调节精子获能的蛋白及其用途的制作方法

专利名称：：调节精子获能的蛋白及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，更具体地，本发明涉及一种附睾特异表达基因及其功能。
背景技术：
：睾丸中产生的精子从其形态结构和染色质的角度已基本成熟，但还不具备运动能力，精卵识别以及结合的能力。它们必须进入睾丸邻近组织-附睾中进行成熟。精子在附睾移行过程中，精子各部分也在发生着一系列的变化，如精子胞质小滴的移行，胞浆、顶体等精子的形态发生了进一步的变化；精子核染色质的浓縮，对核酸酶的抵抗力增强；精子膜的电荷、糖基、脂质、蛋白等发生了明显的改变；不正常的精子逐渐被吞噬、吸收或降解掉等。精子从睾丸到附睾经历了一系列的物理、化学和形态的改变而获得完全成熟。但是附睾中的成熟精子还是不能直接穿卵、结合卵子，它们还需要在雌性生殖道内或者体外培养达到获能状态，然后对卵子透明带进行应答，发生顶体反应，从而穿透卵子与卵子融合。尽管获能过程已经被发现半个世纪，但是目前对这一过程的调控还知之甚少，特别是附睾分泌蛋白结合到精子上以后，在获能或顶体反应中有何生物学作用鲜见报道，特别是对附睾特异性表达蛋白在这一过程中生物学作用知之甚少。HongrESl是本发明人新发现的一个基因(参见Zhang,Y.L.等，Identificationandcharacterizationofanewmemberofserpinfamily-HongrESlinrat印ididymis.CellRes.12,407-410，2002)，它位于大鼠6q32染色体上，由五个外显子构成。分析表明，HongrESl序列具有信号肽，它属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族。尽管推测HongrESl可能是一种与哺乳动物生殖相关的因子，然而现有技术中对于HongrESl蛋白的功能还了解甚少。因此，本领域迫切需要进一步研究HongrESl蛋白的功能，以期提供新的、有用的药物研究耙点。
发明内容本发明的目的在于提供一种附睾特异表达基因及其应用。本发明的另一目的在于提供基于所述附睾特异表达基因为靶点，筛选对于调节哺乳动物精子获能有效的物质。在本发明的第一方面，提供一种附睾特异表达基因HongrESl的用途，用于制备调节哺乳动物精子获能的组合物；或筛选调节哺乳动物精子获能的物质。在另一优选例中，所述的附睾特异表达基因HongrESl抑制精子获能。在另一优选例中，所述的组合物还用于调节哺乳动物生育。在另一优选例中，所述的组合物提高哺乳动物生育能力。在另一优选例中，所述的组合物用于雌性哺乳动物或雄性哺乳动物。在本发明的第二方面，提供附睾特异表达基因HongrESl的拮抗剂，所述的拮抗剂选自附睾特异表达基因HongrESl的抗体，或特异性干扰附睾特异表达基因HongrESl表达的小干扰RNA。在另一优选例中，所述的小干扰RNA具有SEQIDNO:5或SEQIDNO:7所示的序列。在本发明的第三方面，提供一种组合物，所述的组合物含有有效量的附睾特异表达基因HongrESl或其拮抗剂，和药学上可接受的载体。在另一优选例中，所述的组合物的剂型选自(但不限于)胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂、注射剂。在本发明的第四方面，提供一种筛选调节哺乳动物精子获能的潜在物质的方法，所述方法包括步骤(a)将候选物质与含有附睾特异表达基因HongrESl的体系接触；(b)观察候选物质对于附睾特异表达基因HongrESl的表达或活性的影响；其中，若所述候选物质可提高附睾特异表达基因HongrESl的表达或活性，则表明该候选物质是抑制哺乳动物精子获潜在物质；若所述候选物质可降低附睾特异表达基因HongrESl的表达或活性，则表明该候选物质是促进哺乳动物精子获能的潜在物质。在另一优选例中，步骤(a)包括在测试组中，将候选物质加入到含有附睾特异表达基因HongrESl的体系中；和/或步骤(b)包括检测测试组的体系中附睾特异表达基因HongrESl的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的含有附睾特异表达基因HongrESl的体系；如果测试组中附睾特异表达基因HongrESl的表达或活性在统计学上高于(优选显著高于，如高20%;优选的高40%;更优选的高60%或更高)对照组，就表明该候选物是抑制哺乳动物精子获能的潜在物质；如果测试组附睾特异表达基因HongrESl的表达或活性在统计学上低于(优选显著低于，如低20%;优选的低40%;更优选的低60%或更低)对照组，就表明该候选物是促进哺乳动物精子获能的潜在物质。在另一优选例中，所述体系选自溶液体系、细胞体系、组织体系或动物体系。在另一优选例中，还包括步骤对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以选出对于调节哺乳动物精子获能有用的物质。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图1A显示了利用已知浓度(0.25ng、0.5ng、1.0ng、2.0ng、5.0ng)的HongrESl蛋白作为抗原，与HongrESl抗体进行杂交试验，检测HongrESl抗体的特异性和敏感性。图lB显示了Western杂交检测附睾各部分组织中HongrESl的表达情况。其中，cap:头部；cor:体部；cau:尾部；T:睾丸；GAPDH作为内参。图lC显示了利用Western杂交试验检测了附睾组织各部分精子蛋白抽提物中HongrESl的表达情况。其中，Cap:头部；Cor尾部；Cau:体部；3-actin作为内参。图1D显示了糖基酶PNGase-F消化和非消化的HongrES1的Western杂交情况。图lE-G显示了免疫组化检测HongrESl蛋白在附睾中的存在情况。图1H-K显示了间接免疫荧光试验检测HongrESl的表达情况。图1L-R显示了精子结合试验检测附睾上的精子结合情况。图2A-B显示了在大鼠体内，HongrESlmRNA的表达与雄激素量增减的关系，以18SRNA作为内参。图2C-E显示了在大鼠体内，HongrESlmRNA的表达与HongrESl蛋白表达的关系，以3-肌动蛋白(actin)作为内参。图3A-C分别显示了未获能精子(A)/获能精子(B)和顶体反应的精子(C)在CTC处理后，在荧光显微镜下的情况。图3D-F显示了伴随着精子的获能和顶体反应，精子头部HongrESl的分布逐渐减少直至消失。图3G-J分别显示了精子在被HongrESl抗体(anti-H)处理后其运动、未获能(F)、获能(B)、顶体反应(AR)的情况，以免疫前血清(Pre)和大鼠RNase9抗体(anti-R9)处理的精子作为对照，以未处理精子作为空白对照。图4A显示了在实施(Hsil或Hsi2，以Csi为对照)干扰后，附睾上皮细胞的HongrESlraRNA和蛋白表达情况。图4B显示了小RNA电转入附睾尾部后，对HongrESl的mRNA和蛋白的干扰效果。图4C显示了荧光分析在采用小RNA干扰后，伴随着HongrESl表达减少，精子上HongrESl结合情况。图4D显示了用Hsil或Hsi2干扰后，流式细胞仪定量测定精子结合情况，以Csi干扰为对照。其中Pre表示免疫前血清对照，用于扣除HongrESl抗体检测精子上蛋白时产生的背景。图4E-H分别显示了Hsil或Hsi2处理后精子的运动、未获能(F)、获能(B)、顶体反应(AR)情况，以采用Csi处理的精子作为对照。图4I显示了被Hsil或Hsi2处理后，精子蛋白酪氨酸磷酸化情况，以Csi处理的精子作为对照。图5A显示了HongrESl被Hsil或Hsi2敲低后，大鼠附睾内HongrESlm醒和蛋白的表达情况，以采用Csi处理的大鼠作为对照。图5B显示了HongrESl被Hsil或Hsi2敲低后，大鼠产仔数和怀孕过程中的胚胎数的变化，以采用Csi处理的大鼠的产仔数和胚胎数作为对照。图5C显示了HongrESl被敲低后子代中出现出生死亡缺陷，箭头l所示为发生初生死亡的大鼠。箭头2所示为体型低于正常的大鼠。图5D显示了HongrESl被敲低后大鼠出现胚胎发育异常的现象，箭头所示为发育异常的胚胎。具体实施方式本发明人经过长期的研究和试验，首次揭示附睾特异表达基因HongrESl能够在附睾中特异性表达，并且其在调节哺乳动物精子获能和/或生育能力方面具有重要的作用。因此，该基因可直接作为药物以调节哺乳动物精子获能或生育能力；或者可作为筛选药物的靶点，用于筛选通过调节HongrESl的表达或活性而调节精子获能或生育的物质。附睾特异表达基因HongrESl及其用途HongrESl(ratepididymis-specificgeneHongl)位于大鼠6q32染色体上,由五个外显子构成。序列分析表明，HongrESl序列具有信号肽，它属于丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员。在本发明中，所用的HongrESl蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。此外，所述的HongrESl蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组HongrESl蛋白。优选的，本发明可采用重组的HongrESl蛋白。任何适合的HongrESl蛋白均可用于本发明。所述的HongrESl蛋白包括全长的HongrESl蛋白或其生物活性片段。优选的，所述的HongrESl蛋白的氨基酸序列可以与SEQIDNO:2所示的序列基本上相同。经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的HongrESl蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。HongrESl蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域的公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等MolecularBiologyofTheGene,第四版，1987，TheBenjamin/CummingsPub.Co.P224。任何一种HcmgrESl蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，HongrESl蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的HongrESl蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长HongrESl蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长HongrESl蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。本发明也可采用经修饰或改良的HongrESl蛋白，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的HongrESl蛋白。所述经过修饰或改良的HongrESl蛋白可以是一种HongrESl蛋白的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的HongrESl蛋白或者基因可以是与天然存在的HongrESl蛋白或基因虽然具有一定的不同点，但也能调节哺乳动物精子获能或生育，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响HongrESl蛋白的生物活性或者说是基因的生物功能的变化形式都可用于本发明中。任何与所述的HongrESl蛋白同源性高(比如与HongrESl蛋白的同源性为70%或更高，优选的，同源性为80%或更高，更优选的，同源性为90%或更高)的、且具有HongrESl蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。作为本发明的一个实例，所述的HongrESl获自大鼠，所述的HongrESl蛋白的编码基因全长1248bp，编码415aaAA的一个多肽，该基因如SEQIDNO:1所示，其编码的蛋白如SEQIDNO:2所示。本发明人的研究显示，HongrESl只在动物的附睾尾部表达，其mRNA主要位于上皮细胞中。在蛋白水平上，本发明人制备了特异性抗HongrESl蛋白的抗体来检测HongrESl蛋白的表达，结果显示，HongrESl只在附睾尾部表达，而且只在上皮细胞中的主细胞内表达，细胞表达后能够分泌到管腔中，与精子结合并包在精子整个头部。HongrESl的分布特点提示其在精子获能和顶体反应中发挥重要作用。体外利用抗体中和方法，将精子与HongrESl抗体共孵育后，发现获能精子的百分数显著增加，而运动和顶体反应没有明显变化。应用RNAi技术在动物整体水平上将HcmgrESl表达敲低后，获能精子百分数显著增加，运动和顶体反应没有受到影响。伴随获能精子增加，动物生育能力下降，产仔数和胚胎数均下降。因此，HcmgrESl是一个附睾特异表达且调节精子获能和动物生育的新的关键分子。基于本发明人的新发现，本发明提供了HongrESl的用途，用于调节哺乳动物精子获能或生育，或筛选调节哺乳动物精子获能的物质。精子获能是指精子获得穿透卵子透明带能力的生理过程，是精子在受精前必须经历的一个重要过程，该过程受到去能因子和获能因子的调节。精子获能是一种时空性很强的机制，获能过早或获能过晚都无法使得精子与卵子正常结合和受精。由于所述的HongrESl可抑制精子获能，因此，可利用所述的HongrESl来调节精子获能从而达到调节哺乳动物生育的目的，例如，可利用该HongrESl抑制精子过早地获能来促进哺乳动物的生育能力；或者可通过下调HongrESl的表达或活性来使得精子过早获能，从而抑制哺乳动物生育。所述的HongrESl可直接作为药物调节哺乳动物精子获能或生育；如作为抑制哺乳动物精子获能的药物，或者作为促进哺乳动物生育(包括但不限于提高哺乳动物生育能力，提高哺乳动物胚胎个数，降低哺乳动物生殖缺陷或生殖功能紊乱的发生)的药物。HongrESl的拮抗剂或激动剂及其用途所述的HongrESl的激动剂是指任何可提高HongrESl的活性、维持HongrESl的稳定性、促进HongrESl表达、延长HongrESl有效作用时间、或促进HongrESl的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为通过促进HongrESl的表达或活性而抑制哺乳动物精子获能有用的物质。所述的激动剂包括(但不限于)促进剂、上调剂等。所述的HongrESl的拮抗剂是指任何可降低HongrESl的活性、降低HongrESl的稳定性、下调HongrESl的表达、减少HongrESl有效作用时间、或抑制HongrESl的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为促进哺乳动物精子获能或抑制哺乳动物生育有用的物质。所述的拮抗剂包括(但不限于)抑制剂、下调剂、阻滞剂等。作为本发明的优选方式，所述的HongrESl的拮抗剂包括(但不限于)附睾特异表达基因HongrESl的抗体，或特异性干扰附睾特异表达基因HongrESl表达的小干扰RNA。或其它可与HongrESl发生特异性结合或相互作用的物质。任何可调节HongrESl的各种活性机制的物质也可用于本发明，作为对于调节哺乳动物精子获能或生育有效的物质。作为本发明的一种实施方式，将HongrESl的拮抗剂(如抗体或小干扰認A)给药于雄性动物或植入雌性动物体内(如生殖道)，则可以发挥抑制哺乳动物生育(如避孕)的作用。作为本发明的优选方式，提供了一种HongrESl的拮抗剂，所述的拮抗剂是一种可特异性干扰HongrESl基因转录的小干扰脂A。所述的小干扰RNA具有SEQIDNO:5或SEQIDNO:7所示的序列；或与SEQIDNO:5或SEQIDNO:7互补的序列，上述的小干扰RNA通过反复筛选获得，具有良好的抑制HongrESl转录的活性。制备和使用siRNA的方法是本领域技术人员熟知的。所述的siRNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链。双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。此外，siRNA包含的正义链和反义链可通过一个或多个编码正义链和反义链的表达盒来制备。当正义链和反义链由一个单独的表达盒编码时，它们可以从生成的转录物中断裂形成分离的正义链和反义链，其后杂交生成双链siRNA。作为本发明的另一优选方式，所述的HongrESl的拮抗剂是一种特异性抗HongrESl蛋白的抗体。所述的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的HongrESl或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达HongrESl或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。所述的抗体也可以是单克隆抗体，此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。筛选调节哺乳动物精子获能的物质在得知了所述的HongrESl对于哺乳动物精子获能的影响作用后，可以采用本领域熟知的多种方法来筛选调节哺乳动物精子获能的潜在物质。可从所述的潜在物质中找到对于调节哺乳动物精子获能真正有用的物质。因此，本发明提供一种筛选调节哺乳动物精子获能的潜在物质的方法，包括以下步骤将候选物质与含有附睾特异表达基因HongrESl的体系接触；观察候选物质对于附睾特异表达基因HongrESl的表达或活性的影响；其中，若所述候选物质可提高附睾特异表达基因HongrESl的表达或活性，则表明该候选物质是抑制哺乳动物精子获能的潜在物质；若所述候选物质可降低附睾特异表达基因HongrESl的表达或活性，则表明该候选物质是促进哺乳动物精子获能的潜在物质。在本发明中，所述的体系选自(但不限于)溶液体系、细胞体系、亚细胞体系、组织体系、器官体系、或动物体系。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到HongrESl的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的含有HongrESl的体系。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，可对这些物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以便于最终可以从中筛选出能够对于调节哺乳动物精子获能真正有用的药物。因此，本发明还包括一类通过本发明的筛选方法获得的调节哺乳动物精子获能的调节剂，通过在一定的时间点上调节哺乳动物的精子获能，从而可调节哺乳动物的生育能力(如抑制精子过早获能，从而促进生育)。组合物和治疗方法本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.00001-0.01克/60千克体重/天；优选的，为0.0001-0.005克/60千克体重/天)的所述的HongrESl蛋白，或HongrESl的拮抗剂，或HongrESl的激动剂，以及药学上或食品学上可接受的载体。如本文所用，"药学上或食品学上可接受的"的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语"药学上可接受的载体"指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟矢口的。在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的组合物可用于雌性哺乳动物或雄性哺乳动物。可将所述的组合物制成各种适合于雌性哺乳动物或雄性哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限于胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂、注射剂。当用于雄性哺乳动物时，较佳的给药方式是生殖系统内给药，较佳的给药剂型是注射剂；当用于雌性哺乳动物时，较佳的给药方式是生殖系统内给药，如阴道内给药、子宫内给药，给药剂型是胶囊剂、栓剂、片剂。当然，由于精子获能还具有时空性特点，因此具体的给药方式需要考虑受试者的情况和需要(如促进生育的需要或抑制生育(避孕)的需要)，选择合适的给药时间、给药位置。本发明的组合物可直接用于进行哺乳动物精子获能调节或生育调节。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联合使用。本发明还提供了一种调节哺乳动物精子获能或生育的方法，包括给予受试者有效量的HongrESl蛋白(用于抑制精子获能或促进生育)，或HongrESl的拮抗剂(用于促进精子获能或抑制生育)，或HongrESl的激动剂(用于抑制精子获能或促进生育)。应理解，当用于调节哺乳动物精子获能或生育时，所用的HongrESl或其拮抗剂或激动剂的有效剂量可随待治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据受试者的个体情况来决定，这些因素均在熟练医师或营养师可以判断的范围内。在得知了所述HongrESl或其拮抗剂或激动剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述的HongrESl或其拮抗剂或激动剂，或它们的编码基因、或它们的药物组合物给药于哺乳动物。优选的，可采用基因治疗的手段进行。比如，可直接将HongrESl或其拮抗剂或激动剂通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定的途径将携带HongrESl或其拮抗剂或激动剂的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达有活性的HongrESl或其拮抗剂或激动剂，具体情况还需视所述的拮抗剂或激动剂的类型而定，这些均是本领域技术人员所熟知的。优选的，可将编码HongrESl或其拮抗剂或激动剂的基因、或携带所述基因的载体通过常规的方法引入到靶细胞或靶组织中实现HongrESl蛋白或其拮抗剂或激动剂的表达。所述的靶组织包括但不限于雄性附睾组织(如附睾尾部)、雌性动物皮下、腹腔、生殖系统等各组织；或者，让雌性动物产生HongrESl抗体。本发明的主要优点在于-首次揭示HongrESl能够在附睾中特异性表达，并且其在调节哺乳动物精子获能和生育能力方面具有重要的作用。因此，该基因可直接作为药物以调节哺乳动物精子获能或生育能力；或者可作为筛选药物的靶点，用于筛选通过调节HongrESl的表达或活性而调节精子获能或生育的物质。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。1.试验材料HongrESl的序列、质粒与细胞HongrESl蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，编码该蛋白的DNA序列如SEQIDNO:l所示。应理解，虽然实施例中所述的HongrESl蛋白获自大鼠，但是获自其它哺乳动物的与所述的HongrESl蛋白具有一定同源性且也具有调节精子获能功能的蛋白也是可用的；特别是获自其它哺乳动物的与大鼠HongrESl蛋白高度同源(如具有70。/。以上，优选80%以上，如85%、90%、95%、甚至98%序列相同性)且也具有调节精子获能功能的蛋白。并且，本领域人员可理解，所述的HongrESl蛋白或其同源蛋白也可用于其它哺乳动物。HongrESl的表达载体pcDNA3.1-HongrESl(pCD-H)的构建如下采用常规的方法获得大鼠基因组cDNA文库，以该cDNA文库为模板，以5'-GCCTCGAGCTATGGCACTCTCCATCCTG-3，(SEQIDNO:9)和5，-GCAAGCTTCCGGGAAATTGTAGAGTGTCC-3，(SEQIDNO:10)为引物，PCR扩增获得HongrESl序列。以XhoI和HindIII酶切该PCR扩增产物，将酶切产物连接入经过同样酶切的pcDNA3,1载体(Invitrogen)中，从而获得表达载体pc腿3.1-HongrESl(pCD-H)。杂交用HongrESl的探针为PstI酶切产物(453bp)，序列如下tgctacatactaagaactgcgggatctacaccggaagtttgctctttatagacaagactctaaagccagcaaagact:ctcttttgggaactacgggttggcccaaaaacttgtttctggccaattataatttctttaaagggaagtggaaeiteicccctttaaccggaeLgcacacarggatgELggtacttctggttagaagatggaacaaaaaccctggtaccaatgatgcagagagtaggctggttccagctgca-3'(SEQIDN0:11)小鼠附睾上皮细胞系PC1购自美国范德毕特大学。工具酶与试剂PI染料、FITC标记的羊抗兔IgG的荧光二抗、actin单抗及化学试剂购自Sigma公司。HRP偶联的羊抗兔二抗购自Calbiochem公司，GAPDH单抗、服P偶联抗小鼠二抗购自上海华舜公司。orTubulin单抗购自SantaCruz公司，抗磷酸化抗体购自Upstate公司。对照siRNA(Ctr-si)和针对HongrESl的双链siRNA购自上海吉凯公司。SiRNA的序列如下No-silencingsiRNA(Ctr-si):正义链5，-UUCUCCGAACGUGUCACGUdtdt-3，(SEQIDNO:3);反义链5，-ACGUGACACGUUCGGAGAAdtdt-3，(SEQIDNO:4)。H—sil:正义链5，-CAGGAGCCUUGGAUACUAAdtdt-3，(SEQIDNO:5);反义链5，-UUAGUAUCCAAGGCUCCUGdtdt-3，(SEQIDNO:6)。H-si2:正义链5，-GUAACCUGCUACAUACUAAdtdt-3，(SEQIDNO:7);反义链5，-UUAGUAUGUAGCAGGUUACdtdt-3，(SEQIDNO:8)。实验动物健康雄性SpragueDawley大鼠(400-450g)和性成熟雌性SD大鼠(220-280g)购自中国科学院上海实验动物中心。实验前在动物房喂养7-10天，自由进食和水。2.试验方法2.1抗体制备从组织总RNA中用RT-PCR方法扩增HongrESl去掉信号肽片段(核酸1161bp;肽段为从29aa到结束(共387aa))。引物如下上游5，-CATATGGCTTCAAACATGTCA-3，(SEQIDNO:12)，下游5，-AAGCTTCCAAACGTCAAAGGA-3，(SEQIDNO:13)。将PCR产物连接到T-载体(Invitrogen)中，再用Ndel和HindI工I切下HongrESl片段，然后连接到pET-28a原核表达载体(Novagen)中，将此重组原核表达载体转入大肠杆菌BL-21菌中，使之表达HongrESl成熟肽，然后收集包含体，变性，电泳，收集纯化的HongrESl蛋白，将该成熟肽作为抗原，常规方法免疫大白兔并收获多克隆抗血清，用ELASA检测效价。从而获得抗HongrESl的抗体。冻存于-2(TC待用。2.2组织和精子蛋白的制备组织蛋白抽提物的制备在冰上将组织在匀浆缓冲液中(25mMNaH2P04(pH7.2),1,5mMEDTA，10%甘油，10mMNa2M0"lOmMNaF，2uM抑肽酶，5uM亮肽素，2mMPMSF)剪碎，用高速搅拌器匀浆，而后于13000g超离心40分钟。取上清，用Brandford法定蛋白浓度，分装冻存于-2(TC。精子蛋白制备大鼠附睾组织分成头部(Cap)、体部(Cor)和尾部(Cau)，用手术刀片将组织进行切口后放入PBS中使精子游出，然后将精子用PBS洗三次。将收集的精子直接在SDS-PAGE上样缓冲液(O.045MTris-Cl，10%甘油，1%SDS，0.01%溴酚蓝，0.05MDDT)中裂解，离心，吸取上清即得到精子总蛋白备用。2.3Western杂交用8。/。-12。/。的SDS-PAGE胶分离蛋白样品。电泳结束后，凝胶和预先用甲醇浸湿的PVDF膜(AmershamPharmaciaBiotech，Poscataway)在转移缓冲液(2.9g甘氨酸，5.8gTris，0.37gSDS，200ml甲醇，至1L)中浸泡15分钟；剪6张与PVDF膜同样大小的滤纸，在转移缓冲液中浸润，将其中3张平堆在半干式转移系统(Bio-Rad)的转移板上，依次铺上PVDF膜，凝胶和3张润湿的滤纸，赶气泡。于20伏转移l小时。转移完毕，膜用TBS漂洗IO分钟；封闭液(IXNET:0.15MNaCl，5mMEDTApH8.0，0.05MTrispH7.5，0.05%TritonX-100)室温封闭2小时，用含O.1%Tween-20的TBS漂洗3次，每次IO分钟；加入稀释(稀释于1XNET中)的抗血清或者单抗，4"C过夜。用含0.05%Tween-20的TBS漂洗3次，每次IO分钟。加入l:10000稀释的，HRP偶联的羊抗兔二抗，室温l小时。用含O.1%Tween-20的TBS漂洗3次，每次IO分钟。用ECLPLUS显色液显色(WesternBlotChemiluminescenceReagentPlus,AmershamPharmaciaBiotech)。2.4免疫组化分析大鼠附睾组织用固定液(用PBS配制的4%多聚甲醛)固定4小时，PBS洗涤3次，每次5分钟。分别用30%,50%,70%,80%,90%乙醇梯度脱水，每次O.5小时。100%乙醇脱水两次，每次l小时。二甲苯乙醇等体积混合物中O.5小时。在二甲苯中彻底透明。二甲苯和石蜡的等体积混合物于56'C1小时。在石蜡中于56"C彻底透蜡，中间换蜡两次，每次l小时，包埋。切片(8um)。45°C水浴展片捞片，37'C烤片72小时。组织切片于二甲苯脱蜡2次，每次15分钟。然后通过100%，95%，80%,70%,50%，30%乙醇，水，依次复水，每次5-10分钟。再用PBS平衡5分钟。用胰蛋白酶试剂(胰蛋白酶10mg，CaCl2100mg，0.05MTrispH7.6，10ral)37'C消化10-15分钟。阻断内源性过氧化物酶(30°厕202:甲醇=1:100)作用10分钟。PBS平衡，羊血清封闭液(10。/。羊血清在PBS中)封闭30分钟以上。一抗4t:结合过夜，然后用ABC试剂盒(华美公司)反应(A与B分别1:200稀释)，DAB显色液(0.05MTris-HClpH7.410ml，DAB5g，0.01%H202)显色，然后流水冲洗终止反应。切片再用苏木精染核，梯度脱水，封片，在01ympus52显微镜下观察。2.5间接免疫荧光分析用上述方法制备的石蜡切片，前期脱蜡方法相同，然后用10%羊血清室温封闭lh，加一抗，4°C过夜。PBST(PBS加0.P/。的Tween-20)洗3次，每次5分钟。分别加FITC标记的荧光二抗(Sigma,USA)和Rhodamine标记二抗(SantaCruz),PBST(PBS加0.P/。的Tween-20)洗3次，每次5分钟。用80%的甘油封片。用C0NF0CALmicroscope(LeicaTCSSP2A0BS)禾口OlympusBX-52显微镜观察。2.6精子结合测定收集附睾尾部精子用PBS洗涤后，用4%多聚甲醇固定，然后涂于多聚赖氨酸包被的载玻片上，空气中干燥。将涂片用10。/。的羊血清室温封闭lh，一抗4。C过夜(兔抗大鼠HongrESl的多克隆抗血清，1:700稀释)，免疫前血清作为对照。PBST(PBS加0.P/。的Tween-20)洗3次，每次5分钟。加FITC标记的羊抗兔IgG的荧光二抗(l:500稀释)室温作用2小时，PBST(PBS加0.1%的Tween-20)洗3次，每次5分钟。用PI染核(Sigma)(1:1000稀释)。用80%的甘油封片，OlympusBX-52显微镜观察。对于流式细胞仪测定精子结合，多聚甲醛固定后，用PBS分散，取部分于离心管中，5000g离心2分钟，弃去上清，用10%羊血清室温封闭2小时，加入HongrESl抗血清(l:300)，4。C过夜。PBS洗两次，每次5分钟，加入FITC标记的羊抗兔IgG的荧光二抗(l:100稀释)室温作用2小时，PBS洗两次，置于流式细胞仪上进行测定。2.7CTC(氯四环素，Chlortetracycline)测定取体外培养的附睾尾部精子50nL，加入50pL冰浴的CTC(l.5mMCTC，20raMTris-Cl，130mMNaCl，5mM半胱氨酸)，混匀，30秒后加入4%多聚甲醛17.5pL混匀，4。C过夜，吸取15pL置于载玻片上，盖上盖玻片，用匀力压紧，四周用指甲油封闭，用荧光显微镜观察记数F型(未获能精子，顶体帽完整，整个顶体布满黄绿色荧光)、B型(获能精子，顶体依然存在，在顶体后区出现一条无或者暗淡的荧光区带)、AR(顶体反应精子，顶体帽不完整，除了顶端有浅色荧光带外，整个精子头部淡绿色或无荧光)，至少计数300个精子，计算百分数。2.8精子与抗血清体外共孵育手术取出附睾尾部组织，用手术刀片划开组织置于lmL获能液中(94.6mMNaCl,25mMKC1,1.71mMCaCl2，1.19mMMgS04，1.19mMKHA,25mMNa线，5.56mM葡萄糖，10.76mM乳酸钠和O.5mMsodium丙酮酸钠，0.002%酚红(phenolred),4mgml牛血清白蛋白；50|igml硫酸链霉素(streptomycinsulphate),75jLigm1potassiumpenicillin,pH7.4，osmolarity310mOsmkg—')。5-10分钟后吸入5ml圆底培养管中，补充2mL获能液置于37。C，5%C02培养箱中，精子上游l小时，取出上层精子分管培养，实验设置四个组空白对照组；免疫前血清组；加HongrESl抗体组；加大鼠尾部特异表达蛋白RNase9抗体组。在培养箱中培养0小时、1小时、3小时和5小时取样进行CTC测定。2.9精子运动测定取出精子用精子运动分析仪(CASA，HTM-T0XIV0S，version12.3a)进行运动参数的测定，用测定大鼠精子软件分析。2.10细胞转染及总RNA提取转染前24小时，细胞PC1在放有盖玻片的35mm培养皿中培养，呈80%90%融合时，以脂质体介导转染，转染方法按照Lipofectamine"12000说明书进行。转染48小时后将细胞用PBS洗两次，提取细胞总RNA和总蛋白。RNA提取按照TRIZ0L试剂盒说明进行，总蛋白用RIPA(120MmTris-Cl，pH=7.4，120MmNaCl，lmMEDTA，lmMDTT，10Mme-甘油磷酸，0.lmM氟化钠，0.lmM砜酸钠，0.5%NonidetP-40和蛋白酶抑制剂)抽提。2.11RNA膜的制备取组织总RNA(2(Vg)上样1.2。/。琼脂糖/17.9%甲醛变性凝胶上，于4。C，45V、5070mA电泳56小时。用毛细管转移法将RNA转移至Hybond-N+阳离子尼龙膜上。转移过后取出Hybond-N+阳离子尼龙膜，在UV-Crosslinker仪上用C3Program(能量为150mJ)，将RNA交联固定在尼龙膜上，经亚甲基蓝染色，ddH20漂洗后标好5S、18S、28S的位置。用保鲜膜封好，置于-20'C保存备用。2.12采用随机引物法标记探针于一灭菌Eppendorf离心管中加入将20ng探针DNA与一定体积(1犯20补充至14.5pl，置沸水浴中IO分钟，立即上冰5分钟，使模板DNA充分变性。置于冰上后加入BSA(10mg/ml)5x标记缓冲液5pl;dNTP(dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM)Klenow酶(lOu/pl)0.5^1后，再与3(ilc^32P-dATP混合，反应体系总体积为25)nl。置离心管于铅盒中，37'C空气浴中反应12小时。探针于沸水浴中再次变性10分钟，立即上冰，置于冰上备用。2.13NorthernBlot分析将已转移好的尼龙膜置于杂交瓶(Appligene公司)中，加入510ml杂交液(7%(W/V)SDS、0.2MNa:iP0jpH7.2)、lmMEDTA(pH8.0)、1%(W/V)BSA、15%Formaide(甲酰胺)于65'C杂交炉预杂交1小时，弃尽瓶中杂交液。重新加入2ml新鲜的杂交液，将变性后的上述探针加入杂交瓶中，于65'C杂交炉中杂交过夜。取出杂交管将杂交液倒入指定容器中。加入1/31/2瓶体积的洗膜缓冲液(40mMNa2HPO^nNaH2P04的混合液(pH7.2)、lmMEDTA(pH8.0)、1%(W/V)SDS)洗涤，在65t:每隔60分钟换液一次，共3次。取出膜，用重蒸水漂洗，后用保鲜膜封好，用Moniter测定膜上的放射性，以作为压片时间的参考。在暗室中压BioMaxX光片(Kodak),置于-8(TC自显影。完成后进行灰度分析。杂交后，湿润尼龙膜用TES缓冲液(10mMTris-HC1(PH8.0)，lmMEDTA，0.1%SDS)于10(TC洗涤15分钟(两次)，以除去杂交信号，用于下一次杂交。2.14精子蛋白磷酸化测定收集培养的精子置于离心管中，PBS洗两次，5000g离心2分钟，加入SDS裂解液(50mMTris-CIpH=6.8，lOOmMDTT，1%SDS，0.1%溴酚蓝，10°/。甘油)。离心取上清用8呢的SDS-PAGE胶分离蛋白，进行Western杂交检测。酪氨酸蛋白磷酸化单抗l:10000，HRP标记抗小鼠IgGl:10000，oH敫管蛋白(Tubulin)作为内标，一抗为l:5000，二抗为l:10000。2.15附睾尾部siRNA导入针对HongrESl的siRNA导入大鼠附睾尾部并且加电转。仅划开包裹大鼠睾丸和附睾皮肤，用镊子固定附睾尾部，将siRNA用超细针头微量注射器(BD-Ultra-Fine'29G,lmL)注入附睾尾部，然后立即用电极镊夹住附睾尾部，进行电击(50V，50msec，8x2次，ls)，完成后缝合皮肤，48小时后，取组织抽提总RNA和总蛋白，测定精子运动、精子结合、CTC、精子酪氨酸磷酸化变化情况。2.16动物交配实验注射siRNA的雄性大鼠48小时与雌性大鼠合笼过夜，第二天早晨进行阴道涂片，在显微镜下检测有无精子，发现阴道中有精子的雌性大鼠单独饲养，同时与之交配雄性大鼠进行附睾取样观察干扰效果。一部分雌性大鼠怀孕18天时，子宫解剖观察胚胎数量和发育情况；一部分怀孕雌鼠产仔后观察生育情况。实施例l蛋白水平上HongrESl在附睾内的定位采用常规的抗体制备技术，本发明人得到了高敏感度和高度特异性的HongrESl抗体。利用所述的抗体进行杂交试验，以HongrESl蛋白作为抗原。结果如图1A，以不同浓度的抗原结合所述抗体，杂交获得的条带深浅也不同，抗原浓度越高，杂交条带越深，可见本发明制备的抗体具有高敏感性和高特异性。将附睾各组织进行Western杂交试验，检测HongrESl在组织中的表达情况。结果表明，HongrESl在附睾尾部组织中表达而在附睾头部、体部以及睾丸中都没有表达，如图1B。利用Western杂交试验检测精子蛋白抽提物中HongrESl的表达情况。结果发现，只有尾部精子蛋白检测出HongrESl信号。头部和体部精子蛋白中未发现信号，如图1C。实验中还注意到HongrESl的分子量比预计要大，用Prosite软件分析表明，HongrESl有三个N糖基化位点(N32，N152和N380)，用糖基酶PNGase-F消化结果发现HongrESl分子量变小，表明HongrESl确实是被N糖基化的，如图1D。免疫组化结果表明，HongrESl蛋白只存在于附睾尾部，且分布于上皮细胞中，如图1E，1F，1G。间接免疫荧光试验显示，HongrESl主要由上皮细胞中的主细胞表达，而亮细胞中没有表达，如图1H(绿色为FITC标记二抗，指示HongrESl信号)，lI(红色为Rhodamine标记二抗，指示亮细胞特有的ATP6E信号)，1J(相差显示)，1K(叠加效果)。精子结合试验结果表明，只有附睾尾部精子上有HongrESl结合(图1N)，而头部和体部精子没有HongrESl结合信号(图1L，图1M);并且HongrESl包裹在整个精子的头部，如图10(绿色为FITC标记二抗，指示HongrESl信号)，1P(红色为用PI染色，指示精子DNA，1Q(相差显示)，1R(叠加效果)。实施例2HongrESl表达的发育性变化和调控利用大鼠整体阉割和补充雄激素的动物模型，检测在阉割和补充雄激素后，HongrESl的表达变化。结果表明，大鼠在阉割后第一天雄激素即下降为零，伴随这种下降，HongrESl的raRM表达也随着下降，到手术后第七天接近为零。手术后第七天补充雄激素(睾酮)后，雄激素快速上升，而HongrESl的mRNA表达也有相似增加模式。提示HongrESlmRNA的表达受到雄激素调控，如图2A-B。跟踪测定HongrESl的mRNA和蛋白水平的发育性变化，结果显示，在大鼠出生后30天可以检测到HongrESl的表达，成年后HongrESl表达维持在较高的水平，如图2C-E(1,2,3，4，5，6,7，8，9,10分别代表15天，30天，45天,60天，90天，120天，270天，360天，450天和720天)。实施例3精子获能和顶体反应中HongrESl分布的变化采用CTC的方法测定了精子获能和顶体反应情况。F型表示未获能精子，该种精子如图3A所示；B型表示获能精子，该种精子如图3B所示；AR型表示顶体反应的精子，该种精子如图3C所示。分析精子获能和顶体反应前后HongrESl的分布情况。结果发现，伴随着精子的获能和顶体反应，精子头部HongrESl的分布逐渐减少直至消失，如图3D，3E，3F。上述结果说明，HongrESl参与精子获能和/或顶体反应。实施例4HongrESl在体外精子获能中的作用将精子与HongrESl抗体(anti-H)进行共孵育，分别在0、1、3、5小时采样测定获能和顶体反应情况。结果表明，HongrESl抗体能够显著提高获能精子的百分数，对精子运动和顶体反应没有明显影响，而免疫前血清和大鼠RNAase9抗体对获能、顶体反应和运动均没有明显影响。如图3G-J(图中，未处理空白对照，Pre:免疫前血清对照，anti-H:HongrESl抗体，anti-R9:大鼠RNase9抗体对照，RNase9是大鼠附睾头和体部表达的基因，在尾部精子上未检测到有RNase9的结合)。上述结果说明，HongrESl具有抑制精子获能的功能。实施例5动物整体水平上HongrESl在精子获能中的作用首先设计并化学合成针对HongrESl的小RNA片段，在附睾上皮细胞上进行有效片段的筛选，结果筛到两条干扰HongrESl的mRNA和蛋白表达效率在95。/0以上的片段。在加入所述小RNA片段后附睾上皮细胞的HongrESlmRNA和蛋白表达如图4A所示(Csi:不配对siRNA作为对照；Hsil:针对HongrESl序列位点的一条片段；Hsi2:针对HongrESl序列另一位点片段；分别以18S和GAPDH作为内标)，可见加入Hsil和Hsi2后，细胞内HongrESl的mRNA和蛋白表达明显减弱。然后，通过电转的方法将这两条有效片段注射到附睾尾部，检测其对HongrESl的mRNA和蛋白的干扰效果。结果显示，在附睾尾部，整体而言HongrESl的mRNA和蛋白干扰效果可以达到50y。左右，如图4B。荧光分析和精子结合测定显示，在采用小RNA干扰后，伴随着HongrESl表达减少，精子上HongrESl结合明显减少，如图4C(绿色代表HongrESl信号(FITC),红色为PI染核)。流式细胞仪定量测定精子结合情况表明，用Hsil或Hsi2干扰后，与釆用Csi干扰的对照相比，精子上HongrESl结合减少60X左右，如图4D。精子的HongrESl蛋白减少后，获能精子的百分数显著增加，而运动和顶体反应没有明显变化，与体外结果相吻合，如图4E-H。另外，精子在获能过程中会伴随着酪氨酸蛋白磷酸化，因此，精子蛋白酪氨酸蛋白磷酸化也可以作为精子获能的标志。本发明人还发现，HongrESl被干扰后，实验组的精子蛋白酪氨酸磷酸化明显提前，如图4I(干扰后精子取出培养0、1、3小时测定，a-微管蛋白作为内标)，这与CTC的方法测定结果是一致的。上述结果表明，HongrESl具有抑制精子获能的作用。实施例6雄性大鼠HongrESl敲低后的表型采用上述的脂A干扰技术，将HongrESl敲低后的雄性大鼠与正常雌性大鼠进行交配，一部分大鼠观察产仔情况，一部分大鼠于交配成功后18天解剖，计数胚胎数量。结果表明，随着HcmgrESl被敲低，动物产仔数和怀孕过程中的胚胎数均降低，如图5A，5B。意外的是，随着HongrESl被敲低，子代中出现出生死亡缺陷和胚胎发育异常的现象，如图5C，5D和表1。并且两者均有较高的发生比例，如表所示(分母表示观察生育和怀胎个体数，分子表示出现异常生育个体数，括号中表示出现个体生育异常时出现的死亡仔数或异常胚胎数)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>上述结果可见，HongrESl表达被敲低后，动物生育能力下降，而且出现生殖缺陷或生殖功能紊乱。实施例7筛选调节HongrESl表达的物质以附睾尾部的上皮细胞为受试对象，检测候选物质刺激前后的细胞中内源HongrESl的表达情况，利用抗HongrESl的抗体进行杂交试验，通过检测结合的强弱来获知细胞内HongrESl的表达变化。基本方法如实施例1。测试组添加候选物质的附睾尾部的上皮细胞培养物；对照组不添加候选物质的附睾尾部的上皮细胞培养物。如果与对照组相比，测试组中的附睾尾部的上皮细胞中HongrESl的表达加强，则说明该候选物质是可促进HongrESl的表达，从而可抑制精子获能或促进生育的物质；如果与对照组相比，测试组中的附睾尾部的上皮细胞中HongrESl的表达减弱，则说明该候选物质是可抑制HongrESl的表达，从而可促进精子获能或抑制生育的物质。利用SEQIDNO:5所示的siRNA作为候选物质，加入到附睾尾部的上皮细胞培养物中，观察细胞内HongrESl的表达情况，结果发现，测试组中的附睾尾部的上皮细胞中HongrESl的表达明显减弱。讨论精子获能代表精子一种完全成熟状态并赋予精子受精能力，此过程主要涉及到精子内离子浓度的变化、胞浆膜的流动性、代谢、蛋白磷酸化、超激活运动等一系列变化。虽然人们发现获能过程已经几十年，但是，对这一过程的分子基础仍然不清楚。特别是附睾蛋白的参与作用报道极少，到目前为止，只有大鼠附睾分泌蛋白CRISP-1被报道在体外具有抑制获能的作用，本发明人发现的结果在整体水平上证实了附睾特异性表达新蛋白具有抑制获能的生物学功能。同时，本研究也加深对获能的理解，即精子受到蛋白的保护，只有到达适当的时间和地点才进行获能。本试验中HongrESl被敲低后，动物生育出现多种表型，如产仔减少、胚胎减少、死仔、发育异常胚胎。提示这与精子上HongrESl多少有关，RNAi干扰后表型精子主要有三种类型，头部包满HongrESl、部分HongrESl和没有HongrESl，精子上HongrESl的量不同，提前获能的时间亦不相同，所以精子获能状态的同步性比较差，从而出现生育不同表型。根据已有资料，本发明人是第一个应用RNAi技术在整体水平上研究附睾特异性表达基因的功能D目前已报道在不同种属动物的附睾中有200多个蛋白，但是很少报道这些蛋白直接参与精子成熟过程的功能，本发明人建立附睾RNAi技术为这些蛋白研究提供了技术平台，也为研究其他组织或器官新基因功能提供依据和启发。另一方面，了解精子获能抑制蛋白不仅可以为临床不孕、不育诊断提供参考，更为重要的是还可以启发用小分子来改变调节精子获能的蛋白作用，开发新的雄性避孕药。同时，如果将HongrESl抗体或者具有干扰HongrESl作用的物质作成胶囊植入雌性生殖道则可以发挥紧急避孕药的作用。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表〈110〉屮同科，院上海生命科学研究院，浙江省医学科学院〈120>调节精了获能的蛋白及其用途<130〉074501<160>13<170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211〉1248<212〉隠〈213〉人鼠(Rattusrattus)<400>atggcactct.ccatcctgtccctctggctgctcctggctgggcttgtcccctgttcctgc60gacccacagacaccacc3ccaccagaggcttcaaaca.tgtC3Ca33t3CCagtgacccaa120ggagcacccccattcttcaatttgccttgagcctgtacaaacagctacca180C3gCCC3a3Cga,ggcaagaacttaatcttttctccacttggcatcattgtgcctcttgtg240ctgctggccttccaggataagccaaa.agcccgacaccaggttctgcaggatctagggUc300acagtcacaggagcct.tggata.cta,aagcagccagtgagtatgggaagctgctgagtaac360ctgctacatactaagaactgcgggatctacaccggaagtttgctctttatagacaagact420ctaaagccagcaaagacttttgtcaaact3gccaacagctcctaceiac3gcaatgtcgtc480ctcatctcttUggg33Ctacgggttggcccaaaagcagatagacttagccattcgtgcc5403gg3CCC3Cggcaaaat卞.acaaagctactgagaattctgaagccaccaactaacttgttt600ctggccaattataatttctttaaagggaagtggaaatacccctttaaccggaagcacaca660rggatgaggtacttctggtt,agaagatgg3tggtaccaatgatgcag,720gta.ggctggt.tccsgctgcagtatttctcccagatgcacagctatgtcctccagctgccg780ttcacctgc3gt.atctca.ggcgt.cttctttctccccgatgatgga.aaatttg3ggaaagt840gagaaggcactgttggsgcagagttttgasacatggat.tcagcccttt.ccC3tg3gt33g9003ggtggCtgtttttccccaaattctccatacctgttgctcttcacctggaaaagctcaag960cacgtta,acagt.aacatt.aa3Ctgt,tC3gCgaacacatggacctctcaagaatcactctg1020caaaaggcaccgttgacagt,cagca,cggcagta.ca.cagagtggagctgactgtga.atgag1080gacggagagg3333ggatg3gtcccagcccgasccsgacct,tgccactctccacttcaat1140agatccttcctactactaatcctggatgaa3CC3gC33Cagccttctcttcatggggaaa1200gtggtg33tCccactagaatcaacat.ggac3ctctacaatttccctaa1248<210〉2〈211〉415<212>PRT<213>大鼠(Rattusrattus)<220〉<221〉misc_feature<222〉(221亍..(221)〈223〉Xaacanbeanynaturallyoccurringaminoacid<400〉2MetAlaLeuSerlieLeuSerLeuTrpLeuLeuLeuAlaGlyLeuVal151015ProCysSerCysAspProGinThrProProProProGluAlaSerAsn202530Met,SerGinlieProValThrGinGlyAlaProProPhePheAsnAsn354045GinLysPheAlaLeuSerLeuTyrLysGinLeuProGinProLysArg505560<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula><220〉<221>misc一feature<223〉siRNA〈400〉4acgugacacguucggagaa19<210>5<211〉19<212>RNA<213〉人工序列<220〉<221>raisc_feature〈223〉si飄〈400〉5caggagccuuggauacuaa19<210〉6<211>19〈212〉隨<213>人工序列<220〉<221>misc一feature<223>si隨<400〉6uuaguauccaaggcuccug19〈210〉7〈211〉19<212〉RNA〈213〉人丁序列<220><221〉misc—feature<223〉siRNA<400〉7guaaccugcuacauacuaa19<210>8〈211〉19〈212〉RNA<213>人丁序列<220><221〉misc_feature<223〉siRNA<400〉8uuaguaugua.gcagguuac19〈210〉9<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><221>raisc_feature〈223〉引物<400>9gcctcga.gctatggca.ctctccatcctg28<210〉10<211>29<212>DNA<213>人丁序列<220><221〉misc_feature〈223>引物<400〉10gcaagct.tccggga,aattgtagagt,gtcc29<210>11<211>453<212〉DNA〈213〉人工序列<221〉misc—feature<223〉探针<400〉11ggatcta.gggttxacagtcaca,ggagccttggatactaaagcagccagtgagtatgggaa60gctgctga.gtaacctgctacatactaagaactgcgggatctacaccggaagtttgctctt120tatagacaagactctaaagccagcaaagacttttgtcaaactagccaacagctcctacaa180cagcaatgtcgtcctcatctcttttgggaactacgggttggcccaaaagcagatagactt240agccattcgtgccaggacccacggcaa.aattacaaagctactgagaattctgaagccacc300aactaa.cttgtttctggccaattataatttctttaaagggaagtggaaatacccctttaa360ccggaagcacacarggatgaggtacttctggttagaagatggaacaaaaaccctggtacc420aatgat.gcagagagtaggctggttccagctgca453<210〉<211><212><213><220〉<221〉<223>1221DNA人丁序列misc—feature引物—<400〉12catatggcttcaaacatgtca21<210〉<211〉<212><213〉<220〉<221〉〈223〉1321DNA人工序列misc—feature引物—<400〉13aagcttccaaacgtcaaa.gga2权利要求1.一种附睾特异表达基因HongrES1的用途，其特征在于，用于制备调节哺乳动物精子获能的组合物；或筛选调节哺乳动物精子获能的物质。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于调节哺乳动物生育。3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物用于雌性哺乳动物或雄性哺乳动物。4.附睾特异表达基因HongrESl的拮抗剂，其特征在于，所述的拮抗剂选自附睾特异表达基因HongrESl的抗体，或特异性干扰附睾特异表达基因HongrESl表达的小干扰RNA。5.如权利要求4所述的拮抗剂，其特征在于，所述的小干扰RNA具有SEQIDNO:5或SEQIDNO:7所示的序列。6.—种组合物，其特征在于，所述的组合物含有有效量的附睾特异表达基因HongrESl或其拮抗剂，和药学上可接受的载体。7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述的组合物的剂型选自胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂、注射剂。8.—种筛选调节哺乳动物精子获能的潜在物质的方法，其特征在于，所述方法包括步骤(a)将候选物质与含有附睾特异表达基因HongrESl的体系接触；(b)观察候选物质对于附睾特异表达基因HongrESl的表达或活性的影响；其中，若所述候选物质可提高附睾特异表达基因HongrESl的表达或活性，则表明该候选物质是抑制哺乳动物精子获潜在物质；若所述候选物质可降低附睾特异表达基因HongrESl的表达或活性，则表明该候选物质是促进哺乳动物精子获能的潜在物质。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(a)包括在测试组中，将候选物质加入到含有附睾特异表达基因HongrESl的体系中；禾口/或步骤(b)包括检测测试组的体系中附睾特异表达基因HongrESl的表达或活性，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的含有附睾特异表达基因HongrESl的体系；如果测试组中附睾特异表达基因HongrESl的表达或活性在统计学上高于对照组，就表明该候选物是抑制哺乳动物精子获能的潜在物质；如果测试组附睾特异表达基因HongrESl的表达或活性在统计学上低于对照组，就表明该候选物是促进哺乳动物精子获能的潜在物质。10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述体系选自溶液体系、细胞体系、组织体系或动物体系。全文摘要本发明属于生物
技术领域：
，公开了附睾特异表达基因HongrES1或其激动剂或拮抗剂在制备调节哺乳动物精子获能的组合物中的用途；本发明还公开了以所述附睾特异表达基因为靶点，筛选对于调节哺乳动物精子获能有效的物质的方法。本发明首次揭示HongrES1在调节哺乳动物精子获能和生育能力方面具有重要的作用，从而为雄性生殖研究提供了有效的靶点。文档编号A61K48/00GK101396564SQ20071004632公开日2009年4月1日申请日期2007年9月24日优先权日2007年9月24日发明者强刘,周玉传,张永莲,石其贤,胡志红,敏郑,陈文颖申请人:中国科学院上海生命科学研究院;浙江省医学科学院