专利名称：一种蟾酥提取物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种蟾酥提取物及其制备方法，该蟾酥提取物的主要成分为 脂蟾毒配基、华蟾毒精和蟾毒灵这三种蟾毒配基混合物。
背景技术：
药用蟾蜍为两栖纲蟾蜍科动物中华大蟾蜍(Bufo bufogargarizans Cantor) 或黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus Schneider)。蟾酥为中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍 的耳后腺及皮肤腺分泌的白色浆液，经加工干燥制成。古今验方广泛应用蟾 蜍、蟾酥拔毒消肿、定痛杀虫、强心利尿。经现代科学研究，发现蟾酥中的 脂蟾毒配基、华蟾毒精、蟾毒灵三种脂溶性成分的混合物不但具有明显的抗 肿瘤作用，而且还能将肿瘤细胞转化为正常细胞(诱导肿瘤细胞分化)、诱 导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞新生血管形成、降低肿瘤转移等作用。中国专利申请"蟾蜍或蟾酥中三种抗癌化合物的制剂及其制备方法"(申 请号200610045893.7，公开号为1810827A)使用乙醇、丙酮等有机溶剂提 取，提取物经硅胶、氧化铝等色谱柱分离，并以不同比例石油醚、乙酸乙酯、 丙酮、乙醇、甲醇等溶剂梯度洗脱的方法分别得到脂蟾毒配基、华蟾毒精、 蟾毒灵三种脂溶性成分，合并取得此三种蟾毒配基混合物，其总含量高于80 %。但其中许多条件如溶剂的浓度、样品上样方法及洗脱剂的具体比例等都 尚未公开，且梯度洗脱操作复杂、费时。此外，从安全性和疗效的角度考虑, 三种脂溶性成分的总含量有待进一步提高。发明内容本发明要解决的技术问题即是提供一种脂蟾毒配基、华蟾毒精、蟾毒灵三种蟾毒配基混合物含量超过90%的蟾酥提取物及其制备方法。本发明人经过试验惊奇地发现，采用无水乙醇为提取溶剂；并且采用一 定比例的石油醚和丙酮等度洗脱，不仅提取效率高，简化了步骤，还进一步 提高了上述三种蟾毒配基混合物含量，可以达到卯％水平以上。 本发明提供的一种蟾酥提取物的制备方法，其包括下列步骤-① 将蟾酥药材用无水乙醇回流提取；② 将上述提取液浓縮后经硅胶柱分离，用体积比为3~10:1的石油醚和 丙酮等度洗脱，收集洗脱液，过滤，蒸干即得含有三种蟾毒配基混合物的蟾 酥提取物。较佳地，为增加提取效率及节约提取溶剂，步骤①中所述的蟾酥药材通 常先研磨粉碎成粉(过60目筛)；而综合考虑提取效果及所需的成本、时间， 每次提取时药材与无水乙醇的比例优选lg:5 20ml，更优选lg:10 12.5ml; 每次提取时间优选20-60分钟， 一般在40分钟左右；共提取1 3次。较佳地，为增大上样量，易于工业化生产，步骤②中将浓縮的提取液加 入硅胶拌样，蒸干得拌样硅胶，所得拌样硅胶干法上样。其中，加入硅胶的 量以能完全吸附蟾酥提取物浓縮液为宜，优选为最初称取的蟾酥药材重量的 0.5 3倍左右，更优选0.6 1倍。更佳地，为达到更好的纯化效果，在所得拌样硅胶干法上样前先将硅胶 湿法装柱，预先用所述洗脱剂石油醚和丙酮浸泡洗脱。本发明步骤②中洗脱剂石油醚和丙酮的更佳体积比为4~6:1。本发明优选的硅胶为100-160目的粗孔硅胶。采用本发明上述制备方法制得的蟾酥提取物中脂蟾毒配基、华蟾毒精、 蟾毒灵这三种蟾毒配基混合物的重量百分比含量均在90%以上，通常在 91~99%范围。本发明与现有技术相比，其优点在于采用绿色安全的乙醇溶剂提取，采 用上样量较大的干法上样，使用等度洗脱，简化了纯化方法，进一步提高了三种脂溶性成分的总含量，达到高于卯％水平。并且，本发明提取纯化方法 及所用设备简单，成本较低，操作简便，耗时较短，易于工业化生产，三种 脂溶性成分可以得到较好的纯化，纯化效率高，纯化纯度大幅提高，减小了 药物的毒副作用，可以提高药物的安全有效性。
图l为本发明蟾酥提取物经纯化后的HPLC色谱图。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。 实施例1取蟾酥药材l克，加无水乙醇10ml，加热回流40min，上述条件下提2 次。将提取液趁热过滤，旋蒸浓縮后加入0.9克硅胶拌样，得拌样硅胶。取 20克硅胶以石油醚丙酮(体积比5: 1)浸泡后湿法装柱，加入拌样硅胶， 用石油醚丙酮(体积比5: 1)洗脱剂进行等度洗脱。通过HPLC鉴别(如 图1所示，保留时间为7.184min的为蟾毒灵，8.886min的为华蟾毒精， 9.549min的为脂蟾毒配基)，收集含有这三种脂溶性成分的洗脱液，蒸干， 即得本发明蟾酥提取物，其中三种蟾毒配基混合物占整个提取物的重量百分 比为98.01%。实施例2取蟾酥药材2克，加无水乙醇25ml，加热回流40min，上述条件下提2 次。将提取液趁热过滤，旋蒸浓縮后加入1.8克硅胶拌样，得拌样硅胶。取 22克硅胶以石油醚丙酮(体积比5: 1)浸泡后湿法装柱，加入拌样硅胶， 用石油醚丙酮(体积比5: 1)洗脱剂进行等度洗脱。通过HPLC鉴别， 收集含有脂蟾毒配基、华蟾毒精、蟾毒灵这三种脂溶性成分的洗脱液，蒸干，即得本发明蟾酥提取物，其中三种蟾毒配基混合物含量为97.94°%。实施例3取蟾酥药材3克，加无水乙醇35ml，加热回流40min，上述条件下提2 次。将提取液趁热过滤，旋蒸浓縮后加入3克硅胶拌样，得拌样硅胶。取22 克硅胶以石油醚丙酮(体积比5: 1)浸泡后湿法装柱，加入拌样硅胶，用 石油醚丙酮(体积比5: 1)洗脱剂进行等度洗脱。通过HPLC鉴别，收 集含有脂蟾毒配基、华蟾毒精、蟾毒灵这三种脂溶性成分的洗脱液，蒸干， 即得本发明蟾酥提取物，其中三种蟾毒配基混合物含量为99.08%。实施例4取蟾酥药材2克，加无水乙醇15ml，加热回流40min，上述条件下提3 次。将提取液趁热过滤，旋蒸浓縮后加入1.8克硅胶拌样，得拌样硅胶。取 22克硅胶以石油醚丙酮(体积比6: 1)浸泡后湿法装柱，加入拌样硅胶， 用石油醚丙酮(体积比6: 1)洗脱剂进行等度洗脱。通过HPLC鉴别，收集含有脂蟾毒配基、华蟾毒精、蟾毒灵这三种脂溶性成分的洗脱液，蒸干，即得本发明蟾酥提取物，其中三种蟾毒配基混合物含量为96.37%。 实施例5取蟾酥药材2克，加无水乙醇10ml，加热回流20min，上述条件下提3 次。将提取液趁热过滤，旋蒸浓縮后加入1克硅胶拌样，得拌样硅胶。取22 克硅胶以石油醚丙酮(体积比4: 1)浸泡后湿法装柱，加入拌样硅胶，用 石油醚丙酮(体积比4: 1)洗脱剂进行等度洗脱。通过HPLC鉴别，收 集含有脂蟾毒配基、华蟾毒精、蟾毒灵这三种脂溶性成分的洗脱液，蒸干， 即得本发明蟾酥提取物，其中三种蟾毒配基混合物含量为91.06°%。实施例6取蟾酥药材2克，加无水乙醇40ml，加热回流60min，上述条件下提1 次。将提取液趁热过滤，旋蒸浓縮后加入2克硅胶拌样，得拌样硅胶。取22 克硅胶以石油醚丙酮(体积比3: 1)浸泡后湿法装柱，加入拌样硅胶，用 石油醚丙酮(体积比3: 1)洗脱剂进行等度洗脱。通过HPLC鉴别，收集含有脂蟾毒配基、华蟾毒精、蟾毒灵这三种脂溶性成分的洗脱液，蒸干，即得本发明蟾酥提取物，其中三种蟾毒配基混合物含量为90.33%。 实施例7取蟾酥药材l克，加无水乙醇15ml，加热回流40min，上述条件下提2 次。将提取液趁热过滤，旋蒸浓縮后加入3克硅胶拌样，得拌样硅胶。取21 克硅胶以石油醚丙酮(体积比10: 1)浸泡后湿法装柱，加入拌样硅胶， 用石油醚丙酮(体积比10: 1)洗脱剂进行等度洗脱。通过HPLC鉴别，收集含有脂蟾毒配基、华蟾毒精、蟾毒灵这三种脂溶性成分的洗脱液，蒸干，即得本发明蟾酥提取物，其中三种蟾毒配基混合物含量为95.38%。上述实施例中所述的蟾酥药材购自江苏宝应兴平蟾蜍养殖基地，粉碎研 磨至60目左右；硅胶为青岛美高集团产品，粗孔，100-160目，柱直径2 厘米，柱高20厘米。
权利要求
1、一种蟾酥提取物，其含有重量百分比≥90％的脂蟾毒配基、华蟾毒精和蟾毒灵三种蟾毒配基混合物。
2、 如权利要求1所述的蟾酥提取物，其特征在于该三种蟾毒配基混合 物在蟾酥提取物中的含量为91~99%。
3、 如权利要求1所述的蟾酥提取物的制备方法，其包括下列步骤① 将蟾酥药材用无水乙醇回流提取；② 将上述提取液浓縮浓縮后经硅胶柱分离，用体积比为3~10:1的石油 醚和丙酮等度洗脱，收集洗脱液，过滤，蒸干即得含有三种蟾毒配基混合物 的蟾酥提取物。
4、 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤①中所述的蟾酥药 材为蟾酥粉，每次提取时药材与无水乙醇的比例为lg:5 20ml，提取时间为 20-60分钟，共提取1~3次。
5、 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤②中将浓縮的提取 液加入硅胶拌样，蒸干得拌样硅胶，所得拌样硅胶干法上样。
6、 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的加入硅胶的重量 为蟾酥药材重量的0.5 3倍。
7、 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的加入硅胶的重量 为蟾酥药材重量的0.6~1倍。
8、 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于在所得拌样硅胶干法上 样前先将硅胶湿法装柱，预先用所述洗脱剂石油醚和丙酮浸泡洗脱。
9、 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤②中洗脱剂石油醚 和丙酮的体积比为4 6:1。
10、 如权利要求3 9任一项所述的制备方法，其特征在于所述的硅胶为 100-160目的粗孔硅胶。
全文摘要
本发明公开了一种蟾酥提取物及其制备方法，该制备方法包括①将蟾酥药材用无水乙醇回流提取；②将上述提取液浓缩，经硅胶柱分离，用体积比为3～10∶1的石油醚和丙酮等度洗脱，收集洗脱液，过滤，蒸干即得含有三种蟾毒配基混合物的蟾酥提取物。本发明的制备方法简便、易于操作并适于工业化生产，制得的本发明蟾酥提取物中三种蟾毒配基混合物的含量均≥90％。
文档编号A61P35/00GK101322723SQ200710041880
公开日2008年12月17日 申请日期2007年6月12日 优先权日2007年6月12日
发明者丹 刘, 刘小叶, 奉建芳, 林 祝, 陈满仓 申请人:上海医药工业研究院