专利名称：：一种新的抗肿瘤化合物及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种药物化合物，特别涉及抗肿瘤的天然化合物修饰的衍生物，确切地说是喜树碱新的衍生物作为新的抗肿瘤化合物及其制备方法。
背景技术：
：喜树碱是从我国栱桐科植物中提取得到的一种生物碱，具有很强的抗肿瘤活性。其结构如下但喜树碱本身由于毒副作用较大，其应用受到限制，而它的衍生物中已有多种活性高，而毒性较小的新化合物已被合成，其中数十种已进入各期临床试验，少数已被批准用于临床治疗。例如伊立替康(Irrinotican)和拓扑替康(Topotican)等。在喜树碱的E内酯环开环的衍生物中也发现一些活性与喜树碱相当或更好，而毒性比喜树碱小的新化合物(参见J.P.A.H1,131,179；CN1126212A；US006,121,277A)。申请人在分析、比较喜树碱构效关系的研究中，用N-(3-氨基丙基)吗啉或4-(3-氨基丙基)咪唑对E内酯环进行氨解开环、并利用吗啉基和咪唑基的碱性与酸形成药学上可以接受的盐，以及进一步将17-位羟基酯化和9，10，11-位上有卤原子、羟基或烷氧基取代所形成的系列化合物申请了中国专利(CN1803799A、CN1821247A、CN1821245A)。
发明内容本申请旨在提供一种抗肿瘤活性更强的化合物，所要解决的技术问题是基于对喜树碱构效关系系统研究的认识将7-位上有亲脂取代基、9，10，11-位上有卤原子、羟基或烷氧基等取代基以及E内酯环氨解开环或17-位羟基进一步酯化共同形成新的喜树碱衍生物。本发明所称的新的抗肿瘤化合物是一种新的喜树碱衍生物，其化学结构如下式中R1代表C1-C6的直链或支链烷基或C3-C8的环烷基；R2代表9、10或11-位上的0-3个相同或不同的取代基，这些取代基选自卤原子、硝基、氨基、羟基或烷氧基，如F、Cl、Br、NO2、NH2、OH、OMe、OEt；R3代表氢原子或R4CO-；R4代表C1-C4的直链或支链烷基、甲氧基亚烷基或甲氨基亚烷基和二甲氨基亚烷基，如-CH3、-(CH2)nCH3、-(CH2)nOCH3、-(CH2)nNHCH3、-(CH2)nN(CH3)2，后4个式中n＝1-3。优选的化合物是R1代表-CH3、-CH2CH3或环戊基；R2代表9-NO2、9-NH2、10-OH、10-OCH3、10-F或11-OH；R3代表氢原子或R4CO-；R4代表C1-C4的直链或支链烷基。最优选的化合物是R1代表-CH2CH3或环戊基；R2代表10-OH；R3代表H或R4CO-；R4代表-CH3或-CH2CH3。优选以下化合物7-乙基-10，17-二羟基-21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺E环开环喜树碱，7-环戊基-10，17-二羟基-21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺E环开环喜树碱，7-乙基-10-羟基-17-乙酰氧基-21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺E环开环喜树碱，7-环戊基-10-羟基-17-乙酰氧基-21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺E环开环喜树碱，7-乙基-10-羟基-17-丙酰氧基-21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺E环开环喜树碱，7-环戊基-10-羟基-17-丙酰氧基-21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺E环开环喜树碱。本发明的另一方面涉及式(I)化合物的制备方法，制备反应可用如下简图表示由式2化合物与式3化合物反应得到式4化合物，式4化合物在碱性条件下与适当的酰化试剂反应得式5化合物。该制备方法包括以下步骤(1)、将化合物2溶于强极性的溶剂中，再加入化合物3于70-80℃条件下进行反应，直至体系澄清；所述的强极性溶剂包括甲醇，乙醇；(2)、将(1)中得到的反应混合物倒入弱极性的溶剂中，使产物4以沉淀的方式析出；所述的弱极性溶剂包括乙醚、石油醚以及C5-C8的饱和烷烃或环烷烃；(3)、将(2)中获得的产物4在吡啶存在下与酰化试剂在15-40℃温度下反应过夜，主要生成化合物5，同时也有少量10-位羟基酰基化的副产物；(4)、将(3)中所得的反应混合物蒸去低沸点溶剂，剩余物倒入乙醚中，析出淡黄色固体粗产物；(5)、将(4)中所得粗产物用硅胶柱层析纯化得纯度≥98％的式5化合物。洗脱剂可为石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1→4∶1。式(1)化合物的用途是在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的肿瘤是肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、乳腺癌、卵巢癌或白血病等。所述的药物是式(1)原药与药剂学上允许的各种辅料加工的制剂。具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明实施例一7-乙基-10-羟基喜树碱氨解开环产物4a的制备98mg(0.25mmol)7-乙基-10-羟基喜树碱2a与5当量的氨解试剂N-(3-氨基丙基)吗啉3和5ml甲醇混合，于80℃下反应12小时后，体系变澄清，将反应混合物逐滴加入乙醚中，析出黄色沉淀，滤出沉淀，用冷乙醚洗涤。由TLC可看出，产物中含有未反应的原料2a。将产物溶于少量CHCl3，用氧化铝柱层析分离(洗脱剂∶乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1→4∶1)得纯的开环产物4a113mg，产率81％。IR(KBr)v1655.24cm-1(-CONH-)。1HNMR(CDCl3，300MHz)δppm1.08(t，J＝7.20Hz，3H，18-CH3)，1.29(t，J＝7.23Hz，3H，7-CH2CH3)，1.79(m，2H，19-CH2)，2.25(m，1H，23-CH2)，2.43(m，1H，23-CH2)，2.44(m，6H，24-CH2，and2×25-CH2)，3.07(q，2H，7-CH2CH3)，3.41(m，2H，22-CH2)，3.75(m，4H，2×26-CH2)，4.88(q，JAB＝12.70Hz，2H，17-CH2)，5.04(s，2H，5-CH2)，7.48(s，1H，14-H)，7.56(s，1H，9-H)，7.67(d，J＝5.32Hz，1H，11-H)，7.97(d，J＝5.83Hz，1H，12-H)，8.20(s，1H，NH)，9.72(br，1H，10-OH)。实施例二7-环戊基-10-羟基喜树碱的氨解开环产物4b的制备433mg7-环戊基-10-羟基喜树碱2b(1mmol)与5当量的N-(3-氨基丙基)吗啉3和5mL甲醇混合，加热至75℃，搅拌反应14小时，反应液变为澄清，将反应混合物逐滴加入乙醚中，析出黄色沉淀，滤出沉淀，用冷乙醚洗涤。粗产物溶于少量CHCl3，用氧化铝柱层析分离(洗脱剂∶乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1→1∶4)得纯的开环产物4b483mg，产率90％。IR(KBr)v1651.08cm-1(-CONH-)。1HNMR.(CDCl3，300MHz)δppm1.06(t，J＝6.44Hz，3H，18-CH3)，2.05(m，2H，19-CH2)，2.06(m，1H，环戊基1’-CH)，2.24(m，4H，环戊基2×2’-CH2)，2.25(m，1H，23-CH2)，2.43(m，1H，23-CH2)，2.44(m，6H，24-CH2，and2×25-CH2)，3.41(m，2H，22-CH2)，3.75(m，4H，2×26-CH2)，3.86(m，4H，环戊基2×3’CH2)，4.92(dd，JAB＝12.64Hz，2H，17-CH2)，5.04(s，2H，5-CH2)，6.94(s，1H，)，7.48(s，1H，14-H)，7.56(s，1H，9-H)，7.67(d，J＝5.20Hz，1H，11-H)，7.97(d，J＝5.47Hz，1H，12-H)，8.20(s，1H，NH)，9.72(br，1H，10-OH)。实施例三4a的17-羟基乙酰化产物5a的制备537mg7-乙基-10-羟基喜树碱氨解开环产物4a(1mmol)溶于1mL(12.4mmol)吡啶中，加入0.15mL(1.5mmol)乙酸酐，加热使温度维持在40℃左右，搅拌过夜，TLC表明除生成预期的产物5a外，有少量10，17-羟基同时乙酰化的副产物生成。减压蒸去溶剂。残留物用少量的CHCl3溶解，倒入20mL石油醚乙醚等体积比的混合液中，析出沉淀，过滤，冷乙醚洗涤。再用CHCl3溶解，硅胶柱层析纯化(洗脱剂∶乙酸乙酯∶石油醚＝2∶1→纯乙酸乙酯)，得黄色的固体粉末5a409mg。产率70.5％。IR(KBr)v1734.73cm-1(-CH3COO-)，1620.38cm-1(-CONH-)。1HNMR(CDCl3，300MHz)δppm1.10(t，J＝7.17Hz，3H，18-CH3)，1.28(t，J＝7.34Hz，3H，7-CH2CH3)，1.77(m，2H，19-CH2)，2.06(s，3H，-CO-CH3)，2.30(m，1H，23-CH2)，2.52～2.54(m，7H，24-CH2，2×25-CH2，1/2×23-CH2)，3.03(q，J＝7.35Hz，2H，7-CH2CH3)，3.31～3.42(m，2H，22-CH2)，3.78(d，J＝4.38Hz，4H，26-CH2)，5.15(q，J＝19.41Hz，2H，5-CH2)，5.47(dd，JAB＝11.58Hz，2H，17-CH2)，7.58(s，1H，14-H)，7.63(s，1H，9-H)，7.69(d，J＝7.23Hz，1H，11-H)，8.04(d，J＝8.34Hz，1H，12-H)，8.17(s，1H，NH)，9.83(br.，1H，10-OH)。实施例四4b的17-羟基乙酰化产物5b的制备7-环戊基-10-羟基喜树碱氨解开环产物4b577mg(1mmol)溶于1mL(12.4mmol)吡啶中，加入0.15mL(1.5mmol)乙酸酐，加热使温度维持在40℃左右，搅拌过夜，减压蒸去溶剂，残留物用少量的CHCl3溶解，倒入20mL石油醚乙醚等体积比的混合液中，析出沉淀，过滤，冷乙醚洗涤，再用CHCl3溶解，硅胶柱层析纯化(洗脱剂∶乙酸乙酯∶石油醚＝2∶1→纯乙酸乙酯)，得5b黄色固体粉末463mg。产率75％。IR(KBr)v1732.63cm-1(-CO-CH3)，1622.17cm-1(-CONH-)。1HNMR(CDCl3，300MHz)δppm1.10(t，J＝7.17Hz，3H，18-CH3)，1.77(m，2H，19-CH2)，2.06(s，3H，CH3COO-)，2.05(m，1H，环戊基1’-CH2)，2.24(m，4H，环戊基2×2’-CH2)，2.30(m，1H，23-CH2)，2.52～2.54(m，7H，24-CH2，2×25-CH2，1/2×23-CH2)，3.31～3.42(m，2H，22-CH2)，3.78(d，J＝4.38Hz，4H，26-CH2)，3.86(m，4H，环戊基2×3’CH2)，5.15(q，J＝19.41Hz，2H，5-CH2)，5.47(dd，JAB＝11.58Hz，2H，17-CH2)，7.58(s，1H，14-H)，7.63(d，J＝8.11Hz，1H，9-H)，7.69(d，J＝7.23Hz，1H，11-H)，8.04(d，J＝8.34Hz，1H，12-H)，8.17(s，1H，NH)，9.83(br.，1H，10-OH)。实施例五4a的17-羟基丙酰化产物5c的制备537mg7-乙基-10-羟基喜树碱氨解开环产物4a(1mmol)溶于1mL(12.4mmol)吡啶中，加入0.2mL(1.6mmol)丙酸酐，加热使温度维持在40℃左右，搅拌过夜，蒸去低沸点溶剂，剩余物倒入50mL乙醚，析出淡黄色固体，经硅胶柱层析进一步纯化(洗脱剂∶乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1→3∶1)得5c纯产品362mg，产率61％。IR(KBr)v1729.83cm-1(-COCH2CH3)，1654.52cm-1(-CONH-)。1HNMR.(CDCl3，300MHz)δppm1.11(t，J＝7.23Hz，3H，18-CH3)，1.21(t，J＝7.05Hz，3H，CH3CH2COO-)，1.27(t，J＝7.28Hz，3H，7-CH2CH3)，1.77(m，2H，19-CH2)，2.31(m，1H，1/2×23-CH2)，2.15～2.40(m，1H，1/2×23-CH2)，2.55～2.56(m，6H，24-CH2and2×25-CH2)，3.05(q，J＝7.31Hz，2H，7-CH2CH3)，3.32(m，1H，1/2×22-CH2)，3.44(m，1H，1/2×22-CH2)，3.48(q，J＝6.99Hz，2H，CH3CH2COO-)，3.79(t，J＝4.50Hz，4H，2×26-CH2)，5.13(q，J＝19.17Hz，2H，5-CH2)，5.47(q，J＝AB＝11.58Hz，2H，17-CH2)，7.57(s，1H，14-H)，7.60(s，1H，9-H)，7.68(d，J＝7.51，1H，11-H)，8.03(d，J＝8.46，1H，12-H)，8.21(s，1H，NH)，9.76(br.，1H，10-OH)。实施例六4b的17-羟基丙酰化产物5d的制备7-环戊基-10-羟基喜树碱氨解开环产物4b577mg(1mmol)溶于1mL(12.4mmol)吡啶中，加入0.2mL(1.6mmol)丙酸酐，加热使温度维持在40℃左右，搅拌过夜蒸去低沸点溶剂，剩余物倒入50mL乙醚，析出淡黄色固体，经硅胶柱层析进一步纯化(洗脱剂∶乙酸乙酯∶石油醚＝1∶1→3∶1)得5d纯产品421mg，产率66.5％。IR(KBr)v1729.83cm-1(-COCH2CH3)，1654.52cm-1(-CONH-)1HNMR.(CDCl3，300MHz)δppm1.11(t，J＝7.23Hz，3H，18-CH3)，1.21(t，J＝7.05Hz，3H，CH3CH2COO-)，1.77(m，2H，19-CH2)，2.05(m，1H，环戊基1’-CH2)，2.24(m，4H，环戊基2×2’-CH2)，2.31(m，1H，1/2×23-CH2)，2.40～2.15(m，1H，1/2×23-CH2)，2.55～2.56(m，6H，24-CH2and2×25-CH2)，3.32(m，1H，1/2×22-CH2)，3.44(m，1H，1/2×22-CH2)，3.48(q，J＝6.99Hz，2H，CH3CH2COO-)，3.79(t，J＝4.50Hz，4H，2×26-CH2)，3.86(m，4H，环戊基2×3’-CH2)，5.13(q，J＝19.17Hz，2H，5-CH2)，5.47(q，J＝AB＝11.58Hz，2H，17-CH2)，7.57(s，1H，14-H)，7.60(d，J＝8.10，1H，9-H)，7.68(t，J＝7.51，1H，11-H)，8.03(d，J＝8.46，1H，12-H)，8.21(s，1H，NH)，9.76(br.，1H，10-OH)。实施例七5a化合物的盐酸盐的制备将0.5g5a化合物溶于20ml甲醇中，逐滴滴加20％盐酸溶液至PH中性，蒸除溶剂，残留物用乙醇重结晶得亮黄色5a化合物的盐酸盐晶体401mg，mp244-246℃。实施例八5d化合物的对甲苯磺酸盐的制备将0.53g5d化合物溶于30ml氯仿中，加入等摩尔对甲苯磺酸，加热搅拌至固体完全溶解，蒸除溶剂，残留物用乙醇重结晶得浅黄色5d化合物的对甲苯磺酸盐晶体447mg，mp233-236℃.本发明喜树碱衍生物的抗肿瘤活性实验1、实验方法MTT法1).取处于指数生长期状态良好的细胞一瓶，加入0.25％胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数2～4×10-4个/mL，制成细胞悬液。2).取细胞悬液接种于96孔板上，180μl/孔，置恒温CO2培养箱中培养24小时。3).换液，加入受试药物，20μl/孔，培养48小时。4).将MTT加入96孔板中，20μl/孔，培养箱中反应4小时。5).吸去上清夜，加入DMSO，150μl/孔，平板摇床上振摇5分钟。6).用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的吸光值，并计算细胞抑制。体外抗肿瘤作用筛选中，不同类型受试物的阳性作用判断标准见下表<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="763">已知分子量化合物(mol/L)未知化合物μg/ml粗提物μg/ml细胞抑制率％活性1×10-71×10-61×10-5110100220200≥50≥50≥50+++强效1×10-71×10-61×10-5110100220200＜50≥50≥50++中效1×10-71×10-61×10-5110100220200＜50＜50≥50+弱效</table></tables>2、受试细胞株选用人肺癌细胞A549，人低分化胃腺癌细胞BGC-823，人肝癌细胞SMMC-7721，人幼粒细胞白血病细胞HL-60四个细胞株。3、实验结果表中4a-b，5a-d分别代表本发明各化合物7-乙基-10，17-二羟基-21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺E环开环喜树碱4a，7-环戊基-10，17-二羟基-21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺E环开环喜树碱4b，7-乙基-10-羟基-17-乙酰氧基-21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺E环开环喜树碱5a，7-环戊基-10-羟基-17-乙酰氧基-21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺E环开环喜树碱5b，7-乙基-10-羟基-17-丙酰氧基-21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺E环开环喜树碱5c，7-环戊基-10-羟基-17-丙酰氧基-21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺E环开环喜树碱5d。本发明各化合物静脉给药对小鼠的急性毒性试验急性毒性试验，本发明各化合物经小鼠静脉注射(iv)给药，所得结果按Bliss法计算，各化合物的的LD50值列于下表其95％的置信限为257.7～353.2mg/kg。小鼠的中毒症状表现为摄食减少，自发活动明显下降，腹卧，眼睑下垂，对外界刺激反应迟钝，动物安静而亡。最高剂量组给药3h后即出现动物死亡，各剂量组动物死亡均发生在48h内，约48小时后，小鼠活动开始增加并恢复正常。死亡小鼠肉眼尸检，脏器未见明显病变。总之，式(1)化合物具有高的抗癌活性和低毒性。此外，其中4a和4b有很好的水溶性性，5a-5d转变成相应的盐，也有很好的水溶性，从它们中有望发展出更有效的抗肿瘤药物制剂。权利要求1.一种新的抗肿瘤化合物，其特征在于如下结构式(1)所示的喜树碱衍生物式中R1代表C1-C6的直链或支链烷基或C3-C8的环烷基；R2代表9、10或11-位上的0-3个相同或不同的取代基，这些取代基选自卤原子、硝基、氨基、羟基或烷氧基；R3代表氢原子或R4CO-；R4代表C1-C4的直链或支链烷基、甲氧基亚烷基或甲氨基亚烷基和二甲氨基亚烷基。2.根据权利要求1所述的喜树碱衍生物，其特征在于R1代表-CH3、-CH2CH3或环戊基；R2代表9-NO2、9-NH2、10-OH、10-OCH3、10-F或11-OH；R3代表氢原子或R4CO-；R4代表C1-C4的直链或支链烷基。3.根据权利要求1或2所述的喜树碱衍生物，其特征在于R1代表-CH2CH3或环戊基；R2代表10-OH；R3代表H或R4CO-；R4代表-CH3或-CH2CH3。4.根据权利要求3所述的喜树碱衍生物，其特征在于是如下化合物7-乙基-10，17-二羟基-21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺E环开环喜树碱，7-环戊基-10，17-二羟基-21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺E环开环喜树碱，7-乙基-10-羟基-17-乙酰氧基-21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺E环开环喜树碱，7-环戊基-10-羟基-17-乙酰氧基-21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺E环开环喜树碱，7-乙基-10-羟基-17-丙酰氧基-21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺E环开环喜树碱，7-环戊基-10-羟基-17-丙酰氧基-21-N[3-(1-吗啉基)丙基]酰胺E环开环喜树碱。5.由权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，用式2化合物与式3化合物反应得到式4化合物，式4化合物在碱性条件下与酸酐或酰氯反应得式5化合物，6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于经过以下步骤(1)、将式2的化合物溶于强极性的溶剂中，再加入式3式化合物，于70-80℃条件下进行反应，直至体系澄清；所述的强极性溶剂包括甲醇，乙醇；(2)、将(1)中得到的反应混合物加入弱极性的溶剂中，使产物4以沉淀的方式析出；所述的弱极性溶剂包括乙醚、石油醚以及C5-C8的饱和烷烃或环烷烃；(3)、将(2)中获得的产物4在吡啶溶剂中与1当量酸酐或酰氯于15～40℃下反应过夜；(4)、将(3)中所得的反应混合物蒸去低沸点溶剂，剩余物倒入乙醚中，析出淡黄色固体产物5；(5)、将(4)中所得粗产物用硅胶柱层析纯化可得纯度大于98％的目标化合物；洗脱剂为石油醚∶乙酸乙酯＝1∶1→4∶1。7.由权利要求1所述的化合物的用途是在制备抗肿瘤药物中的应用。8.根据权利要求7所述的抗肿瘤用途，所述肿瘤是肺癌，肝癌，胃癌，食道癌，乳腺癌，卵巢癌或白血病。全文摘要一种抗肿瘤化合物是喜树碱衍生物。以7－位上有亲脂取代基、9，10，11－位上有卤原子、羟基等取代基的喜树碱为起始原料，首先用N－(3－氨基丙基)吗啉打开E内酯环，然后或者将17－位羟基进一步酯化得到的新喜树碱衍生物。本化合物毒性低、抗癌活性高，有望开发出更有效的抗肿瘤药物。文档编号A61K31/5355GK101024644SQ20071002111公开日2007年8月29日申请日期2007年3月28日优先权日2007年3月28日发明者尤田耙,王宗贵,曾福星,耿燕申请人:耿燕