专利名称：自组装短肽在治疗烧伤创面的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及自组装短肽RADA16-1的用途，特别是在制备治疗烧伤创面的药物中的应用。
背景技术：
在工程建设、工业生产和日常生活中，火灾时有发生，因此不可避免地存在火对人体的伤害，即使未产生火灾，在某些情况下(例如电焊工、炉前工操作不当，家用电器使用不当等)也会导致人体的烧伤。严重烧伤病人的治疗时间长、并发症多、残废率高，特别是深度烧伤往往导致痊愈后遗留有不同程度瘢痕，甚至毁容影响到美观，严重的情况可以造成组织活动受限，功能丧失，即使后期手术整形纠正功能障碍和/或美容，不幸的是不少病人最终仍不免遗留一定程度的残废和/或畸形，尤其是颜面深度烧伤，由于毁容使病人精神和肉体承受极大痛苦。临床一直在寻找一种理想敷料能尽快覆盖创面，避免感染，从而促进创面表皮细胞生长，恢复皮肤功能，减少创面瘢痕，进一步避免多脏器功能衰竭如呼吸窘迫综合征，肠道功能障碍，弥漫性血管内凝血。
现有创面敷料有传统敷料、天然生物敷料、合成敷料。传统敷料包括纱布、棉垫，缺点是粘连伤口，不隔菌，保湿能力差，止血性不好。天然生物敷料包括自体皮、同种异体皮、羊膜、辐照猪皮、无细胞真皮和胶原类，具有来源有限，免疫源性强，携带病原体等弊端。合成敷料以高分子材料为原料，存在生物相容性差，难以降解，毒性强等问题。
自组装短肽(Self-assembly of peptides，简称SAP)RADA16-1是一种含16个氨基酸残基的小分子多肽，其氨基酸序列为AcN-RADARADARADARADA-CONH2(见国际公开号为WO 2005/014615 A2、国际
公开日为2005年2月17日的专利申请)，在公开号WO 2005/014615 A2的专利申请中，仅简要描述了该短肽对切割创伤创面具有修复功能。
发明内容
本发明的目的在于证明自组装短肽RADA16-1在制药中的新用途，为治疗烧伤创面提供一种疗效好的药物。
以往的研究表明(Leila Cuttle，Margit Kempf，Gael E，Phillips，Julie Mill，Mark T.Hayes，JohnF.Fraser，Xue-Qing Wang，Roy M.Kimble..A porcine deep dermal partial thickness burn model withhypertrophic scarring.Burn 2006；32806-820..)，烧伤创面修复不同于切割伤创面修复。因为深II度及III度烧伤及烧伤后伴随的炎症反应、创面感染水肿等并发症可对有机体的表皮、真皮造成毁灭性的损害，在严重烧伤后创面会有一定程度的扩大，烧伤深度会有一定程度进展，这种恶化会延缓创面修复的上皮化进程，而切割伤则不会发生这种现象。烧伤后通过抑制严重的炎症损伤来抑制烧伤深度的进展是十分重要的。
本发明采用调温式电烫仪及火焰烧伤制造大鼠皮肤烧伤模型，以自组装短肽RADA16-1形成的水凝胶及常用的烧伤治疗药物壳聚糖、胶原、聚乳酸为敷料进行实验，实验结果表明自组装短肽RADA16-1可抑制烧伤创面的扩大和水肿、促进烧伤创面胶原的有序重排、促进烧伤创面愈合及皮肤和皮肤组织附属物的再生和修复，能够协调创面表皮细胞生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF)的分泌，与壳聚糖、胶原、聚乳酸相比，对烧伤的疗效更好。
所述水凝胶形态的自组装短肽RADA16-1是由自组装短肽RADA16-1和纯净水制备而成，自组装短肽RADA16-1的质量体积百分比为0.05％～10％，纯净水包括双蒸水、超纯水(电阻18.2KΩ/cm2)。
发明具有以下有益效果1、本发明所制造的烧伤动物模型的优势在于，烧伤创面条件均衡，有利于实验的量化分析及比较，便于在不同时间窗观察受损组织的恢复及再生，通过详尽的病理观察，可清晰显示受损创面炎症渗出(受损创面未切除，这是此模型区别于全层皮肤切除模型的有益效果之一)，炎症细胞聚集，创面胶原修复，再生，重排，以及创周健康上皮细胞爬行生长的动态过程，可评价各种材料对烧伤创面的修复功能。
2、本发明对自组装短肽RADA16-1发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。
3、本发明对烧伤的治疗提供了一种有效的新药品，有利于解除烧伤病人的痛苦，使其早日康复。
图1是自组装短肽RADA16-1组、壳聚糖组、胶原组、聚乳酸组、空白对照组的创面收缩率曲线。
图2是苏木素染色病理照片，其中，A图是正常对照、自组装短肽RADA16-1组和空白对照组在烧伤创面处理后三小时的苏木素染色病理照片，B图中的上部是自组装短肽RADA16-1组第70天的苏木素染色病理照片，B图中的下部是壳聚糖组第70天的苏木素染色病理照片。
图3是用偏振光显微镜观察的深II度烧伤修复各时期I型、III型胶原显示图，图中，(a)为自组装短肽RADA16-1组，(b)为空白对照组，空白对照组和自组装短肽RADA16-1组比较，苦味酸天青石蓝特殊染色I型胶原为红色或桔黄色，强折光性，III型胶原绿色，弱折光性。
图4是烧伤后再生皮肤创面的胶原排列图，图中，(a)为自组装短肽RADA16-1组，(b)为壳聚糖组，(c)为正常对照组，(d)为空白对照组，自组装短肽RADA16-1组创面胶原排列接近正常皮肤，空白对照组和壳聚糖组显示胶原排列无序，有瘢痕化倾向，呈现“纯一化”玻璃样变，缺乏汗腺等皮肤附属物。
图5是碱性成纤维细胞生长因子(FGF)和表皮细胞生长因子(EGF)修复烧伤创面的表达图，图中，(a)和(c)为自组装短肽RADA16-1组FGF表达，(a)为第7天，(c)为第10天，(b)为阴性对照，(d)和(f)分别为空白对照组第7天和第10天FGF表达，(e)为正常皮肤FGF表达，(ghi)是EGF表达，(g)为自组装短肽RADA16-1组第7天，(i)为自组装短肽RADA16-1组第14天，(h)为空白对照组第7天。
图6是原子力显微镜形貌图，(a)自组装短肽RADA16-I 0.5％(5mg/ml)，(b)I型胶原0.5％(5mg/ml)，(c)壳聚糖生物流体敷料(5mg/ml)图7是火焰烧伤形态学照片，左边是空白对照组，右边是自组装短肽RADA16-1组，四张照片均显示烧伤后第四天的创面。
图8是烧伤创面恢复的形态学照片，图中各照片下方为自组装短肽RADA16-1组，上方为壳聚糖组。
图9是烧伤创面上皮化进程动态图，图中，(a)为伤口左端，(b)为伤口右端。
图10是第7天自组装短肽RADA16-I组和空白对照组创面组织HE染色照片，图中，大鼠全层皮肤组织肌肉层下水肿带厚度见黄色箭头所示。
具体实施例方式
1、材料与方法1.1材料1.1.1动物实验动物(SD大鼠)来自华西实验动物中心，体重在200克-290克，实验前让动物在清洁恒温(20℃±2℃)恒湿(湿度50％)饲养室适应一周。共92只动物，其中，80只用于烫伤仪制备烧伤模型，12只采用火焰烧伤制备烧伤模型。
用烫伤仪制备烧伤模型时，按照随机化原则，每种材料每个时间窗3只动物，自组装短肽RADA16-I、壳聚糖、胶原、空白对照组、聚乳酸共5种材料共15只。设计3个时间窗，分别为第7，10，14天，每个时间窗以10％水合氯醛过量麻醉处死。取创面皮肤及创周正常皮肤做HE，mallory(胶原染色)，天狼猩红染色，免疫组织化学染色。另15只动物做创面描记分别记录第4，7，10，14，18，21天的创面收缩。剩下20只动物做第23，28，60，70，80天的空白对照组和自组装短肽RADA16-I组的病理组织观察。
1.1.2实验材料自组装短肽RADA16-1RADA16-1干粉购自3DM Inc(Cambridge，MA)，溶于双蒸水中配制成质量体积百分比1％(10mg/ml)的RADA16-1溶液。
胶原使用I型胶原，I型胶原购自serologicalscompany(Lake Placid，NY)。100mg胶原溶于28.65ml乙酸(0.02N)中，pH调至4.41，使用浓度3.49mg/ml。
壳聚糖使用的是市售商品壳聚糖生物流体敷料(购自浙江省医学科学院科技开发公司)。
聚乳酸使用PLGA 9010(DL-乳酸(90％)-乙交酯(10％)共聚物，[特性粘数]＝1.66，购自Sigma公司)1.2方法实验动物模型以调温式电烫仪、火焰烧伤制造大鼠皮肤烧伤模型。
1.2.1动物实验过程(1)对动物的处理过程包括10％水合氯醛腹腔注射麻醉、备皮、消毒、烫伤制备。以恒温式电烫仪在每只大鼠背部脊柱两侧对称部位制造两个大小、烧伤深度一致的烧伤创面(92℃，8秒，深II度烧伤)。烧伤形成后，分别于烧伤处涂敷上述1.1.2所述的自组装短肽RADA16-1溶液，胶原溶液、壳聚糖生物流体敷料和聚乳酸，每个创面50μl，空白对照组用生理盐水涂敷。之后，薄层凡士林油纱覆盖。术后复苏，抗感染。
(2)火焰烧伤用酒精灯，95％酒精点火，固定大鼠，背部朝下，固定酒精灯和火焰距离，火焰在大鼠背部持续8秒，每只大鼠背部制造一个创面，烧伤形成后，分别于烧伤处涂敷上述1.1.2所述的自组装短肽RADA16-1溶液、生理盐水，形成短肽RADA16-1组和空白对照组，后续处理方法同上。
1.2.2创面描记与结痂、溶痂时间记录于调温式电烫仪烧伤制备当时描记创面原始大小，于第4、7、10、14、18、21天描记当天的创面大小。以透明胶片沿规则的创面边缘描记，用扫描仪扫描胶片，图像处理软件计算创面面积，按照公式“100％×(原始创面面积-实测创面面积)/原始创面面积”计算创面收缩率。各时间窗组间创面收缩率采用多个样本均数间的两两比较q检验。
火焰烧伤后1-7天(急性水肿期)进行创面观察。
每天照像，分别记录每只动物烧伤创面的开始结痂时间和溶痂时间。
1.2.3组织学观察组织学观察时间窗调温式电烫仪伤后第7、8、10、14、21、23、28、60、70、80天，动物分别被过量麻醉处死，取创面皮肤制备组织切片。
1.2.3.1创面I型、III型胶原比例检测(1)分别于各时间窗取烧伤创面皮肤组织，每组各取6个创面；(2)梯度脱水，石蜡包埋，切片，梯度二甲苯脱腊，梯度酒精脱二甲苯；(3)切片于蒸馏水洗3遍；(4)浸入苦味酸天青石兰溶液(浓度0.5％，w/v)；(5)苏木素染色显示细胞核；(6)二甲苯梯度浸泡；(7)树胶封片；(8)Olympus偏振光显微镜观察，显微照相，图像处理软件处理图像，胶原含量以色差对比，I型胶原染成黄色或橘红色，呈强折光性；III型胶原呈绿色呈弱折光性，Image-pro plus图像处理软件处理分析绿色弱折光胶原含量，III型胶原含量为x％，I型胶原含量为(100-x)％，SPSS软件处理。各时间段组间数据处理以独立样本均数单因素方差分析。
1.2.3.2HE病理染色(1)烧伤部位全层皮肤组织切除后脱水，于4％多聚甲醛固定，石蜡包埋；(2)脱腊，浸入脱腊液二甲苯两次，每次各10分钟；(3)100％纯酒精去二甲苯5分钟；(4)95％酒精去二甲苯2分钟；
(5)90％酒精去二甲苯2分钟；(6)80％酒精去二甲苯2分钟；(7)水洗去酒精至无味；(8)蒸馏水洗一次；(9)0.5％苏木素染色，室温5-10分钟；(10)水洗；(11)盐酸酒精分色；(12)氨水促蓝；(13)1％伊红室温染色5分钟；(14)80％酒精分色；(15)90％酒精脱水；(16)95％酒精脱水；(17)100％酒精脱水5分钟；(18)二甲苯透明10分钟；(19)加拿大树胶封片。
1.2.4免疫组织化学染色调温式电烫仪烧伤后第7、8、10、14、21、23、28、60天，动物分别被过量麻醉处死，取创面皮肤制备组织切片。
(1)皮肤组织梯度脱水，石蜡包埋固定；(2)切片，片厚5um；(3)载玻片防脱片处理，5um厚的石蜡组织切片裱于经3-氨基丙基三乙氧硅烷(APES，购自Sigma公司)硅化的切片上，置37℃恒温箱48小时；(4)切片常规脱腊；(5)梯度二甲苯脱腊，梯度酒精脱二甲苯；(6)热修复抗原将切片浸入枸橼酸盐缓冲液，电炉或微波炉加热至沸腾后断电，反复1-2次，冷却后PBS洗涤2次；(7)滴加5％BSA封闭液，室温20分钟，甩去多余液体，不洗；(8)滴加1∶100稀释的一抗(小鼠或兔IgG)，4℃过夜，PBS洗2分钟×3次；(9)滴加生物素化山羊抗小鼠IgG.PBS(pH7.2)洗2分钟×3次；(10)滴加试剂SABC，20-37℃20分钟，PBS洗4次；
(11)DAB显色，使用DAB显色试剂盒；(12)苏木素轻度复染，脱水、透明、封片，显微镜观察，照相，图像处理软件分析创面生长因子表达，以吸光值衡量阳性颗粒在创面组织细胞中的表达。
1.2.5水肿定量测量(1)选取烫伤后3小时及第7天空白对照组和自组装短肽RADA16-I组皮肤标本各6个，制备24张病理切片，HE染色病理切片制备方法同上述；(2)Olympus光学显微镜采取图像，照片放大10倍；(3)采用Image-pro plus图像分析软件计算图像中规定指标长度值，3小时创面标本计算表皮至肌肉层上厚度(见图2)，7天标本计算肌肉层下疏松结缔组织厚度(见图10)；(4)3小时标本分别采集空白对照组和自组装短肽RADA16-I组样本45和57个，7天标本分别采集空白对照组和自组装短肽RADA16-I组样本167和154个；(5)组间对照采用两大样本均数比较的u检验。
1.2.6原子力显微镜观察(1)在新鲜的云母片上涂布5μl，材料，分别为胶原、壳聚糖、自组装短肽RADA16-I；(2)以纯水洗净未黏附的材料；(3)自然晾干一小时；(4)常温下以SPI4000 Probe Station and SPA-400 SPM Unit(Seiko Instruments Inc.，Chiba，Japan)以敲击模式进行。
2、结果2.1创面形态观察结果2.1.1创面描记结果调温式电烫仪制备的动物烧伤模型的创面收缩率计算结果见图1，创面恢复见图8，从图1可以看出，自组装短肽RADA16-1组的创面收缩率高于其它各组，在急性水肿期的第4天、第7天，胶原，壳聚糖，空白对照组由于烧伤创面水肿而呈现创面扩大趋势(创面收缩率平均值呈负值)，自组装短肽RADA16-1组创面在这两个观察窗仍表现为正收缩。21天时，自组装短肽RADA16-1组的创面收缩率高达80％，其它几组的创面收缩率为45％-60％。从图8可以看出自组装短肽RADA16-1组创面收缩、结痂、溶痂情况较壳聚糖组好。
火焰烧伤制备的动物烧伤模型的创面收缩见图7，图7中四张照片显示，自组装短肽RADA16-1组创面收缩较空白对照组显著增快，尤其在烧伤早期收缩显著，在急性水肿期(伤后第4天)，短肽治疗组创面无扩大趋势，而空白对照组创面较原始创面扩大35％～50％(P＜0.05)。
2.1.2结痂、溶痂时间结痂、溶痂时间见表1。
表1结痂、溶痂时间
P＜0.01，*P＞0.05从表1可以看出，自组装短肽RADA16-1组的结痂时间和溶痂时间均短于其它各组。提示短肽处理组烧伤创面皮肤再生速度加快，愈合时间缩短。
2.2组织学观察结果2.2.1创面I型、III型胶原比例检测结果创面III型胶原比例检测结果见表2，创面I型胶原比例则为(100-x)％。创面I型、III型胶原的显示见图3。
表2各时间段修复创面III型胶原含量比例(短肽和空白对照组)
从表2、图3可以看出，自组装短肽RADA16-1组的创面III型胶原比例远大于空白对照组。提示短肽处理组创面增生活跃，修复后期形成增生性瘢痕风险较空白对照组小。
2.2.2HE病理染色结果HE病理染色结果见图2、图4、图9，从图2B上部可以看出，第70天，自组装短肽RADA16-1组可见真皮层皮肤附属物、腺体，毛囊再生丰富；从图2B下部可以看出，第70天，壳聚糖组可见真皮层皮肤附属物，但毛囊缺乏。发明人比较了空白对照组和自组装短肽RADA16-I组烧伤创面的毛囊数，空白对照组新生表皮毛囊数每低倍镜视野0～10个，短肽治疗组每低倍镜视野毛囊数22～44个，P＜0.01。此结果提示短肽使用可促进烧伤创面皮肤组织附属物的再生和修复。
从图4可以看出，第70天，自组装短肽RADA16-1组(a)创面胶原排列接近正常皮肤(c)，空白对照组(d)和壳聚糖组(b)创面胶原排列无序，有瘢痕化倾向，呈现“纯一化”玻璃样变，缺乏汗腺等皮肤附属物。此结果提示短肽使用对促进创面胶原有序重排和皮肤附属组织分化有明显作用。
从图9可以看出，烧伤后坏死表皮脱落，新生的上皮组织沿白细胞浸润带爬行覆盖。清晰地显示烧伤后表皮细胞从皮肤深层分化的上皮化进程。此结果提示，本实验采用的烧伤模型可清楚显示烧伤坏死组织脱落，新生表皮组织分化爬行的各个时期的动态过程。有利于实验的量化分析及比较，并且在不同时间段观察受损组织的恢复及再生，通过详尽的病理观察，可清晰显示受损创面炎症渗出(受损创面未切除，这是此模型区别于全层皮肤切除模型的有益效果之一)。
2.3免疫组织化学染色结果免疫组织化学染色结果见图5，从图5可以看出，自组装短肽RADA16-1组棕色浓染阳性颗粒沉积在表皮细胞、成纤维细胞及腺体上，空白对照组阳性表达率明显低于RADA16-1短肽组(吸光度值)，(P＜0.05)。
发明人应用链霉素过氧化物酶复合免疫组织化学方法检测了创面组织中的碱性成纤维细胞生长因子(FGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的分泌。发现在炎症水肿期及胶原修复期自组装短肽RADA16-1组FGF和EGF这两种生长因子在血管和腺体上的表达明显有所增高(较空白对照)，但FGF没有持续增高的趋势(FGF持续高表达有瘢痕化形成趋势)。提示短肽处理组生长因子表达对创面修复具有良好的调节作用。
2.4水肿检测结果水肿检测结果见图2A和图10，从图2A可以看出，计算烫伤创面处理3小时的创面标本表皮至肌肉层上厚度，发现自组装短肽RADA16-1组几乎与正常对照无差异，而空白对照组与正常对照差异很大，此结果提示自组装短肽RADA16-1可明显抑制烧伤皮肤创面的水肿程度。从图10可以看出，第7天，自组装短肽RADA16-1组的大鼠全层皮肤组织肌肉层下水肿带厚度(黄色箭头所示)明显较空白组减少(P＜0.01，空白对照组皮肤组织呈过渡炎症反应。此结果提示，自组装短肽RADA16-1可明显抑制烧伤皮肤创面修复炎症期的水肿程度。
2.5原子力显微镜观察结果原子力显微镜观察结果如图6、表3所示。
从图6可以看出，自组装短肽RADA16-1(a)可形成均匀粗大的纤维并且保持良好的表面孔隙率，而I型胶原(b)、壳聚糖生物流体敷料(c)则形成不规则的球片状聚集(P＝0.01)。提示短肽RADA16-1作为药物敷料具有良好的透气性能。
从表3可以看出，随着浓度逐渐降低，短肽RADA16-1仍保持良好的纤维状态，且表面孔隙率逐渐下降，而I型胶原、壳聚糖生物流体敷料在浓度逐渐降低的时候不能形成良好的纤维状态，且其表面孔隙率没有随浓度梯度逐渐下降而呈现有规律的变化趋势。提示短肽RADA16-1作为药物敷料在吸收渗液后逐渐被稀释且越接近创面的敷料稀释度越大，形成创面表面由浅入深逐渐减少的浓度梯度变化。
表3随浓度梯度变化纳米级三维支架材料的纤维形态表征(孔隙率)
权利要求
1.自组装短肽RADA16-1在制备治疗烧伤创面的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于自组装短肽RADA16-1为水凝胶形态。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于水凝胶形态的自组装短肽RADA16-1是由自组装短肽RADA16-1和纯净水制备而成，自组装短肽RADA16-1的质量体积百分比为0.05％～10％。
全文摘要
本发明公开了自组装短肽RADA16－1在制备治疗烧伤创面的药物中的应用。本发明采用调温式电烫仪与火焰烧伤制造大鼠皮肤烧伤模型，以自组装短肽RADA16－1形成的水凝胶及常用的烧伤治疗药物壳聚糖、胶原、聚乳酸为敷料进行治疗实验，实验结果表明自组装短肽RADA16－1可抑制烧伤创面的扩大和水肿、促进烧伤创面胶原的有序重排、促进烧伤创面愈合及皮肤和皮肤组织附属物的再生和修复，与壳聚糖、胶原、聚乳酸相比，对烧伤的疗效更好。
文档编号A61P17/02GK101036780SQ20071004897
公开日2007年9月19日 申请日期2007年4月27日 优先权日2007年4月27日
发明者赵晓军, 孟辉, 陈丽艳, 王松涛, 叶朝阳 申请人:四川大学