专利名称：淡色库蚊细胞色素p450(cyp6f1)基因的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及一种来自于淡色库蚊溴氰菊酯抗性的细胞色素P450(CYP6F1)基因。
背景技术：
及
发明内容
细胞色素P450单加氧酶是昆虫体内参与各类杀虫剂以及其它外援性和内源性化合物化代谢的主要解毒酶系。细胞色素P450(简称CYP)是细胞色素P450单加氧酶系的末端氧化酶，起着与底物结合以及从NADPH传递电子到NADPH细胞色素P450还原酶的重要作用。细胞色素P450功能多样，特别是能够代谢目前广泛使用的杀虫剂如拟虫菊酯类、氨基甲酸酯类等，其与昆虫抗药性形成机制的研究成为当前研究的热点。近些年来，随着分子生物学及其技术的发展，克隆昆虫P450基因、研究其系统进化以及与抗药性的关系越来越引起重视。昆虫细胞色素P450与诸多杀虫剂，尤其目前广泛使用的拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性密切相关。目前，在众多已知的昆虫细胞色素P450家族中，被认为与菊酯类杀虫剂抗性关系最为密切的主要为CYP6家族基因。
本发明所述的淡色库蚊细胞色素P450(CYP6F1)基因是发明人在山东省寄生虫病防治研究所医学昆虫学研究室应用兼并引物，以淡色库蚊溴氰聚酯抗性品系提取的RNA为模板，降落RT-PCR技术克隆扩增，并采用快速末端扩增法克隆获得。序列经拼接获得淡色库蚊细胞色素P450(CYP6F1)基因cDNA全长，为1639bp；其开放阅读框为1527bp，编码508个氨基酸。在NCBI网站上用BLAST完成序列同源性分析，表明其为新基因。经半定量RT-PCR和实时定量PCR证实，该基因在淡色库蚊溴氰聚酯抗性品系中高表达。因此，推测淡色库蚊细胞色素P450(CYP6F1)基因可能与淡色库纹溴氰聚酯抗性有关。
由于淡色库蚊细胞色素P450(CYP6F1)基因在GenBank中为新基因，本发明人对该基因的结构和功能研究成果均为开创性的。美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)已正式接收该基因为GenBank的新成员，接收号为AY662654。
淡色库蚊细胞色素P450(CYP6F1)基因序列1639bp1 cttatgtttg cgtggataat ctgcgctgcg gcagcagttc cgctggtgta cttcctgatc61 gtgtaccagt tcagctactg gaaacgtcgt gggatcacac aactcactcc atcattccca121 tttggagatc ttggaccgtt ctttcggcaa cggtccagcc tcggagtggt ctacgccgat181 gtgtaccggc tgtgcaagcg cctacccttt gtggggatct acttttcctt gcggccaatg241 ctggtggtca acgaccccga gttgattaaa aatgtgcttg tgcgtgattt tgaccacttt301 cacgatcgtg gactgtacgt gaacgaggag aaggacccac tcagtgggca tttgtttgca361 ctcggtggcg aacagtggcg ccatcatcgg tccaagctaa cgccaacgtt cacctcggga421 aggttgaagg agatgttcac gaacttggtc caaattgggc gtgttctcca agatcacgtg481 gcgaaacgtg ctggggagga catcgaaatt cgggacgtga tggcgcggta cactaccgat541 atcattgcat cggttggatt cggaatcgaa aatgactcca tcaacgaaaa gggcaacatt601 ttcagggaaa tgggaacgaa ggtgttctct cctgatctta agacgatact tcgattgacg661 agcacatttt tcactccaaa gctgaacgca ctgtttggat tcaaatttat cgcacaggag721 attgaagact tcatcatgaa cgttgtacgt gaaaccctgg agtacagaga aagcaacaaa781 gtcgtccgga aggatatgat gcagctgctc atgcagctac gtaactccgg aacggtttcg841 atcgacgatc gatgggacat cgaagtgtca accaacaaga aaaagctgtc cctggaacaa901 gtcacagcac acgcgttcgt attcttcata gcagcatacg aaacatcatc gaccaccatt961 tcgttctgct tgttcgaact ggcacgcaat ccggagattc aaaagaaagt gcaacaagaa1021 attgaccaag ttctcgcaag ccacaacggc gaaatcacct acgacaacat caacgaaatg1081 aaatacctcg aaaactgcat cgacgaaacg ctccgaaagt atccggcagt tccgttcctg1141 aaccgtgagt gttctaagga ttacaaaatc cccggaacag acaccaccat cgagaaagga1201 acatcgttag tcattccagt cctcggacta caccgcgatc ccgatcacta cccggaaccg1261 gacaggttca ttccggaacg gttcagcaac tttgaagata tttccaccaa accgtatctt1321 ccgtttgggg caggacctcg caactgtatt ggactgagat tgggcaagct gcaaacaaag1381 gcgggactgg tgatgatgct gtccaagttt aacgtgcggc ttgctgatga aacttacgcc1441 agcaaagagc tagcgctcga tgcgcgaagt gtggttctaa tgccggttgg aggtattaag1501 gtgtcgattt cggaacggag ggcttcgtaa tacaaattga agtgactcgt aatataatac1561 ttaaatatca caataaatga taccaaaata aactatttaa tgaacaaaaa aaaaaaaggt1621 ccggtacctc tagatcaga 1639
淡色库蚊细胞色素P450(CYP6F1)氨基酸序列508aaMFAWIICAAAAVPLVYFLIVYQFSYWKRRGITQLTPSFPFGDLGPFFRQRSSLGVVYADVYRLCKRLPFVGIYFSLRPMLVVNDPELIKNVLVRDFDHFHDRGLYVNEEKDPLSGHLFALGGEQWRHHRSKLTPTFTSGRLKEMFTNLVQIGRVLQDHVAKRAGEDIEIRDVMARYTTDIIASVGFGIENDSINEKGNIFREMGTKVFSPDLKTILRLTSTFFTPKLNALFGFKFIAQEIEDFIMNVVRETLEYRESNKVVRKDMMQLLMQLRNSGTVSIDDRWDIEVSTNKKKLSLEQVTAHAFVFFIAAYETSSTTISFCLFELARNPEIQKKVQQEIDQVLASHNGEITYDNINEMKYLENCIDETLRKYPAVPFLNRECSKDYKIPGTDTTIEKGTSLVIPVLGLHRDPDHYPEPDRFIPERFSNFEDISTKPYLPFGAGPRNCIGLRLGKLQTKAGLVMMLSKFNVRLADETYASKELALDARSVVLMPVGGIKVSISERRAS淡色库蚊细胞色素P450(CYP6F1)基因是本发明人发现的全新基因，目前人类对于此基因的认识和了解仅限于本发明人所做的研究工作。由于该基因在淡色库蚊溴氰聚酯抗性品系中高表达，因此该基因很可能与淡色库蚊溴氰聚酯抗性发生密切有关，其表达量的上调可能引起抗药性。该基因可用于1、通过制备该基因的融合蛋白，研究该基因与抗药性的关系，为昆虫抗药性的治理提供新的思路。
2、制备特异性抗体，用于现场蚊虫抗药性的监测。目前，现场蚊虫抗药性的监测尚无行之有效的方法，可用该基因表达蛋白制备特异性抗体，然后制成检测试剂盒，可大大简化操作步骤，经济简便、省时省力。
具体实施例方式淡色库蚊细胞色素P450(CYP6F1)基因片断的克隆淡色库蚊敏感品系引自中国科学院上海昆虫研究所，并在本室经传60余代；抗性品系由本室逐代用溴氰菊酯汰选而成，抗性系数617。蚊虫饲养在28℃，相对湿度为70％-80％的室内，14h光照时间，并用小白鼠饲喂产卵传代。
根据GenBank登录的昆虫CYP6家族的已知基因序列，包括果蝇、冈比亚按蚊、埃及伊蚊、致倦库蚊等CYP6基因，设计兼并引物。以淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系蚊虫所提的总RNA为模板，用两步法RT-PCR克隆扩增，第一链的合成后，用降落PCR克隆扩增基因序列。PCR结果经1％琼脂糖凝胶电泳，120V，30min后，用QIAquick Gel Extraction Kit割胶纯化。纯化产物加A尾，将之插入pGEM-T easy载体，进行蓝白斑筛选，挑取培养板上的白斑，于含有抗生素Amp+的LB液体培养基中，220rpm，37℃培养过夜。以菌液为模板，用通用引物及特异性引物PCR方法初步鉴定，阳性克隆提取质粒进行测序。
1、RACE法获得淡色库蚊细胞色素P450(CYP6F1)基因根据测序获得的基因序列，利用Primer premier软件设计3’RACE和5’RACE引物用于扩增3’和5’端序列。
3’RACE引物5’-TGACCAAGTTCTCGCAAGCC-3’5’RACE引物5’-AGTATCCGGCAGTTCCGTTCC-3’以淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系蚊虫所提的总RNA为模板，用两步法RT-PCR克隆扩增，第一链的合成后，用降落PCR克隆扩增基因序列。PCR结果经电泳鉴定、割胶纯化后加A尾后，插入pGEM-T easy载体进行蓝白斑筛选，阳性克隆提取质粒进行测序。将3’RACE和5’RACE获得的序列和RT-PCR获得的序列进行拼接，得到基因全长cDNA序列。根据基因全长设计扩增基因全长引物，以总RNA为模板RT-PCR，扩增出1700bp的条带，和预期的目的条带(1639bp)大小相符，说明目的基因拼接正确。淡色库蚊细胞色素P450(CYP6F1)基因全长序列(GenBank/NCBI AY662654)，总长度为1639bp；开放阅读框为1527bp，推导的蛋白质编码508个氨基酸。
2、半定量PCR和实时定量PCR(Real time PCR)鉴定细胞色素P450(CYP6F1基因在溴氰菊酯抗性品系和敏感品系的表达差异(1)半定量PCR测定蚊抗性、敏感品系CYP6F1的表达分别取30mg淡色库蚊对溴氰菊酯抗性、敏感品系蚊虫虫，提取总RNA。电泳鉴定、定量测定后，稀释至相同浓度(0.5μg/μl)，RT-PCR预实验确定PCR指数扩增的循环数为25个循环。各取5μl扩增PCR产物，以1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，用凝胶成像系统拍照，并用Gel-Pro Analyzer软件定量分析，每次PCR反应均以β-actin作为对照，通过目的基因和管家基因β-actin电泳条带的光吸收灰度比值来衡量目的基因的表达强度。结果显示，敏感品系的CYP6F1/β-actin灰度比值1.0；抗性品系的CYP6F1/β-actin灰度比值为1.6，提示抗性品系的CYP6F1基因的表达高于敏感品系。
(2)实时定量PCR测定蚊虫抗性、敏感品系CYP6F1的表达根据扩增的基因全长设计实时定量PCR的引物
CYP6F1上游引物5’-GGCGAAATCACCTACGACAAC-3’下游引物5’-TCCGAGGACTGGAATGACTAAC-3’β-actin作为内参照基因，引物如下β-actin上游引物5’-AGCGTGAACTGACGGCTCTTG-3’下游引物5’-ACTCGTCGTACTCCTGCTTGG-3’制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板针对需要测量的目的基因和管家基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。PCR产物2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。将PCR产物进行10倍梯度稀释，设定PCR产物浓度为1，分别稀释为1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6梯度浓度的DNA，每一浓度取1μl作为模板进行荧光定量扩增。以模板拷贝数的对数为横坐标，测得各自的Ct值为纵坐标作图，即得标准曲线。
实时定量PCR反应几个梯度稀释的DNA模板以及所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。PCR反应液置于实时定量PCR仪上进行PCR反应。PCR反应条件为50℃、2min，95℃、10min，然后再进行40个循环的95℃、15s，60℃、1min。
根据梯度稀释DNA分别进行目的基因和管家基因定量PCR反应，得出各自的Ct值，再以Ct值为纵坐标，拷贝数的对数为横坐标，算得标准曲线为y＝-3.666x+6.216，R2＝0.99976，表明反应体系状态良好，具有可重复性。样品目的基因和管家基因的浓度结果直接由机器生成。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。经计算获知抗性品系细胞色素P450(CYP6F1)表达是敏感品系的1.93倍，提示抗性品系的CYP6F1基因的表达高于敏感品系，即CYP6F1基因在溴氰菊酯抗性品系蚊虫中表达增加。
尽管从原核生物到真核生物，全球科学家已就多种物种的细胞色素P450(CYP6F1)基因进行了研究，但这是首次获得的在淡色库蚊溴氰菊酯抗性品系高表达的细胞色素P450(CYP6F1)基因，这对进一步研究昆虫抗药性机制及其治理具有重要意义。
序列表淡色库蚊细胞色素P450(CYP6F1)基因序列1639bp1 cttatgtttg cgtggataat ctgcgctgcg gcagcagttc cgctggtgta cttcctgatc61 gtgtaccagt tcagctactg gaaacgtcgt gggatcacac aactcactcc atcattccca121 tttggagatc ttggaccgtt ctttcggcaa cggtccagcc tcggagtggt ctacgccgat181 gtgtaccggc tgtgcaagcg cctacccttt gtggggatct acttttcctt gcggccaatg241 ctggtggtca acgaccccga gttgattaaa aatgtgcttg tgcgtgattt tgaccacttt301 cacgatcgtg gactgtacgt gaacgaggag aaggacccac tcagtgggca tttgtttgca361 ctcggtggcg aacagtggcg ccatcatcgg tccaagctaa cgccaacgtt cacctcggga421 aggttgaagg agatgttcac gaacttggtc caaattgggc gtgttctcca agatcacgtg481 gcgaaacgtg ctggggagga catcgaaatt cgggacgtga tggcgcggta cactaccgat541 atcattgcat cggttggatt cggaatcgaa aatgactcca tcaacgaaaa gggcaacatt601 ttcagggaaa tgggaacgaa ggtgttctct cctgatctta agacgatact tcgattgacg661 agcacatttt tcactccaaa gctgaacgca ctgtttggat tcaaatttat cgcacaggag721 attgaagact tcatcatgaa cgttgtacgt gaaaccctgg agtacagaga aagcaacaaa781 gtcgtccgga aggatatgat gcagctgctc atgcagctac gtaactccgg aacggtttcg841 atcgacgatc gatgggacat cgaagtgtca accaacaaga aaaagctgtc cctggaacaa901 gtcacagcac acgcgttcgt attcttcata gcagcatacg aaacatcatc gaccaccatt961 tcgttctgct tgttcgaact ggcacgcaat ccggagattc aaaagaaagt gcaacaagaa1021 attgaccaag ttctcgcaag ccacaacggc gaaatcacct acgacaacat caacgaaatg1081 aaatacctcg aaaactgcat cgacgaaacg ctccgaaagt atccggcagt tccgttcctg1141 aaccgtgagt gttctaagga ttacaaaatc cccggaacag acaccaccat cgagaaagga1201 acatcgttag tcattccagt cctcggacta caccgcgatc ccgatcacta cccggaaccg1261 gacaggttca ttccggaacg gttcagcaac tttgaagata tttccaccaa accgtatctt1321 ccgtttgggg caggacctcg caactgtatt ggactgagat tgggcaagct gcaaacaaag1381 gcgggactgg tgatgatgct gtccaagttt aacgtgcggc ttgctgatga aacttacgcc1441 agcaaagagc tagcgctcga tgcgcgaagt gtggttctaa tgccggttgg aggtattaag1501 gtgtcgattt cggaacggag ggcttcgtaa tacaaattga agtgactcgt aatataatac1561 ttaaatatca caataaatga taccaaaata aactatttaa tgaacaaaaa aaaaaaaggt1621 ccggtacctc tagatcaga 1639
淡色库蚊细胞色素P450(CYP6F1)氨基酸序列508aaMFAWIICAAAAVPLVYFLIVYQFSYWKRRGITQLTPSFPFGDLGPFFRQRSSLGVVYADVYRLCKRLPFVGIYFSLRPMLVVNDPELIKNVLVRDFDHFHDRGLYVNEEKDPLSGHLFALGGEQWRHHRSKLTPTFTSGRLKEMFTNLVQIGRVLQDHVAKRAGEDIEIRDVMARYTTDIIASVGFGIENDSINEKGNIFREMGTKVFSPDLKTILRLTSTFFTPKLNALFGFKFIAQEIEDFIMNVVRETLEYRESNKVVRKDMMQLLMQLRNSGTVSIDDRWDIEVSTNKKKLSLEQVTAHAFVFFIAAYETSSTTISFCLFELARNPEIQKKVQQEIDQVLASHNGEITYDNINEMKYLENCIDETLRKYPAVPFLNRECSKDYKIPGTDTTIEKGTSLVIPVLGLHRDPDHYPEPDRFIPERFSNFEDISTKPYLPFGAGPRNCIGLRLGKLQTKAGLVMMLSKFNVRLADETYASKELALDARSVVLMPVGGIKVSISERRAS。
权利要求
1.一种淡色库蚊细胞色素P450(CYP6F1)基因，其特征是淡色库蚊细胞色素P450(CYP6F1)基因，氨基酸序列为MFAWIICAAAAVPLVYFLIVYQFSYWKRRGITQLTPSFPFGDLGPFFRQRSSLGVVYADVYRLCKRLPFVGIYFSLRPMLVVNDPELIKNVLVRDFDHFHDRGLYVNEEKDPLSGHLFALGGEQWRHHRSKLTPTFTSGRLKEMFTNLVQIGRVLQDHVAKRAGEDIEIRDVMARYTTDIIASVGFGIENDSINEKGNIFREMGTKVFSPDLKTILRLTSTFFTPKLNALFGFKFIAQEIEDFIMNVVRETLEYRESNKVVRKDMMQLLMQLRNSGTVSIDDRWDIEVSTNKKKLSLEQVTAHAFVFFIAAYETSSTTISFCLFELARNPEIQKKVQQEIDQVLASHNGEITYDNINEMKYLENCIDETLRKYPAVPFLNRECSKDYKIPGTDTTIEKGTSLVIPVLGLHRDPDHYPEPDRFIPERFSNFEDISTKPYLPFGAGPRNCIGLRLGKLQTKAGLVMMLSKFNVRLADETYASKELALDARSVVLMPVGGIKVSISERRAS
2.根据权利要求1所述的一种淡色库蚊细胞色素P450(CYP6F1)基因，其特征是应用兼并引物，以淡色库蚊溴氰聚酯抗性品系蚊虫提取的RNA为模板，降落RT-PCR技术克隆扩增，并采用快速末端扩增法克隆获得。
3.根据权利要求1所述的一种淡色库蚊细胞色素P450(CYP6F1)基因制备的融合蛋白，其特征是融合蛋白可用作制备治理昆虫抗药性的有关药物。
4.根据权利要求1所述的一种淡色库蚊细胞色素P450(CYP6F1)基因制备的特异性抗体，其特征是可用该抗体制成试剂盒，用于现场蚊虫抗药性的监测和蚊虫抗药性机理的研究。
全文摘要
本发明属于基因工程领域，所述淡色库蚊细胞色素P450(CYP6F1)基因(Culex pipiens pallens CYP6F1)，基因全长为1639bp，其开放阅读框为1527bp，编码508个氨基酸。该基因在GenBank中的编号为AY662654。本发明以淡色库蚊溴氰聚酯抗性品系蚊虫提取的RNA为模板，应用降落RT－PCR技术克隆扩增，并采用快速末端扩增法(rapid amplification cDNA ends，RACE)克隆获得。利用该基因制备融合蛋白及特异性抗体，用于制备与抗药性治理有关的药物及试剂盒。
文档编号A61K38/17GK101078014SQ20071001418
公开日2007年11月28日 申请日期2007年4月14日 优先权日2007年4月14日
发明者公茂庆, 邓绪礼, 闫歌, 刘波, 寇景轩, 王怀位, 程鹏, 朱昌亮 申请人:山东省寄生虫病防治研究所