细胞浸润事件。因此，十分有必要揭示所述WRYMVm诱导的抗肿瘤效应和所述白细胞浸润事件之间的直接关系。实施例12:WRYMVm与长春新碱增强抗肿瘤效果的组合"^为了增强WRYMVm的抗肿瘤效果，进行了一项与抗癌药物长^^新碱的组合试验。长春新碱可破坏^#管稳态并且可导致细胞死亡。通过使用^新碱可以为免疫系统提供肿瘤特异性抗原。因此，在注射所述肽之前8小时对每只小鼠腹腔注射2jLig的长春新碱。仅^4新碱的处理组显示出与WRYMVm处理组类似的肺瘤生长抑制才莫式(图12A)。如预期一致，WRYMVm和M新碱的組合处理显示了最有效的抗肿瘤活性。所i^ia合试验显示比仅WRYMVm处理组或仅长春新碱处理组提高15%。存活率也出现了相似的结果(图12B)。虽然所述组合试验与单处理组相比没有出现显著提高，但是三个组合试验组、WRYMVm处理组和长春新碱处理组仍然具有抑制肿瘤生长的能力，而PBS对照和CpGODN不能阻止死亡。综合以上结果可以得出结论调节免疫功能的合成肽WRYMVm具有抗肺瘤活性。所述WR丽m能够明显地抑制肿瘤生长。另夕卜，WRYMV迈在与长^^f碱的组合试验中的功能更强，表明WRYMVm可以与其他试剂一块用于癌治疗。再者，本发明首次发明了一种短肽衍生的抗癌效应，它可调节免疫细胞。参考文献1.Le，Y.，Li'B.,Gong,W.，Shen,W.,Hu'丄，Duntop,N.M.,Oppenheim,丄丄'andWang,丄M.(2000)ImmunolRev,177,185-194.2.Le，Y.,Oppenheim，丄丄，andWang,丄M.(2001)CytokineGrowthFactorRev.12,91-1O丄3.White,丄R.，Lee，丄M.,Young,P.R.,Hertzberg,R.P.,Jurewicz，A.丄，Chaikin,M.A.,WWdowson,K.'Foley,丄丄，Martin.,D.,Grlswold，D.E.'andSarau,H.M.(1998)丄Biol.Chem.273,10095-10098.4.Zagorski，丄，andWahl,S.M.(1997)丄Immunol.159，1059-1062.5.Prossnitz,E.R"andY&rR.D.(1997)Pharmacol,Ther.74,73-102.6.Su,S-B.,Gong,W.H.,Gao,丄L,Sherr,W.P.,Grimm,M-C.，Deng,X.,Murphy,P.M.,Oppenhe，m，丄丄，andWang,丄M.(1999)Blood93'3885-3892.7.Walther,A.，R'旧hemann，K.,andGerke，V.(2000)Wlol.Cell.5，8.Baek,S.H.，Seo，丄Chae,C.B.,Suh,P.G.，aridRyu，S.H.(1996)丄Biol.Chem.271,8170-8175.9.Seo'丄K.,Choi,S.Y.，Kim，Y"B$ek,S.H.,Kim'K.T.,Chae,C,B.,Lambeth,丄D.，Suh,P.G.,andRyu，S.H.(1997)丄Immunol.158,1895-1901.10.Bae,Y.S.，Ju,S.A.,Kim,丄Y.，Seo，丄K.,Baek，S.H,，Kwak,丄Y.，Kim,B.S.,Suh，P.G.,andRyu，S.H,(1999)丄Leukoc.Biol.65,241-248.11.Bae,Y.S.,Kim，Y.,Kim，Y.'Kim,丄H,，Suh，P.G.，andRyu，S.H.(1999)丄Leukoc.Biol.66，915"922.12丄e'Y"Gong，W.，Li,B.，Dunlop，N.M.,Shen，W"Su,S.B.,Ye,R.D.,andWang,丄M.(1999)丄Immunol,163，6777-6784.13.He,R.,Tan,L.,Browning,D.D.'Wang,丄M.，andYe,R.D.(2000)丄Immunol.165，4598-4605.14.Bae,Y.S.,Bae,H.,Kim,Y.,Lee,T.G,,Suh'P.G"邻dRyu,S.H.(2001》Blood97,2854"2862.15.Grynkiewicz，G.，Poenie，M.，andTsien,R.Y.(1986)丄Biol.Chem.260，3440-3450.化.Hu,丄Y.,Le,Y.,Gong，W.,Dunlop，N,M.,Gao，丄L"Murphy,P.M.,andWang，丄M.(2001)丄Leukoc.Biol.70,155~1561.17.King,丄，andLaemmlf,U.K.(1971)丄Mol.Biol.62，化Haribatrti,B.，Zhelev，D.V.，Pridgen,B,C.,Richardson,R.M.rAli,H.，andSnyderman，R.(1999)丄Biol,Chem.274，37087^37092.19.Franke,T,F.,Yang,S.l.，Chan,T.O.,Datta,K.，Kazlauskas,A.,Morrison,D-K.,Kaplan,D.R"andTsichlis,P.N.(1995)Cell.81,727-736.20.Jin,X.,Sh印herd，R.K.,Duling,B.R.,andLinden,丄(1997)丄Clin.Invest.100,2849-2857.21-Thomas,G.，Qian,H.,Chang,C.S.，andKamik，S.(2000)丄Biol.Chfem.275,2893-2900.22.Palanche，T.'llien,B.，Zoffmann,S.,Re汰，M.P.,Bucher，B.，Edelstein，S,丄，'andGalzi，J.L(2001)丄Biol.Chem.276，34853-34861.23.Prossnitz^E.R"Quehenberger,O.,Cochrane,C.G.,andYe,R.D.(1993)Biochem.丄294，581-587.24.Miettinen，H.M，，Grip節什og,丄M.,Mason,M.M.,andJesaitis,A.丄(1999)JBiol.Ch柳.274,27934>27942.权利要求1.一种抗癌剂，所述抗癌剂包含具有选自于SEQIDNO4、SEQIDNO11及其组合的氨基酸序列的肽。2.权利要求2的抗癌剂，所述抗癌剂用于抑制结肠癌。3.权利要^2的抗癌剂，所述抗癌剂用于抑制起源于胰、乳房、肺、脑、前列腺、鳞状细胞或淋巴样细胞的癌。4.一种在需要它的患者中抑制癌细胞增殖或者增加癌细胞凋亡的方法，所述方法包括给予需要它的患者有效量的选自于SEQIDNO:4、SEQIDN0:11及其组合的氨基酸序列或其类似物，以在所述患者中抑制癌细胞增殖或者增加癌细胞的凋亡。5.权利要求4的方法，其中给予所述需要它的患者有效量的选自于SEQIDNO:4、SEQIDNO:11及其组合的氨基酸序列。6.权利要求4的方法，其中给予所述需要它的患者有效量的选自于SEQIDNO:4、SEQIDNO:11及其组合的氨基酸序列的类似物。7.权利要求4的方法，其中所述增殖被抑制或凋亡被增加的癌细胞是结肠癌细胞。8.权利要求4的方法，其中所述增殖被抑制或者凋亡被增加的癌细胞选自起源于胰、乳房、肺、脑、前列腺、鳞状细胞或淋巴样细胞的癌细胞。9.一种用于抑制癌细胞增殖或者增加癌细胞凋亡的药物组合物，所述药物组合物包含选自于SEQIDN0:4、SEQIDNO:11及其组合的氨基酸序列或其类似物，以及可药用的载体、稀释剂或赋形剂。10.权利要求9的药物组合物，所述药物組合物用于抑制结肠癌。11.权利要求9的药物组合物，所述药物组合物用于抑制起源于胰、乳房、肺、脑、前列腺、鳞状细胞或淋巴样细胞的癌。全文摘要根据本发明的实施方案的抗癌剂提供了具有选自于SEQIDNO4、SEQIDNO11及其组合的氨基酸序列的肽。所述抗癌剂用于抑制起源于结肠、胰、乳房、肺、脑、前列腺、鳞状细胞或淋巴样细胞的癌。文档编号A61K38/08GK101370510SQ200680052746公开日2009年2月18日申请日期2006年12月26日优先权日2005年12月23日发明者宋芝英,徐判吉,柳成浩,裴外植申请人:Posco公司;学校法人浦项工科大学校