Septin1蛋白在制备治疗淋巴细胞白血病药物中的应用的制作方法

专利名称：：Septin1蛋白在制备治疗淋巴细胞白血病药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及细胞生物学领域，提供了一种Septinl蛋白的新用途，即其在制备治疗淋巴细胞白血病药物中的应用。
背景技术：
：白血病是一种造血系统的恶性肿瘤。表现为正常血细胞生成减少，周围血白细胞发生质和量的异常，白细胞及其幼稚细胞(即白血病细胞)在骨髓或其它造血组织中进行性、失控制的异常增生，浸润并损害各种组织，产生不同症状。根据白血病的病程及细胞形态学可将白血病分为(1)急性白血病病情发展迅速，骨髓及周围血中主要是异常原始和幼稚细胞。其自然病程多在6个月以内。急性白血病又分A、急性淋巴细胞白血病(急淋)；B、急性非淋巴细胞白血病(急非淋)。包括急性粒细胞白血病(急粒)、急性单核细胞白血病(急单)。(2)慢性白血病病程较长，骨髓及血中主要是较成熟的异常细胞，其次为幼稚细胞。自然病程多在一年以上。慢性白血病主要包括慢性粒细胞白血病(慢粒)；慢性淋巴细胞白血病(慢淋)；多毛细胞白血病；幼淋巴细胞白血病。(3)特殊类型白血病如低增生性白血病、绿色瘤或粒细胞肉瘤、嗜酸粒细胞白血病、嗜碱粒细胞白血病等。白血病是一种常见的恶性肿瘤，我国已将其列入重点防治的十大恶性肿瘤之一。白血病占恶性肿瘤总发病数的5%左右，发病以儿童和青年居多，在我国各年龄组恶性肿瘤的死亡率中占第六位(男性)和第八位(女性)，在儿童及35岁以下的人群中则占第一位。人类白血病的确切病因至今未明。有关研究表明，病毒可能是主要的因素，此外尚有遗传因素、放射、化学毒物和药物等因素。某些染色体的异常与白血病的发生也有直接关系，染色体的断裂和易位可使癌基因激活或位置发生移动，染色体内基因结构的改变可直接引起细胞发生突变。免疫功能的降低，也有助于白血病的发生。由于目前白血病的治疗大多需要进行骨髓移植，这就阻碍了进一步提高治愈率或者缓解率。首先，找到可以配型的骨髓机率就不高；其次，在骨髓移植手术期间，由于成熟免疫细胞被一率杀灭，患者的免疫力极其低下，需要住在无菌室进行治疗，给患者带来了非常大的痛苦；再次，骨髓移植手术耗费巨大人力、物力，给患者及其家属都带来了很大的负担和压力。Septin是一个GTP酶家族，最早是在AzccAanw^cwcerev/wae酵母中被鉴定的。Septin的功能研究主要有两方面首先是Septin蛋白形成lOmn直径的颈丝环绕胞浆膜内侧的母芽颈一周，作为胞质运动相关蛋白的载物台[Bi，E.，Maddox，P.，Lew,DJ.,"a/.(1998)JCe〃5/o/'142:1301-1312.;Boyne，JR.,Yosuf,HM.,Bieganowski,P"Wa/(2000)JCe〃Sc/113:4533-4543.]。次之，Septin与极性生长的调节有关[Barral,Y.,Me腿ll，V,，Mooseker，MS,,er(2000).Afo/Ce〃.5，84卜851;Takizawa，PA.，Derisi，JL.，Wilhelm，JE.,a/.(2000).Sc/CTce.290，341-344]。然而，尚未有人报道关于Septinl在制备免疫制剂中的应用。
发明内容本发明的目的是提供蛋白S印tinl的新用途，即将其应用于制备治疗淋巴细胞白血病药物。本发明提供了GTP酶蛋白Septinl的一种新用途，即将其应用于制备治疗淋巴细胞白血病药物。本发明的Septinl表达组织谱分析表明，在胰腺、肾、骨胳肌、肝、肺、胎盘、脑、心脏、外周血白细胞、大肠、小肠、卵巢、睾丸、前列腺、胸腺和脾脏等16种组织中，Septinl只在外周血、胸腺和脾脏的淋巴细胞中大量表达，这说明Septinl蛋白主要在淋巴细胞中发挥功能，而不会对其它组织或者细胞起作用。细胞结果显示，Septinl可被磷酸化，而在206位氨基酸残基由丝氨酸突变为A时，Septinl就不能被磷酸化。这说明了206位丝氨酸残基是Septinl被磷酸化的关键。在淋巴系统来源细胞中表达本发明的Septinl、SeptinlS206A突变体(即在Septinl蛋白206位氨基酸残基由丝氨酸突变为A)和SeptinlS206E突变体(即在Septinl蛋白206位氨基酸残基由丝氨酸突变为E),结果显示，以表达正常Septinl的细胞为对照，SeptinlS206A突变体会使细胞不进入G2期，即细胞不能分裂；SeptinlS206E突变体使G2期细胞大大增加，即促进细胞分裂。这说明Septinl可调控细胞分裂，尤其是206位的丝氨酸残基。这也说明，如果将Septinl蛋白206位氨基酸残基由丝氨酸突变为A、抑制Septinl蛋白活性或者使Septinl蛋白失活，就可以使细胞停止分裂增殖。因而，可以将S印tinl蛋白作为药靶，筛选Septinl蛋白的抑制剂和失活剂。一旦筛选到了Septinl蛋白的抑制剂或者失活剂，施用于细胞，就可以使细胞停止分裂。另一方面，一旦筛选到了Septinl蛋白的增强剂，施用于细胞，就可以使细胞加速分裂生长。有丝分裂是细胞周期过程中很重要的一个阶段。大多数的肿瘤其发生原因是有丝分裂所致的基因组的不稳定性，基因组的不稳定又来源于染色体的不稳定，染色体的不稳定是癌症的特征性标志。染色体的分离、中心粒的复制和分离发生异常，会导致每个细胞染色体数目的异常，既非整倍体，增加杂合性缺失的机会，抑癌基因的缺失或原癌基因的数目增加都会使细胞生命代谢和信号传导发生紊乱，增加癌变的机会。肿瘤与正常细胞的区别就是无限制增生，即有丝分裂失去正常调控。综上所述，Septinl可调控细胞分裂，尤其是淋巴细胞的细胞分裂。Septinl的突变体可以特异性的促进淋巴细胞的分裂停滞或者凋亡。曰前，淋巴细胞白血病患者在接受治疗时，往往需要进行骨髓移植。本发明的S印tinl蛋白抑制剂或者Septinl蛋白突变体，可以在骨髓移植期间及前期治疗和准备阶段用于抑制淋巴细胞的增殖。本发明的Septinl蛋白突变体及Septinl蛋白抑制剂可以特异性的促进淋巴细胞的分裂停滞或者凋亡。例如，本发明的SeptinlS206A突变体会使细胞不进入G2期，即细胞不能分裂；将其施用于淋巴细胞白血病患者，就可以特异性的使淋巴细胞停止分裂或者凋亡，而不影响其它免疫细胞，例如中性粒细胞，单核细胞等等，的生长增殖，这将大大增加患者的存活率、改善患者的生存状态、縮短患者的恢复时间，减轻患者及其家属的负担。用本发明的Septinl蛋白筛选到的Septinl蛋白抑制剂也能起到相似的作用。本发明中，所述的淋巴细胞白血病包括急性淋巴细胞白血病或者急性复发的慢性淋巴细胞白血病。本发明中，Septinl可以作为筛选和制备治疗淋巴细胞白血病药物的药耙。将S印tinl作为药靶，可以用于筛选使淋巴细胞停止分裂或者加速分裂生长的物质，作为治疗淋巴细胞白血病或者缓解白血病的药物。本发明的SEPTIN1可以作为靶标，筛选抑制SEPTIN1活力的物质或者方法。筛选方法包括以下步骤A选择候选化合物；B提供检测SEPTIN1表达或者活性的体系；C用SEPTIN1的检测体系选择候选化合物；D确定SEPTIN1表达量或者活性在候选化合物的影响下的改变。所述候选化合物可以是核酸、氨基酸或者小分子化合物。其中，核酸包括DNA、RNA等，可以是siRNA、反义寡核苷酸、核酶或者与SEPTIN1核苷酸序列互补的其它核酸分子;氨基酸包括肽、抗体、互作蛋白等；小分子化合物则包括天然和人工的合成的。在本发明中，术语"SEPTIN1蛋白"指可维持细胞正常分裂的、序列与(NCBI登陆号NP一443070)所示多肽序列至少70%同源性的SEPTIN1多肽及其变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地l-30个，更佳地l-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为IO个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人SEPTIN1蛋白的活性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人SEPTIN1DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人SEPTIN1多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人SEPTIN1多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人SEPTIN1多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人SEPTIN1多肽序列的至少约IO个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约IOO个连续氨基酸。本发明还提供人SEPTIN1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人SEPTIN1多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如e、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。本发明的SEPTIN1蛋白可以采用各种常规的制备方法制备。如基因工程方法或者人工合成方法等。例如，可将SEPTIN1基因表达为蛋白而得。本发明的SEPTIN1基因可以采用各种常规的制备方法制备。本发明的SEPTIN1基因序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明的SEPTIN1核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。在本发明中，术语"SEPTIN1基因"指编码具有维持淋巴细胞正常分裂生长活性的多肽的核苷酸序列，如核苷酸的序列号为(NCBI登陆号NM—052838)的序列及其简并序列。该简并序列是指该核酸序列开放阅读框中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与该核酸序列开放阅读框序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出神经元分化相关基因SEPTIN1的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与NM—052838开放阅读框序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与NM_052838开放阅读框序列的同源性至少70%，较佳地至少80%，更佳地至少90%的核苷酸序列。该术语还包括能编码序列号为NP—443070氨基酸序列的核苷酸序列变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为l-90个，较佳地l-60个，更佳地l-20个，最佳地l-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5，和/或3'端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。获得了SEPTIN1基因序列后，就可以将SEPTIN1基因序列插入适当的表达载体，以获得重组表达质粒。一旦获得了含有SEPTIN1基因序列的重组表达质粒，就可将其转化到相应宿主中进行蛋白表达。作为靶标的除了SEPTIN1蛋白，还可以是SEPTIN1基因、SEPTIN1的mRNA、SEPTIN1的表达产物及其前述三者的特异性片断。所述"特异性片断"是指可以区别本发明的SEPTIN1与其它基因的片断。利用本发明的SEPTIN1，通过各种常规筛选方法，可筛选出与其发生相互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。这些与SEPTIN1发生相互作用或者抑制其活性的物质可以是核酸、氨基酸、化合物等。本发明的SEPTIN1及其抑制剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。以本发明的人SEPTIN1蛋白的抑制剂为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的人SEPTIN1可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的SEPTIN1还可与其他治疗剂一起使用。当本发明的人SEPTIN1蛋白抑制剂被用作药物时，可将治疗有效剂量的该抑制剂施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约l毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明中，所述的治疗淋巴细胞白血病药物是由含有效治疗量的SEPTIN1抑制剂和药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。所述药物组合物可以是针剂或者片剂。其有效治疗量可以为每天1微克/千克至5微克/千克体重。本发明还提供了一种用于筛选治疗淋巴细胞白血病药物的试剂盒，该试剂盒中包括Septinl蛋白或者特异性扩增人Septinl编码核苷酸序列的引物对。上述试剂盒中含有特异性扩增人Septinl的引物对、进行PCR反应所需的其他试剂例如缓冲液等，和使用说明。其中，该特异性引物的序列衍生自(Septinl-F:5'-ATGGACAAGGAGTACGTG-3'Septinl-R:5'-TCAGAGGGCGTCTGACTG-3')的序列，长度为15-35。此外，较佳地，至少一个所用的引物跨越了两个外显子，因为此时对应于SEPTIN1的基因组序列将不产生扩增产物。使用该试剂盒时，可以按照实施例2的方法筛选治疗淋巴细胞白血病药物。如果候选药物对Septinl蛋白活力或者表达水平的有较强的抑制作用，则该候选药物可以作为治疗淋巴细胞白血病药物。本发明还提供了一种用于治疗淋巴细胞白血病的试剂盒。该试剂盒中包括Septinl蛋白的抑制剂或者其编码核苷酸序列的互补序列。该试剂盒还可含有使用说明、分子标记、将Septinl蛋白的抑制剂或者其编码核苷酸序列的互补序列引入细胞或者组织所需的其他试剂，例如缓冲液等。将Septinl蛋白的抑制剂或者其编码核苷酸序列的互补序列引入细胞或者组织，可以将细胞的有丝分裂停滞在S期，即使细胞不分裂，从而抑制肿瘤细胞生长增殖。本发明还提供了一种生物芯片，该生物芯片的载体上含有Septinl蛋白或者其编码核苷酸序列。本发明根据上述方法筛选到了一种Septinl蛋白的抑制剂(双链小RNA)，称为SEPTIN1SR(序列如下正义链5'-GGAAGAGGAGAUCCACAUCtt-3'反义链5、GAUGUGGAUCUCCUCUUCCtt-3')。将其转入了内源表达septinl的人T细胞淋巴瘤细胞株Jurkat中，48小时后western印迹法检测了内源septinl的表达水平，结果如图7所示，在所取细胞量相同的条件下(P-actin蛋白表达水平大致相同)，转入干扰siRNA的细胞中内源表达septinl的水平明显下降(下降水平〉50%)。为了验证SEPTIN1SR的功能，本发明首先检测了千扰septinl后，Jurkat细胞在不同浓度的PHA刺激下的增殖能力，结果如图8所示，与转入对照siRNA(将SEPTIN1SR序列中的l，9，19三位核苷酸进行置换所得片断，序列如下正义链5'-AGAAGAGGGGAUCCACAUGtt-3'反义链5'-CAUGUGGAUCCCCUCUUCUtt-3')的Jurkat细胞相比，干扰了septinl后的Jurkat细胞对PHA刺激的敏感性明显下降，对比lpg/ml的PHA剌激与O.lpg/ml的PHA剌激下Jurkat细胞的增殖水平，对照组升高约200%,而干扰组只升高了约25%。随后本发明又检测了在lpg/ml的PHA刺激下，60小时内干扰septinl的Jurkat细胞的增殖水平。结果如图9所示，对照组在60小时后增殖了161%，而干扰组只增殖了44%。这充分证实了septinl是Jurkat细胞增殖所必需的，同时也证明了用上述方法筛选Septinl蛋白的抑制剂是正确的。本发明的Septinl蛋白及其突变体可以特异性的促进淋巴细胞的分裂停滞或者凋亡。将SeptinlS206A突变体施用于淋巴细胞白血病患者，就可以特异性的使淋巴细胞停止分裂或者凋亡，而不影响其它免疫细胞的生长增殖，这将大大增加患者的存活率、改善患者的生存状态、縮短患者的恢复时间，减轻患者及其家属的负担。用本发明的Septinl蛋白筛选到的Septinl蛋白抑制剂也能起到相似的作用。图1为Septinl的组织表达谱图。其中，1为心脏、2为脑、3为胎盘、4为肺、5为肝、6为骨胳肌、7为肾、8为胰腺、9为脾脏、IO为胸腺、ll为前列腺、12为睾丸、13为卵巢、14为小肠、15为大肠、16为外周血白细胞。图2为septinl蛋白在17种人类细胞系中的表达情况图。图3为septinl蛋白与CK2互作IB-免疫印迹杂交试验的结果。图4为septinl蛋白在Jurkat细胞株的定位结果。图5为septinl蛋白被CK2体内磷酸化的结果。图6为septinl蛋白被CK2体外磷酸化的结果。图7为septinl蛋白在Jurkat细胞株内被SEPTIN1SR抑制的结果。图8为SEPTIN1SR抑制Jurkat细胞株分裂受PHA浓度影响的结果。图9为在相同PHA浓度条件下SEPTIN1SR抑制Jurkat细胞株分裂的结果。图10为空载体转染Jurkat细胞株的细胞周期分析结果。横坐标为基因组数。为图11-13的空白对照，由流式细胞仪分析而得。图11为野生型septinl蛋白转染Jurkat细胞株的细胞周期分析结果。横坐标为基因组数。为图12-13的对照，由流式细胞仪分析而得。图12为septinl蛋白S206A突变体转染Jurkat细胞株的细胞周期分析结果。横坐标为基因组数，由流式细胞仪分析而得。可见，与图10和11相比，G2期细胞几乎没有。图13为septinl蛋白S206A突变体转染Jurkat细胞株的细胞周期分析结果。横坐标为基因组数，由流式细胞仪分析而得。可见，与图10和11相比，G2期细胞明显增加。具体实施方式下列实施例中，未注明具体条件的实验方案，通常按照常规条件，如Sambrook等人的《分子克隆》实验室手册(NewYork,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或者按照生产商建议的条件进行操作。实施例1Septinl的组织中的表达情况1.1Northern探针制备用ClontechMultipleTissuenorthen膜检测成人组织中septinl基因的分布情况，所用探针为克隆到的septinl全长开放阅读框(即NCBI登陆号NM_052838所示核苷酸序列中第188到1291位)。1)用septinl基因的特异的引物从构建好并已经测序的质粒中扩增得到PCR产物。PCR产物用QIAquickPCR纯化试剂盒纯化后，用GeneQuantII型紫外分光光度计测定纯化后DNA的浓度。2)DNA模板经100'C热变性2min后，用随机引物标记试剂盒以随机引物标记法掺入Y-32PdCTP。标记反应结束后，加入EDTA至终浓度20mmol/L中止反应，100°C热变性5min，置于冰上。3)将探针用MicroSpinG-25纯化柱纯化。纯化前后分别取样lpl稀释IOO倍，取3pl稀释液点样在WhatmanDE81滤纸上,用Monitor卯0型放射性检测仪测定其放射强度(cps)。将纯化后的放射性强度除以纯化前的放射性强度记为掺入率，掺入率大于30%则认为探针制备合格。1.2Northen杂交1)将杂交膜用2XSSC液润湿后将膜带RNA的一面朝上放入杂交管中，每10cm2膜面积加入lml甲酰胺预杂交液，预杂交液含50%甲酰胺，5XSSPE，10XDenhardt试剂，2Q/SDS,1000mg/L小牛胸腺DNA。42'C预杂交2-4小时。2)预杂交结束后，将纯化后的标记探针加入剩余的预杂交液中。42'C杂交48小时。3)杂交反应结束后，将杂交液弃去，加入杂交洗脱液l(2XSSC,0.05%SDS)室温洗涤3次，每次30min，其间不停晃动膜。然后加入杂交洗脱液2(0.1XSSC，0.1。/。SDS)，5(TC洗涤2次，每次30min。用Monitor卯O型放射性检测仪测定整张膜上的放射强度。如果背景的放射强度过高，可以适当的提高洗膜温度，再次洗涤。4)将洗涤完毕的膜放入保鲜袋中封口，进行放射自显影.结果显示，在胰腺、肾、骨胳肌、肝、肺、胎盘、脑、心脏、外周血白细胞、大肠、小肠、卵巢、睾丸、前列腺、胸腺和脾脏等16种组织中，Septinl的mRNA仅在外周血、胸腺、脾脏等组织中有表达，而且在胸腺中表达量最高。详见图l。实施例2western-blot分析septinl蛋白在17种人类细胞系中的表达情况1、17种人类细胞系的培养所选17种细胞均来自中国科学院细胞库，其组织来源及培养条件如下<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2.Western印迹检测septinl蛋白的表达水平(1)分别收获17种细胞各约106个，加入500nl细胞裂解液，振荡混匀后4。C孵育30min。12000rpm/min离心15分钟，取上清。(2)分别取每种上清10^1进行SDS-PAGE电泳。(3)用BIORAD转移系统，将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转至硝酸纤维素薄膜上，冰浴中转移2hr，电压为100V。置于丽春红染色液中510min,水洗去染料，标记蛋白标准分子量条带。(4)封闭将膜放置于30ml封闭缓冲液中，室温下置于摇床震荡lhr。(5)—抗反应按推荐的稀释比加入septinl特异性抗体(购于SANTACRUZ公司)，将膜浸于稀释好的一抗中，室温下摇床孵育2hr;用洗涤缓冲液洗膜4次，每次10min;(6)二抗反应按1:1,0000的稀释比加入HRP耦联的抗羊抗体，将膜浸于稀释好的二抗中，室温下摇床孵育lhr;用洗涤缓冲液洗膜4次，每次10min。(7)ECL发光反应把膜用三倍稀释或不稀释的ECL发光试剂显影曝光。结果显示，Septinl主要在T细胞(Jurkat，ATCC;6T-CEM，购自中国科学院生命科学学院)和B细胞(EB-3，ATCC)中表达。实施例3Septinl在Jurkat细胞中的定位本发明中，首先将全长septinl的cDNA构建入Ds-Red-Cl荧光表达载体。将所得的RFP一septinl重组子转染入Jurkat细胞中，培养48小时，经过固定处理后，激光共聚焦显微镜下观察。具体步骤如下(1)收取悬浮培养的Jurkat细胞，充分打散后滴加在涂有多聚赖氨酸的载波片上，静置5min后置于4X的多聚甲醛中室温固定10min(分钟)。(2)PBS洗三遍，于0.2%TritonX-100中室温打孔15min。(3)PBS洗三遍，于含有10%马血清、1%BSA的TBS中室温封闭1hr(小时)。(4)TTBS洗一遍，在盖玻片上滴加入用抗体稀释液按比例稀释的一抗(抗septinl抗体，1:20)，37°C孵育2hr。(5)TTBS洗三遍，在盖玻片上滴加入用抗体稀释液按比例稀释的二抗(Rhodamine-抗羊，1:100)，37。C孵育lhr。(6)TTBS洗三遍，于lng/plDAPI溶液中37°C染色20min。(7)TTBS洗三遍，封片，上荧光显微镜观察。结果显示，发现septinl呈细胞质分布(如图4)，且其分布具有一定的极性，另外，其分布随细胞周期的变化有所不同，在细胞分裂的全过程中，septinl极有可能在纺锤体两极的中心粒周围分布，在中期以后，septinl还会在两细胞分裂沟处聚集。实施例4pull-down检测septinl蛋白与CK2激酶的互作1、将瞬时转染有PCMV-Myc-CK2a的细胞裂解液(细胞数5X106)与50|al50%的谷胱甘肽琼脂糖珠和20pg的GST在摇床上4。C孵育2h.2、4°C,2000rpm离心2分钟。3、将上清转移到新的离心管中，分为两等份，各加入50pl谷胱甘肽琼脂糖珠，其中一管加入10iag的GST蛋白，另一管加入10ng的GST-septinl融合蛋白，4°C摇床孵育2小时。4、2000rpm离心2分钟，上清取到新的离心管中，4°C保存，以备后用。5、用lml冰浴的裂解缓冲液(20mMTris-clpH8.0，500mMNaCl,lmMEDTA，1%NP-40)洗珠子，2000rpm离心1分钟，弃上清，再重复洗3次。6、用20^120mM的还原谷胱甘肽(在50mM的Tris-ClpH8.0的缓冲液中)从珠子上洗脱GST融合蛋白和与它结合的蛋白。2000rpm离心2分钟。7、洗脱的蛋白加入等体积的2XSDS-PAGE上样缓冲液，煮沸4分钟。8、WesternBlotting检测。页结果显示，如图3所示，Septinl与CK2能相互作用。实施例5CK2激酶在体外、体内磷酸化septinl1、体外磷酸化(1)取His-CK2a激酶0.2ng，底物蛋白5ug(GST-septinl，GST-septinl-206A)，加入lXKinasebuffer(cellsignal公司)，反应体系中另含有200(iMr-32p-ATP5pCi一)。(2)在30'C让反应物作用30分钟，然后加5pl5XSDS上样缓冲液终止反应。(3)取2(^1反应产物经12%SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳分离，胶染色、脱色。(4)真空干燥仪上干胶60。C2小时，冷却后，压上X-光片，-80匸曝光。(5)显影2、体内磷酸化(1)将PCMV-HA-CK2a分别与PCMV-myc-septin1、PCMV-myc-septinl(206A)共转染人H1299细胞系(2)37°C培养48hr后收获细胞并裂解。(3)向每500(xl细胞裂解液中加入3ialanti-myc—抗(sigma),25^ilProteinGPlus/ProteinAAgarose(sigma公司)，置于4'C摇床缓慢震荡1小时。(4)2000rpm离心l分钟后用1XPBS洗涤Agarose三次(5)向Agarose中加入2XSDS-PAGE上样缓冲液，煮沸4分钟。取上清20(il进行SDS-PAGE电泳(6)用磷酸化蛋白染色试剂盒(invitrogen)染色结果显示，在体外和体内，Septinl均可被CK2激酶磷酸化。体外磷酸化详见图5，体内磷酸化详见图6。实施例6检测septinl的磷酸化突变体对Jurkat细胞生长及周期的影响1、分别将PCMV-myc,PCMV-myc-septinl,PCMV-myc-septinl(S206A)，PCMV-myc-septinl(S206E)质粒转染Jurkat细胞2、37°C培养60hr后流式细胞仪检测个细胞的周期结果显示，如图10-13所示，septinl(S-A)突变体(即将s印tinl蛋白第206位丝氨酸突变为丙氨酸(alanine，Ala,A))导致细胞凋亡增加，G2/M期细胞明显减少，而septinl(S-E，即将septinl蛋白第206位丝氨酸突变为谷氨酸(glutamicacid，Glu，E))突变体则不能诱导细胞凋亡，但引起细胞G2/M期增高。这提示，septinl可以维持细胞分裂的正常进行，septinl206位丝氨酸突变时，细胞不能正常分裂。实施例7细胞中RNA干扰septinl的表达1、将合成的siRNA溶于去RNAase的ddH20中，制成50mM的工作母液2、取5nl脂质体(GIBCO公司脂质体Lipfectmine2000)与250plOPTI—MEM培养基混合均匀，静置5min3、取25plsiRNA工作母液与250nlOPTI—MEM培养基混合均匀4、将2与3溶液混合均匀，室温静置20min5、将lX10e的悬浮细胞离心收集并用lXPBS洗涤一次，用400plOPTI—MEM培养基重悬后与4所得溶液混合，加入6孔板一孔6、37°C培养5hr后更换完全培养基7、继续培养48-60hr后收获细胞，取出一半细胞进行western-blot检测septinl的表达情况，同时另一半细胞用于流式细胞检测。结果显示，在lpg/ml的PHA刺激下，60小时内干扰septinl的Jurkat细胞的增殖水平。结果如图9所示，对照组在60小时后增殖了161%，而干扰组只增殖了44%。这提示，septinl是淋巴系统来源的细胞增殖所必需的。权利要求1.GTP酶蛋白Septin1在制备治疗淋巴细胞白血病药物中的应用。2.如权利要求2所述的应用，其特征是，所述的淋巴细胞白血病是急性淋巴细胞白血病或者急性复发的慢性淋巴细胞白血病。3.如权利要求l所述的应用，其特征是，S印tinl是筛选和制备治疗淋巴细胞白血病药物的药靶。4.如权利要求l所述的应用方法，其特征是，将候选化合物的计算机模拟三维结构与SEPTIN1蛋白的计算机模拟三维结构结合，候选化合物的计算机模拟三维结构与RTN4B蛋白第206位的丝氨酸残基结合的，该候选化合物即为治疗淋巴细胞白血病药物的活性成分。5.如权利要求2所述的应用方法，其特征是，将候选化合物加入含有S印tinl蛋白的溶液中，然后，检测S印tinl蛋白活性，S印tinl蛋白活性下降的候选化合物为治疗淋巴细胞白血病药物的活性成分。6.如权利要求2所述的应用方法，其特征是，将如权利要求4或者5得到的候选化合物转入癌细胞中，导致癌细胞数量不增加的候选化合物为治疗淋巴细胞白血病药物的活性成分。7.—种用于筛选和制备治疗淋巴细胞白血病药物的试剂盒，其特征是，该试剂盒中包含S印tinl蛋白。8.—种筛选和制备治疗淋巴细胞白血病药物生物芯片，其特征是，该生物芯片的载体上含有S印tinl蛋白。全文摘要本发明涉及细胞生物学领域，提供了一种Septin1蛋白的新用途，即其在制备治疗淋巴细胞白血病药物中的应用。本发明的Septin1蛋白及其突变体可以特异性的使淋巴细胞的分裂停滞或者凋亡。将Septin1S206A突变体施用于淋巴细胞白血病患者，就可以特异性的使淋巴细胞停止分裂或者凋亡，而不影响其它免疫细胞的生长增殖，这将大大增加患者的存活率、改善患者的生存状态、缩短患者的恢复时间，减轻患者及其家属的负担。用本发明的Septin1蛋白筛选到的Septin1蛋白抑制剂也能起到相似的作用。文档编号A61K38/43GK101239183SQ200710037189公开日2008年8月13日申请日期2007年2月6日优先权日2007年2月6日发明者丁向明,龙余,余文博,唐丽莎申请人:复旦大学