专利名称：：卵内接种用疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明涉及卵内接种用家禽疫苗。具体而言，涉及卵内接种用家禽疫苗，其特征在于使活病毒吸附、保持在病毒吸附剂上。
背景技术：
：在世界上，为了预防来自各种病原体的感染或发病而对饲养的商业用家禽接种疫苗。作为使家禽产生疾病的一般病毒可以列举例如马立克氏病病毒、禽痘病毒、传染性腔上嚢病病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸡贫血病毒、禽流感病毒、禽呼肠孤病毒、禽白血病病毒、网状内皮组织增生症病毒、禽腺病毒、禽肺病毒和鴒痘病毒等。上述疾病对家禽产业影响甚大。现在对上述多种疾病使用疫苗。疫苗通常分为活疫苗和灭活疫苗。活疫苗通常是指使用通过人为操作减毒的减毒抹或自然减毒抹的疫苗，而灭活疫苗是指通过物理、化学处理消除了病毒感染性的疫苗。活疫苗由于还能够通过自然感染途径进行给药，因此在早期可以期待局部免疫效果，体液免疫和细胞免疫均成立，通常免疫持续期间长。相对于此，接种灭活疫苗主要是成立体液免疫，但由于免疫成立通常慢、免疫持续时间短，因此为了延长免疫持续期间而往往添加佐剂。在活疫苗的使用中，由于受到母源性抗体的影响，通常也考虑母源性抗体的分散而进行多次接种。另外，母源性抗体的水平因种卵的导入位置而多种多样，因此必需#4居各母源性抗体来建立适合的疫苗接种程序。虽然在各个疫苗中存在具各种致病性的菌抹，这些菌株要根据野外污染状况和母源性抗体水平来选择。根据上述各种情况来设计最佳疫苗接种程序需要相当丰富的知识和经验，所以通常并不容易。如上所述，各种疾病对家禽产业影响甚大。例如，家禽类在通过疫苗接种获得适当的保护性免疫之前受到野外致病性菌株的感染时，往往无法得到充分的疫苗效果。因此，开发作为预防疾病发生的解决方法之一的尽量在早期确实获得免疫的方法是当务之急。在上述状况下，Sharma等人报道了卵内接种法(专利文献l)，公开了通过在卵内接种马立克氏病(MD)活疫苗，与以往的孵化后接种疫苗相比能够获得早期免疫(非专利文献l)。卵内接种用疫苗的特征可以列举出可期待早期免疫；与孵化后施行的疫苗接种作业相比省力；可以实现接种的机械化、自动化；能够更均匀地进行确实接种和减轻对雏鸡的应激等。性腔上嚢病(IBD)活疫苗两种，其他一直在孵化后使用的多种疫苗尚未作为卵内接种用疫苗实际应用。其原因在于多种鸡用活疫苗中使用的病毒是在鸡胚胎初代细胞或发育鸡卵内培养的，因此若进行卵内接种，则会对胚胎产生致命影响。传染性支气管炎(IB)病毒、新城疫病(ND)病毒等疫苗抹也一样，为了将这些病毒用作卵内接种用，必需采取某种方法来降低其对胚胎的致病性。目前，作为卵内接种用疫苗，尚无商业上可获取的适当的ND活疫苗或IB活疫苗。作为卵内接种用ND活疫苗，有人公开了使用用于产生对晚期胚胎无致病性的HitchnerB1株的ND病毒突变林的化学突变诱发剂(专利文献2)和使用低水平表达V蛋白质的ND病毒突变株(专利文献3)。但是，将上述突变林用作疫苗时，还不能完全否定其有可能对家禽和摄入该家禽的人体带来不良影响。因此还尚未广泛普及，预料对其进行评价将需要非常长的时间。专利文献l:美国专利第4458630号^H艮专利文献2:美国专利第542779l号公报专利文献3:日本特开2001-069970号公报非专利文献l:Sharma,J.M.等，AvianDiseases,26(1),第134-149页，198
发明内容发明所要解决的课题如上所述，目前普及的卯内接种用活疫苗仅有MD疫苗和IBD疫苗两种。孵化后使用的多种现有疫苗由于疫苗病毒本身对胚胎显示致病性，因为卵内接种引起孵化率下降和孵化后临床症状加重，安全性存在问题，因此尚未作为卵内接种用疫苗实际应用。因此，为了卵内接种用，必需通过谋求病毒本身减毒等某种方法来降低病毒对胚胎的致病性，然而这很困难。但是，如果能够开发对MD和IBD以外的疾病也可进行卵内接种的疫苗，则对各种疾病的病因病毒都能广泛地获得保护性免疫，从而可期待对家禽产业的卫生对策作出大的贡献。解决课题的方法
技术领域：
：本发明人等鉴于上述状况进行了深入研究，结果发现通过使活病毒吸附、保持在病毒吸附剂上，在卵内接种后的发育鸡卵内病毒增殖变得緩慢，其结果，可降低病毒对胚胎的致病性，而且即使在活病毒吸附、保持在病毒吸附剂上的状态下也能够有效引起保护性免疫，从而完成了本发明。因此，本发明提供如下所示的卵内接种用家禽疫苗。1)卵内接种用家禽疫苗，其中含有活病毒作为抗原，该疫苗的特征在于含有病毒吸附剂。2)上述疫苗，其中上述病毒吸附剂选自铝化合物、羟基磷灰石或硅胶中的任一种。3)上述疫苗，其中上述铝化合物选自氬氧化铝、磷酸铝、氯化4吕、石岸酸三4内氯4b4吕(trisodiumphosphatealuminumchloride)和4甲明石凡。4)上述疫苗，其中上述活病毒为选自马立克氏病病毒、禽痘病新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸡贫血病毒、禽流感病毒、禽呼肠孤病毒、禽白血病病毒、网状内皮组织增生症病毒、禽腺病毒、禽肺病毒和鴒痘病毒中的至少一种。5)上述疫苗，其中上述家禽类选自小鸡、火鸡、珍珠鸡、鹌鹁、鸵鸟和鹆子。6)家禽的免疫方法，该方法包括对家禽卵内仅给予产生免疫的有效量的上述1)5)中任一项的疫苗。7)上述方法，该方法是在胚胎孵育期间的最后的四半期中给予上述疫苗。8)卵内接种用家禽疫苗的制造方法，该方法包括将活病毒溶液和病毒吸附剂混合，搅拌所得混合液使该活病毒吸附、保持在该病毒吸附剂上。9)上述方法，其中上述病毒吸附剂选自铝化合物、羟基磷灰石或硅胶中的任一种。10)上述方法，其中上述铝化合物选自氢氧化铝、磷酸铝、氯化铝、磷酸三钠氯化铝和钾明石凡。.11)上述方法，其中上述活病毒为选自马立克氏病病毒、禽痘病毒、传染性腔上嚢病病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸡贫血病毒、禽流感病毒、禽呼肠孤病毒、禽白血病病毒、网状内皮组织增生症病毒、禽腺病毒、禽肺病毒和鴒痘病毒中的至少一种。12)上述方法，其中上述家禽类选自小鸡、火鸡、珍珠鸡、鹌鹁、鸵鸟和鸽子。13)病毒吸附剂在含有活病毒作为抗原的卵内接种用家禽疫苗中的应用。14)上述应用，其中上述病毒吸附剂选自铝化合物、羟基磷灰石或硅胶中的任一种。15)上述应用，其中上述铝化合物选自氢氧化铝、磷酸铝、氯化铝、^粦酸三钠氯化铝和钾明石凡。16)上述应用，其中上述活病毒为选自马立克氏病病毒、禽痘病毒、传染性腔上嚢病病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸡贫血病毒、禽流感病毒、禽呼肠《瓜病毒、禽白血病病毒、网状内皮组织增生症病毒、禽&泉病毒、禽肺病毒和鴒痘病毒中的至少一种。17)上述应用，其中上述家禽类选自小鸡、火鸡、珍珠鸡、鹌鹁、鸵鸟和鴒子。发明效果根据本发明，通过在疫苗中使用病毒吸附剂，即使是以迄今为止作为卵内接种用疫苗因接种后孵化率下降和孵化后临床症状加重等安全性问题而无法使用的ND病毒、IB病毒等疫苗抹为代表的对发育鸡卵具有致死性的致病性的多种病毒也可以安全且有效地用作卵内接种用疫苗。实施发明的最佳方式本发明中使用的病毒吸附剂只要具有通过物理或化学作用吸附、保持病毒的性质即可，可以是任何物质。优选例有胶态(在某介质中呈lnm~l/mi范围的微粒分散状态)铝化合物。该铝化合物的例子有氢氧化铝、磷酸铝、氯化铝、磷酸三钠氯化铝和钾明矾等，均可以利用常规方法进行制作并使用(柚木弘之，佐剂和病毒，动生协会会报，22(6),1~6,1989)。本发明中使用的活病毒的例子有马立克氏病病毒、禽痘病毒、传染性腔上嚢病病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸡贫血病毒、禽流感病毒、禽呼肠孤病毒、禽白血病病毒、网状内皮组织增生症病毒、禽腺病毒、禽肺病毒和鴒痘病毒等预防家禽疾病时通常使用的活疫苗病毒。上述病毒可以单独使用，或者将两种以上混合使用。上述活病毒可以按照该
技术领域：
中公知的常规方法进行制造(国立预防卫生研究所学友会编，病毒实验学总论，丸善株式会社，1964)。简单说明如下将病毒接种在敏感基质(sensitivesubstrate)中，使其增殖至复制了所需病毒量，之后回收含有病毒的物质即可。作为敏感基质，可以使用包括发育鸡卵、初代鸡胚胎细胞培养(例如鸡胚胎成纤维细胞(CEF)或鸡肾细胞(CK))或哺乳类细胞系(例如VERO细胞系、仓鼠肺(HmLu-l)细胞系或乳仓鼠肾(BHK)细胞系)在内的可进行病毒复制的各种基质。本发明的卯内接种用疫苗可以使用病毒吸附剂，按照用于制造疫苗的该
技术领域：
中公知的常规方法来制造(参照DerekT.O，Hagan等编，VaccineAdjuvants,HumanaPress,2002)。例如可以采用4寻病毒和事先制备的病毒吸附剂混合的方法、在病毒液中制作病毒吸附剂的方法等来制造。本发明的卵内接种用疫苗可以按照常规方法(参照上述专利文献l)接种在卵内。疫苗的卯内接种包括在卵内所含的胚胎中接种疫苗。通常在胚胎形成的后期，一般是在孵育的最后的四半期(1521日龄的发育鸡卵)中接种疫苗，但_优选接种在18~19日龄的发育鸡卵中。本发明的卵内接种用疫苗可适用于小鸡，但对其他家禽例如火鸡、珍珠鸡、鹌鹑、鸵鸟、鹆子等也可以有效地进行接种。本发明的卵内接种用疫苗还可以和其他灭活疫苗混合使用。混合方法可以是将本发明的卵内接种用活疫苗和灭活疫苗事先混合，也可以是将分别制造的本发明的卵内接种用活疫苗和灭活疫苗在用时混合。以下，给出实施例来具体说明本发明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。实施例《实施例1:添加了病毒吸附剂的卯内接种用ND疫苗的制作》制作分别添加了钾明矾、氢氧化铝凝胶、羟基磷灰石和硅胶作为病毒吸附剂的卵内接种用新城疫病(ND)疫苗。按照常规方法使用生理盐水制备钾明矾和氢氧化铝凝胶，使铝含量为2mg/ml，使用生理盐水制备羟基磷灰石为200mg/ml。将各IOml的钾明矾、氢氧化铝凝胶和羟基磷灰石溶液分别与10ml用生理盐水制备为10"EIDso/ml的ND病毒减毒林D26抹病毒液混合，在4。C下用搅拌器搅拌过夜。另外，将lg粉末状硅胶和lml用生理盐水制备为10"EID5o/ml的ND病毒减毒林D26抹病毒液混合，添加生理盐水至总量20ml，在4。C下用搅拌器搅拌过夜。混合后，为了确认病毒吸附在各病毒吸附剂上，将制作的疫苗以2500rpm的转速离心5分钟，^使用来源于除去了特定病原体(无特定病原(SpecificPathogenFree),以下记作"SPF，，))的鸡的11日龄发育鸡卵测定上清液中残留的病毒量。其结果，确认在所有病毒吸附剂中病毒的吸附都足够充分。其中，在病毒吸附剂中使用钾明矾和羟基磷灰石时，病毒量在检测限以下(表l)。由以上结果评价各种病毒吸附剂均可用于本发明。组病毒吸附剂吸附前的病毒量(EID50/20ml)吸附后离心上清液中的病毒量(EID50/20ml)1钾明矾1063<10182氢氧化铝凝月交10631。2.23羟基磷灰石1063<10184硅胶106.31028《实施例2:添加了病毒吸附剂的卵内接种用ND疫苗在SPF卵中的安全性》使用按照实施例1中记载的方法制作的添加了钾明矾和氩氧化铝凝胶的卵内接种用ND疫苗，按照Sharma等人(参照上述非专利文献l)报道的方法，按O.lml/个对SPF18日龄发育鸡卵进行卵内接种(1组和2组)。设定未添加病毒吸附剂而仅为病毒的试验组作为对照(3组)。其结果，如表2所示，添加了病毒吸附剂的卵内接种用ND疫苗组与未添加组相比，孵化率存在显著差别(利用Fisher的直接概率计算法抬r验与未添加组的显著差别)。并且，添加了病毒吸附剂的卵内接种用ND疫苗组与未添加组相比，孵化后第2周的存活率也存在显著差别(表3)。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*:PO.05,**:PO.01《实施例3:添加了病毒吸附剂的卵内接种用ND疫苗在SPF卵中的有效性》为了评价实施例2中供试的试验组的有效性，在孵化后第3周采取血清，使用ND病毒红细胞凝集素(财团法人化学及血清疗法研究所)按照附加的使用说明书的记载，实施红细胞凝集反应抑制试验(HI试验)。已知一般以5倍以上的HI抗体效价可以防御ND病毒强毒抹佐藤抹的攻击，因此添加了病毒吸附剂的卵内接种用ND疫苗组的HI抗体效价充分高于防御水平(表4)。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>":括弧内显示抗体阳性率(％)。5倍以上时为阳性。《实施例4:添加了病毒吸附剂的卵内接种用IB和FP疫苗的制作》使用钾明矾作为病毒吸附剂，制作卵内接种用传染性支气管炎(IB)和鸡痘(FP)疫苗。钾明矾按照常规方法使用生理盐水来制备，使铝含量为2mg/ml。将IOml钾明矾液和10ml用生理盐水制备的105'8EID50/ml的IB病毒TM-86w抹病毒液或用生理盐水制备的10"TCIDs。/ml的来源于鴒痘(PP)病毒中野抹的KIII抹病毒液混合，在4。C下用搅拌器搅拌过夜。混合后，为了确认病毒吸附在各病毒吸附剂上，将制作的疫苗以2500rpm的转速离心5分钟，使用来源于SPF鸡的ll日龄发育鸡卵测定上清液中残留的病毒量。其结果，确认IB和PP病毒均充分吸附(表5)。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>《实施例5:添加了病毒吸附剂的卵内接种用IB疫苗在SPF卵中的安全性》使用按照实施例4中记载的方法制作的添加了钾明矾的卵内接种用IB疫苗，按照Sharma等人报道的方法按O.lml/个对SPF18日龄发育鸡卵进行卵内接种(l组)。设定未添加病毒吸附剂而仅为病毒的试验组作为对照(2组)。其结果，如表6所示，添加了病毒吸附剂的卵内接种用IB疫苗组与未添加组相比，孵化率存在显著差别(利用Fisher的直接概率计算法检验与未添加组的显著差别)。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>性》使用按照实施例4中记载的方法制作的添加了钾明矾的卵内接种用FP疫苗，按照Sharma等人报道的方法按O.lml/个对SPF18日龄发育鸡卯进行卵内接种(l组)。设定未添加病毒吸附剂而仅为病毒的试验组作为对照(2组)。其结果，如表8所示，添加了病毒吸附剂的卵内接种用FP疫苗组与未添加组相比，孵化率存在显著差别(利用Fisher的直接概率计算法检验与未添加组的显著差别)。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>**:PO.01《实施例8:添加了病毒吸附剂的卵内接种用FP疫苗在SPF卯中的有效性》为了评价实施例7中供试的试验组的有效性，孵化后第3周采取血清，测定荧光抗体(FA)效价。另外，孵化后第3周在拔掉大腿部的羽毛后按每只104QTCID5。/0.1ml滴加FP病毒Nishigahara抹，用牙刷进行涂擦。接种后观察临床症状3周，确认是否有起痘、痂皮和溃疡。其结果，添加了病毒吸附剂的卵内接种用FP疫苗组与未添加组相比，FA阳性率和对FP病毒强毒株攻击的防御率均良好(表9)。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>FA效价为20倍以上时为阳性。产业实用性本发明的卵内接种用家禽疫苗由于使用病毒吸附剂来吸附、保持活病毒，故卯内接种后的发育鸡卵内病毒增殖变得緩慢，其结果，可以降低病毒对胚胎的致病性，而且还不会引起卵内接种的孵化率下降和孵化后临床症状的加重，安全性高。并且，本发明的卵内接种用家禽疫苗包含作为抗原的活疫苗，因此对以该病毒为原因的疾病的防御效果也和通常的活疫苗一样优异。因此，本发明的卯内接种用家禽疫苗不限于目前普及的MD疫苗和IBD疫苗等特定活疫苗，还可以使用所有的天然活病毒来制造疫苗，因此对各种广泛的疾病的致死性致病病毒都能够获得广泛的保护性免疫。因此，可以期待对家禽产业的卫生对策作出大的贡献。权利要求1.卵内接种用家禽疫苗，其中含有活病毒作为抗原，该疫苗的特征在于:含有病毒吸附剂。2.权利要求l的疫苗，其中上述病毒吸附剂选自铝化合物、羟基磷灰石或硅胶中的任一种。3.权利要求2的疫苗，其中上述铝化合物选自氢氧化铝、磷酸铝、氯化铝、磷酸三钠氯化铝和钾明矾。4.权利要求13中任一项的疫苗，其中上述活病毒为选自马立克氏病病毒、禽痘病毒、传染性腔上嚢病病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸡贫血病毒、禽流感病毒、禽呼肠孤病毒、禽白血病病毒、网状内皮组织增生症病毒、禽腺病毒、禽肺病毒和鴒痘病毒中的至少一种。5.权利要求14中任一项的疫苗，其中上述家禽类选自小鸡、火鸡、珍珠鸡、鹌鹁、鸵鸟和鴒子。6.家禽的免疫方法，该方法包括对家禽卵内仅给予产生免疫的有效量的权利要求15中任一项的疫苗。7.权利要求6的方法，该方法是在胚胎孵育期间的最后的四半期中给予上述疫苗。8.卵内接种用家禽疫苗的制造方法，该方法包括将活病毒溶液和病毒吸附剂混合，搅拌所得混合液使该活病毒吸附、保持在该病毒吸附剂上。9.权利要求8的方法，其中上述病毒吸附剂选自铝化合物、羟基磷灰石或硅胶中的任一种。10.权利要求9的方法，其中上述铝化合物选自氢氧化铝、磷酸铝、氯化铝、石粦酸三钠氯化铝和钾明石凡。11.权利要求810中任一项的方法，其中上述活病毒为选自马立克氏病病毒、禽痘病毒、传染性腔上嚢病病毒、新Jt成疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸡贫血病毒、禽流感病毒、禽呼肠孤病毒、禽白血病病毒、网状内皮组织增生症病毒、禽腺病毒、禽肺病毒和鴒痘病毒中的至少一种。12.权利要求811中任一项的方法，其中上述家禽类选自小鸡、火鸡、珍珠鸡、鹌鹁、鸵鸟和鴒子。13.病毒吸附剂在含有活病毒作为抗原的卵内接种用家禽疫苗中的应用。14.权利要求13的应用，其中上述病毒吸附剂选自铝化合物、羟基磷灰石或硅胶中的任一种。15.权利要求14的应用，其中上述铝化合物选自氢氧化铝、磷酸铝、氯化铝、磷酸三钠氯化铝和钾明矾。16.权利要求1315中任一项的应用，其中上述活病毒为选自马立克氏病病毒、禽痘病毒、传染性腔上嚢病病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸡贫血病毒、禽流感病毒、禽呼肠孤病毒、禽白血病病毒、网状内皮组织增生症病毒、禽腺病毒、禽肺病毒和鴒痘病毒中的至少一种。17.权利要求1316中任一项的应用，其中上述家禽类选自小鸡、火鸡、珍珠鸡、鹌鹁、鸵鸟和鴒子。全文摘要本发明的目的在于提供对预防所有家禽类病毒性疾病都有效的卵内接种用疫苗。该卵内接种用家禽疫苗是通过病毒吸附剂将迄今为止作为卵内接种用疫苗难以实用化的病毒吸附、保持，使接种后的卵内病毒增殖变得缓慢，可以降低病毒对胚胎的致病性、改善孵化率下降和减轻孵化后临床症状的加重，从安全性方面考虑有效性也高。使用氢氧化铝凝胶、钾明矾等铝化合物作为病毒吸附剂。文档编号A61K39/00GK101374547SQ20068005298公开日2009年2月25日申请日期2006年12月21日优先权日2005年12月22日发明者太田秀幸,山崎宪一,江副伸介,河合透申请人:财团法人化学及血清疗法研究所