专利名称：一种从红豆杉中分离提取10－去乙酰基巴卡丁Ⅲ的方法
技术领域：
本发明涉及一种从红豆杉中分离提取10-去乙酰基巴卡丁III的方法，属有机化学技术领域。
背景技术：
随着环境污染问题日益严重，癌症发病率逐年上升，癌患人群不断扩大，治癌药物的需求量，特别是疗效确切的治癌新药的需求量每年也以较高的速度增长。
1979年，生化药理教授Su.Horwity研究发现了紫杉醇具独特的抗癌作用机理，各国对此进行了研究并取得了一定的成果。据美国肿瘤研究所(NCI)调查认为，紫杉醇及多西紫杉醇将是人类未来二十年间最有效的抗癌药物。这样就为抗癌新药紫杉醇提供了巨大的市场空间。据美国施贵宝公司统计，1999年该公司的紫杉醇针剂全年销售额达到2.5亿美元，到2000年国际紫杉醇市场原料药贸易额突破15亿美元。目前，美国几家大的化学制药公司及欧洲部分国家的药业公司正在全球范围内广泛寻求合作，以求建立自己的药源供应基地。
红豆杉属植物属珍稀濒危植物，产地及产量较少且植物体内紫杉醇含量较少。因此，从植物红豆杉(包括其他同系物种)中提取紫杉醇，获得紫杉醇的量相当少，远远不能满足医药行业的需求，为此有关的药物研究人员致力于开拓紫杉醇的合成与半合成之路，以扩大紫杉醇的来源，并成功利用紫杉醇的前体10-去乙酰基巴卡丁III(10-DAB III)为原料来半合成紫杉醇或紫杉醇的类似物如多西紫杉醇等，其抗癌活性及水溶性均优于紫杉醇，并有望很快进入工业化。
10-去乙酰基巴卡丁III是从红豆杉中分离出的天然有机化合物，是紫杉系列产品中重要的中间体，被用于半合成紫杉醇及紫杉醇类化合物，其分子式如下 目前存在的问题是如何利用现有的资源能工业化地提取足够多地半合成的原料，即获得高纯度10-DAB III精品，为此，医药界的有关人士期望生物工程方面的专家探索一条从植物红豆杉中能高效地提取和纯化10-DAB III地工业化之路，以推动和支持抗肿瘤医药工业的技术进步。
中国专利(ZL03129635.1)公开了一种从红豆杉中分离提取10-去乙酰基巴卡丁III的方法。该方法首先将红豆杉枝叶粉碎至粒径小于10μm，然后用醇类溶剂提取有效成分，蒸发浓缩除醇，经有机溶剂萃取，再经硅胶柱层析，常压色谱柱层析，水解后再次层析得到10-去乙酰基巴卡丁III。可见，该提取方法非常复杂。
中国专利(ZL02136678.0)公开了一种从红豆杉枝叶残渣中分离提取10-去乙酰基巴卡丁III的方法。该方法使用种植的红豆杉的树叶、树枝被提取出紫杉醇后的残渣，经过常温至70℃干燥脱除废渣中的有机溶剂，将残渣放入提取罐，加入水后，在40-80℃下浸泡2-8小时；水与废渣的重量比在2-5之间；残渣浸泡后趁热过滤去除废渣，滤液浓缩后得到10-去乙酰基巴卡丁III的粗提物；用喷雾干燥仪将10-去乙酰基巴卡丁III粗提物喷雾干燥，得到的干粉末用乙酸乙酯溶解色谱分离。
使用传统的硅胶层析，其提取工艺得率低，从枝叶到95％产品的一次收率只有55％左右；产品含量低，产品纯度一般只能达到95％，对后续的分离工作造成了麻烦；颜色差，产品质量不高，从而影响了产品质量；硅胶不能多次重复使用成本很大，氯仿做为洗脱溶剂毒性非常大对操作人员有很强的身体伤害。
发明内容
本发明的目的是提供一种工艺简单，10-去乙酰基巴卡丁III提取率高，价格低廉，无毒无污染的工业化生产方法。
10-DABIII是合成抗癌药紫杉醇和多西紫杉醇的母体，它的工业化程度和成本从某种意义上讲直接决定了合成紫杉醇和多西紫杉醇的工业化程度和成本。然由于10-DABIII在原植物中的含量通常在100ppm-1000ppm之间，要从成吨的植物里面提取100克-1000克的成品，其在分离过程中所花费的有机溶剂成本之大主要集中在含量富集到50％以前，因此，降低成本的关键是将10-DABIII从ppm级分离到50％左右的粗品过程。
本发明实现过程如下首先用醇类溶剂提取红豆杉枝叶，得到的提取液进行蒸发浓缩得浓缩液或干粉，再经分离纯化。
在分离纯化过程中，浓缩液或干粉先过聚酰胺柱初次分离，使用乙醇或甲醇溶液梯度洗脱得粗品；粗品用硅胶柱色谱二次分离并结晶干燥。
所述的聚酰胺柱使用40-60目的聚酰胺，使用的填料聚酰胺与干粉重量比为4-7∶1；将干粉加2-3倍量10％的乙醇水溶液搅拌成糊状，加于装好的层析柱顶部，先用10％的乙醇水溶液冲柱，待流出液变为黄色后，改用20％的乙醇水溶液冲柱，并按每个柱体积为一个馏分收集，每个馏分收集完成后按照10％递加乙醇浓度，直到100％的纯乙醇；对所有馏分用高效聚酰胺进行薄层检测，区分有料部分和无料部分，有料部分在60℃真空浓缩，待回收的乙醇浓度低于10％时，停止浓缩，将有料部分放出，冷却后置于冰柜中结晶得粗品；经HPLC检测，粗品中10-去乙酰基巴卡丁III含量不低于50％。
粗品用硅胶柱色谱二次分离，硅胶柱中加入的硅胶与粗品重量比为7-9∶1；先将粗品加入9-12倍量的乙醇使粗品充分溶解，然后加入与粗品重量等同的硅胶，蒸发回收乙醇，使粗品均匀的被硅胶吸附，待乙醇完全回收后，将粉末干燥、粉碎、过60目筛；用体积比为1∶1的乙酸乙脂与环己烷溶液冲柱，待流出液变为黄色后，按每个柱体积为一个馏分收集，用硅胶薄层追踪检测直至有料部分完全冲出后停止；对所有馏分用HPLC进行检测，无料部分直接进行浓缩回收溶剂，对有料部分HPLC归一法≥85％和归一法≤85％的有料部分各自进行浓缩，回收溶剂；对于归一法≥85％的部分，回收至干；归一法≤85％的有料部分直接浓缩后拌入硅胶与下次硅胶层析合并过柱。
本发明所述的红豆杉是南方红豆杉、云南红豆杉、加拿大红豆杉、中国红豆杉、尖杉红豆杉、欧洲浆果红豆杉；最好使用欧洲浆果红豆杉，其生产综合成本更低。
本发明的优点①本发明使用聚酰胺柱，相比硅胶柱，成本大大降低，同时，聚酰胺可经过处理反复使用几十次，大大降低了过柱成本；不使用氯仿等有害有毒溶剂，保护了环境；②在分离阶段，先采用了大型聚酰胺柱进行初次分离，将大部分杂质甩掉，使生产成本大大降低，然后采用乙酸乙酯和环己烷的梯度组分为流动相，使一次性上样可获达3000克成品，分离效果显著，操作方便，易于实现工业化生产；③由于利用了聚酰胺层析分离，产品除色效果好，产品色泽、外观、品质好；④两套完全不同的分离系统同时应用在一个产品的分离上，除杂的效果非常明显，目标产品的杂质含量非常低，产品纯度高；⑤该方法的产品一次收率在78％以上，产品纯度在99.0％以上，最高可达99.9％，各类溶剂得回收率可达92％以上，废水BOD在100以下，适合工业化生产；⑥发明人以2007年市场原料价格为参照，核算了传统的硅胶层析法与本发明所述方法每生产1公斤成品所使用的原料成本(使用的各种溶剂及填料)，传统的硅胶层析法原料成本为30450元，而本发明公开的方法原料成本18744元，可见，本发明所述方法价格低廉，易于工业化生产。
图1为传统硅胶层析工艺流程图。
图2为本发明的工艺流程图。
具体实施例方式
下面结合附图对本发明做进一步详细叙述。
层析溶剂的选择目前广泛用于工业上的层析溶剂主要分为两类—有机溶剂和水，而几乎所有的有机溶剂成本都偏高，比较低廉的层析溶剂无疑就是水和甲醇或者水和乙醇，因为甲醇对眼睛有较强的伤害作用，故用水和乙醇做为层析溶剂就成为首选。
层析填料的选择常规的工业填料有很多种，硅胶、氧化铝、氧离子交换树脂、阴离子交换树脂、聚酰胺等等很多种，从使用乙醇水作为洗脱剂的角度分析，只能使用阳离子交换树脂、阴离子交换树脂、聚酰胺这些填料做为吸附剂。而10-DABIII是一种环萜类化合物，其分子量较大，少量的H+或者OH-都会对其结构产生破坏作用，使目标产品里面未知杂质的含量偏高。发明人经过长达2年的对比实验和筛选，最终确定了用聚酰胺作为吸附剂进行分离，并把产品销售给目标客户，同时也得到了目标客户的广泛认可。
具体如下齐鲁制药有限公司试用时间是2006年12月05日，意见是“含量99％以上，符合多西合成标准”；加拿大SINO PHARMACEUTICALS公司试用时间是2007年3月20日意见是“含量是99.5％以上，白色粉末，比旋度-35-40，未知杂质含量符合USP29”；产品于2007年3月30日经陕西药检所分析检测中心检测，纯度为99.8％以上，产品质量高。
本发明10-DABIII的纯化步骤1、聚酰胺层析A装柱准确称取用于层析的提取干粉5倍量的聚酰胺(40-60目)，用乙醇浓度10％的乙醇溶液充分拌匀，缓慢加入层析柱中，并不断的用10％的乙醇水溶液反复淋洗3个小时，待气泡完全排出后，将填料面整平加上筛板，并使液面高于填料面10cm，等待装料。
B装料将提取好的干粉，用2倍量(重量)10％的乙醇水溶液充分搅拌成糊状，缓慢加于装好的层析柱顶部并加盖筛板。
C过柱分离先用10％的乙醇水溶液冲柱，待流出液变为黄色后，改用20％的乙醇水溶液冲柱，并按每个柱体积为一个馏分收集。每个馏分收集完成后按照10％递加乙醇浓度，直到100％的纯乙醇。
D薄层检测；对所有馏分用高效聚酰胺进行薄层检测，区分有料部分和无料部分，并对有料部分和无料部分各自进行浓缩，回收乙醇。
E有料部分的收集；有料部分在60℃抽真空浓缩(真空度≤-0.09Mpa)待回收的乙醇浓度低于10％时，停止浓缩，并将有料部分放出，置于密闭容器中放凉至室温，然后放于冰柜中结晶24小时。
F粗品的过滤和干燥将结晶好的粗品，用布氏漏斗抽滤，并用水反复洗涤3次，抽干后放入真空干燥箱中干燥。温度60℃、真空度-0.09Mpa、干燥时间48小时。
H粗品的质量样品经HPLC检测，10-DABIII含量不低于50％；干燥失重不高于6％；水份含量不高于5％。杂质组分为10-Deacetyl-19-hydroxybaccatin III(NMT3％)、10-deacetyl-2-debenzoyl-2-tigloybaccatin III(NMT3％)、10-Deacetyl paclitaxel(NMT3％)、10-Deacetylpaclitaxel ethyl analog(NMT2％)、10-Deacetylpaclitaxel propyl analog(NMT 1％)、10-Deacetylcephalomannine(NMT1％)。
2、硅胶柱层析A装柱准确称取用于层析的粗品8倍量的硅胶(100-200目)，用乙酸乙脂环己烷(1∶1V/V)溶液充分拌匀，缓慢加入层析柱中，并不断的用流动相反复淋洗6个小时，待气泡完全排出后，将硅胶面整平加上筛板，并使液面高于填料面10cm，等待装料。
B制样将聚酰胺层析所得的粗品置于20L的旋转蒸发仪中，加入10倍量的乙醇使粗品充分溶解，然后缓慢加入与粗品重量等同的硅胶，缓慢回收乙醇，使粗品均匀的被硅胶吸附，待乙醇完全回收后，将蒸发瓶中的粉末倒出，并置于真空干燥箱中干燥6小时，粉碎、过60目筛即可。
C装料将制得的干粉，缓慢加于装好的层析柱顶部并加盖筛板。
D过柱分离用体积比乙酸乙脂∶环己烷＝1∶1的溶液冲柱，待流出液变为黄色后，按每个柱体积为一个馏分收集，用硅胶薄层追踪检测直至有料部分完全冲出后停止。
EHPLC检测对所有馏分用HPLC进行检测，无料部分直接进行浓缩回收溶剂，对有料部分HPLC归一法≥85％和归一法≤85％的有料部分各自进行浓缩，回收溶剂。
F有料部分的收集对于归一法≥85％的部分(以下称为半成品)，回收至干等待下一步的处理。归一法≤85％的有料部分直接浓缩后拌入硅胶与下次硅胶层析合并过柱。
H结晶和干燥将半成品直接在旋转蒸发仪中用4倍量的热丙酮使其充分溶解，并趁热过滤，放入密闭容器在冰柜中结晶12小时。然后用布氏漏斗抽滤，抽干后放入真空干燥箱中干燥。温度60℃、真空度-0.09Mpa、干燥时间12小时。此次所得的产品，以下称为类成品。
将类成品在旋转蒸发仪中用10倍量纯乙醇充分溶解，并趁热过滤2次，然后浓缩掉一半的乙醇，放入密闭容器置冰柜中结晶24小时。然后用布氏漏斗抽滤，抽干后放入真空干燥箱中干燥。温度60℃、真空度-0.09Mpa、干燥时间48小时，即得成品。
I.成品的规格要求样品经HPLC检测，10-DABIII含量不低于99.0％；熔点225℃-230℃；旋光度-36.0°--40.0°；干燥失重不高于1.5％；水份含量不高于1％；有机溶剂含量不高于1.5％，其中甲醇不高于3000ppm(ICH)，丙酮不高于5000ppm(ICH)；杂质组分为10-Deacetyl-19-hydroxybaccatin III(NMT1.0％)、10-deacetyl-2-debenzoyl-2-tigloybaccatin III(NMT1.0％)、10-Deacetyl paclitaxel(NMT1.0％)、10-Deacetylpaclitaxel ethyl analog(NMT0.3％)、10-Deacetylpaclitaxel propyl analog(NMT0.4％)、10-Deacetylcephalomannine(NMT0.5％)。
实施例1取含量为147ppm的南方红豆杉1公斤，置于5L的广口瓶加入5L甲醇60℃提取4次，合并提取液并浓缩回收甲醇，干燥后得225克粉末，等待上柱。
取1125克聚酰胺(40-60目)装柱(10cm*150cm)，用乙醇水为流动相梯度洗脱，每1L为一个收集单位，得有料部分6L，合并并浓缩有料部分，并按照发明工艺进行结晶、抽滤。在温度60℃、真空度-0.09Mpa、干燥48小时。得粗品0.25克，含量检测为52.33％。
将0.25克粗品，用2克硅胶装柱(2mm*20mm)用体积比乙酸乙脂∶环己烷＝1∶1的溶液冲柱，每5毫升为一个收集单位，HPLC追踪检测，得HPLC归一法≥85％有料部分0.15克和归一法≤85％的有料部分0.02克。
对于0.15克归一法≥85％有料部分按工艺要求，细心操作，得0.1151克纯品，含量检测为99.68％收率为78.29％。
实施例2取含量为1320ppm的欧洲红豆杉10公斤，置于100L的提取罐加入50L甲醇60℃提取4次，合并提取液并浓缩回收甲醇，干燥后得2.41公斤粉末，等待上柱。
取12.05公斤聚酰胺(40-60目)装柱(20cm*180cm)，用乙醇水为流动相梯度洗脱，每5L为一个收集单位，得有料部分50L，合并并浓缩有料部分，并按照发明工艺进行结晶、抽滤。在温度60℃、真空度-0.09Mpa、干燥48小时。得粗品22.0克，含量检测为53.78％。
将22克粗品，用176克硅胶装柱(5cm*20cm)用体积比乙酸乙脂∶环己烷＝1∶1的溶液冲柱，每100毫升为一个收集单位，HPLC追踪检测，得HPLC归一法≥85％有料部分13.2克和归一法≤85％的有料部分1.78克。
对于13.2克归一法≥85％有料部分按工艺要求，细心操作，结晶、干燥得10.428克纯品，含量检测为99.63％收率为79％。
实施例3取含量为1450ppm的欧洲红豆杉500公斤，置于5000L的提取罐加入2500L甲醇60℃提取4次，合并提取液并浓缩回收甲醇，干燥后得117.5公斤粉末，等待上柱。照次方法连续投料3000公斤，共制得干燥粉末712公斤。
按照本发明10-DAB纯化工艺每20公斤提取粉末用100公斤聚酰胺(40-60目)装柱(40cm*200cm)，用乙醇水为流动相梯度洗脱，每5L为一个收集单位，得有料部分1000L，合并并浓缩有料部分，并按照发明工艺进行结晶、抽滤。在温度60℃、真空度-0.09Mpa、干燥48小时。尊照操作要求将712公斤提取粉末全部层析完成，共得粗品7.5公斤，含量检测为52.17％。
将7.5公斤粗品，用60公斤硅胶装柱(40cm*180cm)用体积比乙酸乙脂∶环己烷＝1∶1的溶液冲柱，每10升为一个收集单位，HPLC追踪检测，得HPLC归一法≥85％有料部分4.5公斤和归一法≤85％的有料部分0.63公斤。
对于4.5公斤归一法≥85％有料部分按工艺要求，细心操作，结晶、干燥得纯品3.4191公斤，含量检测为99.73％ 收率为78.6％。
权利要求
1.一种从红豆杉中分离提取10-去乙酰基巴卡丁III的方法，首先用醇类溶剂提取红豆杉枝叶，得到的提取液进行蒸发浓缩得浓缩液或干粉，再经分离纯化，其特征在于浓缩液或干粉先过聚酰胺柱初次分离，使用乙醇或甲醇溶液梯度洗脱得粗品；粗品用硅胶柱色谱二次分离并结晶干燥。
2.根据权利要求1所述的分离提取10-去乙酰基巴卡丁III的方法，其特征在于聚酰胺柱使用40-60目的聚酰胺，使用的填料聚酰胺与干粉重量比为4-7∶1。
3.根据权利要求1或2所述的分离提取10-去乙酰基巴卡丁III的方法，其特征在于干粉加2-3倍量10％的乙醇水溶液搅拌成糊状，加于装好的层析柱顶部。
4.根据权利要求3所述的分离提取10-去乙酰基巴卡丁III的方法，其特征在于先用10％的乙醇水溶液冲柱，待流出液变为黄色后，改用20％的乙醇水溶液冲柱，并按每个柱体积为一个馏分收集，每个馏分收集完成后按照10％递加乙醇浓度，直到100％的纯乙醇。
5.根据权利要求4所述的分离提取10-去乙酰基巴卡丁III的方法，其特征在于对所有馏分用高效聚酰胺进行薄层检测，区分有料部分和无料部分，有料部分在60℃真空浓缩，待回收的乙醇浓度低于10％时，停止浓缩，将有料部分放出，冷却后置于冰柜中结晶得粗品。
6.根据权利要求5所述的分离提取10-去乙酰基巴卡丁III的方法，其特征在于经HPLC检测，粗品中10-去乙酰基巴卡丁III含量不低于50％。
7.根据权利要求1所述的分离提取10-去乙酰基巴卡丁III的方法，其特征在于硅胶柱中加入的硅胶与粗品重量比为7-9∶1。
8.根据权利要求7所述的分离提取10-去乙酰基巴卡丁III的方法，其特征在于粗品加入9-12倍量的乙醇使粗品充分溶解，然后加入与粗品重量等同的硅胶，蒸发回收乙醇，使粗品均匀的被硅胶吸附，待乙醇完全回收后，将粉末干燥、粉碎、过60目筛。
9.根据权利要求8所述的分离提取10-去乙酰基巴卡丁III的方法，其特征在于用体积比为1∶1的乙酸乙脂与环己烷溶液冲柱，待流出液变为黄色后，按每个柱体积为一个馏分收集，用硅胶薄层追踪检测直至有料部分完全冲出后停止。
10.根据权利要求9所述的分离提取10-去乙酰基巴卡丁III的方法，其特征在于对所有馏分用HPLC进行检测，无料部分直接进行浓缩回收溶剂，对有料部分HPLC归一法≥85％和归一法≤85％的有料部分各自进行浓缩，回收溶剂；对于归一法≥85％的部分，回收至干；归一法≤85％的有料部分直接浓缩后拌入硅胶与下次硅胶层析合并过柱。
全文摘要
本发明公开了一种从红豆杉中分离提取10－去乙酰基巴卡丁III的方法，具体的说，首先用醇类溶剂提取红豆杉枝叶，得到的提取液进行蒸发浓缩得浓缩液或干粉，再经分离纯化。在分离纯化过程中，浓缩液或干粉先过聚酰胺柱初次分离，使用乙醇或甲醇溶液梯度洗脱得粗品；粗品用硅胶柱色谱二次分离并结晶干燥。本发明使用聚酰胺柱，相比硅胶柱，成本大大降低，同时，聚酰胺可经过处理反复使用几十次，大大降低了过柱成本；不使用氯仿等有害有毒溶剂，保护了环境；聚酰胺柱分离得到的产品除色效果好，产品色泽、外观、品质好。
文档编号A61K36/13GK101074219SQ20071001813
公开日2007年11月21日 申请日期2007年6月27日 优先权日2007年6月27日
发明者孙晓莉, 张生勇, 杨海鹰, 杨平 申请人:西安天丰生物科技有限公司