专利名称：对趋化因子受体cxcr4具有表型敲除效应的重组蛋白及其构建方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种对趋化因子受体CXCR4具有表型敲除效应的重组蛋白(命名为54R/Tat/KDEL)及其构建方法。
背景技术：
乳腺癌等恶性肿瘤高转移性是致使患者病情发展、难治、恶化乃至死亡的重要原因。有效防止、延缓或阻断肿瘤细胞转移是提高相关肿瘤患者生存率的关键。人们已经注意到许多恶性肿瘤的转移并非随机迁徙，而是有其固有迁移路径和特定器官。有多种学说试图解释这种现象。其中“土壤学说”假设不同器官提供适合特定癌细胞生长的特殊微环境；“返巢学说”则认为不同器官具有识别、吸引或捕捉特定癌细胞的能力。但对引起此现象的内在机制一直缺乏有说服力的解释。2001年Muller等在《自然》杂志首次发表的关于趋化因子受体CXCR4(CXC chemokine receptor 4)与其特异性配体基质细胞衍生因子(SDF-1，Stromal cell-derived factor-1)相互作用密切介导肿瘤转移的研究成果为“返巢学说”提供了有力证据。他们证实CXCR4在人类乳腺癌细胞及其转移瘤的表达水平显著高于正常乳腺细胞；与此相应，SDF-1在乳腺癌常规转移器官，如肺、肝、骨髓、淋巴结中高水平表达，而在非常规性转移器官的表达水平却很低；阻断CXCR4与SDF-1的相互作用能有效削弱乳腺癌细胞向局部淋巴结和肺组织的转移。由此他们提出了CXCR4与SDF-1相互作用支配乳腺癌细胞进行多步骤有序的转移模式(Muller A.，et al.Involvement ofchemokine receptors in breast cancer metastasis.Nature 2001；410(6824)50-56)。相继人们也发现卵巢癌(Chris J.Scotton，et al.Cancer Research 2002；62(20)5930-5938.Porcile C，et al.Ann N Y Acad Sci.2004；1030162-169)、小细胞性肺癌(Takashi Kijima，et al.Cancer Research 2002；62(21)6304-6311)、前列腺癌(Russell S.Taichman，et al.Cancer Res.2002；62(6)1832-1837)、横纹肌肉瘤(Jolanta Libura，et al.Blood 2002；100(7)2597-2606.)、肾透明细胞肉瘤(PeterStaller，et al.Nature 2003；425(6955)307-311)、多发性骨髓瘤(Marisa et al.Experimental Cell Research 2004；294(2)571-580)、子宫内膜癌(Yayoi Mizokami，et al.J.Cancer2004；110652-659)、胰腺癌(Sato N，etal.Cancer Biol Ther.2005，Jan 15；4(1))、骨肉瘤(Perissinotto E，et al.Clin CancerRes.2005；15490-497)等存在与乳腺癌相似的转移模式。
CXCR4/SDF-1驱动癌细胞转移模式的提出无疑为乳腺癌等恶性肿瘤转移的有效防治开拓出崭新思路。而如何消除原发灶与远程特定转移器官之间固有的SDF-1梯度，阻断其与CXCR4相互作用则是利用CXCR4/SDF-1这一新靶点提高防治肿瘤转移有效性的关键。90年代末，人们意外发现CXCR4是X4HIV-1入侵T细胞的重要辅助受体，封闭CXCR4可有效保护T细胞免遭X4HIV-1的感染。这在艾滋病病毒感染机制研究领域的突破性进展促进了CXCR4拮抗剂的研发速度(Craig Gerard，et al.Nature immunity 2001；2(2)108-115)。而在此方面的成果也为开发抗乳腺癌等肿瘤转移的CXCR4拮抗剂奠定了基础。新近证明具有阻断X4HIV-1感染T细胞活性的CXCR4拮抗剂T140能有效抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞从植入部位向肺部的转移(Tamamura H，at al.FEBS Letters 2003；550(1-3)79-83)。新近，Liang等运用反义RNA技术构建两种针对乳腺癌细胞所表达的CXCR4的isRNA。经体外基质胶侵袭实验和动物模型证实该isRNA可抑制乳腺癌细胞CXCR4的表达，进而阻止乳腺癌细胞的转移(Liang Z，at al.Cancer Res.2005；65(3)967-71)。
已知SDF-1α的结构分为N-端功能区、β片层结构和C-端α螺旋结构三个主要功能区。N-端功能区是决定SDF-1α与CXCR4相互作用的亲和力和内在活性的关键部位，C-端α螺旋结构的作用在于维持SDF-1α构象和生物活性(PiusLoescher，et al.Journal of Leukocyte Biology 2001；69881-884)。由此提示，采取基因工程的手段，对SDF-1α的定向遗传改造，保留其对CXCR4的高亲和力，取消其内在活性的技术路线，有可能获得CXCR4特异性拮抗剂。根据SDF-1的构效关系，在前期研究中，对人和小鼠SDF-1α基因进行定向遗传改造，保留N-端和β片层结构，去除C-端α-螺旋，获得CXCR4竞争性拮抗剂SDF-1/54R(专利申请号03146833.0)。研究证实，SDF-1/54R在竞争性拮抗野生型SDF-1α与CXCR4结合的同时，还可促进CXCR4的内在化，导致细胞膜表面CXCR4迅速消失。但此拮抗作用短暂可逆，随着细胞膜上反馈性地CXCR4表达增强，SDF-1/54R对CXCR4介导细胞迁徙的抑制效应也随之消失(Cai Shao-hui，et al.Acta Pharmacologica Sinica 2004；25(2)152-160)。由此我们得到启示欲获得具有临床抗乳腺癌转移应用价值的CXCR4拮抗剂，尝试持久性阻断CXCR4的技术路线是十分必要的。
近年来，一系列运用细胞内抗体/化学因子(intrabody/kine)从细胞内抑制蛋白质表达及其功能的细胞表型修饰技术相继问世，并在艾滋病、肿瘤等疾病防治领域显现出潜在的应用前景(Yurong Yang Wheeler，et al.Moleculartherapy 2003；8(3)355-366)。既然内质网是大多数蛋白质在细胞内加工成熟的核心细胞器，故最常用方法就是利用转基因技术将intrabody/kine定向导入内质网。通过定位在内质网的intrabody/kine特异性地识别和捕获目标蛋白，加速其降解，阻断其在细胞膜上表达或向胞外分泌的通路。基于CXCR4是HIV-1入侵T细胞最重要辅助受体之一的事实，Chen等证明转染SDF intrakine重组质粒的T细胞其胞膜CXCR4表达显著降低，且能有效抵抗HIV病毒的感染(Chen JD，et al.Nature Medicine 1997；3(10)1110-1116)。Onai等用另一种SDF-1αintrakine重组质粒转染小鼠骨髓造血干细胞，结果使其CXCR4表达明显减少，SDF-1α诱导的脾细胞和骨髓细胞迁移明显抑制(Onai N，et al.Blood2000；96(6)2074-2080.)。另据报道，在内质网定位片段的介导下，SDF-1intrakine可致人T淋巴细胞白血病CEM和Jurkat细胞系以及HeLa-T4+细胞等表面CXCR4的表达阻断或大量下调(Engle，B.C.Mol.Ther.2000；1165-170)。由此可见，将intrakine细胞表型修饰技术用于持久性阻断乳腺癌细胞CXCR4的表达不失为一种新思路。但考虑到现行转基因方法在整体应用方面存在诸多局限，因此如何保证将具有CXCR4拮抗作用的蛋白有效导入细胞是实现这一新思路的关键。
新近发现一类称为细胞穿膜肽(CPP，cell penetrating peptide)的小分子肽类化合物可通过无受体介导、无耗能的方式将某些多肽或蛋白质有效导入哺乳动物细胞(Schwarze SR，et al.Trends Pharmacol Sci.2000；21(2)45-48)。源于HIV转录活化因子Tat蛋白的Tat(47～57)片段(GRKKRRQRRRPPQ)被认为是迄今发现的穿膜功能最强的穿膜肽(Nagahara H，at al.Nat Med 1998；4(12)1449-1452)。其穿膜特点是①广谱、高效、快速；②在一定范围内对温度、时间及其浓度不敏感；③不受组织特异性的限制；④在一定浓度范围内不会造成细胞损伤。依据Tat(47～57)的穿膜特点，我们设想，利用穿膜肽Tat(47～57)作为跨膜载体，则有可能将CXCR4拮抗蛋白直接导入细胞。此外，已知KDEL片段具有特异性内质网定位功能，这为促使已进入胞内的CXCR4拮抗蛋白能够特异定位于内质网提供了可能(Bu，G.，et al.J.Cell Sci.1997(110)65-73.Townsley，F.M.，et al.1993，EMBO J.122821-2829.Barbara C.Engel，t al.Molecular Therapy 2000；1(2)165-170)。
发明内容
为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种对趋化因子受体CXCR4具有表型敲除效应的重组蛋白54R/Tat/KDEL。本发明对基质细胞衍生因子-1突变体SDF-1/54R进行二次基因改造，即通过将其与高效穿膜载体Tat(47～57)和内质网定位片段KDEL连接而形成能对肿瘤细胞所表达的趋化因子受体CXCR4(CXC chemokine receptor 4)产生表型敲除效应的重组蛋白。
本发明的另一目的在于提供上述对趋化因子受体CXCR4具有表型敲除效应的重组蛋白54R/Tat/KDEL的构建方法。
本发明对具有CXCR4拮抗活性的SDF-1α的重组突变子SDF-1/54R进行二次基因改造，构建和制备一种由SDF-1/54R(SDF-1α去除C端54个碱基的重组突变子)、高效穿膜载体Tat(47～57)和内质网定位片段KDEL三种短肽片段共同组成的重组蛋白54R/Tat/KDEL。利用Tat(47～57)的高效穿膜功能和KDEL的内质网定位作用，将CXCR4特异性拮抗剂SDF-1/54R导入乳腺癌细胞，达到对其膜表面CXCR4进行表型敲除的目的，从而为最终实现有效阻断乳腺癌转移奠定必要的工作基础。
本发明的目的通过下述技术方案实现的一种对趋化因子受体CXCR4具有表型敲除效应的重组蛋白54R/Tat/KDEL，该重组蛋白由SDF-1/54R(SDF-1α去除C端54个碱基的重组突变子)、HIV(人类免疫缺陷病毒)Tat(47～57)和KDEL片段三部分组成，其核苷酸编码序列为aagcccgtca gcctgagcta cagatgccca tgccgattct tcgaaagcca tgttgccaga 60gccaacgtca agcatctcaa aattctcaac actccaaact gtgcccttca gattgtagcc 120cggctgaaga acaacaacag acaagtgtgc attgacccga agctaaagtg gattcaggag 180tacctggaga aagctttaaa caagggatcc tacggccgta agaagcgccg ccagcgccgt 240cgtaaggacg agctc 255
所述的对趋化因子受体CXCR4具有表型敲除效应的重组蛋白54R/Tat/KDEL氨基酸序列为Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu15 10 15Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn20 25 30Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn35 40 45Asn Arg Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu50 55 60Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn Lys Gly Ser Tyr Gly Arg Lys Lys65 70 75Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Asp Glu Leu80 85其中，SDF-1/54R为中国申请专利的天然SDF-1α的重组突变子(专利申请号03146833.0)，研究证实其具有CXCR4竞争拮抗活性，利用结构中Tat(47～57)的高效穿膜功能和KDEL片段的内质网定位作用，SDF-1/54R可被导入细胞，定位内质网，发挥捕获CXCR4蛋白质前体的作用，进而实现对CXCR4的表型敲除。
上述对趋化因子受体CXCR4具有表型敲除效应的重组蛋白54R/Tat/KDEL的构建方法，包括如下步骤按照编码Tat(47～57)和KDEL片段的核酸序列人工合成两条单链寡核苷酸；在95℃下变性5min后，人工合成的单链寡核苷酸自然冷却至室温，即退火形成双链寡核苷酸；然后利用BamHI和XhoI双酶切，将酶切后的双链寡核苷酸定向插入到已含有SDF-1/54R的原核表达载体pET-28a(+)中(3’-末端)，构建成带His-Tag的54R/Tat/KDEL原核表达克隆载体；将带His-Tag的54R/Tat/KDEL原核表达克隆载体转入克隆菌株JM109，扩增并提取重组质粒，经过测序鉴定后转入表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)，用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)进行诱导表达，最后获得裂解菌体上清液，并通过Ni亲和柱获得C端带His-Tag的重组蛋白54R/Tat/KDEL。目标蛋白的N-端带有启始密码子翻译的甲硫氨酸(M)和为了保证阅读框正确而添加的丙氨酸(A)，C-端带有XhoI酶切位点编码的亮氨酸(L)、谷氨酸(E)和6个组氨酸(H)。其氨基酸序列如下MAKPVSLSYRCPCRFFESHVARANVKHLKILNTPNCALQIVARLKNNNRQVCIDPKLKWIQEYLEKALNKGSYGRKKRRQRRRKDELLEHHHHHH。
所述两条单链寡核苷酸如下A5’-GATCCTACGGCCGTAAGAAGCGCCGCCAGCGCCGTCGTAAGGACGAGCTCC-3’；B5’-TCGAGGAGCTCGTCCTTACGACGGCGCTGGCGGCGCTTCTTACGGCCGTAG-3’。
所述Tat(47～57)的N-端带有BamHI酶切位点，所述内质网定位片段KDEL的C-端带有XhoI酶切位点。
利用稳定高表达CXCR4的人白血病T淋巴细胞MOLT-4在体外证实，54R/Tat/KDEL能够将合成的CXCR4定位在内质网内，对MOLT-4(人白血病T淋巴细胞)细胞表面所表达的CXCR4具有表型敲除作用(如图7所示)；并利用高表达CXCR4的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231，在细胞水平证实54R/Tat/KDEL对CXCR4介导的SDF-1趋化作用具有抑制活性(如图8所示)。
本发明首次采取对乳腺癌细胞所表达的CXCR4进行表型敲除的策略来抑制乳腺癌转移。借鉴intrakine和穿膜肽的最新研究成果，对具有CXCR4拮抗活性的SDF-1α的重组突变子SDF-1/54R进行二次基因改造，构建由SDF-1/54R与高效穿膜载体Tat(47～57)和内质网定位片段KDEL共同组成的重组蛋白54R/Tat/KDEL。其中的TAT可以把融合蛋白带入细胞，KDEL可以使融合蛋白定位在内质网，SDF-1/54可以与新合成的CXCR4结合，使CXCR4也定位在此，从而靶向敲除细胞表面的CXCR4，抑制肿瘤细胞的转移。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果本发明运用关于CXCR4与SDF-1相互作用支配肿瘤细胞多步骤有序转移的理论，选择CXCR4为靶标原创性提出在蛋白水平上通过对乳腺癌细胞胞膜表面CXCR4进行表型敲除来抑制乳腺癌转移的策略，借鉴intrakine和穿膜肽的研究成果，构建具有细胞CXCR4表型敲除功能的重组蛋白54R/Tat/KDEL。本发明利用Tat(47～57)的高效穿膜功能和KDEL的内质网定位作用，将CXCR4特异性拮抗剂SDF-1/54R导入乳腺癌细胞，达到对其细胞膜表面CXCR4进行表型敲除的目的，为最终实现有效阻断乳腺癌转移奠定必要的工作基础。本发明的重组蛋白的活性已在体外得到证实，本发明的重组蛋白制备成基因工程药物，相对于化学合成药物还具有科技含量高、投资效益大、符合环保要求等特点。
图1为本发明54R/Tat/KDEL嵌合重组体的构建方案图。
图2为54R/Tat/KDEL/pET28-a(+)的PCR鉴定结果图。
图3为54R/Tat/KDEL/pET28-a(+)测序结果图。
图4为重组蛋白54R/Tat/KDEL的表达结果图。
图5为重组蛋白54R/Tat/KDEL的Western Blot验证结果图。
图6为重组蛋白54R/Tat/KDEL的纯化结果图。
图7为54R/Tat/KDEL使MOLT-4细胞表面CXCR4敲除结果图。
图8为54R/Tat/KDEL抑制SDF-1α诱导的T细胞迁徙结果图。
具体实施例方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1 重组蛋白54R/Tat/KDEL的原核表达系统建立1)Tat(47～57)穿膜肽和KDEL片段的合成在www.pubmed.com网站查找编码Tat(47～57)和KDEL片段的核酸序列，按照BamHI-TAT-KDEL-XhoI依次串联的顺序人工合成两条单链寡核苷酸，两条链序列反向互补，在95℃下变性5min后，人工合成的单链寡核苷酸自然冷却至室温，即退火形成双链寡核苷酸。所述两条单链寡核苷酸如下A5’-GATCCTACGGCCGTAAGAAGCGCCGCCAGCGCCGTCGTAAGGACGAGCTCC-3’；B5’-TCGAGGAGCTCGTCCTTACGACGGCGCTGGCGGCGCTTCTTACGGCCGTAG-3’。
其中，高效穿膜载体Tat(47～57)的N-端带有BamHI酶切位点，内质网定位片段KDEL的C-端带有XhoI酶切位点。
2)将上述双链寡核苷酸和已含有SDF-1/54R的原核表达载体pET-28a(+)同步用BamHI和XhoI双酶切，回收的酶切产物采用T4连接酶进行连接，将TAT-KDEL定向插入到SDF-1/54R/pET-28a(+)中(3’-末端)，构建成带His-Tag的54R/Tat/KDEL原核表达载体。将连接产物用CaCl2法转入100ul感受态菌株JM109，筛选阳性克隆，扩增并按质粒提取试剂盒的操作说明提取重组质粒，DNA自动测序仪(上海生工)测序鉴定证实54R/Tat/KDEL/pET-28a(+)重组体构建成功。54R/Tat/KDEL嵌合重组体的构建方案如图1所示，54R通过BamHI酶切位点与TAT-KDEL顺次连接。54R/Tat/KDEL/pET-28a(+)的PCR鉴定结果如图2所示(其中1.Marker；2-5.54R/Tat/KDEL)。54R/Tat/KDEL/pET-28a(+)测序结果如图3所示(测序引物为T7 promoter primer和T7 terminator primer，ABIDNA自动测序仪，上海生工测定)。
实施例2 54R/Tat/KDEL/pET-28a(+)重组质粒转化大肠杆菌BL21及IPTG诱导表达和纯化取经测序鉴定正确的54R/Tat/KDEL/pET-28a(+)重组质粒约200ng加入200ul感受态BL21(DE3)细菌中(氯化钙法制备)，轻轻混匀，在冰上放置30min，然后在42℃热休克90sec，立即转到冰上放置2min，随后加入800ul LB培养液在37℃条件下振荡培养45min，取200ul铺到含50ug/ml卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜(约12hr)，随机挑取5个阳性菌落分别接种于5ml的LB液体培养基(含50ug/ml卡那霉素)37℃振荡培养约12hr，然后分别取50ul上述培养液转接于50ml的LB液体培养基(含50ug/ml卡那霉素)37℃振荡培养约3hr，当OD600＝0.5时，分别加入终浓度为1.0mM的IPTG 37℃诱导表达3hr，10000×g离心5min收获细菌。54R/Tat/KDEL融合蛋白表达结果如图4所示(1.Marker；2.pET-28a(+)上清；3.pET-28a(+)沉淀；4.54R/Tat/KDEL/pET-28a(+)上清；5.54R/Tat/KDEL/pET-28a(+)沉淀)。54R/Tat/KDEL融合蛋白Western Blot验证结果如图5所示(1-4.54R/Tat/KDEL；5.pET-28a(+))。然后按镍固相亲和层析树脂(Invitrogen，Catalog nos.R801-01，R801-15)操作说明的Native protocol进行纯化，具体操作如下1)离心收集细菌，将沉淀重悬于8ml溶菌酶裂解缓冲液(50mM Tris-HClpH 9.0，0.1mg/ml溶菌酶，1％曲拉通X-100)中。
2)在冰上超声处理细菌裂解液3sec，间隔3sec，重复100次。
3)15000×g离心15min，将上清转入干净的离心管中，取5μl裂解液上清用作SDS-PAGE检测样品。
4)将8ml上清液加入2ml非变性结合缓冲液(20mM NaPO4，pH 8.0，500mM NaCl)平衡的镍固相亲和层析树脂中。
5)室温下静置结合30min，800×g离心5min，吸取上清液。
6)用4ml非变性结合缓冲液(20mM NaPO4，pH 8.0，500mM NaCl)重悬沉淀，在室温下振荡洗涤2min，800g离心5min，小心吸取上清液，并取50μl上清用作SDS-PAGE检测样品。此步骤重复一次。
7)用8ml非变性洗涤缓冲液(20mM咪唑，20mM NaPO4，pH 8.0，500mM NaCl)重悬沉淀，在室温下振荡洗涤2min，800g离心5min，小心吸取上清液，并取50μl上清用作SDS-PAGE检测样品。此步骤重复三次。
8)用8ml洗脱缓冲液(250mM咪唑，20mM NaPO4，pH 8.0，500mMNaCl)重悬沉淀，在室温下振荡洗涤2min，800g离心5min，小心吸取上清于干净的离心管中，并取50μl上清用作SDS-PAGE检测样品，其余保存于-80℃或进行如下操作。
9)将重组蛋白溶液装入透析带中，用PBS透析两次，每次12hr。
10)然后将透析袋内的重组蛋白溶液转移到超滤离心管中进行低温脱盐。
重组蛋白54R/Tat/KDEL的纯化结果如图6所示(1.Marker；2.3.54R/Tat/KDEL)。
实施例3 54R/Tat/KDEL体外CXCR4的表型敲除活性研究1)54R/Tat/KDEL进入细胞的活性研究用54R/Tat/KDEL处理MOLT-4细胞24h，经过SDF-1-荧光抗体染色，用荧光显微镜和流式细胞仪鉴定其侵入细胞的效率，结果显示随浓度的增加和时间的延长侵入细胞的54R/Tat/KDEL增加。
2)亚细胞定位研究用54R/Tat/KDEL处理MOLT-4细胞24h，经抗SDF-1和CXCR4-荧光抗体染色后，再用ConA标记内质网，共聚焦显微镜显示54R/Tat/KDEL和CXCR4共同定位在内质网中。
3)表型敲除活性研究用54R/Tat/KDEL处理MOLT-4细胞24h后，用PBS洗两次，用抗CXCR4-PE荧光抗体冰上孵育30min后，再用PBS洗两次，用流式细胞仪检测细胞膜表面CXCR4的表达量，结果表明细胞表面的CXCR4表达量明显降低。54R/Tat/KDEL使MOLT-4细胞表面CXCR4敲除结果如图7所示(a.阳性对照，高表达CXCR4的MOLT-4细胞，PE染色；b.54R/Tat/KDEL)。
4)54R/Tat/KDEL对SDF-1趋化作用的抑制活性研究用10-9M，10-8M，10-7M，10-6M，10-5M不同浓度的54R/Tat/KDEL预处理乳腺癌MDA-MB-231细胞24h。将含有SDF-1(终浓度1nM)的1640培养基(700μl)加入趋化小室的下层培养腔，小心将上腔置入下层培养腔，并使之腔底悬浮于下腔之中。将预处理的MDA-MB231细胞悬液加入上腔，于37℃培养3小时后，记数转移到下腔的细胞数。结果显示与未经预处理的细胞相比，用54R/Tat/KDEL处理的MDA-MB-231细胞对SDF-1诱导的趋化迁移有显著的抑制作用。54R/Tat/KDEL抑制SDF-1α诱导的T细胞迁移结果如图8所示。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING<110>暨南大学<120>对趋化因子受体CXCR4具有表型敲除效应的重组蛋白及其构建方法<130>26<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>255<212>DNA<213>Artificial sequence<220>
<223>对趋化因子受体CXCR4具有表型敲除效应的重组蛋白54R/Tat/KDEL核苷酸编码序列<400>1aagcccgtca gcctgagcta cagatgccca tgccgattct tcgaaagcca tgttgccaga 60gccaacgtca agcatctcaa aattctcaac actccaaact gtgcccttca gattgtagcc 120cggctgaaga acaacaacag acaagtgtgc attgacccga agctaaagtg gattcaggag 180tacctggaga aagctttaaa caagggatcc tacggccgta agaagcgccg ccagcgccgt 240cgtaaggacg agctc255
<210>2<211>85<212>PRT<213>Artificial sequence<220>
<223>对趋化因子受体CXCR4具有表型敲除效应的重组蛋白54R/Tat/KDEL氨基酸序列<400>2Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu15 10 15Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn20 25 30Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn35 40 45Asn Arg Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu50 55 60Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn Lys Gly Ser Tyr Gly Arg Lys Lys65 70 75Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Asp Glu Leu80 8权利要求
1.一种对趋化因子受体CXCR4具有表型敲除效应的重组蛋白，所述重组蛋白由SDF-1/54R、人类免疫缺陷病毒HIV Tat(47～57)和内质网定位片段KDEL片段三部分组成，其特征在于所述重组蛋白的核苷酸编码序列为aagcccgtca gcctgagcta cagatgccca tgccgattct tcgaaagcca tgttgccaga 60gccaacgtca agcatctcaa aattctcaac actccaaact gtgcccttca gattgtagcc 120cggctgaaga acaacaacag acaagtgtgc attgacccga agctaaagtg gattcaggag 180tacctggaga aagctttaaa caagggatcc tacggccgta agaagcgccg ccagcgccgt 240cgtaaggacg agctc 255。
2.根据权利要求1所述的对趋化因子受体CXCR4具有表型敲除效应的重组蛋白，其特征在于所述重组蛋白的氨基酸序列为Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu1 5 10 15Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn20 25 30Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn35 40 45Asn Arg Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu50 55 60Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn Lys Gly Ser Tyr Gly Arg Lys Lys65 70 75Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Asp Glu Leu80 85。
3.根据权利要求1所述的对趋化因子受体CXCR4具有表型敲除效应的重组蛋白的构建方法，其特征在于包括如下步骤按照编码高效穿膜载体Tat(47～57)和内质网定位片段KDEL片段的核酸序列人工合成两条单链寡核苷酸；在95℃下变性5min后，人工合成的单链寡核苷酸冷却至室温，即退火形成双链寡核苷酸；然后用BamHI和XhoI双酶切，将酶切后的双链寡核苷酸定向插入到已含有SDF-1/54R的原核表达载体pET-28a(+)中，构建成带His-Tag的原核表达克隆载体；将带His-Tag的原核表达克隆载体转入感受态克隆菌株JM109，扩增并提取重组质粒，经测序鉴定后转入表达菌株BL21，用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷进行诱导表达，最后获得裂解菌体上清液，并通过Ni亲和柱获得C端带His-Tag的重组蛋白
4.根据权利要求3所述的对趋化因子受体CXCR4具有表型敲除效应的重组蛋白的构建方法，其特征在于所述两条单链寡核苷酸如下A5’-GATCCTACGGCCGTAAGAAGCGCCGCCAGCGCCGTCGTAAGGACGAGCTCC-3’；B5’-TCGAGGAGCTCGTCCTTACGACGGCGCTGGCGGCGCTTCTTACGGCCGTAG-3’。
5.根据权利要求3所述的对趋化因子受体CXCR4具有表型敲除效应的重组蛋白的构建方法，其特征在于所述高效穿膜载体Tat(47～57)的N-端带有BamHI酶切位点，所述内质网定位片段KDEL的C-端带有XhoI酶切位点。
全文摘要
本发明公开了一种对趋化因子受体CXCR4具有表型敲除效应的重组蛋白及其构建方法。本发明对具有CXCR4拮抗活性的SDF－1α的重组突变子SDF－1/54R进行二次基因改造，构建一种由SDF－1/54R与高效穿膜载体Tat(47～57)和内质网定位片段KDEL三种短肽片段共同组成的重组蛋白54R/Tat/KDEL。利用Tat(47～57)的高效穿膜功能和KDEL的内质网定位作用，将CXCR4特异性拮抗剂SDF－1/54R导入乳腺癌细胞，达到对其膜表面CXCR4进行表型敲除的目的，为最终实现有效阻断乳腺癌转移奠定必要的工作基础。
文档编号A61P35/00GK101063130SQ20071002771
公开日2007年10月31日 申请日期2007年4月26日 优先权日2007年4月26日
发明者蔡绍晖, 杜军, 马伟峰, 陈宏远, 蔡绍皙, 谭毅, 郭芝刚 申请人:暨南大学