专利名称：：甘草黄酮分散片的制备及该片剂作药物活性成份在降血糖中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及甘草黄酮分散片有效降糖成分的分离纯化方法和甘草黄酮分散片的制备以及甘草黄酮分散片降血糖活性的试验研究。
背景技术：
：糖尿病是一种因胰岛素分泌绝对或相对不足，导致以高血糖为特征的内分泌代谢性疾病。若机体长期处于高血糖状态，可导致失明、肾功能衰竭、神经病变、心脑血管疾病、肢体坏疽等多种并发症。现已成为继心脑血管、癌症之后的严重危害人类健康的第三大疾病。目前对于I型糖尿病的治疗，研究方向是开发给药方便、有效的胰岛素制剂及代用品。而对于n型糖尿病的治疗，则主要是依靠现有的口服降糖药物进行有限的治疗。a-葡萄糖苷酶抑制剂是上世纪70年代开发研制的一类新型口服降血糖药物，能竞争性抑制小肠内a-葡萄糖苷酶的活性，延缓或抑制葡萄糖在肠道吸收，有效降低餐后高血糖。该类药物的研制成功，为糖尿病口服降糖药物治疗开辟了一个新的途径。a-葡萄糖苷酶抑制剂在临床上主要用于糖尿病的治疗，可单独或者与磺脲类、双胍类和胰岛素联合使用治疗II型糖尿病，也可在I型糖尿病的治疗中与胰岛素合用，来减少胰岛素的用量和稳定血糖，以及缓解高胰岛素血症。目前，临床常用的a-葡萄糖苷酶抑制剂有阿卡波糖(acarbose)、伏格列波糖(voglibose)、米格列醇(miglitol)等。但是，这些药物不仅价格昂贵，而且临床应用中发现有较大的毒副作用，不能长期使用。如近来发现阿卡波糖(拜糖平)有损害肝脏的副作用，有可能引起严重的肝功能障碍(《中国糖尿病杂志》2002，10(6):326-329)。急需开发研究天然来源，毒副作用小，可长期使用的a-葡萄糖苷酶抑制剂。中药甘草为豆科植物甘草(G7:vqFT/H:zflwra/m^Fisch.)，胀果甘草(G/j^^r/ziza/"/7atoBat.)或光果甘草(G(yc;^r/^ag/a6raL.)的干燥根及根茎。我国是世界上认识和研究甘草最早的国家，东汉的《神农本草经》中即有记载。其味甘，性平，入心、肺、脾、胃经。用于治疗脾胃虚弱、中气不足、咳嗽气喘、痈疽疮毒、腹中挛及作痛等病症和缓和药物烈性、解药毒。科学研究实验表明甘亨中富含甘草酸、甘草次酸、黄酮、皂苷、生物碱和氨基酸等成分，具有抗病毒、抗菌、抗溃疡、抗氧化、抗肿瘤、解毒、保肝等功效。近年来，随着对甘草药理作用的深入研究，表明甘草具有抗病毒、抗菌、抗溃疡、抗炎、降血脂、镇痛等作用。
发明内容甘草作为一种常用中药和香料，资源丰富，价格低廉，应用非常广泛，具有进一步开发利用的价值和研究背景。我们研究组经多年研究从中药甘草中提取分离出降血糖有效成分。本发明的目的旨在提供一种甘草黄酮分散片制备方法。另则，在试验中，甘草黄酮分散片剂作药物活性成份在药理学功效日趋显现，糖尿病模型小鼠试验研究显示该制剂降糖效果明显，本发明的另一目的旨在上述片剂作药物活性成份在降血糖中的应用。本发明的目的可以通过以下技术方案来实现甘草黄酮分散片的制备，其步骤是取甘草饮片，按甘草与95%乙醇1:4比例回流提取3次，每次2h，合并滤液，回收溶剂，得浸膏，将所得浸膏通过30-60目聚酰胺柱层析，依次用水、95%乙醇洗脱，以盐酸-镁粉反应检测合并得总黄酮，再经浓縮和冷冻干燥得总黄酮粉末；取4-12%羧甲基淀粉钠(CMS-Na)、2-6。/。L-低取代羟丙基纤维(HPC)、0.5-1.5%十二烷基硫酸钠(SLS)与20-85°/。甘草黄酮粉末，加适量微晶纤维素(MCC)，过100目筛混合均匀，6(TC干燥后，直接压片。本发明的另一目的是通过甘草黄酮分散片三个剂量组对四氧嘧啶、肾上腺素、葡萄糖引起的高血糖模型小鼠均有显著的降血糖作用来实现。本发明的优点和产生的有益效果1、本发明制剂，主要降糖成分取自天然药物，原料药来源广泛，制备工艺简单，产品生产所需成本较低，适宜大规模工业化生产。2、本发明制剂，降糖效果明显，毒副作用低，适于长期使用。本发明制剂对四氧嘧啶、肾上腺素和葡萄糖引起的高血糖小鼠模型均有显著的降血糖作用(见表4、表5、表6)。其降糖作用与临床使用同类降糖药物拜糖平相当或更显著。同时糖尿病模型小鼠的"三多一少"症状明显缓解，尤其是饮水量明显;^少。与拜糖平严重的肝脏损害和有可能引起严重的肝功能障碍等副作用相比，本制剂小鼠急性毒性试验研究表明，该制剂毒性很低，最大给药剂量下未见毒副反应，小鼠体重增长正常。3、本发明制剂各项质量均符合药典分散片的质量要求。以崩解时间为考察指标，对甘草黄酮分散片的处方组成和制备工艺进行了初选和正交试验优选(见表l因素水平表)。确定甘草黄酮分散片的最优处方为4n/。CMS-Na、4%L-HPC、1.5%SLS、25。/。甘草黄酮和65.5。/。MCC，干法直接压片(250mg/片)(见表2L9(3^试验表)。按此工艺制得的分散片崩解时间、分散均匀性和溶出度(见图l甘草黄酮分散片溶出度曲线图)均符合药典分散片的质量要求。4、本发明制剂稳定性良好。本发明对甘草黄酮分散片的制剂稳定性进行了研究，甘草黄酮分散片在40'C，照度为4000Lx，相对湿度为75%条件下放置3个月，甘草黄酮的含量没有明显变化(结果见表3)。图1甘草黄酮分散片溶出度曲线图具体实施方式(一)甘草黄酮分散片的制备实施例1称取甘草饮片2000g，按甘草与95%乙醇1:4比例回流提取3次，每次2h，合并3次滤液，减压蒸馏回收溶剂，得浸膏356g，将所得浸膏通过30-60目聚酰胺柱层析，依次用水、95%乙醇洗脱，以盐酸-镁粉反应检测，合并得总黄酮。再经，縮和冷冻干燥得总黄酮粉末82.45g，产率为4.12%。按处方量称取4%CMS-Na、4%L-HPC、1.5。/。SLS与20。/。黄酮粉末，加适量MCC，过100目筛混合均匀，6(TC干燥后，直接压片(每片含有效成分250mg)。甘草黄酮分散片(LFT)的制备工艺(1)制备工艺的优选根据文献及预试验，影响分散片制备工艺的主要因素有崩解剂、粘合剂、表面活性剂、压力等。但由于甘草黄酮本身具有一定的吸湿性和粘连性，因此本试验以崩解时间作为指标，只考察崩解剂羧甲基淀粉钠和低取代羟丙基纤维素、表面活性剂十二烷基硫酸钠的用量。试验安排见表l。表l.甘草黄酮分散片制备的因素水平表Tab.lThetableoffactorandlevel水平因素CMS-Na(%)—AL-HPC(%)~BSLS(%)~C1420.5284131261.5按表1的实验安排制得的分散片，分别按药典规定的分散片崩解时限检查法检查，即在(20士1)"水中，3min内应全部崩解。试验结果(见表2)表2L9(3、试验表Tab.2ThetableofL9(33)test试验号~~i~~2346789因CMS-Na(%)~AL-HPC(%)—BSLS(%)~C4448881212122462462460.511.511.50.51.50.51崩解时间(s)Tii42421098311910185137经过直观分析，可知各因素对崩解时间的影响大小顺序为B〉OA，并且确定最佳工艺处方为CMS-Na的用量为4%、L-HPC的用量为4%、SLS的用量为1.5%。验证试验测定按照上述优选的最佳工艺所制备的甘草黄酮分散片(n-3)硬度为(52±4)N，崩解时间为(72±9)s，且能够均匀分散。(2)分散均匀性检查S655。974So<y。792oSg008SS21化^差MMM极按药典规定的分散片分散均匀性检査，取制得的分散片2片置于100mL水中，搅拌至完全分散，颗粒全部通过2号筛。(3)溶出度旳测定(a)对照品溶液的制备精密称定甘草苷对照品10mg，用50%甲醇溶解，定容于50mL容量瓶中，得浓度为0.2mg，mL—1的对照品溶液。(b)检测波长的确定精确"次取甘草苷对照品溶液2mL，加入7%NaOH溶液2mL，室温放置5min，用甲醇定容至10mL，用甲醇做空白对照，于190800nm波长处扫描，结果在409nm处有最大吸收。以同样的方法对辅料进行处理后扫描，发现辅料在此处无吸收，因而确定检测波长为409nm。(c)标准曲线的制作精确吸取0.2mgTnL"甘草苷对照品溶液0.05、0.1、0.25、0.5、lmL，分别加入lmL甲醇，再加入7n/。NaOH溶液2mL，室温放置5min，用甲醇稀释至10mL，在409nm处测定其吸收值。以吸收度Y为纵坐标，浓度X为横坐标，得线性回归方程Y=35.419X+0.0506，r=0.998，线性范围为120吗'ml/1。(d)测定方法按照浆法，量取300mL蒸馏水作为溶出介质，温度为(37±0.5)。C，转速为(100士l)rpm，分别于l、2、5、10、20、30min取经0.8iim微孔滤膜过滤的续滤液2mL，加入7n/。NaOH溶液2mL，室温放置5min，用甲醇定容至10mL，在409nm处测定其吸收值，并计算其累积溶出百分率，结果见图l。(e)甘草黄酮分散片稳定性研究甘草黄酮分散片在40'C，照度为4000Lx，相对湿度为75%条件下放置3个月，甘草黄酮的含量没有变化(见表3稳定性试验结果)。表3甘草黄酮分散片稳定性试验结果(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实验例2甘草黄酮分散片作药物活性成份在降血糖中的应用(一)甘草黄酮分散片(LFT)对小鼠血糖影响的实验研究(1)甘草黄酮分散片对四氧嘧啶诱发糖尿病小鼠的血糖影响实验取昆明种小鼠85只，雌雄各半，禁食12h，除正常对照外，各组均腹腔注射四氧嘧啶(200ml/kg)，正常对照组为腹腔注射等量生理盐水，72h后预测血清葡萄糖水平，选用血糖值在16mmol/L以上进行试验，小鼠分为正常对照组,模型组，拜糖平组(25mg/kg),LFT高剂量组(150ml/kg)，LFT中剂量组(100mg/kg)，LFT低剂量组(50mg/kg)，每天灌胃给药1次，对照组和模型组给予等体积蒸馏水，连续7天，于末次给药后lh，小鼠眼眶静脉丛取血，按葡萄糖氧化酶法测定血糖水平。结果见表4。表4LFT对四氧啼啶引起高血糖小鼠血糖的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注与模型组比较"P〈0.01，*p<0.05从表4可以看出，与四氧嘧啶模型组比较，LFT大、中、小剂量均对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖升高有显著抑制作用。与临床使用同类型降糖药物拜糖平相比效果相当或更好。一般观察造模后小鼠多饮、多食、多尿、体重减轻即"三多一少"症状明显。随着实验的进行LFT高中低三个剂量组对模型小鼠的"三多一少"症状均有所缓解，尤其是饮水量明显减少。(2)甘草黄酮分散片对肾上腺素引起的高血糖小鼠的血糖影响实验实验用昆明种小鼠60只，雌雄各半，随机分为对照组，模型组，拜唐苹组(25mg/kg)，LFT高剂量组(150ml/k)，LFT中剂量组(100mg/kg)，LFT低剂量组(50mg/kg)，对照组和模型组给予等量生理盐水，每天灌胃给药l次，连续7天，末次给药后lh，各组(除对照组腹腔注射等体积的生理盐水外)均腹腔注射肾上腺素(240ug/kg)，分别于注射后0.5和lh，从小鼠眼眶静脉丛取血测定血糖含量。结果见表5。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>结果表明，LFT高、中、低三个剂量组在0.5、lh时具有明显抑制肾上腺素的升血糖作用。其抑制效果与拜糖平相当。(3)甘草黄酮分散片对葡萄糖引起的高血糖小鼠的血糖影响实验实验用昆明种小鼠60只，雌雄各半，随机分为对照组，模型组,拜唐苹组(25mg/kg)，LFT高剂量组(150ml/kg)，LFT中剂量组(100mg/kg),LFT低齐U量组(50mg/kg)，对照组和模型组给予等体积生理盐水，每天灌胃给药1次，连续7天，末次给药后lh，除对照组腹腔注射等体积生理盐水，其余各组注射葡萄糖(2.0g/kg)溶液，分别在注射葡萄糖后0.5、1、2h，从小鼠眼眶静脉丛取血测定血糖含量，结果见表6。表6甘草黄酮分散片(LFT)对葡萄糖引起高血糖小鼠的血糖影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>从表6中可以看出，LFT对在0.5h葡萄糖引起的血糖升高具有明显抑制作用，1、2h时仍有一定的降糖作用。其降糖效果与拜糖平相近。上述的实验研究表明甘草黄酮分散片对多种糖尿病小鼠动物模型具有较显著的降血糖作用，且中剂量(10Omg/kg)效果最佳。(二)安全性研究(1)急性毒性试验预试验试验用体重18-22g昆明种小白鼠，雌雄各半，共10只。将甘草黄酮分散片(LFT)溶于一定量的蒸馏水中，配成最大浓度(0.4g/ml)(以灌胃不赌针为准)，给小鼠一次灌胃受试物0.8ml/20g，观察是否引起小鼠死亡，若能引起小鼠死亡，按预实验结果进行LDs。测定。若不能引起小鼠死亡，限于给药体积，未能测出其LD5。，按有关规定进行最大给药量实验。结果小鼠灌胃最大浓度后，没引起小鼠有异常和死亡现象。(2)最大耐受量(MTD)实验.昆明种小白鼠，18-22g，雌雄各半，共20只。实验前禁食16小时，不禁水，于24小时内按最大浓度最大灌胃体积0.8ml/20g给小鼠灌胃受试物3次，连续观察七天，记录小鼠活动行为、大小便和饮食等情况。观察七天，未见小鼠有行为异常、死亡等情况，体重正常增长。计算其最大灌胃量为]2g/kg。权利要求1、甘草黄酮分散片的制备，其步骤是取甘草饮片，按甘草与95％乙醇1∶4比例回流提取3次，每次2h，合并滤液，回收溶剂，得浸膏，将所得浸膏通过30-60目聚酰胺柱层析，依次用水、95％乙醇洗脱，以盐酸-镁粉反应检测合并得总黄酮，再经浓缩和冷冻干燥得总黄酮粉末；取4-12％羧甲基淀粉钠、2-6％L-低取代羟丙基纤维、0.5-1.5％十二烷基硫酸钠与20-85％甘草黄酮粉末，加适量微晶纤维素，过100目筛混合均匀，60℃干燥后，直接压片。2、甘草黄酮分散片作药物活性成份在降血糖中的应用。全文摘要本发明公开了一种甘草黄酮分散片的制备及该片剂作药物活性成份在降血糖中的应用。活性实验结果显示，甘草黄酮分散片三个剂量组对四氧嘧啶、肾上腺素、葡萄糖引起的高血糖模型小鼠均有显著的降血糖作用；其降糖作用与临床使用同类降糖药物拜糖平相当或更显著。同时糖尿病模型小鼠的“三多一少”症状得到明显缓解，尤其是饮水量明显减少。小鼠急性毒性试验实验表明在最大给药剂量下，小鼠未见毒副反应，体重增长正常。本发明原料药来源广泛，主要降糖成分取自天然药物，降糖效果明显，适于长期使用。本制剂制备工艺简单，生产所需成本较低，适宜大规模工业化生产。文档编号A61K36/484GK101347495SQ200710018420公开日2009年1月21日申请日期2007年7月16日优先权日2007年7月16日发明者倪京满,姚世霞,锐王,莉董,许有瑞申请人:兰州大学