多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂的应用的制作方法

专利名称：：多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物医药领域，具体地涉及多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂在制备治疗中枢神经系统退行性疾病药物中的应用。
背景技术：
：中枢神经退行性疾病对全球人口存在越来越大的威胁。世界卫生组织预测，到2040年中枢神经退行性疾病将超过癌症成为人类的第二大死因。2002年，中枢神经退行性疾病导致的全球人口死亡总数是50万人。该病主要发生在老年人，但也有一些早发病例。同时，随着人们生活水平的提高，人类生存寿命逐渐延长，从而使中枢神经退行性疾病的高危人群数量进一步增加。目前,随着社会的进步、老年人口的比例和数量不断增加，这类疾病已经成为影响人类健康水平和生活质量的重大社会问题。中枢神经退行性疾病是可表现为多种临床症状和结果的一类疾病的总称。中枢神经系统退行性疾病大多呈进行性发展，是一类病因学和发病机制尚不清楚的疾病。它的发病机制是通过具有特定功能的神经核团发生萎縮和神经元死亡，从而引起脑损害或躯体功能障碍。目前已发现的中枢神经系统退行性疾病..阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD)、帕金森病(Parkinson'sdisease,PD)、亨廷顿病(Huntingtondisease,HD)、肌萎縮性脊髓侧索硬化症(amyotrophiclateralsclerosis,ALS)、Lewy体痴呆(dementiawithlewybody,DLB)、多发梗死灶性痴呆(multi-infarctdementi2a,MID)、Pick小体病(Pickbodydisease)、大脑前叶退行性变(frontallobedegeneration，FLD)、皮层基底节退行性变(corticobasaldegeneration，CBD)、多系统蒌縮症(multiplesystematrophy，MSA)、渐进性上运动核瘫痪(progressivesupranuclearpalsy,PSP)、新变异型Creutzfeldt-Jakob病(newvariantCreutzfeldt-Jakobdisease，nvCJD)等，目前临床上对于这类疾病尚无有效控制病程进展的措施,患者最终将丧失生活能力甚至死亡。阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD)的发病率在多种退行性疾病中位居首位，是一种渐进性的神经退行性疾病，为老年性痴呆中最常见的病因。临床表现为进行性认知功能下降，记忆和日常生活能力的丧失;晚期患者甚至不能识别家庭成员。病变最易累及的区域是与高级认知功能相关的脑区,特别是新皮层和海马。脑组织病理检查可见到相关脑区(基底前脑、海马和新皮层等)内神经突触和锥体神经元消失等。(DeStrooperB，.JCellSci，2000,113:1857-1870;ZhangX.CurrDrugTargetsCMSNeurolDisord,2004,3:137-152;Muir几.PharmacolBiochemBehav，1997，56:687-696.)目前临床上，AD患者经常被给予一些辅助用药,如失禁药物,抗抑郁药或镇静药来控制某些牿殊的症状，但一般有两种药物被用来控制AD的进展:胆碱脂酶抑制剂和NMDA受体拮抗剂。目前尚无能够阻断AD进展的疫苗，疗法或药物。帕金森病(parkinson'sdisease,PD)是以中脑黑质中多巴胺能神经元为主受到损伤的老年性退行性神经疾病，呈进行性发展。临床早期以锥体外系运动受损为主运动迟缓、静止性震颤、肌强直及姿势反射障碍为临床特征，随着疾病进展，可出现认知障碍，包括痴呆、抑郁和焦虑等症状，其中对于帕金森病伴随有痴呆的病人能够占到30—60%不等，甚至有调查显示可达到93%的病人有痴呆表现；多巴胺替代治疗有效；临床发病年龄一般在60岁左右，早到40岁就可出现症状，在55岁以上有1%的罹患该病，66岁以上可达2%以上。PD病因尚不清楚，发病机理复杂；病理特征为选择性黑质多巴胺能神经元变性丢失、残余多巴胺能神经元出现嗜酸性包涵体(lewy小体)，导致黑质纹状体系统多巴胺递质减少的生化改变。对于多巴胺能神经元选择性丢失的认识，以氧化应激反应、线粒体功能缺陷和细胞凋亡机制为基础的解释得到了大家的认可，在此认识基础上的药物治疗包括-1)多巴胺替代治疗，如左旋多巴；2)多巴胺受体激动剂，如溴隐亭、麦角乙脲等；3)抗胆碱能制剂，如本海索；4)多巴胺释放促进剂，如金刚垸胺；4)单胺氧化酶抑制剂，如丙炔苯丙胺等；5)儿茶酚胺氧位甲基转移酶抑制剂，如硝替卡明；6)其它，如谷氨酸拮抗剂、抗组胺药、心得胺等；此外，阿朴吗啡、卡麦角林、罗皮尼罗、普拉克索也有报道用于PD治疗。由于现有药物主要以改善症状为目的，难以达到阻止或减少用药过程中多巴胺能神经元继续丢失，不能有效改变病程进展，甚至有加速多巴胺能神经细胞丢失的毒副作用，如左旋多巴。因此，开发出效果显著且副作用小的治疗相关中枢神经退行性疾病的新型药物是保障人们健康的迫切需要。
发明内容本发明的目的在于提供一类多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂，其可通过抑制多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白的转运功能而上调突触间歇多巴胺和去甲肾上腺素的浓度，减少神经细胞死亡，从而可用于制备中枢神经退行性疾病的治疗药物。在本发明的第一方面，提供了多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂的用途，用于制备治疗中枢神经退行性疾病的药物。在本发明的另一优选例中，所述的多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂为一类补骨脂酚类化合物，其结构通式为其中，Rl为氢、C1C8的酰基或卤族。R2、R3、R4、R5分别为氢或卤族。上述C1C8的酰基是指具有18个碳原子的支链或支链羧酸的酰基，例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基、丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、新戊酰基、己酰基、庚酰基和辛酰基支链羧酸的酰基(如丙二酸酰基)等。上述的卤族是指氟、氯、溴或碘原子。优选氯原子。本发明还涉及补骨脂酚类化合物的以酯、氨基甲酸酯或其他常规的"前体药物"的形式，当以这种形式给药时，在体内可转化成活性部分；更优选地，上述补骨脂酚类化合物为13-羟基异补骨脂酚(在本文中也叫Bu)，其结构式如下或其衍生物。较佳的，上述补骨脂酚类化合物为13-羟基异补骨脂酚。上述的13-羟基异补骨脂酚衍生物是指以13-羟基异补骨脂酚为先导化合物，对其进行进一步的结构修饰和改造，而得到对中枢神经退行性疾病具有疗效的化合物。在本发明的另一优选例中，上述中枢神经退行性疾病包括阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD)、柏金森病(parkinson，sdisease,PD)、亨廷顿病(Huntingtondisease，HD)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophiclateralsclerosis,ALS)、Lewy体痴呆(dementiawithlewybody,DLB)、多发梗死灶性痴呆(multi-infarctd柳enti2a，MID)、Pick小体病(Pickbodydisease)、大脑前叶退行性变(frontallobedegeneration,FLD)、皮层基底节退行性变(corticobasaldegeneration,CBD)、多系统萎縮症(multiplesystematrophy，MSA)、渐进性上运动核瘫痪(progressivesupranuclearpalsy,PSP)、新变异型Creutzfeldt-Jakob病(newvariantCreutzfeldt-Jakobdiseas,nvCJD)。更优选地，上述中枢神经退行性疾病为帕金森病(parkinson，sdisease,PD)或阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，AD)。在本发明的第二方面，提供了一类多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂的用途，用于制备治疗神经元细胞损伤或死亡相关的疾病的组合物，包括保健品和药物组合物，较佳的，是用于制备相关的药物组合物。在本发明的第三方面，提供一种多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂剂的用途，用于制备治疗多巴胺和/或去甲肾上腺素功能低下性神经疾病的药物。在本发明的第四方面，提供了多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂的用途，用于制备治疗中枢神经退行性疾病的药物组合物。在本发明的第五方面，本发明还提供一种用于治疗中枢神经退行性疾病的药物组合物，所述药物组合物包含多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂及其药学上可接受的载体。上述药物的剂型是片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒剂、悬浮液、糖浆或注射剂等。较佳的，上述多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂为一类结构通式为式I的补骨脂酚类化合物，其中，Rl为氢、C1C8的酰基或卤族；R2、R3、R4、R5分别为氢或卤族。更佳的，上述多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂为结构式为式II的13-羟基异补骨脂酚或其衍生物。另一方面，根据不同的需要，本发明的含多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂的组合物还可与其它治疗中枢神经退行性疾病的药物联合应用，来治疗中枢神经退行性疾病。本发明药物或药物组合物还可以用于治疗与神经元损伤或死亡相关的疾病。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图1:Bu对D8细胞毒性实验和对MPTP诱导D8细胞毒性反应的保护作用。1:CH0细胞+l免DMS0的HBS;2:D8细胞+WDMS0的冊S;3:D8细胞+33幽MPP+;4-Q8细胞+33幽!^++10幽081^5:08细胞+33^1^++1,81^6:D8细胞+33,MPP++10MMBu;7:D8细胞+33幽MPP++100PMBu;8:D8细胞+l幽Bu;9:D8细胞+10MMBu;10:D8细胞+100MMBu;图2:转棒实验评价Bu对MPTP小鼠停留时间的影响。D4、D9和D14，分别代表MPTP和药物处理后第四天、第九天和第十四天。Solvent+NS:正常对照组；Solvent+MPTP:代表PD模型组；4mg/Kg+MPTP、20rag/Kg+MPTP和100mg/Kg+MPTP:分别代表Bu三个治疗剂量组；LDP+MPTP:左旋多巴(100mg/Kg,ip)阳性对照组。图3:转棒实验评价Bu处理14天后，对MPTP小鼠停留时间的影响。说明见图2。图4:TH免疫组织化学评价Bu对MPTP模型小鼠黑质多巴胺神经元的保护作用。对照组(control)为正常小鼠，即腿;MPTP/Vehicle:模型组；4mg/Kg、20mg/Kg和100mg/KgLDP，分别代表不同剂量组；左旋多巴(LDP):阳性对照组。具体实施方式如本文所用，所述的"本发明双重抑制剂"和"多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂"包括所有能同时完全地或部分地抑制多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白对多巴胺和去甲肾上腺素的摄取和转运功能的物质。更优选的，本发明双重抑制剂为补骨脂酚类化合物以及它们的衍生物等。在本发明的另一优选例中，所述的多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂为一类结构通式为式I的补骨脂酚类化合物，其中，Rl为氢、C1C8的酰基或卤族；R2、R3、R4、R5分别为氢或卤族。上述C1C8的酰基是指具有18个碳原子的支链或支链羧酸的酰基，例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基、丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、新戊酰基、已酰基、庚酰基、辛酰基或丙二酸酰基等。上述的卤族是指氟、氯、溴或碘原子。优选氯原子。本发明还涉及补骨脂酚类化合物的以酯、氨基甲酸酯或其他常规的"前体药物"的形式，当以这种形式给药时，在体内可转化成活性部分；更优选地，所述的补骨脂酚类化合物为结构式为式II的13-羟基异补骨脂酚(在本文中也叫Bu)或其衍生物。上述的13-羟基异补骨脂酚衍生物是指以13-羟基异补骨脂酚为先导化合物，对其进行进--步的结构修饰和改造，而得到对中枢神经退行性疾病具有疗效的化合物，包括本发明双重抑制剂在药学上可接受的盐。本发明中，所述的多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂可以以纯净的补骨脂酚类化合物或其衍生物的形式存在；也可以以含有补骨脂酚类化合物或其衍生物的混合物或提取物(比如可提取自中药)的形式存在；或者，也可以以包含补骨脂酚类化合物或其衍生物的中药材或中药活性部位的形式存在。发明人发现，本发明双重抑制剂能抑制多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白对多巴胺和去甲肾上腺素的摄取和转运功能作用，而对其它转运蛋白(如Y-氨基丁酸转运蛋白)无作用或作用不明显。这表明本发明双重抑制剂具有作用特异性。本发明所述的中枢神经退行性疾病包括阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，AD)、帕金森病(parkinson，sdisease,PD)、亨廷顿病(Huntingtondisease，HD)、肌萎縮性脊髓侧索硬化症(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)、Lewy体痴呆(dementiawithlewybody,DLB)、多发梗死灶性痴呆(multi-infarctdementi2a,MID)、Pick小体病(Pickbodydisease)、大脑前叶退行性变(frontallobedegeneration，FLD)、皮层基底节退行性变(corticobasaldegeneration,CBD)、多系统萎縮症(multiplesystematrophy，MSA)、渐进性上运动核瘫痪(progressivesupranuclearpalsy，PSP)、新变异型Creutzfeldt—Jakob病(newvariantCreutzfeldt-Jakobdisease,nvCJD)。较佳地，所述的中枢神经退行性疾病为帕金森病(parkinson'sdisease,PD)或阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，AD)。本发明中，所述的多巴胺和或去甲肾上腺素功能低下性神经疾病是指由于神经突触间歇多巴胺和或去甲肾上腺素的浓度或含量病理性低下、活性低下而导致的神经系统疾病；或者由于神经突触间歇多巴胺和去甲肾上腺素的浓度或含量病理性低下、活性低下而导致的神经系统疾病。在本发明的另一优选例中，所述的药物组合物含有补骨脂酚类化合物或其衍生物5-IO重量份；药学上可接受的载体80-150重量份；其中，补骨脂酚类化合物或其衍生物的总含量为药物组合物总重量的0.01-99%,较佳地0.1-90%，更佳的0.1-20%。在本发明的另一优选例中，所述的药物为13-羟基异补骨脂酚。13-羟基异补骨脂酚的总含量为本发明药物或药物组合物总重量的0.01-99%，较佳地0.1-90%,更佳的0.1-20%。本发明双重抑制剂也可以由药学上或生理学可接受的酸或碱衍生的盐形式使用。这些盐包括(但不限于)与如下无机酸形成的盐如盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、以及与有机酸形成的盐，而有机酸则指乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸和马来酸。其他盐包括与碱金属或碱土金属(如钠、钾、钙或镁)形成的盐，以酯、氨基甲酸酯或其他常规的"前体药物"的形式(当以这种形式给药时，在体内可转化成活性部分)。使用多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂在治疗中枢神经退行性疾病时，药物的量取决于疾病的性质和程度以及病人已接受治疗的情况。最终由处方医生决定给予病人多少剂量，临床使用的剂量为每公斤体重每日可使用0.05-300mg的多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂。本发明还提供了一种含有本发明双重抑制剂的组合物，优选的，所述的组合物为药物组合物。一般，合适的含量是多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂占药物组合物总重量的0.01-99%，较佳地O.1-90%,更佳的O.1-20%。除了作为活性成份的本发明双重抑制剂，所述的组合物中还可含有药学上可接受的载体，包括但不限于填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、矫味剂、包覆材料、膳食制品、或缓/控释剂等。根据不同的给药方式，所述的组合物可以制备成固体或凝胶等形式，如丸剂、片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒剂等；或者是液体形式，如注射剂、悬浮液、糖浆。它们适合口服给药、直肠给药、局部给药或肠胃外给药、或者静脉内给药等。本发明中，"药学上可接受的"成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。"药学上可接受的载体"是用于将本发明双重抑制剂传送给动物或人的药学上或食品上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是液体或固体。本发明的经口给药的固体组合物可采用片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、滴剂等形式。这些固体组合物中混合了1种或1种以上的活性物质和至少1种惰性稀释剂，例如，乳糖、甘露糖醇、葡萄糖、羟丙基纤维素、微晶纤维素、淀粉、聚乙烯毗咯垸酮、琼脂、果胶、硅铝酸镁、铝酸镁。还可按照常用方法使组合物中含有除了惰性稀释剂之外的添加剂，例如，硬脂酸镁等润滑剂、纤维素乙醇酸钙等崩解剂、乳糖等稳定剂、谷氨酸或天一氨酸等助溶剂。如是片剂或丸剂，还可根据需要，在其外部包裹上蔗糖、明胶、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸酯等糖衣或胃溶性、肠溶性薄膜。经口给药的液体组合物包括药剂上允许的乳浊剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂、酏剂等，通常使用的惰性稀释剂包括精制水、乙醇。该组合物中除了惰性稀释剂之外，还可包含湿润剂、悬浮剂等助剂，甜味剂、矫味剂、芳香剂和防腐剂。非经口给药的注射剂包括无菌水性或非水性溶液剂、悬浮剂和乳浊剂。水性溶液剂和悬浮剂中包含注射剂用蒸馏水及生理盐水。非水溶性溶液剂和悬浮剂中包含两二醇，聚乙二醇，可可脂、橄揽油、蓖麻油等植物油，乙醇等醇类，阿拉伯胶、吐温80等。这些组合物中还可包含等渗剂、防腐剂、湿润剂、乳化剂、分散剂、稳定剂(例如，乳糖)、助溶剂(例如，谷氨酸、天冬氨酸)。用过滤除菌上述组合物，再配合使用灭菌剂就可达到无菌的目的。然后，利用上述组合物制得无菌的固体组合物，在使用前用水或无菌注射用溶剂溶解就可加以利用。可用于配制本发明口服剂型的、具体的药学上可接受的载体和赋形剂例子，在美国专利No3，903，297(1975年9月2日授予Robert)中有描述。用于制造本发明的有用剂型的技术和组合物，在下列文献中有描述7种现代制剂(7ModernPharmaceutics)第9和10章(Banker綠odes编辑，1979):Lieberman等人，药物剂型片剂(PharmaceuticalDosageForms-Tablets)(1981);和Ansel,药物剂型导论(IntroductiontoPharmaceuticalDosageForms)2版(1976)。本发明双重抑制剂，通过体外实验以及动物体内实验的研究证明，该类化合物能选择性抑制多巴胺转运蛋白、去甲肾上腺素转运蛋白，而对Y-氨基丁酸转运蛋白和五羟色胺转运蛋白活性均没有影响，并且该类化合物对细胞没有毒性；同样剂量下，本发明双重抑制剂药效显著好于目前临床帕金森病药物左旋多巴，并对黑质多巴胺神经元有明显地保护作用。因此，该类化合物将为临床治疗中枢神经退行性疾病提供新的药物选择，具有良好的市场前景。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sarabrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。以下实施例中所用药品的来源如下13-羟基异补骨脂酚采用中国药检所市售产品；1640培养基培养、小牛血清购自GIBCO公司；3H-DA、3H-GABA、3H-五羟色胺、3H-去甲肾上腺素、购自AmershamPharmaciaBiotech公司;安非他酮(标记为BRP)、GBR购自sigma;左旋多巴购自Roche,上海；中华仓鼠卵巢细胞(CHO)、COS-7细胞购自美国ATCC公司；C57BL/6小鼠购自中科院动物中心。其它化学试剂购自Sigma公司。实施例1、体外歸选模型的建立建立以五羟色胺、去甲肾上腺素、多巴胺、Y-氨基丁酸四种神经转运蛋白(5-HTT、NET、DAT、GAT-1)为靶标的活性筛选细胞系的建立。通过将大鼠的5-HTT、NET、DAT、GAT-1全长编码序列(5-HTT的GenBank登录号为GI207086;NET的GenBank登录号为GI4630791:DAT的GenBank登录号为GI310097;GAT-1的GenBank登录号为GI204221)克隆于pCDNA3载体(美国invitrogen公司)的多克隆位点中，用电穿孔方法转染导入中华仓鼠卵巢细胞(CHO)，48小时后用含G418的1640培养基培养。IO天后对照组细胞全部死亡，而实验组形成许多细胞克隆。挑取克隆培养一周后，待细胞铺满孔底，吸去培养基，同上用胰酶消化。每孔中的细胞分别接种于两块96孔平板的相应的孔中。待细胞长满孔底后，其中一块板用于同位素流量测定。将对应的另一块板中转运活性高的孔中的细胞逐级扩大培养，每一级都进行同位素流量测定后选取转运活力较高细胞株培养，最后选取转运活力最高的细胞克隆(分别命名为D8，Gl细胞)保种，建立永久表达五羟色胺、去甲肾上腺素、多巴胺、氨基丁酸的多种神经转运蛋白的CH0细胞系(分别命名为S6,N1，D8，GAT-1)。实施例2、多巴胺转运蛋白激动剂体外筛选及选择专一性的测定培养D8细胞于48孔板(Costar)至平板铺满(大约每孔6万细胞)。弃培液。用PBS洗涤一次，吸去PBS溶液，每孔加入90ulHBS(10mMH印es，lOOmMNaCl，PH8.0)，25。C温育10分钟，每孔加入10ul朋S反应液。实验组及阳性对照药加入80ul冊S，10ul不同浓度的药物，及10ul3H-DA(AmershamPharmaciaBiotech),100幽维生素C和IOOMM帕吉林。25。C温育20分钟，用冰浴的PBS溶液洗涤三遍,用裂解液裂解60分钟，吸取各孔的裂解液加入到1.2ml的闪烁液中，放入液闪计数仪(BeckraanLS5000TA)中检测同位素的含量(DMP值)，以此来衡量药物对多巴胺转运蛋白的转运活性的影响。药物对于GABA转运蛋白活性检测，方法类似于多巴胺转运蛋白，用GAT-1细胞替代D8细胞，50nM3H-GABA(AmershamPharmaciaBiotech)取代了反应体系中的:iH-DA，其他方法不变。药物对于五羟色胺转运蛋白活性检测，方法类似于多巴胺转运蛋白，用S6细胞替代D8细胞，50nM3H-五羟色胺取代了反应体系中的3H-DA，其他方法不变。药物对于去甲肾上腺素转运蛋白活性检测，方法类似于多巴胺转运蛋白，用Nl细胞替代D8细胞，50nM3H-去甲肾上腺素取代了反应体系中的3H-DA，其他方法不变。结果见表一表一13-羟基异补骨脂酚对单胺类神经递质转运蛋白的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>从表一可知在0.3uM-lOuM浓度下，13-羟基异补骨脂酚(Bu)对多巴胺转运蛋白(DAT)也显示很强的抑制活力(P〈0.05)。在0.3uM浓度下可抑制37%，1yM浓度下可抑制60%，lOuM浓度下可抑制88%。在0.3uM-10uM浓度下，Bu对D8细胞多巴胺摄取活力的抑制效果与阳性对照药物安非他酮(BPR)相当(P>0.05)。在O.l"M-lOuM浓度下，Bu对去甲肾上腺素转运蛋白的摄取活力有显著抑制作用(P〈0.0S)。0.3uM浓度下可抑制36W，1uM浓度下可抑制60%，10uM浓度下可抑制87.8%。在lyM浓度下，Bu对NET细胞摄取活力的抑制效果与阳性对照药物安非他酮(BPR)相当(P〉0.05)。在0.3uM-10yM浓度下，Bu对GAT-1细胞的y-氨基丁酸转运蛋白和S6细胞的5-羟色胺转运蛋白的活性均没有影响(P>0.05)。上述緒果表明13-羟基异补骨脂酚(Bu)对多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白均有抑制活性，抑制作用强于阳性对照药物安非他酮(BPR),而对Y-氨基丁酸转运蛋白和5-羟色胺转运蛋白的活性均没有影响。因此，13-羟基异补骨脂酚对多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白的抑制作用具有选择性和特异性。实施例313-羟基异补骨脂粉细胞毒性实验及对MPP+细胞毒的抑制作用将D8细胞于1640培养基培养，加10%小牛血清培养，待长满培养皿后，胰酶消化，接种于48孔细胞板中，继续培养待细胞数量达到105左右，分别处理如下换液后,对照组加10W对照液(含浅DMS0的HBS)，药物不同剂量组分别加10W不同浓度的Bu，使其终浓度分别为1幽，10MM和100MM;另外，以33MMMPP+单独处理和与上述不同浓度Bu共同处理细胞；细胞继续培养24小时，在第20小时加MTT，使终浓度为0.5mg/ml。反应结束后，吸去培养液，加10(^DMS0，37。C温育10分钟。转移至96孔板，在570ran波长下用酶标检测仪测每个孔01)值。结果见图1:在分别含有IOOMM、10MM和1HMBu的1640培养液环境下，经24小时培养的D8细胞的生长能力与对照组细胞无显著性差异，表明100PM以内Bu无细胞毒性作用。33MMMPP+作用于D8细胞，可使细胞活力抑制75%，Bu呈浓度依赖性地缓解这种抑制作用，表明Bu有保护MPP+诱导的D8细胞免受损伤的作用。实施例413-羟基异补骨脂酚对帕金森病大鼠模型的治疗作用l.行为学检測动物及分组C57BL/6小鼠，雄性，13月龄，体重28-36g，共60只，购于中国科学院上海实验动物中心，SPF级。常规饲养，光照时间7AM-7PM。正式实验前，对动物进行转棒爬行训练。训练方法将动物放在转棒测试仪(DigBehav-RRTM,上海吉量科技有限公司)上，根据小鼠活动能力，设定转速区间为8-17转/分钟，时间为5.5分钟；每天训练3次，共训练14天，软件自动记录小鼠在转棒停留时间(RetentativeTime)。根据停留时间筛选动物，将小于240秒的动物剔除。将符合标准动物随机分为6组，即正常组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组及左旋多巴对照组，每组9只。分组后，经统计学分析，各组小鼠滚筒爬行时间以及体重没有显著性差异。动物处理模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组及左旋多巴对照组分别给予空白溶剂、4mg/KgBu、2(tog/KgBu、100mg/KgBu及左旋多巴(Roche,上海)100mg/Kg(含25mg/Kg苄丝肼)，腹腔注射；半小时后，分别予以MPTP(Sigma,USA)20mg/Kg颈皮下注射。正常组，用等体积空白溶剂和0.9%生理盐水分别代替观察药物和MPTP溶液。共处理14天。观察指标于处理后第4天、第9天、第14天观察动物滚筒停留时间，每次观察时间点为lh、2h、4h、6h、8h、10h、24h后，检测参数设定同训练参数。结果见图2，第4天MPTP处理4小时后，Bu高剂量组可轻度改善MPTP对动物运动的影响。第9天、14天，中高剂量组均可明显改善动物运动减少症状，而第14天改善作用明显强于第4天和第9天，。第14天分别测定MPTP1小时、2小时、4小时、6小时、8小时和10小时后行为学的检测，动物在MPTP注射4小时后Bu治疗作用显著，其中第6小时作用最为明显，并且呈现剂量依赖效应，见图3。结论Bu对PD模型行为学异常有改善作用，提示BU对帕金森氏病具有治疗作用。2.形态学检测第15天给药6小时后，将所有动物处死，多聚甲醛灌注固定，快速取脑组织，用免疫组织化学检测黑质TH阳性神经元4'C下，将标本用多聚甲醛3ml固定24小时，然后将组织置入10ml蔗糖PBS缓冲液中。冰冻切片机，连续切片，厚度40wru将切片放入含3%羊血清和0.2%TritonX-100的PB液孵育过夜。4。C下，加兔抗TH血清孵育48小时。用0.OIMPBS洗3-4次，每次5分钟，然后将切片放入含二抗(生物素标记羊抗兔IgG)37。C孵育温育1.5小时。PBS洗三次后，入ABC液中37。C温育1小时。然后用0.05MTris缓冲液洗l次。加入含DAB和H202的0.05MTris缓冲液中显色。结果酪氨酸羟化酶(TH)是多巴胺神经元特异性标记物。本研究通过免疫组织化学技术染色观察到MPTP小鼠黑质TH阳性神经元数目是正常动物的40%，符合PD病理学特征。于第15天药物和MPTP处理后6小时，Bu三个剂量组黑质区TH免疫阳性细胞数明显高于单独MPTP处理动物组，见图4。结论Bu对TO模型小鼠的黑质多巴能神经有明显保护作用。实施例513-羟基异补骨脂酚片剂的制备取100g13-羟基异补骨脂酚、560g微晶纤维素、380g无水乳糖、200g硬脂酸镁、30g氧化硅，取上述配方中餘硬脂酸镁外所有成分混合25-30分钟，再筛入硬脂酸镁，继续混匀，然后冲压成片。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。权利要求1.多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂在制备治疗中枢神经退行性疾病的药物中的应用。2.如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂为一类式I所示的补骨脂酚类化合物其中，Rl为氢、C1C8的酰基或卤族；R2、R3、R4、R5分别为氢或卤族。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂为式II所示的13-羟基异补骨脂酚或其衍生物-4.如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的中枢神经退行性疾病选自阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎縮性脊髓侧索硬化症、Lewy体痴呆、多发梗死灶性痴呆、Pick小体病、大脑前叶退行性变、皮层基底节退行性变、多系统萎縮症、渐进性上运动核瘫痪或新变异型Creutzfeldt-Jakob病。5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的中枢神经退行性疾病为阿尔茨海默病或帕金森病。6.如权利要求1至5任一权利要求所述的用途，其特征在于，所述药物的剂型是片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒剂、悬浮液、糖浆、酏剂或注射剂。7.—类多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂的用途，其特征在于，用于制备治疗神经元细胞损伤或死亡相关疾病的药物。8.—种多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂的用途，其特征在于，用于制备治疗多巴胺和/或去甲肾上腺素功能低下性神经疾病的药物。9.如权利要求7或8所述的用途，其特征在于，所述多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂为一类式I所示的补骨脂酹类化合物，其中，Rl为氢、C1C8的酰基或卤族；R2、R3、R4、R5分别为氢或卤族。10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂为式II所示的13-羟基异补骨脂酚或其衍生物。全文摘要本发明公开了一种多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂在制备治疗中枢神经退行性疾病的药物中的应用。本发明还公开了所述多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂的药物组合物。本发明首次提出并证明了多巴胺转运蛋白和去甲肾上腺素转运蛋白双重抑制剂保护多巴胺能神经元，为临床上治疗中枢神经退行性疾病提供了新的选择。文档编号A61K31/05GK101224201SQ20071003660公开日2008年7月23日申请日期2007年1月18日优先权日2007年1月18日发明者张晓华,蒋芝华,刚赵,郭礼和申请人:和泓生物技术(上海)有限公司