专利名称：：一种破壁花粉的提取物及其提取方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种破壁花粉的提取物及其提取方法和应用。技术背景花粉(pollen)是植物雄性配子体。例如向日葵花粉为菊科植物向日葵(//eZ/a^/ms^ca/eto/wDari)的干燥成熟雄性繁殖器官，油菜花花粉为十字花科植物油菜(Saw^O^/^^mL.)的干燥成熟雄性繁殖器官。现有研究表明花粉具有雌激素样作用，可用于抗前列腺增生、前列腺炎等(杜旭，窦秋莲，李春艳等.黑龙江葵花粉治疗前列腺增生的药效学研究.中腐吵度^V发，2002;9(2):9495;吴岩印，赵筱萍，李乓.前列康治疗前列腺增生的研究进展.中国社区医师，2007,23(2):44)。许多研究发现破壁花粉较未破壁花粉具有更佳的疗效，现花粉的破壁方法包括酶破壁法、机械破壁法、温差破壁法等(唐维,张星海.花粉破壁方法研究进展，食品与发酵工业，2003;29(2):8692)。然而，更佳的是要得到花粉中的有效成分，以更好地提高药效。
发明内容本发明要解决的技术问题即是提供一种具有更佳药效的破壁花粉的提取物及其提取方法。本发明人经过诸多试验，惊奇地发现将破壁花粉，如向日葵、油菜等破壁花粉经超临界萃取后获得的超临界萃取物，具有较佳的抗炎和抗前列腺增生的作用。因此，本发明通过下列技术方案来解决上述问题。一种破壁花粉的提取方法，其包括将破壁花粉采用超临界二氧化碳萃取，收集超临界萃取部分。根据本发明，所述的超临界二氧化碳萃取的温度优选在3555"C范围，压力2540MPa。为了提高提取物的收率，所述的超临界二氧化碳萃取中还采用萃取夹带剂。所述的萃取夹带剂可为现有技术中常用的极性有机溶剂，例如甲醇、各种浓度乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇等Cm的低級醇，丙酮，乙酸乙酯，氯仿等。本发明优选C^的低级醇，更优选甲醇和乙醇。根据本发明，所述夹带剂的用量优选为破壁花粉重量510%。同常规，本发明所述的收集超临界萃取部分可以采用减压离析的一级或多级分离收集。为尽可能收集完全并综合工艺时间、成本等因素考虑，本发明萃取物分离条件优选2545t:范围递减的温度、412Mpa的递减压力；更优选二级分离，其中分离釜I的温度为35~45°C、压力812MPa，分离釜II的温度为25~35°C、压力46Mpa。在收率相同情况下，随着超临界二氧化碳萃取中C02每小时循环用量增大，萃取时间可縮短，反之，超临界二氧化碳萃取中C02每小时循环用量越小，萃取时间越长。本发明综合收率、工艺时间、成本等因素，优选采用2545L/小时循环用量的C02萃取1~3小时左右。本发明所说的破壁花粉是指现有固体的破壁花粉，其可以市售得到，也可以采用现有花粉破壁技术(如可以参考张星海等.油菜花粉的微生物破壁技术研究，食品科学,2003，24(3):9295;以及公开号为CN1452888A的专利申请文件公开的酶发酵破壁方法)自制得到。按常规，将破壁花粉进行超临界二氧化碳萃取之前，尽量将破壁花粉，特别是市售产品去除水分，干燥兀生。本发明优选向日葵破壁花粉、油菜花破壁花粉为例来进行说明。而本发明要提供的一种破壁花粉提取物，由上述提取方法制得，即将两个分离釜收集的产物合并即得本发明的破壁花粉提取物。本发明制得的破壁花粉提取物经动物试验显示，具有较强的抗炎及抗前列腺增生的作用，可制备成抗炎，以及抗前列腺炎、前列腺增生等前列腺疾病的药物或保健食品。具体实施方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。实施例1向日葵破壁花粉的制备参照下列文献张星海等.油菜花粉的微生物破壁技术研究，食品科学,2003，24(3):9295;以及公开号为CN1452888A的专利申请文件，具体步骤为-①培养基的制备将黄豆用粉碎机碾碎，按l:IO的重量比例加水，在高压锅中蒸煮6080分钟，用纱布过滤，或将黄豆包在纱布中蒸煮，提取黄豆汁，按10g黄豆，3g蔗糖，4g琼脂的比例制备培养基;②灭菌、接种将刚制备的培养基趁热分装在培养皿中，灭菌，冷却至室温，分别接种试管菌种黑曲霉菌(Aspergillus3040sp.)和米曲霉菌(Aspergillus3514sp.)(购自浙江大学微生物研究所)，置283(TC的恒温培养箱中培养48小时；③曲子制备采用麦麸培养基，按照体积比30%的比例，分别接种步骤②中培养皿中的菌种，在283(TC发酵2天，发酵完毕后，4000转离心20分钟分别获得黑曲霉液和米曲霉液；④将上述黑曲霉液和米曲霉液按体积比2:1~3:1组成酶液，将干燥的向日葵花粉和酶液按照重量比1:3的比例混合均匀，置发酵罐中37"C发酵24小时，待pH值到4.5，停止发酵，将发酵液直接干燥得向日葵破壁花粉l。⑤发酵液以4000转/分离心30分钟，干燥，即得向日葵破壁花粉2。实施例2向日葵破壁花粉超临界提取物的制备将实施例1制得的向日葵破壁花粉1在55°C，萃取釜压力30MPa，分离釜I温度45'C、压力12MPa，分离釜II温度35t:、压力6MPa，以超临界二氧化碳(45L/小时的循环用量)萃取1.5小时，得到超临界萃取部分，收集超临界萃取部分。实施例3向日葵破壁花粉超临界提取物的制备将实施例1制得的向日葵破壁花粉2在45°C，萃取釜压力25MPa，分离釜I温度35'C、压力lOMPa，分离釜II温度3(TC、压力5MPa，以花粉重量5%重的甲醇为夹带剂，进行超临界二氧化碳(30L/小时的循环用量)萃取2小时，得到超临界萃取部分，收集超临界萃取部分。实施例4向日葵破壁花粉超临界提取物的制备将市售的向日葵破壁花粉60°C减压干燥24小时，然后将干燥后的破壁花粉在40"C，萃取釜压力40MPa，分离釜I温度35'C、压力8MPa，分离釜n温度30。C、压力4MPa，以花粉重量10%重的95%(v/v)乙醇为夹带剂进行超临界二氧化碳(25L/小时的循环用量)萃取2.5小时，得到超临界萃取部分，收集超临界萃取部分。实施例5油菜破壁花粉的制备参照下列文献张星海等.油菜花粉的微生物破壁技术研究，食品科学,2003,24(3):9295;以及公开号为CN1452888A的专利申请文件，具体步①培养基的制备将黄豆用粉碎机碾碎，按l:IO的重量比例加水，在高压锅中蒸煮6080分钟，用纱布过滤，或将黄豆包在纱布中蒸煮，提取黄豆汁，按10g黄豆，3g蔗糖，4g琼脂的比例制备培养基；②灭菌、接种将刚制备的培养基趁热分装在培养皿中，灭菌，冷却至室温，分别接种试管菌种黑曲霉菌(Aspergillus3040sp.)和米曲霉菌(Aspergillus3514sp.)(购自浙江大学微生物研究所)，置283(TC的恒温培养箱中培养48小时；③曲子制备采用麦麸培养基，按照体积比30%的比例，分别接种步骤②中培养皿中的菌种，在2830'C发酵2天，发酵完毕后，4000转离心20分钟分别获得黑曲霉液和米曲霉液；④将上述黑曲霉液和米曲霉液按体积比2:1~3:1组成酶液，将干燥的油菜花粉和酶液按照重量比1:3的比例混合均匀，置发酵罐中37"C发酵24小时，待pH值到4.5，停止发酵，将发酵液直接干燥得油菜破壁花粉l。⑤发酵液以4000转/分离心30分钟，干燥，即得油菜破壁花粉2。实施例6油菜破壁花粉提取物的制备将实施例5制得的油菜破壁花粉1在55°C，萃取釜压力30MPa，分离釜I温度45'C、压力12MPa，分离釜II温度35'C、压力6MPa，以超临界二氧化碳(45L/小时的循环用量)萃取1.5小时，得到超临界萃取部分，收集超临界萃取部分。实施例7油菜破壁花粉提取物的制备将实施例5制得的油菜破壁花粉2在45"C,萃取釜压力25MPa，分离釜I温度4(TC、压力lOMPa，分离釜II温度3(TC、压力5MPa，以花粉重量8%重的丙酮为夹带剂，进行超临界二氧化碳(30L/小时的循环用量)萃取2小时，得到超临界萃取部分，收集超临界萃取部分。实施例8油菜破壁花粉提取物的制备将市售的油菜破壁花粉6(TC减压干燥24小时，然后将干燥后的破壁花粉在35°C，萃取釜压力40MPa，分离釜I温度35°C、压力8MPa，分离釜II温度25'C、压力4MPa，以花粉重量6%重的异丙醇为夹带剂进行超临界二氧化碳(25L/小时的循环用量)萃取2.5小时，得到超临界萃取部分，收集超临界萃取部分。上述实施例中的向日葵破壁花粉和未破壁花粉为北京中健博元生物科技有限公司的产品；油菜花粉和破壁花粉为安徽省宣城市百康蜂业的产品；陶瓷膜为意大利水气公司的产品。试验实施例1本发明破壁花粉提取物的抗炎作用SD大鼠按体重随机分组每组10只，空白组给予0.4%的吐温-80，试验组按表l的剂量给予相应供试品，阳性组给予阿司匹林为0.12g/kg，并给予现有花粉药物前列康(油菜破壁花粉制剂)0.5g/kg剂量和舍尼通(裸麦破壁花粉制剂)0.015g/kg剂量作为对照。灌胃容积均为10ml/kg体重，连续给药7天，末次给药前lh用外径千分尺测量大鼠左后足跖的厚度，给药后lh左后足跖注射鸡蛋清0.05ml/爪，然后于注射鸡蛋清后2、4、6小时用外径千分尺各测量一次左后足跖的厚度，测量时均在相同的部位，计算大鼠左后足跖在给药后不同时间点的肿胀度，将其左后足跖肿胀度进行组间比较，t检验。肿胀度(mm)二左后足跖厚度(注射鸡蛋清后)一左后足跖厚度(注射鸡蛋清前)，结果如下表1所示。表1本发明提取物对蛋清致大鼠足肿胀度的影响(歹士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例20.025102.26±0.351.72±0.52**1.35±0.32实施例30.03102.25±0.471.64±0.24**1.05土0.49"实施例40.032102.37±0.291.31±0.24**0.92士0.49"实施例60.025102.33±0.351.72士0.42"1.32±0.53*实施例70.032102.26±0.421.68±0.38**1.33±0.52*实施例80.035102.07±0.531.59±0.361.28士0.6r与模型组比较，P<0.05P<0.01可见，本发明向日葵破壁花粉提取物和油菜破壁花粉提取物的抗炎作用，如抗前列腺炎的疗效较现常用的消炎药阿司匹林更佳，也优于现有破壁花粉制剂。试验实施例2本发明破壁花粉提取物的抗前列腺增生作用取大鼠，随机取9只做伪手术空白组，其他大鼠在无菌条^^下，用2%的戊巴比妥钠麻醉，摘除双侧睾丸，缝合皮肤。手术1周后，将去睾丸大鼠按体重随机分组。除空白组外，其余大鼠每日按0.1ml/200g体重皮下注射丙酸睾酮，剂量为3mg/kg，共30d，试验组和原料对照组按表2的剂量给予相应实施例或原料供试品，阳性组分别给予前列康0.5g/kg剂量和舍尼通0.015g/kg齐U量，空白组和模型组给予等容积的蒸馏水，均灌胃给予，给药容积为1.0ml/100g体重，l次/d，连续给药30d。于末次给药后2h处死动物，剖取前列腺各叶(腹、背+侧叶)，用滤纸吸除表面液体，电子天平称其湿重，计算前列腺各叶重量指数；前列腺各叶重量脏器指数=-xlOO体重结果如下表2所示。表2、本发明提取物对丙酸睾酮诱导前列腺增生大鼠模型前列腺指数的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>可见，本发明破壁花粉提取物的抗前列腺增生疗效优于现有破壁花粉制剂，特别是较现常用药物前列康和舍尼通更佳。权利要求1、一种破壁花粉的提取方法，其包括将破壁花粉采用超临界二氧化碳萃取，收集超临界萃取部分。2、如权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述的超临界二氧化碳萃取的温度为3555°C，压力2540MPa。3、如权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述的超临界二氧化碳萃取中还采用萃取夹带剂。4、如权利要求3所述的提取方法，其特征在于所述的萃取夹带剂选用Cm的低級醇，其用量为破壁花粉重量的510%。5、如权利要求4所述的提取方法，其特征在于所述的低级醇选自甲醇和乙醇。6、如权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述的收集超临界萃取部分采用温度为25~45°C，压力为4~12Mpa的一级或二级分离收集萃取物。7、如权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述的破壁花粉为向曰葵或油菜花的破壁花粉。8、如权利要求17任一项所述的提取方法制得的破壁花粉提取物。9、如权利要求8所述的破壁花粉提取物在制备消炎药物或保健食品中的应用。10、如权利要求8所述的破壁花粉提取物在制备防治前列腺炎或前列腺增生的药物或保健食品中的应用。全文摘要本发明公开了一种破壁花粉的提取方法，其包括将破壁花粉采用超临界二氧化碳萃取，收集超临界萃取部分。本发明方法简单，易于操作，制得的破壁花粉提取物具有较佳的消炎作用以及防治前列腺炎、前列腺增生等前列腺疾病的功效。文档编号A61K36/31GK101332218SQ200710043270公开日2008年12月31日申请日期2007年6月29日优先权日2007年6月29日发明者坤李,李永辉,杨义芳申请人:浙江海正药业股份有限公司;上海医药工业研究院