专利名称：：组织工程化移植物的处理方法
技术领域：
：本发明涉及医学工程领域，尤其涉及组织工程化移植物的保存方法。技术背景组织工程移植物的产业化需要有大批量产品的生产和临床使用，更重要的是，在组织缺损病人急需组织移植时，希望立即提供可移植的工程化产品。为了縮短工程化移植物构建过程所需的时间，尽快提供可供移植的缺损组织或部位的替代材料，必需解决组织工程化移植物的保存问题。根据保存温度不同，保存方式可以分为常温保存和低温保存。对于有活性的组织工程产品，在其保存期间应尽量降低甚至关闭所有的生化反应，而温度是控制生化反应的重要因素，降低储存温度可以极大地抑制组织内的生化反应。目前使用最多的低温保存温度是4t:和深低温(-196°C)。4'C条件下，细胞内外仅存有少量生化反应，研究表明，4。C条件下，细胞的活性呈逐渐下降的趋势，而且伴随着细胞水肿、核固縮、空泡形成等形态学的改变。可见，4。C保存对细胞的活性还是有损伤，故临床主要应用于短时间内(24小时内)保存组织和器官。在-196'C条件下，细胞内外的反应都会终止，但是由于低温冻存操作相对复杂，对仪器以及冻存方案要求较高，而且在降温过程中细胞内形成的冰晶会在降温和复温过程中对细胞造成冰晶损伤和溶质损伤，使其在组织和器官保存中的应用受到很大限制，其在组织工程领域的使用也只限于种子细胞冻存的研究阶段，目前尚未组织工程复合物低温冻存的研究和报道。在37t:下，细胞内大多数酶的活性都处于最高水平，各种酶促反应、氧化反应也最为活跃，细胞活性、功能都维持在相对较高水平。但由于新陈代谢旺盛，也会由此带来在体外细胞、组织的活性不能较长时间地保持的问题。因此目前尚无理想的保存液与之配合，也没有在此温度下细胞、组织保存的研究报道。目前常用的组织、器官保存液有Euro-Collins液、SackII液、UV液等。主要用于4r下短时间内(24小时内)保存组织和器官，目前尚无保存液在常温下或者37"C较长时间保存器官和组织。对于急需使用的移植物，如果仍然采用低温或深低温保存，不但耗时耗力、成本极高，而且会因为要经过复苏等过程给细胞带来损伤。因此，本领域迫切需要一种可短期保存移植物的方法，它不会给移植物带来损伤，而且可以保持其良好的生理性能，同时成本低廉且便于操作。
发明内容本发明旨在提供一种组织工程化移植物的处理方法。本发明的另一个目的是提供成骨诱导液或成软骨诱导液的一种用途。在本发明的第一方面，提供了一种组织工程化移植物的处理方法，它包括步骤(a)在37土2'C将骨移植物或软骨移植物和成骨诱导液或成软骨诱导液放置在一容器中2小时一14天；和(b)从容器中取出骨移植物或软骨移植物作为移植手术准备材料。在另一优选例中，所述骨移植物中单位体积中成骨样组织占30—80%;所述软骨移植物中单位体积中成软骨样组织占40—70%。在另一优选例中，步骤(a)中是将骨移植物或软骨移植物和新鲜配制的成骨诱导液或成软骨诱导液放置在一容器中2小时—14天，且不更换诱导液。在另一优选例中，步骤(a)中所述容器是密封容器。在另一优选例中，步骤(a)中是将骨移植物或软骨移植物和新鲜配制的成骨诱导液或成软骨诱导液放置在一容器中3—10天。在另一优选例中，步骤(a)中是将骨移植物或软骨移植物和新鲜配制的成骨诱导液或成软骨诱导液放置在一容器中4一7天。在另一优选例中，在所述步骤(a)前还包括步骤(a')移植物在诱导液中培养5—9天，每周换液2次。在另一优选例中，所述的骨移植物是骨髓基质干细胞和人脱钙骨复合物。在另一优选例中，所述的成骨诱导液中含有10±5nmol/L地塞米松，10±5nmol/LP—甘油磷酸钠和50±20ymol/L2—磷酸抗坏血酸。在另一优选例中，所述的成骨诱导液中含有10土3nmol/L地塞米松，10±3nraol/LP—甘油磷酸钠和50±10nmol/L2—磷酸抗坏血酸。在另一优选例中，步骤(a)中的容器由运输工具由一地运送到另一地，所述的运输工具包括汽车、轮船、火车和/或飞机;一地至另一地的距离在500米一10000公里。在本发明的第二方面，提供了一种成骨诱导液或成软骨诱导液在处理骨移植物或软骨移植物中的应用。据此，本发明提供了一种可短期保存移植物的方法，它不会给移植物带来损伤，而且可以保持其良好的生理性能，同时成本低廉且便于操作。图1显示了DNA检测细胞在材料上增殖的情况。图2显示了ALP活性测定结果。图3显示了ALP比生成率结果。图4显示了OCN含量测定结果。图5显示了0CN比生成率结果。图6显示了葡萄糖代谢检测结果。图7显示了乳酸代谢检测结果。图8显示了氨代谢检测结果。图9显示了葡萄糖、乳酸和氨比生成率结果；其中A显示葡萄糖比生成率结果，B显示乳酸比生成率结果，C显示氨比生成率结果。具体实施方式本发明经过广泛而深入的研究，意外地发现将组织工程化移植物放在新鲜配制的、相应的诱导液中，可以在37'C保存7天左右。这一发现既能在保存期间使移植物保持最佳生理活性，又能使移植物不会因为需要经过复苏等过程而遭受损伤。如本文所用，"组织工程化移植物"、"组织工程移植物"和"移植物"可互换使用，都是将具有分化潜能的种子细胞接种于生物可降解材料上，通过体外培养生物材料部分或全部降解后所形成的。本发明的组织工程化移植物中优选组织工程化骨移植物或软骨移植物。本发明所用的组织工程化骨移植物中的种子细胞可以是本领域常用的，选自骨髓基质千细胞、真皮成纤维细胞、脂肪干细胞、肌腱细胞、软骨细胞等。优选骨髓基质干细胞。所述的生物可降解材料选自(i)可降解性合成高分子材料，例如聚a-羟基酸(如聚乳酸PLA、聚羟基乙酸PGA、聚羟基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyaminoacid)、假聚氨基酸(pesudo—polyaminoacid)、聚原酸酉旨(polyorthoesters)、聚酉旨尿'院(polyesterurethane)、聚碳酸酉旨(polycarbonate)、聚乙二醇、聚对二氧六环酮(polydioxanone)等；(ii)天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸盐、藻酸钙凝胶等；各种脱细胞基质；(iii)可注射性材料，如Pluronic(—种市售的聚环氧乙丙烯商品)、藻酸,丐凝胶等；(iv)上述材料的混合物或复合材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合材料，以及固体材料与可注射性材料的复合材料。如本文所用，组织工程化移植物的"处理方法"和"保存方法"都是指使移植物保持生理活性的方法。如本文所用，"诱导液"和"诱导培养液"可互换使用，都表示可促进种子细胞进一步分化、增殖的溶液。本发明的诱导液优选本领域所常规使用的成骨诱导液或成软骨诱导液。本发明提供的组织工程化移植物的处理方法中将本领域常规使用的诱导液作为相应移植物的保存液，其中所含成分是本领域常规的。在本发明的一个较佳实施例中，所述的用于保存骨移植物的诱导液中含有10土5nmol/L地塞米松，10±5nraol/Le—甘油磷酸钠和50±20umol/L2—磷酸抗坏血酸；较佳地所述的成骨诱导液中含有10±3nmol/L地塞米松，10±3nmol/LP—甘油磷酸钠和50土10iiinol/L2—磷酸抗坏血酸。在本发明的一个较佳实施例中，所述的用于保存软骨移植物的诱导液中含有转移生长因子-/3il0土5ng/ml，胰岛素样生长因子100±50ng/ml，地塞米松40±20ng/ml。本发明用于保存移植物的诱导液中还可添加或复合其他各种细胞、生长因子、各种转基因成分，从而促进种子细胞分化为骨或软骨细胞，以及保持骨或软骨细胞的表型和/或促进骨或软骨细胞生长。代表性的物质包括(但并不限于)转移生长因子-P3、BMP-2、BMP-4、BMP-7、CDMP、血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)—1和2、碱性脂肪干细胞生长因子(bFGF)、角质细胞生长因子(KGF)、神经生长因子(NGF)和肝细胞生长因子(HGF)和/或表皮生长因子(EGF)。移植物在所述诱导液中可以在37士2X:保存2小时一14天，较佳地保存3一10天，更佳地可保存4一7天。所述诱导液作为保存液使用时应含有足够的氧气，例如在15ml的容器中装有5ml诱导液。更佳地，诱导液应新鲜配制，更佳地应将装有诱导液和移植物的容器封口，以免有微生物进入和隔绝氧气。本发明对移植物的处理可以将移植物从一地运送到另一地。即在37±2'C将骨移植物或软骨移植物和成骨诱导液或成软骨诱导液放置在一容器中后，通过运输工具将容器从一地运送到另一地。所述的运输工具包括但不限于，汽车、轮船、火车和/或飞机。两地的距离可相隔500米一10000公里。本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。本发明的主要优点在于1、提供了一种急需使用的移植物的保存方法，它对移植物没有任何损伤；2、本发明提供的保存方法能在一段时间内(1一14天)保持移植物最佳的生理性能；3、本发明提供的保存方法操作简便、成本低廉。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1保存人骨髓基质干细胞和人脱钙骨复合物材料和方法实验材料DMEM低糖培养基(美国Hyclone公司)，Percoll分离液(美国Pharmacia公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，地塞米松、e—甘油磷酸钠、2—磷酸抗坏血酸、Hoechst33258、DMS0、葡萄糖试剂盒、乳酸试剂盒、氨离子检测试剂盒、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性检测试剂盒(美国Sigma公司)，骨钙素(osteocalcin,0CN)含量检测试剂盒(美国Biosource公司)等。实验方法1.人BMSCs的分离和培养按标准骨髓穿刺程序，从3例健康志愿者(l男2女，年龄28—32岁)髂前上棘处抽取骨髓3—5ml，Perco11密度梯度离心获取单个核细胞，以1.5X105个细胞/cra2的密度接种于培养皿，每皿加入10ml含10%胎牛血清的DMEM基础培养液，置于37'C、5%(]02的饱和湿度培养箱内培养。48h后首次换液，以后每周换液2次。待原代细胞生长至80%—90%融合时消化传代，从2代细胞更换成成骨诱导液(DMEM基础培养液，10%胎牛血清，10nmol/L地塞米松，10mmol/LP—甘油磷酸钠，50umol/L2—磷酸抗坏血酸)培养，每周换液2次至第3代，消化细胞接种脱钙骨(demineralizedbonematrix,DBM)材料。2.细胞接种和复合物保存选择人股骨来源DBM(购自上海组织工程研究与开发中心)，制备成4X4X4im^备用，消化收集hBMSCs，调整浓度为2X106cells/ml，均匀地接种在DBM上，每块材料接种20u1细胞悬液。在培养箱内静置4h后，加入成骨诱导液体外继续培养7天，每周换液2次。7天后将复合物分别转移至①含有5ml新鲜成骨诱导液的15ral离心管中，并用封口膜将管口封闭，37r保存，称为37'C实验组，②4t:冰箱和培养箱中保存，称为4'C实验组。保存时间设定为5、7、9、11天。同时以未保存的复合物(体外37"C、5XC02条件下，成骨诱导液持续培养2周，每周换液2次)为对照组。3.DNA测定细胞在DBM上的增殖情况通过Hoechst33258荧光染料测定细胞DNA，进而确定DBM材料上细胞数目，观察细胞增殖。收集复合物，PBS冲洗，-8(TC保存待测，配制染液(10mgHoechst33258溶于10mlddH20)和分析液(0.1ng/ml，10u1染液溶于100mlDPBS)，将复合物在印pendorf管中尽可能钳碎成小块，加入500ul蛋白酶K，56°。过夜，400g离心10min，吸取40y1悬液至黑色96孔板，每孔中加入分析液160ul，37。C避光孵育20rain，在酶标仪(美国Thermo公司)上选择激发波360nm，吸收波465nm测定荧光值。同时以各浓度单纯hBMSCs绘制标准曲线，根据标准曲线换算各荧光值对应细胞数。4.细胞代谢检测观察细胞物质代谢通过测定培养液中葡萄糖、乳酸、氨离子浓度，方法参照试剂盒，简言之，采集各时间点培养液样本，根据试剂盒中提供之试剂和方法检测培养液中葡萄糖、乳酸、氨离子浓度。5.ALP活性测定采用磷酸对硝基本酯二钠盐(美国Sigma公司)比色法测定复合物ALP活性，方法参照试剂盒手册。6.0CN含量测定采用人0CN放射免疫试剂盒(human0CNRIAKit,Biosource公司)检测0CN含量。检测前一天更换无血清基础培养液lml培养24h，然后收集培养液，依照试剂盒操作程序进行检测。7.组织学对照组和单纯材料在体外培养7天后取材回植裸鼠皮下，实验组则分别在5，7，9，11天取材回植。手术步骤如下戊巴比妥腹腔注射麻醉((3.5mg/100g)，背部钝性分离出四个腔隙，分别将对照组和单纯材料各2块，以及各时间点37t:和4"C保存复合物各2块植入腔隙内，关闭切口，共计20只，4周取材10%福尔马林中固定24小时后酒精脱钙，石蜡包埋，H&E染色。切片使用光镜(1X70，Olympus,Japan)观察，同时使用图像处理软件(MediaCybernetics,SilverSpring,MD)计算成骨比例。成骨比例定义为同一视野中新生骨面积与脱钙骨支架面积之比。结果用均值士标准差表示。8.统计学处理采用单因素方差分析对实验组和对照组的细胞数、代谢、ALP和OCN各检测结果使用单因素方差分析进行统计学处理，各组样本量n=3。P<0.05认为差异有显著性意义。结果1.细胞在材料上增殖结果发现，37i:实验组细胞数目在保存的前5天急剧减少，5—7没有变化，7天之后开始出现减少；与对照组有显著性差异。4"C实验组细胞数目趋势与37X:相似，前5天急剧减少，5天后不再明显变化。而对照组一直保持在2.0X106水平(见图1)。DNA检测结果表明，DBM上的细胞数在保存的前5天急剧下降，这可能是由于环境的急剧变化所致。在这之后细胞数目基本保持稳定，意味着剩余细胞已经适应新的缺氧环境，随着葡萄糖的消耗和代谢产物乳酸和氨的增加，细胞的增殖减缓，反映在增殖曲线上及细胞数目保持稳定。37t保存9天之后细胞数目开始出现轻微下降。2.ALP活性测定37。C实验组，ALP活性在前7天持续增加，之后开始减少。4'C实验组，ALP活性维持在较低水平(见图2)。37i:实验组，ALP比生成率在保存的前9天维持在较高水平，之后急剧下降。4t:实验组，比生成率在保存期间一直维持在较低水平(见图3)。比速率主要用来描述单个细胞代谢情况，比生成速率用以下公式计算<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>比消耗速率用以下公式计算1d512XUn-&n+1)。s.(n+1=——x——《-ft是比生长速率，单位隨ol/l0000细胞/天；tn和tw是时间点，单位天；Xt。和X^是在tn和tw时的细胞数，单位X104细胞；ft是比消耗速率，单位mmol/10000cell/天。4.0CN含量测定OCN含量测定的结果与ALP结果相似37'C实验组，0CN含量在前7天持续增加，之后开始减少。4'C实验组，观察期间含量始终维持在lng/mL左右(见图4)。37。C实验组，OCN比生成率在保存的前9天维持在较高水平，之后急剧下降。4。C实验组，比生成率在保存期间一直维持在较低水平(见图5)。结果表明，37"C保存条件下，细胞的活性在保存前7天维持在一个较高水平，之后出现下降。而在4X:保存条件下，细胞的活性始终处在一个较低水平。表明，37"C保存条件下，随着代谢消耗和副产物的堆积，细胞的活性和成骨分化能力在保存前9天维持在较高水平之后急速下降。4t:保存条件下，细胞处于一种"静止"状态。5.代谢检测37°。实验组，葡萄糖浓度持续降低，从5.6mmol/L减少到2.0mmol/L，乳酸在前9天则持续增加，从L8mmol/L增加到5.3mmol/L，然后进入平台期(见图6)，氨的浓度从1.0mmol/L增加到了3.Ommol/L(见图7),4。C实验组，三者浓度基本未发生改变。37t:实验组，乳酸(见图8A)和氨(见图8B)的比生成速率在保存的第9天达到最高，然后急剧下降，葡萄糖(见图8C)的比消耗速率也表现出同样的趋势。4。C实验组，三者的比速率基本未发生改变。—结果表明，人骨髓基质干细胞在37t:，5ml成骨低糖诱导液中活性最多可以维持9天，3mmol/L的氨浓度可能是抑制细胞活性和增殖的最小浓度。4'C保存期间，葡萄糖的消耗和代谢产物的产生都维持在一个较低的水平。6.组织学检测成骨情况见表l，组织学观察发现37"C保存5，7天和对照组有新生骨形成，镜下观察发现在支架骨小梁表面有大量成骨样细胞成层状分布，骨基质分泌旺盛。成骨比例分别是21.4土0.7%，19.8±0.5%，和23.6±1.4%。9，11天复合物仅有少量新骨形成。成骨比例分别为7.5±1.2%和6.8±1.8%。单纯材料和4X:保存复合物则未见新骨形成。表1成骨情况组织学观察结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>目前保存组织和器官的主要方法是4。C保存和低温冻存，低温冻存已经开始应用于组织工程领域，例如人骨髓基质干细胞，软骨细胞，组织工程血管等等。但是由于在冻存过程中产生的冰晶损伤和溶质损伤，其应用受到了很大的限制。关于4匸保存在组织工程中的应用目前尚未见报道。37i:是最适合哺乳动物细胞增殖，分化的温度，4t在临床器官移植应用较多，主要用于短期保存组织和器官的。葡萄糖是细胞代谢的主要能量物质，代谢产物主要是水和二氧化碳，绝大多数哺乳动物细胞在去除葡萄糖之后会出现死亡。葡萄糖主要通过磷酸戊糖途径合成细胞所需的核酸，通过糖酵解途径为细胞代谢提供能量。乳酸和氨是细胞的主要代谢产物，前者主要来源于葡萄糖代谢，后者主要来源于谷氨酰胺的代谢。Miller报道当培养液中的乳酸浓度超过30—40mmol/L后会对细胞的增殖和活性产生抑制，其抑制作用的强弱随细胞不同而不同。ALP和OCN是成骨过程中分泌的特异性蛋白质。ALP在成熟的成骨细胞中表达，与骨基质的钙化紧密相关，ALP活性的高表达是成骨细胞分化的特异性标志。0CN是矿化组织中一种非常重要的非胶原蛋白，仅由成骨细胞和成牙骨质细胞分泌，故被认为是成骨细胞特异性蛋白质。两者主要在成骨分化的早期阶段表达。发明人发现37'C条件下，ALP活性和0CN含量在保存的前9天持续增高，之后急剧下降。而在4'C条件下，两者在保存期间都维持在较低水平。发明人认为37"C条件下，5ml新鲜成骨诱导液中，人骨髓基质干细胞最多可以在7天内保持较高的活性和成骨分化能力。之后活性和成骨分化能力急剧下降。4t:可能并不适合骨组织工程复合物的体外保存。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。权利要求1.一种组织工程化移植物的处理方法，其特征在于，它包括步骤(a)在37±2℃将骨移植物或软骨移植物和成骨诱导液或成软骨诱导液放置在一容器中2小时-14天；和(b)从容器中取出骨移植物或软骨移植物作为移植手术准备材料。2.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于，所述骨移植物中单位体积中成骨样组织占30_80%;所述软骨移植物中单位体积中成软骨样组织占40—70%。3.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于，步骤(a)中是将骨移植物或软骨移植物和新鲜配制的成骨诱导液或成软骨诱导液放置在一容器中2小时一14天，且不更换诱导液。4.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于，步骤(a)中所述容器是密封容器。5.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于，步骤(a)中是将骨移植物或软骨移植物和新鲜配制的成骨诱导液或成软骨诱导液放置在一容器中3—10天。6.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于，步骤(a)中是将骨移植物或软骨移植物和新鲜配制的成骨诱导液或成软骨诱导液放置在一容器中4一7天。7.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于，所述的骨移植物是骨髓基质干细胞和人脱钙骨复合物。8.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于，所述的成骨诱导液中含有10±5nmol/L地塞米松，10±5nmol/LP—甘油磷酸钠和50±20umol/L2—磷酸抗坏血酸。9.如权利要求1所述的处理方法，其特征在于，步骤(a)中的容器由运输工具由一地运送到另一地，所述的运输工具包括汽车、轮船、火车和/或飞机；一地至另一地的距离在500米一IOOOO公里。10.—种成骨诱导液或成软骨诱导液在处理骨移植物或软骨移植物中的应用。全文摘要本发明公开了一种组织工程化移植物的处理方法，它包括步骤(a)在37±2℃将骨移植物或软骨移植物和成骨诱导液或成软骨诱导液放置在一容器中2小时-14天；和(b)从容器中取出骨移植物或软骨移植物作为移植手术准备材料。所述的方法可短期保存移植物，它不会给移植物带来损伤，而且可以保持其良好的生理性能，同时成本低廉且便于操作。文档编号A61L27/00GK101332312SQ20071004301公开日2008年12月31日申请日期2007年6月29日优先权日2007年6月29日发明者刘广鹏,磊崔,曹谊林,王衡健申请人:上海国睿生命科技有限公司