专利名称：：海洋溴酚在制备治疗抗血栓形成作用药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及治疗心脑血管疾病的药物，具体地说是一种海洋溴酚化合物的制备方法、药理活性及药学用途。该化合物作为凝血酶(J/7ramZn'":)抑制剂，可用于治疗各种血栓性缺血造成的心脑血管疾病。
背景技术：
：心脑血管疾病与糖尿病、肿瘤等是目前对人类健康威胁最大的三类疾病，其中心脑血管疾病位于这三大疾病之首，原因是其不仅具有很高的致死率，而且其发病后导致患者的致残率也极高。中国是世界上心脑血管疾病发病率最高的国家，有心脑血管患者3000多万，其中瘫痪在床者达1200万人，每年死亡400多万人，所以预防和治疗心脑血管疾病已成为摆在我们面前的一项严重而艰巨的任务，并被世界卫生组织列为当前全组织范围总体工作重点之一。血栓形成是心脑血管缺血性疾病的重要病理基础之一，抗血栓形成是预防和治疗多种血栓缺血性心脑血管疾病的重要手段。血栓的形成是复杂的生理、病理过程，其中凝血因子、抗凝因子、纤溶系统以及血液流变学改变等都起重要的作用。正常状态下，血液不会自行凝固，当血管壁受损，血流缓慢，血小板聚集性、血液凝血活性和黏度增高时就易形成血栓，进而引起各种缺血性心脑血管疾病，因此寻找理想抗血栓形成的药物，对于心脑血管疾病的防治具有重要意义。凝血酶Thrombin(EC3.4.21.5)是一种多功能丝氨酸蛋白水解酶，具有与胰凝乳蛋白酶相似的序列和结构，对赖氨酸或精氨酸具有亲和特异性，在心脑血管疾病的病变过程中发挥着重要的作用。凝血酶是血栓形成的关键因素，影响血凝过程中的级联反应、纤维蛋白沉积和血小板活化等；凝血酶抑制剂能阻断凝血酶及其受体在动脉粥样硬化和脑水肿为基本病变的病变过程，因此，作为抗栓以及溶栓药物中重要靶点的凝血酶，寻找其高效特异性的抑制剂，可为预防和治疗心血管疾病提供新的途径，以期发现强活性新结构的抗心脑血管疾病海洋新药。21世纪人类生存和发展的巨大压力，迫使人们加快合理开发海洋资源的步伐，如何进行海洋天然活性物质的深度开发与利用，开发针对人类重大疾病的新药，是合理利用我国生物资源的战略需求。海洋是生命的起源地，海藻是海洋中最大的植物类群，是海洋生物链中能够通过光合作用合成自身必要物质的主要自养生物类群。在海洋独特的生态环境中，海藻属于被吞食的弱者，为了对付海洋食草动物的大量吞食来维护自身的生存繁衍，大多海藻能产生一些很有特色的活性物质。
发明内容申请人从一种海洋红藻中得到一个结构新颖的溴酚类化合物，体外活性筛选中发现其具有极强的Thrombin酶抑制活性，抑制率高达93.7%(阳性对照Argatruban抑制率为95.3。/。)；采用动物模型进行体内活性测试，分别测定药物的凝血时间、凝血酶原时间和白陶土部分凝血活酶时间；检测了药物对三氯化铁(FeCl3)诱导血栓形成的影响，结果表明该化合物在体内具有显著的抗凝血功能和抗血栓形成疗效，可用于治疗各种血栓性心脑血管疾病，如急性冠脉综合症(acutecoronarysyndrome,ACS)、急性心肌梗塞(Acutemyocardialinfarction，AMI)、月市血检检塞症(pulmonarythromboembolism,PTE)、深静脉血栓(deepvenousthrombosis,DVT)及动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)等。本发明目的是提供一种溴酚类化合物在制备治疗抗血栓形成作用药物中的应用，所述溴酚类化合物具有凝血酶(J72ram6/")抑制活性，可用于治疗各种由于血栓性缺血造成的心脑血管疾病。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为溴酚类化合物在制备治疗抗血栓形成作用药物中的应用。所述溴酚类化合物为3-溴-4-[2,3-二溴-4,5-二羟基苯基]-甲基-5-(甲氧基甲基)-l,2-二苯酚及其药物学上可接受的盐、酯或醚；抗血栓形成作用药物可为各种血栓性缺血造成的心脑血管疾病药物。溴酚化合物结构如下HO.、BrBrBrOH3-溴-4-[2，3-二溴-4，5二羟基苯基]-甲基-S-(甲氧基甲基)-l，2-二苯酚3-bromo-4画[2，3陽dibromo-4，5-dihydroxyphenyl]methyl画5陽(methoxymethyl)-l，2-benzenedio1本发明具有如下优点(1)、生物资源丰富我国是海洋大国，拥有的海洋生物资源，其中松节藻分布尤其广泛，其中富含溴酚类化合物。疗效显著作为极具海洋特色的多卤代化合物，溴酚类药物是一种高效的凝血酶抑制剂，在试验动物体内表现出显著的抗血栓形成作用，具有很好的抗心脑血管疾病疗效。(3)、副作用小溴酚类药物来源于海洋红藻，属纯天然生物制品，相比化学合成类药物，具有高效低毒的优点。(2)具体实施方式(一)、溴酚化合物的提取、分离及结构鉴定风干的松节藻i/o^me/acw^rvo^^样品14.4kg(干重)粉碎后用10L95%乙醇提取三次，每次72小时；提取液4(TC下减压浓縮的乙醇提取物723g，浓縮物用IO倍重量蒸馏水悬浮后，用乙酸乙酯(体积比1:1)萃取，减压浓縮，得乙酸乙酯相浸膏594.6g，乙酸乙酯萃取部位进行硅胶柱色谱，以石油醚-丙酮梯度洗脱(体积比从500:1至1:1)，直至二者体积比为h1，改用氯仿-甲醇梯度洗脱(体积比从20:1至1:1)，最后用95%乙醇洗脱，薄层色谱检查，合并成分相似的洗脱液，减压浓縮得14个部分LiL14。L部分[氯仿甲醇体积比=3:l]洗脱部分经过硅胶色谱，采用氯仿-甲醇(体积比依次为50:1-20:1-10:1-5:1)进行梯度洗脱，重结晶可得纯化合物，经波谱分析，此化合物为3-溴-4-[2,3-二溴-4,5-二羟基苯基]-甲基-5-(甲氧基甲基)-1,2-二苯酚(中文)，3-bromo-4-[2,3-dibromo-4,5-dihydroxypheny1]methyl-5-(methoxymethyl)-1,2-benzenediol(英文)。上述化合物具有以下理化特性C15H13Br305，EIMSm/z514(M-1),482(M-OCH3)463,433,402,384(463-Br),355,322(402國Br)，305,275,242,213,197,160,121,92,80,63,45;IRv=cm":3529,3415,2925,1589,1566,1489,1471,1373,1304,1271,1171,1099,1074,1007,933,883，858，808;'H-NMR(Me2CO-4,300MHz)&3.24(3H,s，9-CH3),4.12(2H,s,7-CH2),4.21(2H,s,8-CH2),6.07(1H,s,6'-CH),7.00(1H,s,6-CH);13C-固R(Me2CO-4,75MHz)A39.3(q,7-C),58.0(t,9-C),73.2(t,8-C),113.6(s,3'-C),114.8(d,6'画C),114.8(s,3-C),116.2(d,6-C),116.2(s,2'-C),129.5(s,4-C),130.7(s,l'-C),132.3(s,5-C),143.5(s,2-C),143.5(s,4'隱C)，144.8(s,5'-C),145.4(s,1-C)(二)、人源凝血酶Thrombin活性抑制活性测试Thrombin是一种多功能丝氨酸蛋白水解酶，作为抗栓及溶栓药物的重要靶点，寻找其高效选择性的抑制剂，可为预治心脑血管疾病提供新的途径。将待测药物样品加入到内含冻干人凝血酶国家标准品的酶反应体系中进行孵育；加入特异性的底物Ac-FVR-AMC,室温下Envision多标记微孔板检测仪动态检测RFU(relativefluorescenceunit,相对荧光强度)的变化，计算药物对Thrombin的抑制率和IC5。，Argatroban作为阳性为对照。(三)、溴酚化合物抗凝血活性测试1、小鼠凝血时间的测定玻片法昆明小鼠，随机分组，给药；于末次给药后lh进行凝血时间测定。末次给药lh后毛细管眼眶取血，滴于载玻片，血滴直径约5mm，立即用秒表记时；用清洁的4号注射针头自血滴边缘向里轻轻拨动，观察有无血丝挑起；从采血开始至挑起血丝止即为凝血时间。2、大鼠凝血酶原时间测定试管法Wistar大鼠，抽取心血，枸橼酸钠抗凝；离心分离血浆，用于凝血酶原时间测定和白陶土部分凝血活酶时间测定。兔脑粉0.3g，加入生理盐水和草酸钠溶液中，45。C保温一定时间，即凝血活酶；配制不同浓度的化合物溶液，分别加入凝血活酶、CaCl2溶液以及大鼠血浆，混匀，开始计时。每隔2秒倾斜试管1次，直至液面不动，此记录时间即为凝血酶原时间。3、白陶土部分凝血活酶时间的测定试管法部分凝血活酶用巴比妥缓冲液按比例稀释，加入等量白陶土悬液混合，即白陶土部分凝血活酶。配制不同浓度的化合物溶液，分别加入大鼠血浆和白陶土部分凝血活酶试液，37。C水浴3min，然后加入预热的CaCl2溶液，立即计时，直至白陶土颗粒聚集变粗，凝固成块为止，此记录时间即为大鼠白陶土部分凝血活酶时间。(五)、溴酚化合物对三氯化铁(FeCb)诱导血栓形成的影响wistar大鼠，随机分组，给药后10min造模；大鼠麻醉后，暴露右侧位于嗅束及大脑下静脉之间的一段MCA，置一小片塑料薄膜保护血管周围脑组织，将吸有FeCl3液的小片定量滤纸片贴在该段MCA上，持续30min后去掉滤纸片，生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，回笼饲养；参照ZeaLonga评定标准进行神经功能缺损程度的行为学评价。实施例l溴酚化合物的提取、分离及结构鉴定风干的松节藻A/o^w7e/aco"/ervoW^样品14.4kg(干重)粉碎后用10L95%乙醇提取三次，每次72小时；合并浸提液，提取液40。C下减压浓縮的乙醇提取物723g，浓縮物用IO倍重量蒸馏水悬浮后，用等体积乙酸乙酯萃取，减压浓縮，得乙酸乙酯相浸膏594.6g，乙酸乙酯萃取部位进行硅胶柱色谱，以石油醚-丙酮梯度洗脱(体积比500:ll:l)，直至二者体积比为1:1，改用氯仿-甲醇梯度洗脱(体积比20:11:1)，最后用95%乙醇洗脱，薄层色谱检查，合并成分相似的洗脱液，减压浓縮得14个部分"Lm。Lu部分[氯仿甲醇体积比=3:l]洗脱部分经过硅胶色谱，采用氯仿-甲醇(体积比50:15:1)进行梯度洗脱，重结晶可得纯化合物，经波谱分析，此化合物为3-溴-4-[2,3-二溴-4,5-二羟基苯基]-甲基-5-(甲氧基甲基)-1,2-二苯酚(中文)，3-bromo-4-[2，3-dibromo-4,5-dihydroxyphenyl]methyl-5-(methoxymethyl)-1,2-benzenediol(英文)。实施例2人源凝血酶Thrombin活性抑制活性测试在酶标板小孔中加入5pg/mL3-溴-4-[2,3-二溴-4，5-二羟基苯基]-甲基-5-(甲氧基甲基)-1,2-二苯酚缓冲液50pL和2.7pg/mL标准人凝血酶液IOjiL，混匀后孵育15min;加入4mmol/L特异性的底物Ac-FVR-AMC10jiL,充分混匀，室温下Envision多标记微孔板检测仪动态检测RFU(relativefluorescenceunit,相对荧光强度)的变化；此即抑制凝血酶RFU。将缓冲液取代待测药物缓冲液，其余步骤同上，即抑制凝血酶RFU。为抑制凝血酶和抑制凝血酶RFU的测定可以在同一块酶标板上进行，计算药物对Thrombin的抑制率和IC5()(Argatroban作为阳性为对照)。表1人源凝血酶抑制率及IC5()_Figure1InhibitionandIC50ofthrombin_<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>:化合物对人源凝血酶Thrombin有显著的抑制作用，其抑制率高于阳性对照药物Argatruban,可用于血栓性心脑血管疾病的防治。实施例3溴鼢化合物抗凝血活性测试(1)、动物分组及处理昆明雄性小鼠20只，体重1822g，随机分为4组空白对照组、低、中、高剂量组。药物采用少量乙醇溶解，用生理盐水稀释至不同浓度。剂量组小鼠分别灌胃不同剂量的药物溶液0.5mL/只(剂量分别为5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)，对照组小鼠则灌胃同体积生理盐水，每曰l次，连续10d，于末次给药后lh进行凝血时间测定。Wistar大鼠10只，体重300350g，抽取心血，加入重量浓度3.8%枸橼酸钠l:9(其与心血的体积比)抗凝；离心10min，分离血桨，用于凝血酶原时间测定和白陶土部分凝血活酶时间的测定。(2)、小鼠凝血时间的测定玻片法末次给药lh后毛细管眼眶取血，滴于载玻片，血滴直径约5mm，立即用秒表记时；用清洁的4号注射针头自血滴边缘向里轻轻拨动，观察有无血丝挑起；从采血开始至挑起血丝止即为凝血时间。表2药物对小鼠凝血时间的影响Table2Theeffectsofthebromophenolonbloodcoagulationinmice<table>complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>性，且与空白剂量组比较，高剂量组呈现显著性差异。(3)、大鼠凝血酶原时间测定试管法称取兔脑粉0.3g，加入生理盐水4.9mL和0.1mol/L的草酸钠溶液0.1mL，45。C水浴，每5min摇动l次，15min后即得凝血活酶。实验设空白对照组(生理盐水)、低、中、高剂量组(剂量分别为5mg/kg,10mg/kg,20mg/kg的溴酚化合物)；将上述各组溶液0.2mL加入到不同试管中，37。C水浴，然后分别依次加入O.lmL凝血活酶、0.1mL的CaCl2溶液(0.025mol/mL)和0.1mL大鼠血浆，混匀，立刻开始计时;每隔2s倾斜试管l次，直至液面不动，此记录时间即为凝血酶原时间，实验重复5次。(4)、白陶土部分凝血活酶时间的测定试管法部分凝血活酶用巴比妥缓冲液按l:50的体积比例稀释，加入等量的重量浓度4%白陶土悬液混合，即白陶土部分凝血活酶。实验设空白对照组(生理盐水)、低、中、高剂量组(剂量分别为5mg/kg,10mg/kg,20mg/kg的溴酚化合物)；将上述各组溶液0.2mL加入到不同试管中，依次加入O.lmL大鼠血浆和O.lmL白陶土部分凝血活酶试液，于37。C水浴3min，然后加入37。C预热的0.1mL的CaCl2溶液(0.025mol/mL)，立即开始计时，直至白陶土颗粒聚集变粗，凝固成块为止，此记录时间即为大鼠白陶土部分凝血活酶时间。实验重复5次。表3药物对大鼠凝血酶原时间和白陶土部分凝血活酶时间的影响Table3TheeffectsofthebromophenolontheprothrombintimeandKPTTinrats(x±s，n=5)<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表中*表示与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05):药物能够显著抑制内源性途径和外源性途径的凝血酶(Thrombin)的产生，且对其外源性途径的抑制作用大于内源性途径,其抑制机理主要是抑制凝血酶的活性，而不是抑制凝血酶的产生过程。实施例5溴酚化合物对三氯化铁(FeCl3)诱导血栓形成的影响(1)、动物分组及处理Wistar大鼠60只，随机分为6组，模型组(ig生理盐水，以FeCl3造模)、假手术组(ig生理盐水，不用FeCh，其余操作同其它组)、高、中、低剂量给药组(分别ig溴酚药物5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg，FeCls造模)和阳性药对照组(iv肝素500U/kg，FeCl3造模)。(2)、MCA血栓形成模型制备血管内膜被FeCl3损伤后，暴露出内皮下胶原纤维，诱发血小板的黏附、聚集，形成血栓，其主要成分是血小板、红细胞及纤维蛋白等。各组均于给药或生理盐水后10min造模。用乌拉坦(1.2g/kg,ip)麻醉大鼠，按Tamura法暴露右侧位于嗅束及大脑下静脉之间的一段MCA，置一小片塑料薄膜保护血管周围脑组织，将吸有重量浓度50。/。FeCl3溶液5)aL的小滤纸片贴于该段MCA，30min后去掉滤纸片，生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，回笼饲养。(3)、造模后24h行为学评分参照ZeaLonga评定进行神经功能缺损程度的评价0级，无缺陷；l级，不能伸展对侧前肢；2级，对侧前肢屈曲；3级，轻度向对侧转圈；4级，严重的转圈；5级，对侧瘫痪。表4MCA血栓形成后24h行为学评分Table4Scoreofbehavioralscienceat24hafterMCA(X±s，n=10)<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表中*表示与模型组比较有显著性差异(P<0.05):模型组术后出现不同程度的对侧前肢内收、肩内旋、肌张力降低，推右肩向对侧移动，抵抗阻力降低，甚至出现不停向一侧转圈现象；药物各剂量组症状均有减轻，高剂量组与模型组相比有显著性差异，且溴酚药物对行为学的改善具有明显的量效关系；阳性对照组行为学评分与模型组相比具有显著性差异；假手术组未见行为学改变。权利要求1.海洋溴酚在制备治疗抗血栓形成作用药物中的应用。2.按照权利要求l所述的应用，其特征在于所述海洋溴酚化合物在制备治疗血栓性心脑血管疾病药物中的应用。3.按照权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述海洋溴酚化合物为3-溴-4[2,3二溴-4,5-二羟基苯基]-甲基-5-(甲氧基甲基)-1,2-二苯酚及其药物学上可接受的盐、酯或醚。全文摘要本发明涉及治疗心脑血管疾病的药物，具体地说是溴酚类化合物在制备治疗抗血栓形成作用药物中的应用。本发明溴酚类化合物具有凝血酶(Thrombin)抑制活性，可用于治疗各种由于血栓性缺血造成的心脑血管疾病。文档编号A61K31/075GK101342160SQ200710015298公开日2009年1月14日申请日期2007年7月13日优先权日2007年7月13日发明者史大永,晓范,袁兆慧,凤许,韩丽君申请人:中国科学院海洋研究所