专利名称：岩藻聚糖硫酸酯在制备防治神经退行性疾病药物或保健品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域。尤其涉及岩藻聚糖硫酸酯在制备防治神经退行性疾病药物或保健品中的应用。
背景技术：
神经系统退行性疾病是严重危害人们身体健康的疾病，目前全球大约有10亿人因神经系统的损伤而患病。神经系统退行性变疾病包括多种疾病，如常见的老年性痴呆(alzheimer’s disease，AD)、帕金森病(parkinson disease，PD)等。此类疾病大多呈进行性发展，是一类病因学和发病机制尚不清楚的疾病。其病理特点为具有特定功能的神经核团发生萎缩和神经元丢失。临床上，对于这类疾病尚无有效控制病程进展的措施，患者最终将丧失生活能力甚至死亡。
目前，随着社会的进步、老年人口的比例和数量不断增加，神经系统退行性疾病已经成为影响我国人口健康水平和生活质量的重大社会问题。对于神经退行性疾病治疗目前国内外主要集中在三个方面(1)在实验室里将未分化的神经干细胞(NSC)培养为适合移植到病人体内的已分化细胞。或者直接将NSC移植到体内，由体内的信号引导分化为成熟的合适的脑细胞。(2)发现生长激素、营养因子和药物，激活病人自身的干细胞和体内的修复机制来修复由疾病或损伤引起的损害。(3)利用去分化现象对神经损伤和退行性疾病进行治疗。
目前，用于神经退行性疾病的防治药物包括中枢兴奋剂、改善胆碱能的物质、脑血液循环改善剂、中草药及吡咯烷酮类化合物等，但是它们多存在疗效差、特异性不强，和毒副作用大等缺点。临床治疗和保健领域急需安全有效的针对神经退行性疾病和神经系统损伤的药物和功能性产品。
岩藻聚糖硫酸酯，英文名称Fucoidan，也称为褐藻多糖硫酸酯、褐藻糖胶、岩藻聚糖等，是一种水溶性杂聚糖，其主要组分是α-L-岩藻糖-4-硫酸酯，其次还伴有少量的半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、糖醛酸及蛋白质等。研究表明，岩藻聚糖硫酸酯具有抗凝血、降血脂、抗慢性肾衰、抗肿瘤、抗病毒、促进组织再生、抑制胃溃疡、增强机体免疫机能等多种生理活性。
日本、美国、挪威等国家从我国传统中药昆布受到启发，特别是从我国沿海居民食用海藻后能软化血管、抗肿瘤，增强人体免疫功能等方面受到启示，开展了海藻抗病治病有效成分的分离制备，从褐藻中提取分离得到了岩藻多糖硫酸酯，研究了从海藻中单一提取褐藻多糖酯的制备工艺以及褐藻多糖酯抗凝血、降血脂、抗肿瘤和抗HIV的实验室动物实验，取得了很好的结果。
我国的科研人员和相关企业也在岩藻聚糖硫酸酯的研究、生产及应用方面做了大量的工作。但是，经文献检索，目前国内外有关岩藻聚糖硫酸酯在神经系统疾病方面的研究及应用还罕有报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种岩藻聚糖硫酸酯在制备防治神经退行性疾病药物或保健品中的应用。
本发明所述的应用是依据岩藻聚糖硫酸酯具有促进神经前体细胞去分化，促进神经干细胞增殖和促进神经细胞损伤修复及保护神经细胞免受损伤的研究结果。
岩藻聚糖硫酸酯在制备防治神经退行性疾病和认知损伤药物中的应用。
以岩藻聚糖硫酸酯为活性成分制成的组合物在制备防治神经退行性疾病和认知损伤药物中的应用。
岩藻聚糖硫酸酯在制备防治神经退行性疾病和预防认知损伤的保健品中的应用。
以岩藻聚糖硫酸酯为活性成分制成的组合物在制备防治神经退行性疾病和预防认知损伤的保健品中的应用。
上述岩藻聚糖硫酸酯是以α-L-岩藻糖-4-硫酸酯为主要组分的高分子杂多糖，根据不同来源伴有含量不等的少量的半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、糖醛酸及蛋白质等。
本发明所述的岩藻聚糖硫酸酯的主要来源是从海带、巨藻、马尾藻、羊栖菜、墨角藻等褐藻和海参等海洋无脊椎动物中分离提取，以及从市场上购买获得。分离纯化方法的主要步骤包括酶解、水提，浓缩、醇沉、柱层析、冷冻干燥等。
上述神经退行性疾病是指以神经元凋亡为特征的神经系统疾病。
其中上述神经退行性疾病是肌萎缩侧索硬化、阿尔兹海默症、帕金森氏综合症、享廷顿氏症、脊-小脑共济失调III病的一种或多种。
上述认知损伤是指由遗传、疾病、衰老、药物、医疗、外伤、社会和心理的一种或多种因素造成的心理和生理损伤。
上述药物是指通过多种途径和方式给药的制剂。
其中上述制剂是注射剂、口服制剂、外用制剂、喷雾剂、透皮制剂之一。
其中所述制剂优选是片剂、胶囊剂、注射剂之一。
上述保健品是食品、饮品、化妆品之一。
本发明所述的岩藻聚糖硫酸酯可以根据不同制剂的具体要求，以一定量的纯品或一定纯度的制品作为活性成分制备成各种药物组合物，辅以药学上可接受的各种载体，这些药学可接受的载体可以是在现有技术中广泛用于药物中的各种载体。所述的药物组合物可以按现有技术已知的方法如混合、制粒、压片来制备。所述的药物组合物还可以包括各种药学使用的任选辅助组分，如香味剂、着色剂、甜味剂等。
为了更好地理解本发明的实质及本发明所述岩藻聚糖硫酸酯的作用效果，申请人利用岩藻聚糖硫酸酯进行了细胞和动物药理实验。实验结果表明本发明所述的岩藻聚糖硫酸酯对于神经前体细胞具有显著的去分化作用，对正常神经干细胞及具有显著神经干细胞特征的神经细胞有明显的增殖作用，并有利于神经元细胞间突触的联结和建立及修复；对缺氧、谷氨酸等外界因素导致的神经细胞损伤具有良好的保护和修复作用。
上述发现从机理上表明，岩藻聚糖硫酸酯对于老年痴呆、帕金森病和亨廷顿病等神经退行性疾病的病理、病理生理变化具有良好的改善作用，对各类神经细胞的损伤具有良好的保护和修复作用。预示岩藻聚糖硫酸酯在制备治疗和预防神经退行性疾病及认知损伤的药物或保健品中有很大的开发应用前景。
具体实施例方式
实施例1以新鲜刺参为原料制备岩藻聚糖硫酸酯。
新鲜刺参，去除内脏，洗净，破碎成1cm3的左右的小块，加入5-15倍水匀浆。
匀浆液分别经胃蛋白酶(酶量为海参湿重的0.4％，pH2.0-2.5，温度50℃，时间5h)、胰蛋白酶(酶量为海参湿重的0.45％，pH8.0-8.5，温度50℃，时间5h)酶解，酶解完后，煮沸灭酶活，离心(10000r/min，10min)取上清液。
上清液醇沉，离心(6000r/min，15min)得沉淀物，再用蒸馏水溶解，经DEAE纤维素柱分离，210nm检测吸收峰，收集活性组分(以对神经细胞的活性为指标)，并冻干。
将冻干的岩藻聚糖及其硫酸酯再用蒸馏水溶解，经凝胶柱分离，210nm检测吸收峰，收集活性组分(以对神经细胞的活性为指标)。
活性物质经sephadexG-25脱盐后冻干，得纯岩藻聚糖硫酸酯。
实施例2以海带为原料制备岩藻聚糖硫酸酯淡干海带清洗、干燥、粉碎。称取一定重量的粉末(50g)，加入5倍体积(250ml)无水乙醇回流提取两次，每次2小时，离心后将沉淀置于表面皿上挥干乙醇。
用5倍体积丙酮(250ml)将海带粉回流提取两次，每次2小时，离心取沉淀并挥干丙酮。加入40倍的水(2000ml)70℃水浴条件下浸提5小时，纱布过滤得浸提液。加入20倍的盐酸，pH＝6，60℃条件下浸提6小时。旋转蒸发仪浓缩。30％乙醇醇沉过夜，离心保留上清液。60％乙醇醇沉过夜离心保留沉淀。冷冻干燥得褐藻糖胶粗品。乙醇洗涤或重结晶的精制品，柱层析法得纯品。
实施例3岩藻聚糖硫酸酯对神经前体细胞的去分化作用。
取孕13.5～14天的Wistar大鼠，颈椎脱臼处死。
无菌条件下分离、取出胚胎，在无菌培养皿中，于解剖显微镜下分离，获取神经细胞。置于二氧化碳培养箱中，37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养48h后进行分组实验。
神经细胞在96孔板中培养48小时后，分别加入5mg/ml实施例1制备的岩藻聚糖硫酸酯，使岩藻聚糖硫酸酯的终浓度分别为100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml，设阴性对照组(空白)，和神经生长因子阳性对照组。37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养48小时。
分析结果表明，岩藻聚糖硫酸酯对神经细胞具有明显的去分化作用。显微镜观察发现，加入岩藻聚糖硫酸酯的神经细胞，神经突触逐渐消失，有大量神经球出现，而且各个神经球之间有明显的神经纤维连接建立。神经球细胞nestin染色强阳性，未加入岩藻聚糖硫酸酯的对照样本和加入神经生长因子的样本nestin染色弱阳性。
实施例4岩藻聚糖硫酸酯对神经前体细胞的增殖作用。
取孕13.5～14天的Wistar大鼠，颈椎脱臼处死。
无菌条件下分离、取出胚胎，在无菌培养皿中，于解剖显微镜下分离，获取神经细胞。置于二氧化碳培养箱中，37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养48h后进行分组实验。
神经细胞在96孔板中培养48小时后，分别加入5mg/ml实施例1制备的岩藻聚糖硫酸酯，使岩藻聚糖硫酸酯的终浓度分别为100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml，设阴性对照组(空白)，和神经生长因子阳性对照组。37℃，5％二氧化碳饱和湿度继续培养48小时。
分析结果表明，岩藻聚糖硫酸酯对在对神经前体细胞产生去分化作用的过程中，也表现出了明显的促进增殖作用。显微镜观察发现，加入岩藻聚糖硫酸酯的神经前体细胞发生聚团现象，细胞团随岩藻聚糖硫酸酯的浓度增加和培养时间的延长而逐渐增大，变得致密。神经球细胞nestin染色强阳性，未加入岩藻聚糖硫酸酯的对照样本和加入神经生长因子的样本nestin染色弱阳性。
实施例5岩藻聚糖硫酸酯对神经细胞氧化性损伤的保护作用。
取孕13.5-14天的Wistar大鼠，颈椎脱臼处死。
无菌条件下分离、取出胚胎，在无菌培养皿中，于解剖显微镜下分离，获取神经细胞。置于二氧化碳培养箱中，37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养48h后进行分组实验。
神经细胞在96孔板中培养48小时后，分别加入5mg/ml实施例1制备的岩藻聚糖硫酸酯，使岩藻聚糖硫酸酯的终浓度分别为100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml，设正常对照组。
培养12小时后，每孔加入谷氨酸培养液，使谷氨酸的终浓度为2mmol/ml，37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养36小时后，进行测定。
结果表明，岩藻聚糖硫酸酯对神经细胞谷氨酸氧化性损伤有明显保护作用，其保护作用随作用浓度的增大而增大，200μg/ml以上可以拮抗谷氨酸对神经细胞的损伤作用。谷氨酸损伤在多种神经退行性疾病发挥着重要作用，岩藻聚糖硫酸酯对这种损伤的保护作用表明，岩藻聚糖硫酸酯可以有效用于神经退行性疾病的预防和治疗。
实施例6岩藻聚糖硫酸酯注射剂的制备。
处方以重量百分比计，岩藻聚糖硫酸酯40％，甘露醇60％。
制备方法(1)安瓿洗涤干净，干燥灭菌；(2)称取岩藻聚糖硫酸酯40克，甘露醇60克，搅拌溶解；(3)补加注射用水至处方量，用0.22μm微孔滤膜过滤；(4)中间品检验；(5)灌装，每支2ml，熔封；(6)100℃流通蒸汽灭菌30分钟；(7)安全性检查。
实施例7岩藻聚糖硫酸酯口服片剂制备。
上述片剂主要有岩藻聚糖硫酸酯及辅料组成，其中辅料可以是填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂中的部分或全部，辅料的用量不超过岩藻聚糖及其硫酸酯总重量的8倍。
优选的制片处方以重量份计，岩藻聚糖硫酸酯100份填充剂100份速崩剂90份粘合剂80份润滑剂6份其中填充剂可以是磷酸氢钙、糊精或乳糖；速崩剂可以是L-HPC或干淀粉；粘合剂可以是PVP溶液或淀粉浆；润滑剂是硬脂酸镁。
片剂的生产工艺是按处方量，称取岩藻聚糖硫酸酯，加入填充剂、速崩剂，混合均匀，然后加入处方量的粘合剂混合制成湿粒，低温40-65℃干燥，再加入润滑剂混合均匀，压片，最后用高分子衣料(如HPMC、EC、MC)包薄膜衣。
实施例8岩藻聚糖硫酸酯胶囊剂制备。
上述胶囊剂主要有岩藻聚糖硫酸酯及辅料组成，其中辅料可以是填充剂、崩解剂、粘合剂中的部分或全部，辅料的用量不超过岩藻聚糖硫酸酯总重量的5倍。
优选的制片处方以重量份计，岩藻聚糖硫酸酯100份填充剂80份速崩剂80份粘合剂60份其中填充剂可以是磷酸氢钙、糊精或乳糖；速崩剂可以是L-HPC或干淀粉；粘合剂可以是PVP溶液或淀粉浆。
上述胶囊剂的生产工艺是按处方量，称取岩藻聚糖硫酸酯，加入填充剂、速崩剂，混合均匀，然后加入处方量的粘合剂混合制成湿粒，低温40-65℃干燥，粉碎后，以处方量用胶囊装料，得岩藻聚糖硫酸酯胶囊剂。
实施例9岩藻聚糖及其硫酸酯饮料制备。
处方以重量百分比计，岩藻聚糖及其硫酸酯40％，蒸馏水60％。
制备方法以常规饮料制备工艺，将上述重量百分比的岩藻聚糖及其硫酸酯与蒸馏水混合，以市场供应对象不同，分别添加常规量的香味剂、着色剂、甜味剂，制成500ml、1250ml、2000ml包装的饮料。
权利要求
1.岩藻聚糖硫酸酯在制备防治神经退行性疾病和认知损伤药物中的应用。
2.以岩藻聚糖硫酸酯为活性成分制成的组合物在制备防治神经退行性疾病和认知损伤药物中的应用。
3.岩藻聚糖硫酸酯在制备防治神经退行性疾病和认知损伤保健品中的应用。
4.以岩藻聚糖硫酸酯为活性成分制成的组合物在制备防治神经退行性疾病和认知损伤保健品中的应用。
5.如权利要求1、2、3或4所述的应用，其特征是所述神经退行性疾病是指以神经元凋亡为特征的神经系统疾病；所述认知损伤是指由遗传、疾病、衰老、药物、医疗、外伤、社会和心理的一种或多种因素造成的心理和生理损伤。
6.如权利要求5所述的应用，其特征是所述神经退行性疾病是肌萎缩侧索硬化、阿尔兹海默症、帕金森氏症、享廷顿氏症、脊-小脑共济失调III病的一种或多种。
7.如权利要求1或2所述的应用，其特征是所述药物是指通过多种途径和方式给药的制剂。
8.如权利要求7所述的应用，其特征是所述制剂是注射剂、口服制剂、外用制剂、喷雾剂、透皮制剂之一。
9.如权利要求8所述的应用，其特征是所述制剂是片剂、胶囊剂、注射剂之一。
10.如权利要求3或4所述的应用，其特征是所述保健品是食品、饮品、化妆品之一。
全文摘要
本发明公开了一种岩藻聚糖硫酸酯或以岩藻聚糖硫酸酯为活性成分制成的组合物在制备防治神经退行性疾病和认知损伤药物中的应用。同时还公开了岩藻聚糖硫酸酯或以岩藻聚糖硫酸酯为活性成分制成的组合物在制备防治神经退行性疾病和认知损伤保健品中的应用。本发明所述岩藻聚糖硫酸酯的来源主要是海带等褐藻、海参等海洋无脊椎动物，原料来源广泛，易于产业化和规模化生产，有广阔的开发应用前景。
文档编号A61K9/08GK101040867SQ20071001458
公开日2007年9月26日 申请日期2007年4月27日 优先权日2007年4月27日
发明者吉爱国, 宋淑亮, 宋迪 申请人:山东大学