专利名称：阿胶降解物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种阿胶降解物，具体地说，涉及一种具有促进红、白细胞数增长及粒系和红系造血干、祖细胞扩增活性的阿胶降解物。
背景技术：
阿胶，亦称“驴皮胶”。系驴皮去毛后用清水熬制而成的黑色胶质块。其含动物胶、蛋白质、多种氨基酸及铁、钙等。阿胶不仅具有升高红细胞和血红蛋白的作用，可促进造血功能；而且能升高白细胞、血小板和升高血氧含量。因此在临床上具有重要的药用价值。
然而阿胶中具有促进红、白细胞数增长及粒系和红系造血干、祖细胞扩增的活性物质为何物？至今仍是个迷。因此对这些活性物质的筛选及界定成为本领域的研究热点。
发明内容
本发明采用一种模拟人体消化方式的阿胶降解法对阿胶进行降解，并对所得降解物进行活性筛选，获得了具有促进红、白细胞数增长及粒系和红系造血干、祖细胞扩增活性的阿胶降解物。
本发明所说的具有促进红、白细胞数增长及粒系和红系造血干、祖细胞扩增活性的阿胶降解物，其特征在于，所说的阿胶降解物由阿胶依次经胃蛋白酶(EC 3.4.23.1，购自Sigma公司)和胰蛋白酶(EC 3.4.21.4，购自Sigma公司)于37℃进行降解，然后再经超滤分离后获得，所说的阿胶降解物的平均分子量小于或等于8000 Da。具体降解过程包括如下步骤(1)首先将固体阿胶溶于50℃去离子水中得阿胶水溶液，冷却至37℃，调节阿胶水溶液的pH值为2.0左右(建议用盐酸进行pH值的调节)，按胃蛋白酶与阿胶水溶液的重量比为1∶250的比例加入胃蛋白酶(EC 3.4.23.1，购自Sigma公司)，在37℃条件下，保持120分钟左右(在胃蛋白酶作用下进行降解)；然后将所得混合液的pH值调节至6.8左右，再按胰蛋白酶与阿胶水溶液的重量比为1∶250的比例加入胰蛋白酶(EC 3.4.21.4，购自Sigma公司)，同样在在37℃条件下，保持120分钟左右(在胰蛋白酶作用下进行降解)后获得经胃蛋白酶和胰蛋白酶降解的阿胶降解液。
(2)将由步骤(1)所得的阿胶降解液经升温灭酶(胃蛋白酶和胰蛋白酶)活后冷却(建议的灭酶活的温度为100℃)，离心除去上层油脂和杂质，加入适量去离子水后采用超滤膜进行超滤和真空冷冻干燥后获得目标物。
本发明所用阿胶由山东东阿阿胶有限公司提供；所用超滤装置购自Millipore公司，配有分子量截留范围为3000Da，5000Da，8000Da，10000Da和30000Da的超滤膜。
通过动物实验对所获得的阿胶降解物进行活性物筛选，发现平均分子量小于或等于8000Da(更优选小于或等于5000 Da，)的阿胶降解物(橙白色粉末)具有明显促进红、白细胞数增长及粒系和红系造血干、祖细胞扩增的作用；反之，则不明显或不具备。
本发明通过阿胶仿生学降解方法，即模拟人体的胃和小肠降解过程，用胃蛋白酶和胰蛋白酶对阿胶进行两阶段降解。对降解后的阿胶液进行了超滤分离及活性物筛选，获得了具有促进红、白细胞数增长及粒系和红系造血干、祖细胞扩增活性的阿胶降解物，为阿胶的进一步研究奠定了坚实基础。
图1a本发明所说的阿胶降解物对贫血小鼠外周白细胞数的影响示意1b本发明所说的阿胶降解物对贫血小鼠外周红细胞数的影响示意图其中Control(正常组)表示正常小鼠，未经任何处理；Model(模型组)表示小鼠腹腔注射250mg/kg环磷酰胺，造成小鼠贫血，喂生理盐水；Group A表示小鼠腹腔注射250mg/kg环磷酰胺，造成小鼠贫血，喂2g/kg组份A(由实施例1制得)；Group B表示小鼠腹腔注射250mg/kg环磷酰胺，造成小鼠贫血，喂2g/kg组份B(由实施例1制得)；Group C表示小鼠腹腔注射250mg/kg环磷酰胺，造成小鼠贫血，喂2g/kg组份C(由实施例1制得)。*p＜0.05与正常组比较 #p＜0.05与模型组比较。
图2阿胶活性组份对小鼠骨髓粒系造血干/祖细胞(CFU-GM)和红系造血干/祖细胞(BFU-E)的影响示意图其中Normal(正常组)表示正常小鼠骨髓细胞，未经任何处理；Model(模型组)表示小鼠腹腔注射250mg/kg环磷酰胺，造成小鼠贫血后骨髓细胞；Group A表示小鼠腹腔注射250mg/kg环磷酰胺造成小鼠贫血后骨髓细胞，加入组分A(由实施例1制得)为500μg/ml；Group B表示小鼠腹腔注射250mg/kg环磷酰胺造成小鼠贫血后骨髓细胞，加入组分B(由实施例1制得)为500μg/ml。**p＜0.01，与正常组比较 #p＜0.05，##p＜0.01，与模型组比较。
具体实施例方式
下面通过实施对本发明作进一步说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围
实施例1固体阿胶125克粉碎后加入50℃去离子水溶解在1000ml体积的烧瓶中，冷却到37℃后用盐酸调pH为2.0，总体为200毫升，按250/1(w/w)的比例加入胃蛋白酶0.5克，37℃，120转/分转速条件下降解120分钟。用碳酸氢胺调pH为6.8，总体积保持在500ml，按250/1(w/w)的比例加入胰蛋白酶0.5克，37℃，120转/分转速条件下降解120分钟。降解后的阿胶液升温到100℃灭酶活后自然冷却。8000转/分的转速下进行离心去除杂质和上层油脂。用去离子水调离心后的阿胶液到500ml，用截留分子量为8000 Da的超滤膜进行超滤，获得体积为350ml的超滤阿胶液，再用截留分子量为5000 Da的超滤膜进行超滤获得超滤液250ml。冻干后A和B的回收率分别为24％和29％，C组份为未能透过8000 Da超滤膜组份，回收率为46％。
实施例2本发明所说的阿胶降解物的体内补血活性验证昆明种小鼠随机分为5组。对照组和模型组每天灌生理盐水，实验组每天分别灌不同组分的阿胶分离产物(2g/kg)。第一天一次性腹腔注射环磷酰胺250mg/kg。第8天处死小鼠检测外周血象，由图1a和图1b的可以看出，组分A和B能够明显的提高贫血小鼠外周血白细胞和红细胞的数量，从而显示一定的升白、升红效果，从而说明此种阿胶仿生学降解和小分子提取部位具有补血活性，而组份C不具有升红、升白作用。即降解后阿胶的有效补血组份主要集中于分子量小于8000 Da的组份。
实施例3本发明所说的阿胶降解物的体外补血活性验证小鼠颈椎脱臼处死，无菌取双侧股骨，用6号针头吸无血清RPMI-1640培养基冲洗骨髓腔，混合骨髓细胞悬液过4号针头形成单细胞悬液，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养基调细胞数至1×105/ml，将含有5×104/ml-1细胞数的甲基纤维素半固体培养基以每孔0.5ml接种于24孔板中，试验组培养基内加入阿胶消化分离后组份A、B和C，终浓为500μg/ml，每样设3个复孔在37℃，5％CO2潮湿大气中培养4～7天。该半固体培养基为IMDM培养基中含有1％甲基纤维素，20％胎牛血清，1％BSA，20ng/ml IL-3，20ng/ml IL-6，20ng/ml GM-CSF，2U/ml EPO。
从图2可以看出，组分A和B能够在体外粒系和红系造血干/祖细胞培养中发挥明显的刺激增殖作用。说明运用本方法制备的阿胶组分为阿胶中的有效补血活性部位。
权利要求
1.一种具有促进红、白细胞数增长及粒系和红系造血干、祖细胞扩增活性的阿胶降解物，其特征在于，所说阿胶降解物由阿胶依次经胃蛋白酶(EC 3.4.23.1)和胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)于37℃进行降解，然后再经超滤分离后获得，所说的阿胶降解物的平均分子量小于或等于8000Da。
2.如权利要求1所说的阿胶降解物，其特征在于，所说阿胶降解物的平均分子量小于或等于5000Da。
3.如权利要求1或2所说的阿胶降解物，其特征在于，所说阿胶降解物由包括下列步骤的降解法降解而得(1)首先将固体阿胶溶于50℃去离子水中得阿胶水溶液，冷却至37℃，调节阿胶水溶液的pH值为2.0，按胃蛋白酶与阿胶水溶液的重量比为1∶250的比例加入胃蛋白酶(EC 3.4.23.1)，在37℃条件下，保持120分钟；然后将所得混合液的pH值调节至6.8，再按胰蛋白酶与阿胶水溶液的重量比为1∶250的比例加入胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)，同样在在37℃条件下，保持120分钟后获得经胃蛋白酶和胰蛋白酶降解的阿胶降解液。(2)将由步骤(1)所得的阿胶降解液经升温灭酶活后冷却，离心除去上层油脂和杂质，加入适量去离子水后采用超滤膜进行超滤和真空冷冻干燥后获得目标物。
4.如权利要求3所说的阿胶降解物，其特征在于，其中灭酶活的温度为100℃。
全文摘要
本发明涉及一种阿胶降解物。所说阿胶降解物是通过阿胶仿生学降解方法，即模拟人体的胃和小肠降解过程，用胃蛋白酶和胰蛋白酶对阿胶进行两阶段降解，对降解后的阿胶液进行了超滤分离后获得。本发明为对阿胶活性组分的进一步研究奠定了坚实基础。
文档编号A61P7/06GK101019890SQ200710038089
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月15日 优先权日2007年3月15日
发明者刘建文, 吴宏忠, 张元兴, 秦玉峰, 杨帆, 崔书亚 申请人:山东东阿阿胶股份有限公司, 华东理工大学