专利名称：：1,3,4-三-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法1，3,4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-(3-D-吡喃葡萄糖在制备抗肿瘤药物中的应用本发明涉及医药领域，具体涉及1，3，4-三-0-没食子酰基-6-O咖啡酰基-l3-D-吡喃葡萄糖的新用途。1，3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-(5-D-卩比喃葡萄糖是从蛇菰科(Balanophoraceae)植物日本蛇菰(&/cmo/^ora_/c^om'caMakino)的地上部分的甲醇提取物中分离出来的一种化合物，其化学式如式I所示。该化合物是一种黄色无结晶粉末，在鞣酸酶的作用下可水解为没食子酸和6-0-咖啡酰基-(3-D-吡喃葡萄糖(Caffeoyl，Coumaroyl，Galloyl，andHex勿droxydiphenoylGlucosesfromBal肌ophorajaponica.Zhi-HongJIANG,YokoHIROSE，et.Chem.Pharm.Bull.49(7)887—892(2001)Chem.)。经文献检索未见该化合物药理活性、用途及药剂的报道。本发明的目的是提供1,3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-P-D-吡喃葡萄糖在制药中的新用途。实际上，本发明涉及1，3,4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-J3-D-吡喃葡萄糖在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明所述的应用是利用1,3,4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-P-D-吡喃葡萄糖抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡，来达到抗肿瘤目的的，因此，本发明所述的化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，具体是指所述的吡喃葡萄糖在制备肿瘤细胞生长的抑制剂和肿瘤细胞
技术领域：
背景技术：
发明内容凋亡的诱导剂中的应用。上述应用，其中所述的1，3，4-三-(9-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-p-D-吡喃葡萄糖加入医学上可接受的辅料或载体可制成治疗肿瘤的各种常用制剂。下面将通过实验来证明本发明的具有的技术效果。1、1,3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-p-D-吡喃葡萄糖对人肺癌细胞株A549增殖的影响1)实验方法(1)A549细胞培养生长至指数生长期时，即以0.25%胰蛋白酶消化，1000Xg离心3min，细胞沉淀以10%FBS的DMEM培养基调整至6Xl()4+/ml，96孔培养板每孔接种190u1，置于37'C、5%(:02及饱和湿度条件下培养24小时。(2)每组设5个复孔，每孔中加入10ul不同浓度的本发明化合物或加入200pM表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)作为阳性对照，上述条件下继续培养48小时。实验重复3次，根据所加的药物将实验分为6组阳性对照组加入EGCG，200pM。本发明实验组l:加入l，3,4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-(3-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为3.75pg/ml。本发明实验组2:加入l，3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-P-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为7.5ng/ml。本发明实验组3:加入l，3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-P-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为15pg/ml。本发明实验组4:加入l，3,4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-(3-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为30pg/ml。本发明实验组5:加入l，3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-(3-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为60pg/ml。(3)细胞培养48小时后，每孔加入10pl的CCK-8(cellcountingkit8)试剂，37°C，5。/。C02及饱和湿度条件下继续培养1.5小时。用酶标仪测定在波长为450nm处的吸光度值(0D)，650咖作为参考波长，细胞生长抑制率按公式抑制率=(对照孔0D值-实验孔0D值)/对照孔0D值)乂100%计算。2)实验结果表2本发明化合物对A549细胞增殖的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>结果如表1所示，1，3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-p-D-吡喃葡萄糖能有效抑制HepG2细胞增殖，其抑制率随剂量加大而递增。2、1,3,4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-(3-D-吡喃葡萄糖对HepG2细胞增殖的影响1)实验方法(1)HepG2细胞培养生长至指数生长期时，即以0.25%胰蛋白酶消化，1000Xg离心3min，细胞沉淀以10%FBS的DMEM培养基调整至6X104+/inl，96孔培养板每孔接种190"1，置于37'C、5%(^02及饱和湿度条件下培养24小时。(2)每组设5个复孔，每孔中加入10yl不同浓度的本发明化合物或加入200nM表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)作为阳性对照，上述条件下继续培养48小时。实验重复3次，根据所加的药物将实验分为6组阳性对照组力口入EGCG，200nM。本发明实验组h加入l，3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-p-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为3.75pg/ml。本发明实验组2:加入l,3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-(3-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为7.5ng/ml。本发明实验组3:加入l，3,4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-p-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为15jig/ml。本发明实验组4:加入l，3，4-三力-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-(3-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为3(Hig/ml。本发明实验组5:加入1，3,4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-p-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为60ng/ml。(3)细胞培养48小时后，每孔加入10u1的CCK-8(cellcountingkit8)试剂，37°C,5%C02及饱和湿度条件下继续培养1.5小时。用酶标仪测定在波长为450nm处的吸光度值(0D)，650ntn作为参考波长，细胞生长抑制率按公式抑制率=(对照孔OD值-实验孔OD值)/对照孔OD值)X10(^计算。2)实验结果表1本发明化合物对HepG2细胞增殖的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>结果如表1所示，1，3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-(3-D-吡喃葡萄糖能有效抑制HepG2细胞增殖，其抑制率随剂量加大而递增。3、1，3,4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-P-D-吡喃葡萄糖对人结肠癌细胞株SW480增殖的影响1)实验方法(1)SW480细胞培养生长至指数生长期时，即以0.25%胰蛋白酶消化，1000Xg离心3min，细胞沉淀以10%FBS的DMEM培养基调整至6X1(^个/ml，96孔培养板每孔接种190n1，置于37'C、5%<:02及饱和湿度条件下培养24小时。(2)每组设5个复孔，每孔中加入10y1不同浓度的本发明化合物或加入200nM表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)作为阳性对照，上述条件下继续培养48小时。实验重复3次，根据所加的药物将实验分为6组阳性对照组加入EGCG，200pM。本发明实验组l:加入l，3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-P-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为3.75pg/ml。本发明实验组2:加入l，3,4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-p-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为7.5ng/ml。本发明实验组3:加入l,3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-p-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为15ng/ml。本发明实验组4:加入l，3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-(3-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为30ng/ml。本发明实验组5:加入1,3,4-三-0-没食子酰基-6-(9-咖啡酰基-p-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为60ng/ml。(3)细胞培养48小时后，每孔加入lOu1的CCK-8(cellcountingkit8)试剂，37'C，5。/。C02及饱和湿度条件下继续培养1.5小时。用酶标仪测定在波长为450nm处的吸光度值(0D)，650nm作为参考波长，细胞生长抑制率按公式抑制率=(对照孔0D值-实验孔0D值)/对照孔0D值)X10(m计算。2)实验结果表3本发明化合物对SW480细胞增殖的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>结果如表1所示，1,3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-(3-D-吡喃葡萄糖能有效抑制HepG2细胞增殖，其抑制率随剂量加大而递增。4、1，3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-(5-D-吡喃葡萄糖对人大肠癌细胞株LoVo细胞增殖的影响1)实验方法(1)LoVo细胞培养生长至指数生长期时，即以O.25%胰蛋白酶消化，1000Xg离心3min，细胞沉淀以10%FBS的DMEM培养基调整至6X104个/加1，96孔培养板每孔接种190P1，置于37'C、5%002及饱和湿度条件下培养24小时。(2)每组设5个复孔，每孔中加入10u1不同浓度的本发明化合物或加入200nM表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate，EGCG)作为阳性对照，上述条件下继续培养48小时。实验重复3次，根据所加的药物将实验分为6组阳性对照组加入EGCG，200nM。本发明实验组l:加入l，3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-P-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为3.75pg/ml。本发明实验组2:加入l，3,4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-P-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为7.5pg/ml。本发明实验组3:加入l,3,4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-p-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为15jig/ml。本发明实验组4:加入l，3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-(i-D-妣喃葡萄糖，使其最终浓度为30pg/ml。本发明实验组5:加入1,3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-p-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为60pg/ml。(3)细胞培养48小时后，每孔加入10ul的CCK-8(cellcountingkit8)试剂，37°C，5%C02及饱和湿度条件下继续培养1.5小时。用酶标仪测定在波长为450nm处的吸光度值(0D)，650nm作为参考波长，细胞生长抑制率按公式抑制率=(对照孔0D值-实验孔0D值)/对照孔0D值)X10Cm计算。2)实验结果；表4本发明化合物对LoVo细胞增殖的影响组别抑制率(％)阳性对照组88.24本发明实验组117.97本发明实验组222.53本发明实验组339.78本发明实验组469.28本发明实验组578.64结果如表1所示，1，3,4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-P-D-吡喃葡萄糖能有效抑制HepG2细胞增殖，其抑制率随剂量加大而递增。5、1,3,4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-P-D-吡喃葡萄糖对人大肠癌细胞株MGC-803细胞增殖的影响1)实验方法(1)MGC-803细胞培养生长至指数生长期时，即以0.25%胰蛋白酶消化，1000Xg离心3min，细胞沉淀以10%FBS的DMEM培养基调整至6X104^7ml，96孔培养板每孔接种190Ul，置于37'C、5%(302及饱和湿度条件下培养24小时。(2)每组设5个复孔，每孔中加入10ixl不同浓度的本发明化合物或加入200pM表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)作为阳性对照，上述条件下继续培养48小时。实验重复3次，根据所加的药物将实验分为6组阳性对照组加入EGCG，200nM。本发明实验组l:加入l,3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-[3-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为3.75pg/ml。本发明实验组2:加入l,3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-p-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为7.5jig/ml。本发明实验组3:加入l,3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-p-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为15pg/ml。本发明实验组4:加入l，3,4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-(3-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为30pg/ml。本发明实验组5:加入1,3,4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-P-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为60pg/ml。(3)细胞培养48小时后，每孔加入10p1的CCK-8(cellcountingkit8)试剂，37'C，5%(:02及饱和湿度条件下继续培养1.5小时。用酶标仪测定在波长为450nm处的吸光度值(0D)，650nm作为参考波长，细胞生长抑制率按公式抑制率=(对照孔0D值-实验孔0D值)/对照孔0D值)X100《计算。2)实验结果表5本发明化合物对MGC-803细胞增殖的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>结果如表1所示，1,3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-p-D-吡唓葡萄糖能有效抑制HepG2细胞增殖，其抑制率随剂量加大而递增。6、1,3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-(3-D-吡喃葡萄糖对HepG2细胞凋亡的影响1)实验方法(1)HepG2细胞培养生长至指数生长期时，即以0.25%胰蛋白酶消化，1000Xg离心3min，细胞沉淀以10%FBS的DMEM培养基调整至6X1(^个/ml，6孔培养板每孔接种1.9ml，置于37'C、5%(302及饱和湿度条件下培养24小时。(2)每孔中加入药物，上述条件下继续培养48小时。根据所加的药物将实验分为以下7组空白对照组不加药物处理的HepG2细胞。阳性对照组加入200pM表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate，EGCG)。本发明实验组l:加入l,3,4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-(5-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为3.75^g/ml。本发明实验组2:终浓度为7.5[ig/ml。本发明实验组3:终浓度为15ng/ml。本发明实验组4:终浓度为30ng/ml。本发明实验组5:终浓度为60pg/ml。(3)细胞培养48小时后收集细胞后，PBS洗2次细胞，1000rpm，4。C离心，10mim(4)将1X106个/ml细胞重悬于缓冲液中。(5)取500ul细胞悬液加入试管中。(6)加入5ulannexinv-FITC，10ul碘化丙啶入试管中。(7)避光，室温10min。(8)上机检测。2)实验结果表61,3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-(3-D-吡喃葡萄糖对HepG2细胞凋亡的影响加入1，3，4-三-0-没食子酰基-6-(9-咖啡酰基-(3-D-吡喃葡萄糖，使其最加入1，3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-P-D-吡喃葡萄糖，使其最加入1,3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-P-D-吡喃葡萄糖，使其最加入1,3,4-三-0没食子酰基-6-0-咖啡酰基-P-D-吡喃葡萄糖，使其最<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>空白对照组4.1213.61阳性对照组7.612.99本发明实验组14.7813.9本发明实验组23.5412.13本发明实验组35.3210.86本发明实验组45.4410.95本发明实验组59.5254.36结果如表2所示，当1，3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-P-D-吡喃葡萄糖的最终浓度为60ug/ml时，HepG2细胞得凋亡率高达5(m以上，可见1,3,4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-(3-D-吡喃葡萄糖能诱导肿瘤细胞凋亡。7、1,3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-(3-D-吡喃葡萄糖对HepG2细胞周期的影响1)实验方法(1)收集用1，3,4-三-O没食子酰基-6-0-咖啡酰基-(3-D-吡喃葡萄糖处理48小时的HepG2细胞沉淀用PBS洗涤2次，细胞沉淀用70%在-20°0欲冷的乙醇固定，置于4'C冰箱保存24h。(细胞沉淀用lmlPBS吹散，再加3ml无水乙醇)(2)固定后的细胞再次用含W新生牛血清的PBS洗涤2次，弃上清。(3)加入0.4mlPBS和RNaseA至终浓度50ug/ml,37。C水浴孵育lh。(4)加入碘化丙啶至终浓度50ug/ml，摇匀，4。C避光lh。将细胞经100目尼龙网过滤至流式细胞仪测定各处理组细胞DNA含量，计算细胞周期百分比。根据所加的药物将实验分为以下7组空白对照组不加药物处理的HepG2细胞。阳性对照组加入EGCG200uM本发明实验组l:加入l，3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-(3-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为3.75pg/ml。本发明实验组2:加入l，3,4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-(3-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为7.5ng/ml。本发明实验组3:加入l，3,4-三-0-没食子酰基-6-(9-咖啡酰基-p-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为15pg/ml。本发明实验组4:加入l,3,4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-P-D-卩比喃葡萄糖，使其最终浓度为30ng/ml。本发明实验组5:加入l,3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-(J-D-吡喃葡萄糖，使其最终浓度为60Kig/ml。2)实验结果表31，3,4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-p-D-吡喃葡萄糖对HepG2细胞周期的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>结果如表3所示，经1,3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-(3-D-吡喃葡萄糖处理后，HepG2细胞G0Gl期的细胞增加，证明1，3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-IJ-D-吡喃葡萄糖能阻止细胞的分裂增殖。8、本发明化合物对荷S180小鼠肿瘤大小的影响1)将S180瘤源小鼠于传代接种后10天在无菌条件下从腹腔抽出瘤液，用无菌生理盐水调整瘤细胞数至5X106个/ml。2)取21只小鼠(18-22g/只)，分别接种步骤1所得的瘤液0.2ml于右大腿皮下后被随机分为以下5组(1)本发明化合物低剂量组给予本发明化合物治疗，5.0mg/kg;(2)本发明化合物中剂量组给予本发明化合物治疗，10.0mg/kg;(3)本发明化合物高剂量组组给予本发明化合物治疗，20.0mg/kg;(4)阳性对照组给予表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)治疗，20mg/kg;(5)空白对照组生理盐水灌胃。接种次日同时灌胃给药，给药量0,2ml，每日给药一次，连续10天，停药次日称重，解剖后剥离皮下瘤体，称瘤重。按下式计算抑瘤率(％)=(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重X100%。表7本发明化合物对荷S180小鼠肿瘤大小的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>本发明化合物低剂量组5.0mg/kg0.93±0.0927.34本发明化合物中剂量组10.0mg/kg0.74±0.1342.18本发明化合物高剂量组20.0mg/kg0.68±0.1846.88结果如表2所示，本发明化合物对荷S180小鼠肿瘤的抑制作用随剂量增加而增大，其抑制肿瘤的效果与EGCG相当。具体实施方式应用例蛇菰片剂应用例一制剂处方1，3,4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-P-D-吡喃葡萄糖20g微晶纤维素48g可溶性淀粉30g滑石粉2g共制1000片，每片含该化合物100mg。制备方法称取该化合物20g，加可溶性淀粉稀释成50g，混匀，再称取微晶纤维素48g，用95%乙醇制软材，过筛制粒，低温5(TC干燥，整粒，加入滑石粉2g，混匀，压片(每0.1g)，质检、包装，即得。用法用量每次2-3片，每日3次。适用人群适用各种肿瘤患者。例二制剂处方1,3,4-三-0-没食子酰基-6-(9-咖啡酰基-(5-D-吡喃葡萄糖10g微晶纤维素48g可溶性淀粉40g滑石粉2g共制1000片，每片含该化合物100mg。制备方法称取该化合物IOg，加可溶性淀粉稀释成50g，混匀，再称取微晶纤维素48g，用95%乙醇制软材，过筛制粒，低温5(TC干燥，整粒，加入滑石粉2g，混匀，压片(每0.1g)，质检、包装，即得。用法用量每次2-3片，每曰3次。适用人群适用各种肿瘤患者。例三制剂处方1，3,4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-P-D-吡喃葡萄糖5g微晶纤维素48g可溶性淀粉45g滑石粉2g共制1000片，每片含该化合物100mg。制备方法称取该化合物5g，加可溶性淀粉稀释成50g，混匀，再称取微晶纤维素48g，用95%乙醇制软材，过筛制粒，低温50'C干燥，整粒，加入滑石粉2g，混匀，压片(每0.1g)，质检、包装，即得。用法用量每次2-3片，每曰3次。适用人群适用各种肿瘤患者。权利要求1、1，3，4-三-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖在制备抗肿瘤药物中的应用。2、根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述的药物是肿瘤细胞生长的抑制剂。3、根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的药物是肿瘤细胞凋亡的诱导剂。4、权利要求l、2或3所述的抗肿瘤药物，该药物由1，3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-P-D-吡喃葡萄糖和医学上可接受的辅料或载体组成；其中1,3，4-三-0-没食子酰基-6-0-咖啡酰基-P-D-吡喃葡萄糖的含量为520%。全文摘要本发明提供了1，3，4-三-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖在制备抗肿瘤药物中的应用，具体是指所述的吡喃葡萄糖在制备肿瘤细胞生长的抑制剂和肿瘤细胞凋亡的诱导剂中的应用。本发明还提供了一种抗肿瘤药物，该药物含有5～20％的1，3，4-三-O-没食子酰基-6-O-咖啡酰基-β-D-吡喃葡萄糖。文档编号A61K31/7028GK101152193SQ20071003059公开日2008年4月2日申请日期2007年9月28日优先权日2007年9月28日发明者刘中秋,琳吕,吴少瑜,吴曙光,姜志宏,张嘉杰,伟徐,文晓芸,王广发,饶进军申请人:南方医科大学