专利名称：：可降解血管吻合套管及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及心血管外科手术材料，尤其是一种血管吻合装置。技术背景目前血管吻合套管大多为不锈钢、记忆钛等不可降解材料制成的，吻合装置的存留会使吻合口血管僵硬，影响血管正常的舒縮功能，并限制血管的生长，同时吻合装置的存留也易在血管外膜形成异物肉芽肿；另一方面，目前的血管吻合装置不能吻合管径有差异的血管，使它们的应用受到了一定程度的制约。开发出一种能普遍适用于各种管径血管的吻合的可降解血管吻合装置，己是血管吻合技术和微创外科、移植外科发展的当务之急。
发明内容本发明的目的是提供一种血管吻合套管，该血管吻合套管可降解，且生物相容性良好，能普遍适用于微创外科、移植外科中各种管径血管的吻合，吻合后符合血管生理，且能提高吻合后血管的通畅率。本发明的可降解血管吻合套管是一种用高分子材料PLLA经注射成形法制成的圆筒形套管，套管壁厚和内径与待修复的血管相适配。本发明所述的PLLA是指聚L乳酸，又称聚左旋乳酸。作为本发明的进一步改进，在套管一端的外壁上还可以设有螺纹或凹槽或突起，套管另一端可以设有推进小柄。在套管一端外壁设置螺纹或凹槽或突起，能增加接触面的摩擦力，便于吻合部位的结扎固定。推进小柄的设置使血管套接的操作更加方便快捷。使用本发明的血管吻合套管时，先将套管套入一血管断端，带有小柄的一端向前；然后将血管外翻18(T包住套管，持套管的推进小柄插入另一血管断端；沿套管螺纹或凹槽或突起的部位环形结扎固定两血管吻合处。与现有的血管缝合方法以及不可降解的血管套管相比，本发明制备的PLLA血管吻合套管具有生物可降解性，解决了吻合装置在体内残留的问题。用本套管完成血管吻合后，一方面，套管在一段时间内能起到支撑固定作用，使两断端血管对合良好，吻合口不易扭转和狭窄；另一方面，这种套管最终能在体内自行逐步降吸收，吻合后血管腔面没有内膜损伤及缝线残留，从而不影响血管正常的舒縮功能以及生长发育，也不会在血管外膜形成异物肉芽肿，从而减少了吻合口血栓形成的可能，具有良好的远期血管通畅率，满足了微创外科和移植外科手术中血管吻合技术的要求。此外，动物实验表明，本发明的血管套管的降解产物对机体无明显不良影响。动物体内试验和动物体外试验均表明，本发明的血管吻合套管无细胞毒性，对实验动物无急性和亚慢性毒性作用，不引起溶血和凝血，无致突变作用，具有良好的组织相容性。图lPLLA血管吻合套管结构示意图；图2应用PLLA血管吻合套管进行血管吻合过程示意图；图3PLLA血管套管的亚慢性毒性试验大鼠3月后心脏标本组织病理切片图(HEX200);图4:PLLA血管套管的亚慢性毒性试验大鼠3月后肝脏标本组织病理切片图(HEX200);图5:PLLA血管套管的亚慢性毒性试验大鼠3月后脾脏标本组织病理切片图(HEX200);图6:PLLA血管套管的亚慢性毒性试验大鼠3月后肺脏标本组织病理切片图(HEX200);图7:PLLA血管套管的亚慢性毒性试验大鼠3月后肾脏标本组织病理切片图(HEX200);图8:PLLA套管植入后1周的周围组织病理切片图(HEX200);图9:对照材料PVC在植入后1周的周围组织病理切片图(HEX200);图10:PLLA套管植入后8周的周围组织病理切片图(HEX200);图11:对照材料PVC在植入后8周的周围组织病理切片(HEX200);图12:PLLA血管吻合套管体外降解质量变化曲线图；图13:PLLA血管吻合套管体内降解质量变化曲线图；图14:PLLA血管吻合套管植入前及植入后血清乳酸浓度变化曲线图。具体实施方式1.血管套管的制作制作如附图l所示的血管套管l。制作模具，将PLLA颗粒加入模腔中，加热模具至180-220°C，保温10-30min使原料充分熔融，然后冷却至60-100°C加压挤出，并保压冷却至室温后脱模取出试样。试样内径2.2mm、壁厚0.3mm，外壁一端有螺纹3，修剪套管长度为2.5mm，并在一端修剪出小柄2。2.血管套管的生物相容性试验(1)细胞毒性试验将本发明的PLLA血管套管提取液用L929小鼠成纤维细胞做细胞毒性试验，并设置阴性对照和阳性对照。消毒PLLA颗粒样品置入培养瓶，按材料质量与浸提介质体积比0.2g/ml加入RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100U/ml)，放入37t:5WC02培养箱中浸提72h，作为标准浓度浸提液。按材料质量与浸提介质体积比0.4g/ml、0.2g/ml、0.1g/ml分别制作2、1、0.5倍标准浓度浸提液。72h后吸出浸提液，无菌封存，4。C保存备用。将L929小鼠成纤维细胞用RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100U/ml)于37""C5n/。C02培养箱中培养3648h，待细胞长满后传代。选择一瓶状态好的细胞，弃原培养基，加入0.25%胰蛋白酶(含0.02。/。EDTA)消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基配成单个细胞悬液，并稀释成5Xl(^个/ml细胞浓度，以每孔1Xl(^个细胞(0.2ml)接种于4块96孔培养板中，常规培养24h后弃原培养基，D-hank's液清洗两遍后每孔分别加入不同浓度浸提液、阴性对照液(含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基)、阳性对照液(l。/。苯酚)0.2ml，每组加8孑L在37°C5%C02培养箱中继续培养。分别于l、2、3、4d后各取出一块培养板，每孔加入5g/L的MTT2(M，37°C5。/。C02培养箱中继续培养4h后，弃尽原培养基，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)分析纯溶液IOOW，室温下振荡10min后用Thermolabsystems全自动酶标仪在492nm波长处测定A值。取均值，计算细胞相对增殖率(rdativegrowthrate,RGR)，公式RGR-试样A值/阴性对照组A值。根据不同时期各组RGR值进行细胞毒性分级(cytotoxicitystage,CTS)，观察材料作用的时间和剂量效应。CTS0级RGR》100°/。，1级RGR75%99%，2级RGR50%74%，3级RGR25。/。49。/。，4级RGR1%24%，5级RGR〈10/。。阴性对照组加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基后，细胞继续呈贴壁生长，折光性强，呈梭形及多角形；随着培养时间延长，细胞数量增多，细胞间相互接触，细胞的生长和形态未受影响。阳性对照组加入1%苯酚后，细胞变成圆形、肿胀、不贴壁，无繁殖及生长现象。实验材料组将不同浓度的PLLA材料浸提液加入培养板各孔后，早期即可见材料周围有少量细胞粘附；随着培养时间延长，材料周围粘附细胞数逐渐增加，细胞生长良好，细胞形态及生长状态与阴性对照组相似，呈梭形及多角形，细胞无衰老、死亡及异常分裂现象。从l，2，3，4d的A值可以看出除阳性对照组外，其他各组随着培养时间的延长A值均逐渐增加。各浓度材料浸提液与阴性对照组在同一时期比较采用t检验，结果均无显著性差异(PX).05)，与阳性对照组比较则均有显著性差异(P〈0.05)(表1)。同时各浓度浸提液组的细胞毒性均在1级以下(表2)，符合《医疗器械生物学评价国家标准GB/T16886.1-2001》中对材料细胞毒性要求。本试验结果按6级细胞毒性分级评定，PLLA可降解血管吻合装置各浓度浸提液的毒性级别均为01级，说明实验材料PLLA体外无明显细胞毒性，表现出良好的细胞相容性，而阳性对照液则有严重细胞毒性。表lL929细胞在各浓度浸提液、阳性和阴性对照液中的A值变化浸提液浓度时间(d)-阳性对照阴性对照_2倍1倍(标准)0.5倍_10.134±0.0050.133±0.0080.131±0.0030.053±0.0020.133±0.00820.183±0.0100.188±0.0110.185±0細0.054±0.0040.187±0扁30.287±0.0260.288±0.0140.289±0.0240.054±0.0050.290±0.02640.432±0.0200.417±0.0220.414±0.0130.054±0.0040.431±0.020表2L929细胞在各浓度浸提液和阳性对照液的RGR和CTS2倍l倍(标准)0.5倍阳性对照时问(d)RGRCTSRGRCTSRGRCTSRGRCTS1l細0l扁00.98510.391320.9791l駕00.98910.28930.99010.99310.99710.186440.9651l細00.95810.1254(2)急性毒性试验取健康昆明种小鼠20只，体重2024g，雌雄各半，随机分成2组，记录初始体重。取消毒PLLA颗粒样品2g置于培养瓶中，加入10ml灭菌生理盐水完全浸没材料，放入37。C5。/。C02培养箱中浸提72h。实验组按50ml/kg剂量经尾静脉注射材料浸提液，对照组经尾静脉注射等量灭菌生理盐水。注射后连续2周观察小鼠一般状态、毒性表现及死亡数，并比较两组小鼠注射后24h，48h，72h的体重。2周观察期内实验小鼠一般情况良好，未见中毒症状或不良反应，无l例死亡。实验材料组和对照组小鼠在分别注射材料浸提液和生理盐水24h，48h，72h后的体重比较无显著性差异(P〉0.05)(表3)。表3实验材料组和对照组小鼠在注射后24h，48h,72h的体重比较时间(h)实验组(g)对照组(g)2422.8±0.922.4±0.94822.4±U22.5±1.17222.4±1.022.5±0.9(3)亚慢性毒性试验取健康雄性SD大鼠8只，体重180200g，随机分成2组，记录初始体重。实验组按10ml/kg剂量经腹腔注射材料浸提液(浸提液制备方法同急性毒性试验)，每周5次，对照组经腹腔注射等量灭菌生理盐水。3月后复查体重，并取心、肺、肝、脾、肾标本作常规组织学观察。3月内实验大鼠饮食及精神状况正常，无死亡情况，体重明显增加(P〈0.05)且与同期对照组比较无显著性差异(PX).05)(表4)。心、肝、脾、肺、肾标本组织学观察未见组织和细胞的变性及坏死(参见附图3~7)。表4实验材料组和对照组大鼠实验前和3月后的体重比较时间(h)实验组(g)对照组(g)实验前188.3±2.8188.6±2.43月后427.4±10.6423.9±8.3急性和亚慢性毒性试验分别参照ASTMF750-1987和OECD指南中规定设计，实验结果显示全身急性和亚慢性毒性试验中实验动物未见任何毒性及不良反应，表明PLLA可降解血管吻合装置具有良好的生物安全性。(4)溶血试验取健康家兔新鲜血液2ml，肝素抗凝，加入25ml生理盐水(预热至37°C)，轻轻混匀，制成稀释家兔抗凝血备用。取9支试管，3支试管加入10ml生理盐水和5gPLLA材料(实验组)，3支试管加入10ml生理盐水(阴性对照组)，3支试管加入10ml蒸馏水(阳性对照组)。全部于37'C水浴中静置30min，然后向上述每支试管各加入0.2ml稀释家兔抗凝血，轻轻混匀，继续37。C水浴60min。然后取出试管750rpm离心5min，各管取上清液4ml。在WFZ800-D3B型紫外分光光度计于波长545nm处测量各管溶液的吸光度(以生理盐水调零)，计算溶血率。溶血率公式溶血率(％)=(材料平均吸光度-阴性组平均吸光度)/(阳性组平均吸光度-阴性组平均吸光度)X100%。9支试管各加入0.2ml稀释家兔抗凝血后，轻轻混匀，肉眼可见实验材料组和生理盐水组溶液颜色呈红色浑浊状，说明均无溶血现象；蒸馏水组则呈红色透明状，提示有溶血。PLLA材料的溶血率为1.99%(表5)，低于临界值5%。表5各组吸光度值及PLLA材料溶血率分组试管l试管2试管3均数溶血率(％)实验材料组0.0090.0120.010o扁1.99阴性对照组0.0010扁0.0010.002阳性对照组0.4040.3980.4090.404(5)凝血试验取PLLA颗粒样品50、100、200mg分别加入健康人正常混合血浆2.7ml中，用自动血液凝固仪于lh内测定凝血酶原时间(PT)、部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶凝固时间(TT)和纤维蛋白原(Fig)。加入不同剂量PLLA颗粒材料后，血浆凝血功能各项指标均正常，且与对照组比较均无显著性差异(P〉0.05)(如表6)。表6不同剂量PLLA材料作用后的凝血功能情况分组PT(s)膽APTT(s)TT(s)Fig(gA)空白对照组11.2±0.1l.OO土O.Ol25.5±0.712.1±0.22.4±0.150mg材料组11.3±0.10.99±0.0126.8±1.312.4±0.32.3±0.2100mg材料组11.2±0.21.03±0.0526.0±1.112.3±0.22.4±0.2200mg材料组11.2±0.2l.OOiO.Ol26.2±1.012.2±0.32.4±0.2实验结果显示不同剂量PLLA可降解血管吻合装置作用后，血浆凝血功能各项指标均正常且与对照组比较均无显著性差异，说明PLLA可降解血管吻合装置对凝血功能无影响。(6)微核试验取健康昆明种小鼠24只，体重2024g，雌雄各半。随机分为3组，实验组、阴性对照组和阳性对照组各8只。实验组每次按50ml/kg剂量经尾静脉注射材料浸提液(浸提液制备方法同急性毒性试验)，阴性对照组每次按508ml/kg剂量经尾静脉注射等量灭菌生理盐水，阳性对照组每次按40mg/kg剂量经尾静脉注射环磷酰胺(CTX)溶液。两次给药，间隔24h。于第二次注射后6h，颈椎脱臼法处死小鼠，立即取出股骨，剪去两干骺端，用注射器吸取少许胎牛血清冲洗出骨髓，混匀，匀速推片制得骨髓涂片。每只动物做2张涂片，涂片自然干燥，甲醇固定510min，冲洗晾干后瑞吉染色1012min，用水冲洗，晾干。选择细胞完整、分散均匀、着色适当的区域，在油镜下观察，每只小鼠计数1000个嗜多染红细胞，并计数含有微核的嗜多染红细胞数，计算骨髓微核率(％0。油镜下嗜多染红细胞及微核形态如图14所示。实验材料PLLA组的骨髓微核率为1.0±0.8%。，低于阳性标准5%。，与阴性对照组比较无显著性差异(P〉0.05)，而与阳性对照组则有显著性差异(P〈0.05)(如表7)。表7实验材料组、阴性和阳性对照组小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本试验实验材料组骨髓微核率仅1.0±0.8%。，低于阳性标准5%。，并与阴性对照组比较无显著性差异，而与阳性对照组差异非常显著，说明PLLA可降解血管吻合装置无致突变作用。2.体内植入试验采用自身对照实验设计。实验材料PLLA套管，将其垂直切成两半(植入时两半对合围在血管周围)；阴性对照材料聚氯乙烯(PVC)，该材料已证实具有良好的生物特别是血液相容性，所植入的PVC对照材料形状大小与实验材料类似。取健康雄性SD大鼠20只，体重180200g，随机分为4组，每组5只。乙醚持续吸入麻醉，无菌条件下开腹，将灭菌实验材料PLLA套管和阴性对照材料PVC均植入下腔静脉周围，每只大鼠各植入1个实验材料和1个阴性对照材料，间距约0.8cm,适当固定后关腹。术后观察大鼠一般状况。于植入后第l、2、4、8周分批无痛处死大鼠，解剖暴露下腔静脉周围的植入区，观察植入试样周围炎症及纤维包裹情况。切取标本，包括植入试样及其包绕的血管和周围0.51.0cm的组织，置入10%甲醛溶液内固定24h以上，乙醇系列脱水，透明，石蜡包埋成块后，切片，HE染色，在光镜下观察其组织病理学改变。术后l-2周肉眼可见，植入材料周围组织充血、水肿明显，并有少量纤维包裹形成，随时间推移，纤维包裹逐渐增厚，材料所包绕的下腔静脉腔内无血栓形成，实验材料PLLA组和对照材料PVC组大体病理情况基本相似。术后4-8周实验组、对照组材料周围充血、水肿情况明显消退，纤维包裹层较之前变薄、变致密，下腔静脉腔内仍无血栓形成。术后早期(1-2周)l周后实验组和对照组的组织病理切片参见附图8和附图9，由切片图可见，对照组PVC材料周围组织可见较多的炎性细胞浸润，以中性粒细胞、淋巴细胞及巨噬细胞为主，并可见少量成纤维细胞，实验组PLLA材料周围细胞浸润程度与对照组相仿。术后中期(第4-8周)第8周实验组和对照组的组织病理切片参见附图IO和附图11。对照组、实验组材料周围炎性细胞数量明显减少，以淋巴细胞为主，可见到由成熟的纤维细胞构成的纤维膜包裹，随时间推移，纤维细胞层逐渐变薄，并逐渐变为纤细致密的纤维成份。各组切片均未见组织变性、坏死和异常增生。术后1周中性粒细胞的浸润程度对照组为28.4±3.2，实验组为30.2士3.3;术后8周淋巴细胞的浸润程度对照组为15.8±2.2，实验组为16.2±2.6，统计学分析同期实验组与对照组之间无显著性差异(P〉0.05)。本实验过程中20只大鼠全部成活，一般情况良好，饮食、行为及精神状况无改变，无全身及局部毒性反应发生。PLLA可降解血管吻合装置植入1周时，组织反应呈急性炎症，材料周围的炎性细胞以中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞为主，并可见少量成纤维细胞，周围纤维包膜边界不清；至植入2周以后，炎症反应渐趋于慢性，纤维包膜明显增厚；6周左右时，组织反应呈慢性炎症反应，淋巴细胞数量渐多于中性粒细胞；8周左右时，植入PLLA可降解血管吻合装置周围炎性细胞数量明显减少，以淋巴细胞为主，可见到由成熟的纤维细胞构成的纤维包膜，并逐渐致密化。各期实验材料和对照材料周围组织反应相似。本试验结果显示PLLA可降解血管吻合装置虽然有轻度的组织炎症反应，但与目前临床广泛使用表现良好生物相容性的对照材料PVC相比，仍表现良好的组织相容性。通过综合上述PLLA可降解血管吻合装置的细胞毒性试验、全身急性和亚慢性毒性试验、溶血和凝血试验、微核试验以及体内植入试验，可以证实PLLA可降解血管吻合装置具有良好的生物相容性。3.PLLA血管套管的体内外降解试验10(1)体外降解试验将PLLA血管吻合装置真空干燥至恒重，室温2(TC，电子天平称量得实验材料初始质量(Wo)。将材料置入37。CPBS缓冲溶液(PH值7.4)中，在上述条件下降解，3月内每周取出材料，生理盐水冲洗，真空干燥至恒重，室温2(TC称量材料降解后质量(W0。所有称重均在试样真空干燥24h后进行。计算PLLA可降解血管吻合装置的质量残留率，计算方法为质量残留率(％)=Wi/WoX100%。PLLA可降解血管吻合装置在PBS缓冲溶液中的质量变化情况以残留率表示，各周次的质量残留率如附图12所示。(2)体内降解试验PLLA套管植入前，依前述体外降解试验方法测量各植入试样质量，依上述体内植入试验方法将各试样植入10只大鼠(每只大鼠各植入两个试样，精确标记)，于术后lw、2w、lm、2m及3m各处死大鼠2只，取出试样，清洗后放入50ml含n型胶原酶(浓度2g/L)的PBS溶液中2d，消化残留组织，取出冲洗干净后真空干燥试样，精确测量试样质量，依体外降解试验的计算方法计算质量残留率。植入后各期PLLA套管试样的质量变化情况参见附图13。各期取出套管的形态、体积与植入前相比均无明显变化，套管呈不均匀乳白色，表面光洁度下降。(3)血清乳酸浓度在对大鼠做体内降解试验的同时，在植入PLLA血管吻合装置前，以及植入PLLA套管后lw、2w、lm、2m及3m分别抽血査血清乳酸浓度，每次抽取4个血清标本。PLLA可降解血管吻合装置植入后lw、2w、lm、2m及3m的大鼠血清乳酸浓度与植入前比较均无显著性差异(PX).05)，材料植入前后各期的血清乳酸浓度变化参见附图14，表明实验材料降解产生的乳酸对大鼠体内乳酸水平无明显影响。通过体内、外材料降解试验和血清乳酸浓度的测定，可以表明PLLA可降解血管吻合装置是一种可降解的生物材料，降解产物对机体不致于造成明显不良影响。4.应用PLLA血管吻合套管进行血管吻合动物实验选健康雄性SD大鼠10只，体重180200g，随机分成2组，实验组和对照组各5只。实验组大鼠应用PLLA血管吻合套管行下腔静脉端-端吻合，吻合过程如附图2所示；对照组大鼠用9/0可吸收线以常规两定点缝合法行下腔静脉端-端吻合，并比较吻合时间和吻合后吻合口血流通畅情况。实验组大鼠选用PLLA套管吻合下腔静脉，平均用时9.7土0.9min，对照组大鼠下腔静脉行常规针线吻合，平均用时15.9士1.3min，两者差异显著(P<0.05)。吻合后观察吻合口充盈情况，确认充盈良好后即行勒血通畅试验，结果实验组大鼠下腔静脉吻合口均通畅，对照组大鼠有1例吻合口远端压瘪的静脉充盈缓慢，提示吻合口部分梗阻。权利要求1.一种可降解血管吻合套管，其特征在于所述血管吻合套管是用高分子材料PLLA经注射成形法制成的圆筒形套管，套管壁厚和内径与待修复的血管相适配。2.如权利要求1所述的血管吻合套管，其特征在于所述套管一端的外壁上设有螺纹或凹槽或突起，套管另一端设有推进小柄。3.如权利要求1或2所述之一的套管的制备方法，其特征在于按所需血管吻合套管的形状制作模具，将PLLA材料加入模腔中，加热模具至180-220°C，保温10-30min使原料充分熔融，然后冷却至60-10(TC加压挤出，并保压冷却至室温后脱模。全文摘要本发明公开了一种可降解血管吻合套管，该套管是用高分子材料PLLA经注射成形法制成的圆筒形套管，套管壁厚和内径与待修复的血管相适配。本发明制备的PLLA血管吻合套管具有生物可降解性，解决了吻合装置在体内残留的问题。用本套管完成血管吻合后，一方面，套管在一段时间内能起到支撑固定作用，使两断端血管对合良好，吻合口不易扭转和狭窄；另一方面，这种套管最终能在体内自行逐步降解吸收，吻合后血管腔面没有内膜损伤及缝线残留，从而不影响血管正常的舒缩功能以及生长发育，也不会在血管外膜形成异物肉芽肿，从而减少了吻合口血栓形成的可能，具有良好的远期血管通畅率。文档编号A61L29/00GK101322860SQ20071003510公开日2008年12月17日申请日期2007年6月12日优先权日2007年6月12日发明者周科朝,朱晒红,李志友,黄苏萍申请人:中南大学