专利名称：原儿茶酸在促进神经干细胞体外增殖及诱导分化方面的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞生物学和药理学技术领域，涉及一种中药单体化合物的用 途，特别涉及原儿茶酸在促进神经干细胞体外增殖及诱导分化方面的新用途。
背景技术：
益智(Alpinia oxyphylla MIQUEL)为姜科山姜属(Alpinia Roxb.)植物， 自古以来就是中医临床上的常用药材，有温脾止泻，摄唾涎，固精縮尿的功效。 现代研究表明，益智中含有特殊的化学成分和显著的生物活性，具有强心、抗 癌、抗过敏及神经保护等广泛的药理活性。发明人通过建立的体外神经细胞损 伤模型，首次从中药益智中筛选并证明了原儿茶酸是益智中的主要神经活性成 分(An LJ et al" Food Chem Toxicol, 2006, 44 (3): 436-443.)。原儿茶酸，即3，4-二羟基苯甲酸，化学结构式如下-
其制备过程为益智仁粉碎成适当大小颗粒，95%乙醇室温浸渍24小时，布氏 漏斗过滤，滤渣重复提取三次。合并滤液，减压蒸馏浓縮至浸膏，加水分散后 用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，收集各部分，减压蒸干后，乙酸乙酯组 分采用100 140目硅胶柱层析，干法上样，氯仿-甲醇梯度洗脱，薄层层析(TLC) 检测收集相同馏分。取氯仿-甲醇为50:1的馏分重新溶解于甲醇中，用0.45pm 的滤膜过滤后进行SephadexLH-20凝胶层析，甲醇洗脱。重结晶后即得原儿茶 酸。
原儿茶酸是天然存在于许多蔬菜和果实中的一种酚酸类物质，也是除益智 以外其它很多中药(如四季青、丹参、芙蓉等)的有效活性成分。早期的研究 已经证明，原儿茶酸具有抗血小板凝集、降低心肌耗氧量、抑菌、镇痛等多方 面药理活性，是一种重要的天然活性物质。近年来的研究发现了原儿茶酸许多 新的药理作用。如Ueda等的研究发现原儿茶酸具有显著的抗氧化作用，其抗氧 化能力是a-生育酚的10倍以上(Ueda et al.， Arch Biochem Biophys, 1996, 333 (2): 377-384.)。 Tseng小组从中药芙蓉中分离得到了原儿茶酸，证明了原儿茶酸抗氧 化及抗肿瘤作用，并且初步探讨了原儿茶酸的作用机制(Tseng THetal.,Chem Biol Interact, 1996, 101 (2): 137-148; Tseng TH et al.， Cancer Lett, 1998， 126 (2): 199-207; Tseng TH et al.， Biochem Pharmacol, 2000， 60 (3): 307-315,)。更多的研究 表明，原儿茶酸可作为许多化学致癌物的有效抑制剂，例如二乙基亚硝基胺所 致的肝癌(TanakaTet al.， Cancer Res， 1993， 53 (12): 2775-2779.)、 4-硝基喹啉-1-氧化物导致的口腔癌(Tanaka T et al.， Cancer Res， 1994, 54 (9): 2359-2365.)、 azoxymethane所致的结肠癌(Kawamori T et al.， Jpn J Cancer Res, 1994, 85 (7): 686-691.)、 N-甲基-N-亚硝基脲所致的胃癌(Tanaka T et al.， Cancer, 1995, 75 (6 Suppl): 1433-1439.)、N-丁基-N-(4-羟基丁基)亚硝胺导致的膀胱癌(HiroseYeta1.， Carcinogenesis, 1995， 16 (10): 2337-2342.)等等。这些数据提示了原儿茶酸有可 能成为一种天然的抗癌保护剂。到目前为止，有关原儿茶酸神经活性的研究报 道较少。本研究对益智中原儿茶酸的神经保护活性进行了大量研究，结果发现 原儿茶酸对氧化应激损伤的PC12细胞具有明显的抗氧化及抗凋亡的保护作用。
原儿茶酸能够保护质膜的完整性，提高细胞内谷胱甘肽的含量，增强超氧化物 歧化酶和过氧化氢酶的活性，从而保持细胞内的抗氧化防御体系处于正常的水
平(GuanSetal.,EurJPharmaco1，2006, 538(1-3): 73-79.);而且原儿茶酸能够抑 制细胞凋亡，调节线粒体的通透性，阻止膜电位的丧失，抑制活性氧的产生， 激发内源性抗氧化机制及拮抗caspase-3的激活和上调Bcl-2蛋白的表达，从而 保持线粒体功能的完整性(Guan et al.， Food Chem Toxicol, 2006， 44 (10): 1659-1666.)。
然而迄今未见国内外对原儿茶酸在促进神经干细胞体外增殖及诱导分化方 面的研究报道。
发明内容
本发明公开了原儿茶酸的一种新用途，是发现原儿茶酸具有显著促进体外 培养的神经干细胞增殖的作用，使其持续保持增殖状态，并在适宜条件下能分 化为有功能的神经元，用于神经干细胞移植治疗神经退行性疾病和神经再生及 功能重建的神经营养素和细胞分化剂。
本发明的一个目的是利用原儿茶酸能诱导神经干细胞体外定向分化获得的 有功能的神经元，用于构建高效率的药物筛选模型，并利用该模型进行药物药 效的初步筛选与评价。
本发明的技术方案包括以下内容
(1)神经干细胞的体外分离培养及鉴定
选用胚胎14天(E14d)小鼠引颈处死，无菌操作取出胚胎中脑组织，制成 分离细胞悬液。在无血清DMEM/F12培养基中采用悬浮培养方式培养，培养液 中添加EGF和bFGF。 7~10天后将原代培养所形成的"神经干细胞球"分离，
进行传代培养。取第二代细胞培养7 10天后进行鉴定。采用免疫细胞化学方法
鉴定神经干细胞Nestin染色检测神经干细胞、GFAP染色检测星形胶质细胞、 TuJl染色检测神经元、GalC染色检测少突胶质细胞以及BrdU染色标记增殖的 细胞。
(2) 原儿茶酸对体外培养的神经干细胞的促增殖作用
将原儿茶酸直接作用于原代或传代的神经干细胞，实验分为五组对照组、
6X10—6mol/L原儿茶酸组、6Xl(T5mol/L原儿茶酸组、6X l(T4mol/L原儿茶酸组 及1.2X l(T3m0l/L原儿茶酸组。于体外分别培养4天和7天后显微镜下观察，在 添加原儿茶酸条件下培养的神经干细胞球明显增多，经统计分析，当原儿茶酸 的浓度超过6Xl(T5mol/L以上时，神经球的形成数目明显高于对照组。CCK-8 结果也显示，原儿茶酸组的细胞存活率均明显高于对照组。
(3) 原儿茶酸诱导体外培养的神经干细胞分化为有功能的神经元 实验采用以下两种条件培养的神经球正常培养组(无任何处理的神经球)、
原儿茶酸增殖组(经原儿茶酸处理后的神经球)。将不同条件下培养的神经干细 胞球分别在分化培养基(DMEM/F12+10。/。胎牛血清)中吹打成单细胞悬液，接 种于多聚左旋赖氨酸处理过圆玻片的24孔板内，24小时后可见细胞均贴壁生长， 添加原儿茶酸处理后，继续培养7天，用免疫细胞化学方法检测神经元的特异 性标记物、星型胶质细胞的特异性标记物和少突胶质细胞的特异性标记物的表 达，并计数分化为神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞的百分率。结果显示， 添加原儿茶酸的神经干细胞分化后形成的神经元生长状态良好，神经元的数目 多于对照组。而且对于已由原儿茶酸处理后增殖的神经球而言，其分化为有功 能的神经元的比例明显高于正常培养的神经球。表明经原儿茶酸处理后增殖的 神经干细胞的分化能力并没有受到明显的影响，而且更有利于向神经元方向分 化。
本发明的效果和益处是在细胞层面上对原儿茶酸的药效进行了严格论证， 对其中蕴含的大量生物学信息进行了深入探讨，优点显著
① 本发明开拓了原儿茶酸的新用途，即原儿茶酸具有显著促神经干细胞增 殖的作用，使其持续保持增殖状态，并在适宜条件下能分化为有功能的神经元。
② 原儿茶酸可用于神经千细胞移植治疗神经退行性疾病和神经再生及功能 重建的神经营养素和细胞分化剂。干细胞移植治疗神经退行性疾病目前正处于 实验研究阶段，原儿茶酸的研究将有助于该领域的深入发展。
③ 本发明采用一种中药单体成分来诱导神经干细胞的增殖及定向分化为有 功能的神经元，替代受损伤的细胞或死亡的细胞，为中药的防治作用提供物质 基础，另一方面药效机制的阐明为中药现代化开发拥有自主知识产权的新药提 供借鉴。
④ 本发明利用原儿茶酸能诱导神经干细胞体外定向分化获得的有功能的神 经元，用于构建高效率的药物筛选模型，可为治疗神经退行性疾病的新药开发 提供检测平台。
图1是本发明所述的原儿茶酸体外培养的"神经球"增殖的影响，为原代 培养的第二代神经干细胞培养4天后的显微照片图。图中A对照组；B 6X 10—Smol/L原儿茶酸组。
图2是本发明所述的原儿茶酸对体外培养的神经干细胞生存能力的影响， 为原儿茶酸促进神经干细胞增殖的量效图。图中横坐标轴的数字表示各实验组 (其中0，对照组；1， 6Xl(^mol/L原儿茶酸组;2， 6X 10—5mol/L原儿茶酸组; 3， 6X10"mol/L原儿茶酸组;4， 1.2X l(T3mol/L原儿茶酸组)，纵坐标轴表示神 经干细胞的细胞增殖百分率(*P<0.05，表示同对照组之间的显著性差异)。
具体实施例方式
以下结合技术方案和附图详细说明本发明的具体实施例。 实施例1体外神经干细胞的分离培养和鉴定
a)中脑来源的神经干细胞的分离与培养
取E14d小鼠引颈处死，无菌操作取出胚胎，分离胚胎中脑组织，消化成单 细胞后，台盼蓝计数，以2Xl()S个/mL接种于T25培养瓶中37°C、 5%<:02悬 浮培养，干细胞培养基为DMEM/F12 (1:1)、 2%B27、 bFGF (10ng/mL)、 E:GF (20ng/mL)。每3~4天半量换液，培养一周后观察生长的悬浮细胞球的数目及 大小。收集神经球机械吹打成单细胞悬液后，置于同样条件下继续培养，视生 长情况决定是否传代。
(2) 细胞亚克隆的连续传代及诱导分化
用巴斯德细管从培养瓶中取出单个较大的神经干细胞球(直径约为150pm 左右)，机械吹打成单细胞悬液，接种于干细胞培养基中，观察细胞生长情况及 神经干细胞球的数目。七天后，再用巴斯德吸管从培养瓶中取出单个较大的干 细胞球在分化培养基中(DMEM/F12+10。/。胎牛血清)轻柔机械吹打，尽可能分 散神经球，并接种于多聚左旋赖氨酸处理过圆玻片的24孔板内，继续培养7天， 3 4天半量换液。
(3) 神经干细胞的鉴定
原代培养的神经干细胞球，经传代后接种在底部涂有多聚赖氨酸的35mm 的培养皿中，培养3天后，用4%的多聚甲醛(以0.1MPBS制备，pH7.2 7.4) 固定30min， 0.01MPBS冲洗3次后，进行神经干细胞标记物Nestin和BrdU抗 体免疫细胞化学染色。
实验结果在原代培养神经干细胞7~9天后，可获得大量大小不 、呈悬
浮生长的克隆球。原代单个的克隆球机械分离后进行传代培养，可形成新的细
胞克隆(亚克隆)。这些克隆球经Nestin和BrdU抗体鉴定呈阳型染色，表明它 们是神经干细胞，具有分裂增殖能力。
实施例2原儿茶酸对神经干细胞的促增殖作用
(1) 实验设计及药物处理
实验分为五组，分别为对照组、6Xl(rVol/L原儿茶酸组、6Xl(TSmol/L原 儿茶酸组、6X10"mol/L原儿茶酸组及1.2X10—Smol/L原儿茶酸组。将原代培养 的第二代神经干细胞收集，以2X 1()S个/mL的浓度接种于24孔板，每孔500pL， 每组处理设6个复孔，分别培养4天和7天后观察神经球的数目及细胞的存活 率。
(2) 神经干细胞增殖的检测方法
① 神经球计数法原代培养的第二代神经干细胞分别在不同浓度的原儿茶
酸作用下培养4天和7天后，双盲法计数神经球的形成个数，在10X20荧光显 微镜下每孔随机计数10个视野，每组6孔，计算其平均值。组间比较用非配对 Student's T-test。
② CCK-8法细胞的增殖率采用CCK-8比色法检测。对照组为正常对照和 空白对照(正常对照为不加药物组，空白对照为与实验孔平行的不含细胞外其 它条件相同的对照孔)。CCK-8比色法基本原理为该试剂中含有WST-8 [其 化学名称为2- (2-甲氧基-4-硝基苯基)-3- (4-硝基苯基)-5- (2，4-二磺酸苯)-2H-四 唑单钠盐]，它在电子载体l-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯的作用下被细胞线粒 体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臢染料。生成的甲臢物的数量与 活细胞的数量成正比，在酶标仪上进行比色，所检测OD值的大小可反映细胞 代谢活性的强弱。检测时每孔加50nLCCK-8(终浓度约为0.5mg/mL)于5%C02，
37。C培养3小时，用酶标仪测定450nm，参考波长为630nm的OD值，计算细
胞的增殖率。
细胞的增殖率=(OD 加药孔- OD 加药孔空白 )/ COD 对照孔一 OD 对照孔空白
实验结果神经干细胞在原儿茶酸作用下培养4天和7天后，显微镜下观 察，与对照相比，神经球的数量明显增多。经统计分析，原儿茶酸在6X10—5 1.2 X10—3mOl/L的浓度范围内，可明显促进神经球的增殖。6X10'5mol/L的原儿茶 酸作用4天后，增殖的神经球数目为正常对照的2.9倍(如图1)，同样细胞的 生存能力也得到了显著提高，细胞的增殖率达到了对照的140.32±9.17% (如图 2)。
实施例3原儿茶酸诱导神经干细胞分化为有功能的神经元的能力
(1) 原儿茶酸对神经干细胞的诱导分化
将原代培养的第二代神经干细胞球，和经6Xl(T5mol/L的原儿茶酸作用7 天后的神经干细胞球收集，分别在分化培养基(DMEM/F12+10。/。胎牛血清)中 吹打成单细胞悬液，以2X 1()S个/ml的浓度接种于多聚左旋赖氨酸处理过玻片的 24孔板内，每孔500pL，每组处理设六个复孔。24小时后可见细胞均贴壁生长， 添加不同浓度原儿茶酸(6X1(T5、 6X10'4、 1.2X10-3mol/L)处理后，将培养板 置于饱和湿度，5%C02、 37'C培养箱继续培养7天。
(2) 免疫荧光细胞化学染色
培养结束后，取出24孔培养板各孔中的盖玻片。用4%的多聚甲醛(以 O.IMPBS制备，pH7.2 7.4)固定30min， 0.01M PBS冲洗3次后，各组进行免 疫荧光细胞化学染色，检测神经元的特异性标记物(TuJl)、星型胶质细胞的特 异性标记物(GFAP)和少突胶质细胞的特异性标记物(GalC)的表达。
(3) 细胞计数
在10X20荧光显微镜下，对免疫荧光细胞化学染色TuJl阳性的细胞进行 计数(以0.25mm2区域作为计数单位面积)。每组有6个培养神经千细胞的盖玻 片，每个盖玻片上随机选取4个计数单位面积，计数细胞总数和染色阳性细胞 数及染色阳性细胞的百分率。同样方法计数GFAP和GalC染色阳性细胞数及染 色阳性细胞的百分率。
实验结果原儿茶酸能有效促进神经干细胞分化为有功能的神经元。添加 原儿茶酸的神经干细胞分化后形成的神经元生长状态良好，不同浓度的原儿茶 酸实验组，神经干细胞分化为神经元的百分率都高于对照组(P<0.05)，但不同 浓度的原儿茶酸实验组之间没有显著差异。而且对于己由原儿茶酸处理后增殖 的神经球而言，其分化为有功能的神经元的比例明显高于正常培养的神经球。 表明经原儿茶酸处理后增殖的神经干细胞的分化能力并没有受到明显的影响， 而且更有利于向神经元方向分化。
尽管本发明是以原儿茶酸在促进神经干细胞体外增殖及诱导分化方面的用 途为例来描述的，但这种描述并不意味着对本发明构成限制。参照本发明的描 述，其它种类的细胞以及实施例的其它变形，对于本领域技术人员都是可以预 料的。因此，这样的变形不会脱离所属权利要求限定的范围及精神。
权利要求
1.一种原儿茶酸在促进神经干细胞体外增殖及诱导分化方面的用途，是将原儿茶酸作用体外培养的神经干细胞，诱导其增殖并分化为有功能的神经元，其特征在于制备神经干细胞移植治疗神经退行性疾病药物中的应用；制备修复损伤神经组织及功能重建的神经营养素和细胞分化剂中的应用；制备修复损伤神经组织及功能重建的神经营养素和细胞分化剂中的应用；构建高效率的药物筛选模型，并利用该模型进行药物药效的初步筛选与评价中应用。
2. 根据权利要求1所述的一种原儿茶酸在促进神经干细胞体外增殖及诱导 分化方面的用途，其特征在于体外培养神经干细胞应用的原儿茶酸浓度为6Xl(T5 1.2Xl(T3mol/L。
全文摘要
本发明属于细胞生物学和药理学技术领域，涉及一种中药单体化合物的用途，特别涉及原儿茶酸在促进神经干细胞体外增殖及诱导分化方面的新用途。其特征在于制备神经干细胞移植治疗神经退行性疾病药物中的应用；制备修复损伤神经组织及功能重建的神经营养素和细胞分化剂中的应用；构建高效率的药物筛选模型，并利用该模型进行药物药效的初步筛选与评价中的应用。本发明确定了原儿茶酸的新的药理活性，为中药的防治作用提供物质基础，同时也为开发拥有自主知识产权的新药提供借鉴。
文档编号A61P25/00GK101104845SQ200710011030
公开日2008年1月16日 申请日期2007年4月16日 优先权日2007年4月16日
发明者水 关, 刘天庆, 崔占峰, 李香琴, 马学虎 申请人:大连理工大学