一种人糖基磷脂酰肌醇－cd80融合蛋白的制作方法

专利名称：一种人糖基磷脂酰肌醇－cd80融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物化学领域，具体涉及蛋白质，特别是与抗肿瘤有关的蛋白质。
背景技术：
上世纪80年代以后，有关肿瘤疫苗的各种研究呈现阶梯状上升趋势，肿瘤疫苗在现代肿瘤治疗中作为肿瘤术后化疗、放疗的一种重要的辅助治疗手段越来越受到人们的关注，尤其是应用基因工程疫苗治疗已是近年研究的热点。
研究证明，缺乏共刺激信号是肿瘤细胞逃避免疫监视的重要原因之一，机体抗肿瘤的免疫必须依赖于肿瘤细胞的抗原被机体免疫系统识别，方能激活。CD80是表达于活化的B细胞、巨噬细胞、树突细胞、T细胞和NK细胞等有抗原呈递作用的细胞上的糖蛋白，与其配体CD28结合，在T细胞活化中起协同刺激作用。用CD80制备肿瘤疫苗的传统方法是转导法，即将CD80基因直接导入目的肿瘤细胞内表达，该方法存在以下缺点1.需要外源性载体，而病毒等载体进入患者体内，其活动范围，活动过程都无法控制，很可能带来不良反应；2.患者体内进行基因转染，因受体内生理微环境条件的限制，其转染效率往往较低；3.基因表达的过程复杂且耗时；4.外源性基因整合到宿主细胞核染色体后，往往容易降解，或者表达不稳定，所以目前很难运用于临床。
GPI锚定蛋白是不跨越细胞膜脂质双分子层，只通过其羧基末端的GPI结构锚定于细胞膜上。当GPI锚定蛋白与细胞共同孵育时，可以自动整合到细胞膜表面，并可以保持与其天然配体结合的能力。因此，用GPI修饰的CD80可以克服传统方法制备肿瘤疫苗的缺点。1999年McHugh首先在小鼠身上证明将GPI-CD80锚定于小鼠肿瘤细胞上可以增强小鼠的免疫功能，从而起到清除肿瘤的作用(McHugh RS，Nagarajan S，Wang YC，et al.Protein transferof glycosyl-phosphatidylinositol-B7-1 into tumor cell membranesa novel approachto tumor immunotherapy.[J]Cancer Res.1999 May 15；59(10)2433-7.)；2001年Poloso将患者的肿瘤细胞或者是肿瘤细胞碎片经GPI-CD80修饰后对患者的T细胞起到了刺激增殖的作用(Poloso N，Nagarajan S，Bumgarner GW，et al.Designer cancer vaccines made easyprotein transfer of immunostimulatory molecules for use in therapeutic tumorvaccines.[J]Front Biosci.2001 Jun 1；6D760-75.)；于继云研究了GPI-CTLA-4Ig嵌合分子的构建和在CHO细胞膜上的表达(于继云，沈倍奋，黎燕，等.GPI-CTLA4Ig嵌合分子的构建和在CHO-dhfr2细胞膜上的表达[J].细胞与分子免疫学杂志，2003，19(3)212-214)，以及GPI-SEA免疫分子在CHO细胞中的表达(于继云，陈兴，蔡欣，等.超抗原SEA的GPI锚定修饰和在CHO2dhf细胞膜上的表达[J].中国生物工程杂志，2003，23(3)59-61)。上述研究证明了通过基因工程手段将GPI与CD80嵌合表达用于制备新型肿瘤疫苗的可行性，但是上述制备的GPI-CD80肿瘤疫苗的GPI部分来源于非人类基因，可能会由于与人类基因的非同源性影响肿瘤疫苗的作用效果，且安全性差。
易平永、熊茂林设计的GPI锚定型B7-1(CD80)融合蛋白具有较强的抗肿瘤作用(熊茂林，宋畅，罗荣城，等.人糖基磷脂酰肌醇(GPI)-B7-1真核表达载体的构建及表达[J].中国病理生理杂志2005，21(1)154-158)，该融合蛋白是通过制备CD16和B7-1的融合蛋白得到，具有较强的抗肿瘤作用，能用于肿瘤疫苗的制备，但是该融合蛋白锚定于肿瘤细胞表面的稳定性较差，用该融合蛋白制备所得的肿瘤疫苗的抗肿瘤活性也不够理想。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提高GPI-CD80肿瘤疫苗的抗肿瘤活性。
本发明解决上述技术问题的技术方案是，一种人糖基磷脂酰肌醇-CD80融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列为SEQ NO.1，具体是Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr1 5 10 15Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys20 25 30Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu35 40 45Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile50 55 60Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp65 70 75 80Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr85 90 95
Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly100 105 110Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg115 120 125Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr130 135 140Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile145 150 155 160Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu165 170 175Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp180 185 190Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met195 200 205Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg210 215 220Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro225 230 235 240Asp Thr Thr Cys Ile Pro Ser Ser Gly His Ser Arg His Arg Tyr Ala245 250 255
Leu Ile Pro Ile Pro Leu Ala Val Ile Thr Thr Cys Ile Val Leu Tyr260 265 270Met Asn Gly Ile Leu275本发明所述的融合蛋白的制备方法是1.人GPI-CD80真核表达载体的构建根据genebank提供的人CD58(NM 001779)和CD80基因(NM 005191)的参考序列，设计引物P1、P2，PCR扩增CD80基因的胞外段，设计引物P3、P4 PCR扩增CD58基因的GPI信号序列，各引物序列如下P1AGCAGGCTTGGAAGGAGT(SEQ NO.2)P2GGTTGTATCAGGAAAATGC(SEQ NO.3)P3CCTGATACAACCTGTATCCCAAG(SEQ NO.4)P4TCCGCACTCGAGCAGAATACCAT(SEQ NO.5)然后利用重叠延伸PCR技术将两片段连接起来，反应体系总体积50μl，其中pfuMasterMix 24μl，引物P1 0.4μM，引物P4 0.4μM，CD80胞外段0.04ng/μl，CD58基因的GPI信号段0.04ng/μl，其余为ddH2O；反应循环的设置 将上述PCR产物连入T载体，再用NspV和XhoI 37℃酶切2h，将含编码蛋白SEQ NO.1的片段连接于真核表达载体pReciever-M10。
2.真核表达载体在CHO细胞中的转染和表达(1)阳性脂质体转染法转染CHO细胞，经G418加压筛选后得到稳定表达GPI-hCD80的CHO细胞株；(2)提取稳定表达GPI-hCD80蛋白的CHO细胞的膜蛋白后，选用鼠抗人CD80单抗，通过与溴化氢活化的Sepharose 4B藕联制备亲和层析柱，分离纯化GPI-hCD80膜蛋白。
本发明所述的融合蛋白的鉴定1、间接免疫荧光染色检测经转染后CHO细胞膜上CD80的表达情况①分别取对数生长的转染了pRM10/GPI-CD80的CHO细胞和转染pRM10的CHO细胞，用0.25％的胰酶消化，制成单细胞悬液。将细胞接种到预先放置盖玻片的培养皿中，置37℃，5％CO2培养1～3d，待细胞接近长成单层，取出盖玻片，用PBS缓冲液洗2次，每片盖玻片滴加纯丙酮200μl，-20℃固定15min。
②将已经固定的细胞盖玻片用PBS缓冲液振洗5min，去除丙酮。
③滴加适当稀释的鼠抗人CD80抗体(1∶100)，置于湿盒内，37℃保温1h。
④PBS缓冲液振洗2次，每次5min。
⑤滴加适当稀释的羊抗鼠FITC-CD80二抗(1∶50)，置于湿盒内，37℃保温1h。
⑥PBS缓冲液振洗2次，每次5min，然后用蒸馏水振洗1次。
⑦取以上处理好的转染pRM10/GPI-CD80的CHO细胞和转染pRM10的CHO细胞玻片各一，50％缓冲甘油封片，在荧光显微镜下以波长488nm光源激发，观察并拍照；再取处理好的稳定转染的CHO细胞和空CHO细胞玻片各一，滴加0.25％伊文氏兰复染，37℃保温30min，PBS振洗2次后用缓冲甘油封片，在荧光显微镜下以波长488nm光源激发，观察并拍照。
2、流式细胞仪检测经转染后CHO细胞膜上CD80的表达情况用以上制备好的转染了pRM10/GPI-CD80的CHO单细胞悬液，调整细胞浓度为5×106个/ml，用鼠抗人FITC-CD80标记细胞，流式细胞仪检测CHO细胞膜上的GPI-CD80蛋白的表达的阳性细胞数和平均荧光强度。每份样品检测10000个细胞。将pRM10转染的CHO细胞及未转染质粒的CHO细胞分别设为阴性对照和空白对照。
3、Western-blot鉴定表达蛋白(选用鼠抗人CD80单抗和HRP-羊抗鼠IgG进行实验)(1)灌制分离胶和浓缩胶表1 聚丙稀酰胺凝胶的配方(分离胶为10％，浓缩胶为5％)

在三角锥瓶中按表1中的配方依次混合各成分，一加入TEMED立即快速混匀，迅速在两玻璃板间隙中灌注至距离顶部约3cm处，用微量加样器轻轻在顶层加入0.5-1ml双蒸水，覆盖其界面，使界面平整，并防止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用，室温下放置约30min使之聚合；倾去分离胶上面的水，并尽量用滤纸吸干凝胶顶端残存的液体；配置5％SDS-聚丙稀酰胺浓缩胶，加入浓缩胶，立即平行插入梳子，避免气泡，室温下放置30min；平行拔出梳子，立即用去离子水冲洗孔道，防止未聚合的TEMED聚合造成孔道不平整；将凝胶电泳板放入电泳槽。
(2)煮样及上样取50μl蛋白样品及10μl蛋白Marker，分别加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸3min，每孔分别用微量加样器加20μl转染pRM10的CHO细胞蛋白、GPI-CD80蛋白及纯化后的GPI-CD80上样电泳。
(3)电泳接通电源，电压180V，当染料进入分离胶后，电压改为100V，继续电泳直至染料的前沿接近凝胶的底端。切断电源，从电泳槽中取出玻璃板并小心撬开，取出凝胶，标明方位。
(4)染色及脱色将其放入盛有新配考马斯亮蓝染液的容器中，37℃恒温摇床染色45min；用脱色液浸泡凝胶，于摇床上使其脱色至背景清晰。
(5)蛋白质的凝胶半干转印。
①戴手套将剪好的滤纸及硝酸纤维素薄膜在转移缓冲液中浸泡30min。
②在电转移槽内从下向上依次放置滤纸、硝酸纤维素薄膜、凝胶、滤纸，做好标记，精确对齐并用玻棒赶走气泡。
③接通电源，在100mA电流下转移3h，切断电源，取出硝酸纤维素薄膜。
(6)蛋白质印迹①封闭将硝酸纤维素薄膜正面向下放入玻璃平皿中，加入封闭液，室温平摇1h。
②将膜转入1∶500稀释的鼠抗人CD80抗体，室温平摇1h。
③洗涤洗涤液洗3min×5次。
④将硝酸纤维素薄膜加入1∶1000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，室温平摇1h。
⑤洗涤洗涤液洗3min×5次。
⑥DAB显色用含DAB和H2O2的PBS显色，去离子水漂洗终止反应。
结果判定的方法是在蛋白MARKER60kDa附近出现褐色条带即说明融合蛋白为GPI-CD80。
4、融合蛋白锚定形式的鉴定用磷脂酰肌醇磷脂酶C(PI-PLC)处理锚定于肿瘤细胞膜表面的本发明融合蛋白，通过流式细胞术检测细胞的阳性率和荧光强度。
用流式细胞仪检测稳定表达GPI-CD80的CHO细胞膜上的蛋白，鉴定蛋白是否为GPI锚定形式。将上述细胞用0.2U/mlPIPLC处理，30℃孵育4h并间断振荡。加入鼠抗人FITC-CD80抗体，流式细胞仪分析PIPLC处理前后细胞膜上GPI-CD80蛋白表达的荧光阳性率及荧光强度。分别以质粒pRM10转染的CHO细胞和CHO细胞设为阴性对照和空白对照。
结果判定的方法是GPI-CD80融合蛋白在PIPLC处理前后的荧光阳性率和平均荧光强度发生极大变化，由高变低，即说明GPI-CD80融合蛋白的GPI可以被PIPLC特异性洗脱，该融合蛋白为GPI锚定形式。
5、稳定性检测用PBS缓冲液洗HepG2细胞3遍，重悬于RPMI1640培养基中，使其细胞浓度为5×106个/ml，加入GPI-CD80融合蛋白(10μg/ml)，分别在37℃孵育30min，2h，4h，8h，16h，并间断振荡，用PBS缓冲液洗细胞3遍，加入鼠抗人FITC-CD80抗体进行标记，流式细胞仪检测HepG2细胞表面的CD80荧光阳性细胞率。以不加GPI CD80融合蛋白的HepG2细胞为空白对照组，如果锚定各时间段肿瘤细胞表面荧光阳性率和荧光强度与新制备的样本比较，无明显降低，说明锚定是稳定的。
本发明所述的人糖基磷脂酰肌醇-CD80融合蛋白与肿瘤细胞膜的锚定相当稳定，可用于制备肿瘤疫苗，该肿瘤疫苗具有较高的抗肿瘤活性。
本发明肿瘤疫苗的方法是1、肿瘤细胞样本的处理取新鲜肿瘤组织剪碎并反复研磨后悬浮于保存液内，200目不锈钢滤网过滤制备成单细胞悬液，保存液为新鲜配置的含双抗的RPMI1640培养基。
2、肿瘤细胞与GPI-CD80融合蛋白共孵育用PBS缓冲液洗肿瘤细胞3遍，重悬于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，使肿瘤细胞浓度为5×106个/ml，加入本发明GPI-CD80融合蛋白，调整终浓度为10μg/ml，37℃孵育4h并间断振荡；PBS缓冲液洗3遍后加入丝裂霉素(终浓度为100μg/ml，37℃，5％CO2温育1h)灭活，制成肿瘤疫苗。
本发明肿瘤疫苗能刺激脾淋巴细胞增殖、IL-2和IFN-γ、CTL的分泌，抑制肿瘤生长，具有很高的抗肿瘤活性。
具体实施例方式
例1 GPI-CD80融合蛋白的制备1.人GPI-CD80真核表达载体的设计与构建根据genebank提供的人CD58(NM 001779)和CD80基因(NM 005191)的参考序列，设计引物P1(SEQ NO.2)、P2(SEQ NO.3)，PCR扩增CD80基因的胞外段，设计引物P3(SEQ NO.4)、P4(SEQ NO.5)PCR扩增CD58基因的GPI信号序列，各引物序列如下P1AGCAGGCTTGGAAGGAGTP2GGTTGTATCAGGAAAATGCP3CCTGATACAACCTGTATCCCAAGP4TCCGCACTCGAGCAGAATACCAT然后利用重叠延伸PCR技术(splicing overlap extension，SOE)将两片段连接起来，反应体系为pfu MasterMix 24μl，引物P1(10μM)2μl，引物P4(10μM)2μl，CD80胞外段(2ng/μl)1μl，GPI信号段(2ng/μl)1μl，ddH2O 20μl；反应循环的设置94℃，2min；(94℃，30sec；50℃，30sec；72℃，2min)25个循环；72℃，10min。
加A反应后连入T载体，再NspV和XhoI 37℃酶切2h，连接真核表达载体pReciever-M10。
2、GPI-CD80融合蛋白的表达与检测(1)阳性脂质体转染法转染CHO细胞，经G418加压筛选后得到稳定表达GPI-CD80的CHO细胞株；阳性脂质体转染法的具体方法为紫外吸收检测DNA的浓度和纯度分光光度计先用蒸馏水在260nm和280nm波长下校零，取质粒DNA样品转入滤纸洗干水分后的分光光度计石英比色杯中，在260nm和280nm分别读出OD值。根据OD260/OD280的值估计DNA的纯度，纯净DNA的比值为1.8。
利用阳离子脂质体转染法将重组体pRM10/GPI-CD80质粒DNA转染至CHO细胞，参照Invitrogen公司LipofectamineTM2000转染操作说明，步骤简述如下转染前一天，胰酶消化CHO细胞并计数，细胞铺板，加入含10％胎牛血清的DMEM-F12细胞培养液，使其在转染日密度为90％。在一无菌的eppendoff管中，将pRM10，pRM10/GPI-CD80各1μg，分别用50μl的无血清无抗生素的DMEM-F12进行稀释，混匀，制成溶液A。在另一eppendoff管中，将2μlLipofectamineTM2000用50μl的无血清无抗生素的DMEM-F12进行稀释，混匀，制成溶液B。在5min内将A、B两液混匀，室温静置20min。在此期间，将培养板中的CHO细胞用无血清的DMEM-F12培养液洗涤3次。将A、B混合物加于CHO细胞表面，轻轻来回晃动培养板，使混合物均匀覆盖于细胞表面，37℃，5％CO2孵育5h，吸去培养液，将细胞用新鲜的培养液洗涤2次，加入含10％胎牛血清的DMEM-F12培养液继续培养24h。随后换成含筛选浓度的G418的10％胎牛血清DMEM-F12，直至抗性克隆长成，依次挑取单个克隆，继续用含筛选浓度G418的10％胎牛血清的DMEM-F12培养液扩大培养2w。
确定CHO细胞的G418筛选浓度具体方法为用含10％胎牛血清的DMEM-F12细胞培养液，培养CHO细胞使之贴壁生长成单层细胞，经0.25％的胰酶消化，倒置显微镜下观察，待贴壁细胞开始变圆时加入含10％胎牛血清的DMEM-F12细胞培养液终止反应。离心，去除上清，加入新鲜的10％胎牛血清的DMEM-F12细胞培养液重悬细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml，接种于24孔板内，每孔1ml。待细胞贴壁后，加入G418，调整G418的终浓度依次为400μg/ml，500μg/ml，600μg/ml，700μg/ml，800μg/ml，900μg/ml和1 000μg/ml，每个稀释度做三个平行孔，同时设一个不含G418的培养基对照组。37℃，5％CO2培养。转染细胞G3418的最佳筛选浓度为在此期间能使细胞全部死亡的最低浓度。
转染细胞在G418选择培养基中筛选后得到了稳定表达GPI-hCD80的CHO细胞株；免疫荧光化学法显示该细胞株的膜上有强烈的绿色荧光，而对照组中转染了pReceiver-M10质粒的CHO细胞膜上未见荧光，表明GPI-hCD80融合蛋白是锚定在细胞膜上的；流式细胞仪检测筛选得到的CHO细胞，细胞膜上表达GPI-hCD80的阳性细胞率和平均荧光强度分别高达90.02％、42，而对照组阳性率和荧光强度均极低CHO细胞的阳性标记率和平均荧光强度分别为0.50％、3，转染了pReceiver-M10的CHO细胞阳性标记率和平均荧光强度分别为8.95％、10。
将CHO细胞、转染了pReceiver-M10的CHO细胞、稳定表达GPI-hCD80的CHO细胞用胰酶消化后以PBS重悬，加入鼠抗人FITC-CD80抗体，流式细胞仪检测各样本中CD80荧光阳性标记细胞的阳性率及平均荧光强度。结果显示CHO细胞CD80阳性标记率和平均荧光强度分别为0.47％、2，转染了pReceiver-M10的CHO细胞CD80阳性标记率和平均荧光强度分别为7.62％、9，稳定表达了GPI-hCD80的CHO细胞CD80阳性标记率和平均荧光强度分别为90.02％、42。将这些细胞用PIPLC处理4h后再进行流式细胞仪检测，可见两个对照组的CD80细胞阳性率和平均荧光强度几乎没有发生改变，而稳定表达了GPI-hCD80的CHO细胞阳性标记率和平均荧光强度分别改变为6.34％、7。说明在稳定表达GPI-hCD80的CHO细胞表面表达的蛋白为GPI锚定蛋白。
(2)提取稳定表达GPI-hCD80蛋白的CHO细胞的膜蛋白后，选用鼠抗人CD80单抗，通过与溴化氢活化的Sepharose 4B藕联制备亲和层析柱，分离纯化GPI-hCD80膜蛋白；提取CHO细胞膜蛋白的具体方法为①取对数生长期的细胞，吸出培养液后用冰预冷的PBS缓冲液(0.01M pH 7.2～7.3)洗三次；②用冰预冷的含有蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF，1mM)的PBS缓冲液(0.01M pH7.2～7.3)重悬细胞，冰浴中最大功率超声破碎细胞(3×10s)；③4℃下采用差速离心法，去除未破碎细胞、细胞核及大部分线粒体。小心吸取上清(含有胞质成分和细胞膜成分)，并适当富集。
④采用20％～45％蔗糖线性密度梯度离心，12000g在4℃下离心2h，收集质膜部分；⑤加入TritonX-114溶液冰浴15min，4℃下10000g离心5min；⑥溶液37℃水浴10min以分离水相和去污剂相，然后37℃2000g离心5min；⑦将上述沉淀(TritonX-114与膜蛋白的混合物)加入9倍体积冰冻丙酮，冰浴40min，10000rpm离心30min，这时就可以将上层的丙酮和TritonX-114一起去除，从而得到膜蛋白。
⑧真空浓缩膜蛋白。
亲和层析的具体方法为①膨胀填料称取1g CNBr Sepharose 4B，用新鲜配制的0.001mol/L的HCL室温浸泡15min。
②稀释鼠抗人CD80抗体20mg鼠抗人CD80抗体溶解于4ml，pH9，0.25mol/L碳酸氢钠缓冲液中。
③填料与鼠抗人CD80抗体藕联浸泡后的填料离心2000rpm×5s，缓冲液洗涤2次。与鼠抗人CD80混合，混匀后20℃放置4h，并缓慢搅拌溶液。离心后收集上清测未藕联的鼠抗人CD80抗体的量，记做G1。
④洗去与鼠抗人CD80抗体藕联后的填料中非特异性吸附的鼠抗人CD80抗体藕联后装柱，用20倍体积的缓冲液洗去未结合的鼠抗人CD80抗体，再用5倍体积的pH2.8，0.1mol/LHCL-甘氨酸缓冲液(16.8ml0.2mol/LHCl，50ml0.2mol/L的甘氨酸，用水补足至100ml终体积)洗去非特异性吸附的鼠抗人CD80抗体。最后用pH7.4，0.01mol/L的PBS平衡后待用。收集洗脱液并测定其蛋白含量，记做G2，与上步中G1合并，计算鼠抗人CD80抗体的吸附载量(抗体的吸附载量＝(抗体的总使用量-G1-G2)/填料的体积)。
⑤稳定表达GPI-CD80的CHO细胞膜蛋白的吸附将膜蛋白以0.5～1ml/min的流速吸附于鼠抗人CD80-CNBr Sepharose 4B上，4℃保持4h，然后用10倍体积的PBS缓冲液以及1ml/min的流速洗脱未结合的杂蛋白，直到洗脱液的OD280nm≤0.05为止。
⑥解离结合在CD80-CNBr Sepharose 4B填料中的GPI-CD80蛋白用0.1mol/L的pH2.4，HCl-甘氨酸缓冲液洗脱与鼠抗人CD80-CNBr Sepharose 4B填料中的配基结合的GPI-CD80蛋白，流速为1ml/min，洗至OD280nm≤0.02，立即用1mol/L的NaHCO3中和洗脱的蛋白溶液。
Western-Blot显示在60KD附近有一明显的褐色蛋白条带出现。将GPI-hCD80融合蛋白与HepG2细胞共同孵育30min，2h，4h，8h，16h后，流式细胞仪检测细胞表面呈现荧光的CD80阳性细胞率分别为78.02％、75.46％、78.29％、80.40％、82.12％，各样本进行比较，阳性细胞数百分率变化不明显，表明GPI-hCD80融合蛋白与HepG2肿瘤细胞共孵育后，能够锚定在肿瘤细胞膜上，而且这种锚定具有相当的稳定性。
例2 制备治疗HePG2细胞肿瘤的GPI-CD80疫苗1、HePG2细胞样本的处理取新鲜肝癌组织剪碎并反复研磨后悬浮于保存液内，200目不锈钢滤网过滤制备成单细胞悬液，保存液为新鲜配置的含双抗的RPMI1640培养基；2、HePG2细胞与本发明GPI-CD80融合蛋白共孵育用PBS缓冲液洗HePG2细胞3遍，重悬于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，使HePG2细胞浓度为5×106个/ml，加入本发明GPI-CD80融合蛋白使其终浓度为10μg/ml，37℃孵育4h并间断振荡；PBS缓冲液洗3遍后加入丝裂霉素(终浓度为100μg/ml，37℃，5％CO2温育1h)灭活，制成肿瘤疫苗。
例3效果实验1、肿瘤疫苗对脾淋巴细胞增殖的影响刺激原分别为经过丝裂霉素灭活的HepG2、HepG2/GPI-CD80(制备方法见实施例2)，反应细胞为正常的小鼠脾淋巴细胞。将刺激原和反应细胞按1∶5的比例混合培养3d，具体为将分离的脾淋巴细胞密度调整为5×105个/ml，加到96孔板中，每孔100μl，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养，每份8复孔。实验组每孔加入经丝裂霉素灭活的HepG2/GPI-CD80细胞，阴性对照组加入经过丝裂霉素灭活的HepG2细胞，空白对照组只加培养液。于37℃，5％CO2培养箱培养的0h、24h、48h、72h后，每孔加入20μlMTT，继续培养4h，弃上清，加DMSO100μl孔，振荡10min，在酶联仪上测定吸光度(A570)值。阴性组实际OD值＝阴性组A570-空白对照组A570；阳性组实际OD值＝阳性组A570-空白对照组A570。
结果如表2所示，阴性对照组和实验组脾淋巴细胞OD值在接受刺激后均升高(F＝51.912，P＝0.003)，但阴性对照组升高不及实验组升高明显(F＝63.958，P＝0.000)。进一步两两比较显示实验组在72h时OD值最高，可见本发明肿瘤疫苗刺激脾淋巴细胞的增殖。
表2 肿瘤疫苗对淋巴细胞增殖的影响(n＝8，x±s)

注分组之间F＝63.958，P＝0.000，说明分组之间差异有统计学意义；时间点之间F＝51.912，P＝0.003，说明各时间点间差异有统计学意义；分组与时间点间交互效应的F＝23.351，P＝0.000，说明分组与时间点间有交互作用。进一步两两比较显示实验组在72h时OD值最高。
2、肿瘤疫苗刺激脾淋巴细胞后对分泌细胞因子IL-2和IFN-γ的量的影响分别将正常的小鼠脾淋巴细胞和刺激细胞[丝裂霉素灭活的HepG2(阴性对照组)、丝裂霉素灭活的HepG2/GPI-CD80(实验组)]放在24孔板中培养，每孔淋巴细胞和刺激细胞分别为1×107个/ml和5×104个/ml，每个样本做6个复孔。常规培养24h后，收集上清液，按试剂盒说明书测IL-2含量；常规培养72h后，收集上清液，按试剂盒说明书测IFN-γ含量，均以样品稀释液做为空白对照组，结果以pg/ml表示。阴性组实际值＝阴性组-空白对照组；阳性组实际值＝阳性组-空白对照组。
结果如表3所示，实验组IL-2和IFN-γ的水平均明显高于阴性对照组，可见本发明肿瘤疫苗能有效刺激IL-2和IFN-γ的分泌。
表3 各组小鼠脾细胞分泌IL-2和IFN-γ的水平(pg/ml，n＝6，x±s)

3、肿瘤疫苗刺激脾淋巴细胞后CTL的活性变化将分离的小鼠脾淋巴细胞调整浓度至1×107个/ml，分别与经过丝裂霉素灭活的HepG2细胞(阴性对照组)、HepG2/GPI-CD80细胞(实验组)置于37℃，5％CO2培养箱孵育48h，每个样本3个复孔。均以PBS做为空白对照组，吸取各孔上清备用。
根据乳酸脱氢酶(CTL)测试盒说明书测定CTL活力。
CTL活力(U/L)＝(测定管OD值-测定空白管OD值)/(标准管OD值-标准空白管OD值)×标准管浓度(2umol/ml)×1000ml×测试前样品稀释倍数结果如表4所示，实验组CTL的水平明显高于阴性对照组，可见本发明肿瘤疫苗能刺激CTL的分泌。
表4各组小鼠脾细胞分泌CTL的水平(U/L，n＝3，x±s)

例4从人CD16中截取GPI信号肽制备的GPI_B7_1融合蛋白与本发明融合蛋白的效果对比实验现有技术《人糖基磷脂酰肌醇_GPI_B7_1真核表达载体的构建及表达》中公开的GPI-B7_1蛋白，其融合蛋白中的GPI信号肽来源于人CD16(熊茂林等，中国病理生理杂志，2005，21(1)154-158)，B7_1即CD80，为了区别于本发明，下述实验中均简称为GPI_B7_1蛋白，用该蛋白制备的肿瘤疫苗简称为HepG2/GPI-B7_1。
1、与本发明融合蛋白GPI锚定的稳定性的比较(1)方法将GPI-B7_1蛋白和本发明融合蛋白(制备方法见实施例1)分别与HepG2细胞共同孵育30min，2h，4h，8h，16h后，流式细胞仪检测细胞表面呈现荧光的CD80阳性细胞率。
(2)结果GPI-B7_1蛋白与HepG2细胞共同孵育30min，2h，4h，8h，16h后，流式细胞仪检测细胞表面呈现荧光的CD80阳性细胞率分别为79.65％、75.46％、64.29％、66.72％、65.79％，呈明显的下降的趋势。而本发明融合蛋白与HepG2细胞共同孵育30min，2h，4h，8h，16h后，流式细胞仪检测细胞表面呈现荧光的CD80阳性细胞率分别为78.02％、75.46％、78.29％、80.40％、82.12％，各样本进行比较，阳性细胞数百分率变化不明显，可见本发明融合蛋白与HepG2肿瘤细胞共孵育后，能够锚定在肿瘤细胞膜上，而且这种锚定具有相当的稳定性。
2、与本发明融合蛋白对小鼠肿瘤的免疫治疗作用的比较(1)方法于8周龄BALB/C-Nu裸鼠的左后肢背部皮下注射1×106个活HepG2细胞，体积为100μl。第4d，将荷瘤BALB/C-Nu裸鼠随机分为3组(组与组之间按照肿瘤体积的大小配对，以尽可能地减小个体差异带来的系统误差)，每组3只，第1d，3d，6d，9d按分组分别于小鼠右后肢皮下注射相应制剂。分组(1)丝裂霉素灭活的HepG2细胞组(空白对照组)100μl的1×106个HepG2细胞；(2)丝裂霉素灭活的HepG2/GPI-B7_1组(GPI-B7_1组)100μl的1×106个HepG2/GPI-B7_1肿瘤疫苗细胞；(3)丝裂霉素灭活的本发明疫苗组(本发明组，制备方法见实施例2)100μl的1×106个本发明肿瘤疫苗细胞；注射肿瘤疫苗后，每天观察肿瘤生长状态。每3d用游标卡尺测量并记录各组荷瘤裸鼠瘤体的长短径，计算瘤体的体积(体积＝0.5×长径×短径2)。
(2)结果如表5所示，本发明组和GPI-B7_1组的肿瘤增长速度均比空白对照组的慢，可见本发明肿瘤疫苗和HepG2/GPI-B7_1均能抑制肿瘤的增长，但是本发明肿瘤疫苗对肿瘤增长的抑制作用明显高于HepG2/GPI-B7_1，证明本发明肿瘤疫苗具有更高的抗肿瘤活性。
表5 两种肿瘤疫苗对小鼠肿瘤的免疫治疗作用的比较

注分组之间F＝801.801，P＝0.000；进一步组间LSD两两比较显示空白对照组-阴性对照组P＝0.011；空白对照组-实验组P＝0.000；阴性对照组-实验组P＝0.037；时间点之间F＝1206.107，P＝0.000。
综上所述，用经过丝裂霉素灭活的本发明肿瘤疫苗刺激小鼠脾淋巴细胞后，脾淋巴细胞增殖能力、IL-2和IFN-γ、CTL的水平均明显提高，且经过丝裂霉素灭活的本发明肿瘤疫苗治疗过的裸鼠肿瘤体积增长速度减慢，这些结果均提示本发明肿瘤疫苗能有效抑制肿瘤的生长，减慢肿瘤的生长速度，具有很高的抗肿瘤活性。
SEQUENCE LISTING<110>南方医科大学<120>一种人糖基磷脂酰肌醇-CD80融合蛋白<160>5<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>277<212>PRT<213>人工序列<400>1Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr1 5 10 15Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys20 25 30Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu35 40 45Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile50 55 60Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp65 70 75 80Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr85 90 95Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly100 105 110
Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg115 120 125Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr130 135 140Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile145 150155 160Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu165 l70 175Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp180 185 190Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met195 200 205Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg210 215 220Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro225 230 235 240Asp Thr Thr Cys Ile Pro Ser Ser Gly His Ser Arg His Arg Tyr Ala245 250 255Leu Ile Pro Ile Pro Leu Ala Val Ile Thr Thr Cys Ile Val Leu Tyr260 265 270Met Asn Gly Ile Leu275<210>2
<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>2agcaggcttg gaaggagt 18<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>3ggttgtatca ggaaaatgc 19<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>4cctgatacaa cctgtatccc aag 23<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>5tccgcactcg agcagaatac cat 2权利要求
1.一种人糖基磷脂酰肌醇-CD80融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列为SEQ NO.1。
2.一种制备权利要求1所述的人糖基磷脂酰肌醇-CD80融合蛋白的真核表达载体，该表达载体由以下方法制备得到(1)用引物P1、P2，PCR扩增CD80基因的胞外段，引物P3、P4 PCR扩增CD58基因的GPI信号序列，其中，引物P1AGCAGGCTTGGAAGGAGT，引物P2GGTTGTATCAGGAAAATGC，引物P3CCTGATACAACCTGTATCCCAAG，引物P4TCCGCACTCGAGCAGAATACCAT；(2)利用重叠延伸PCR技术将两片段连接起来，反应体系总体积50μl，其中pfuMasterMix 24μl，引物P1 0.4μM，引物P4 0.4μM，CD80胞外段0.04ng/μl，CD58基因的GPI信号段0.04ng/μl，其余为ddH2O；反应循环的设置94℃，2min； 72℃，10mim；(3)将步骤(2)得到的PCR产物连入T载体，再NspV和XhoI 37℃酶切2h，然后将含编码蛋白SEQ NO.1的片段连接于真核表达载体pReciever-M10，即得。
3.权利要求1所述的人糖基磷脂酰肌醇-CD80融合蛋白在制备肿瘤疫苗中的应用。
4.权利要求3所述的人糖基磷脂酰肌醇-CD80融合蛋白在制备肿瘤疫苗中的应用，其中肿瘤疫苗的制备方法由以下步骤组成a.肿瘤细胞样本的处理取新鲜肿瘤组织剪碎并反复研磨后悬浮于保存液内，200目不锈钢滤网过滤制备成单细胞悬液，保存液为新鲜配置的含双抗的RPMI1640培养基。b.肿瘤细胞与GPI-CD80融合蛋白共孵育用PBS缓冲液洗肿瘤细胞3遍，重悬于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，使肿瘤细胞浓度为5×106个/ml，加入本发明GPI-CD80融合蛋白，调整终浓度为10μg/ml，37℃孵育4h并间断振荡；PBS缓冲液洗3遍后加入丝裂霉素使其终浓度为100μg/ml，37℃，5％CO2温育1h灭活，即可。
全文摘要
本发明提供了一种人糖基磷脂酰肌醇－CD80融合蛋白，该融合蛋白的的氨基酸序列为SEQNO.1，其人糖基磷脂酰肌醇信号肽来源于人CD58，能稳定地锚定于肿瘤细胞表面。该融合蛋白锚定于肿瘤细胞表面后能促使脾淋巴细胞增殖以及IL－2和IFN－γ、CTL的分泌，可作为肿瘤疫苗用于肿瘤的治疗。
文档编号A61K39/00GK101067001SQ20071002841
公开日2007年11月7日 申请日期2007年6月5日 优先权日2007年6月5日
发明者林敬明, 刘煜, 张雪 申请人:南方医科大学