专利名称：Exenatide在制备用于逆转FFA对P53活化作用的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及化学合成药品艾塞那肽(Exenatide)对肥胖早期游离 脂肪酸(FFA)过多而引起的经由P53途径的几种疾病形成中的预防作 用，其中包括具有胰岛素抵抗的典型2型糖尿病形成以及游离脂肪酸 血症，脂肪性肝病及心血管并发症的形成和发展。
背景技术：
Exenatide是一个新的有医疗价值的治疗2型糖尿病、或葡萄糖调 节活性的药物(Kharroubi，I. et al， Endocrinology,2004,145:5087; Egan J.M, Clocquet A.R,et al，J Clin Endocrinol Metab,2002,87:1282; Kolterman O.G. et al, J Clin Endocrinol Metab，2003,88:3082)。该药物能够增加胰岛 素基因转录和胰岛素的分泌，促进P _细胞增殖/新生和抑制P -细胞凋 亡，恢复和增加P -细胞数量和功能(Chepurny O.G. et al，Endocrinology,2002，143:2303-13)。上述研究已经在链佐霉素诱导的糖 尿病模型和细胞因子诱导的3 -细胞凋亡模型以及在临床研究中得到 确证(Li L. et al，Diabetologia,2005,48:1339-49)。关于2型糖尿病最初形 成的机理尚不十分清楚，但一旦形成2型糖尿病， 一个典型的特征是 由于高血糖造成葡萄糖毒性，并产生氧化应激，从而引起P-细胞凋亡。 葡萄糖毒性作用机理很复杂，已有研究证实Exenatide分别通过蛋白质 激酶A (PKA)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K) /蛋白质激酶B，以及胰岛素/类胰岛素生长因子的信号级联反应胰岛素受体底物2 (IRS2)分 支增强e-细胞的生理功能和e-细胞的增殖(Park S. et al, J Biol Chem.2006,281-2:1159-68; Li LX.et al, Endocrinology,2006, 147-7:3318-25)。
在2型糖尿病机理研究中证实肥胖和异常血脂病(dyslipidemia) 均与2型糖尿病相关(Eldor R. et al. Diabetes Res Clin Pract.2006 74-2:S3-8; Yoo BK. et al. Ann Pharmacother. 2006 40-10:1777-84)。游离
脂肪酸(FFA)作为营养物质提供身体需要的能量，另外，在胰岛素分 泌等各种细胞活动事件中，FFA作为信号分子发挥作用。但是，由于 肥胖病人血浆中存在过高的FFA，胰岛P -细胞长期暴露于过高的FFA 中，^-细胞会以不同的方式逐渐丧失正常的生理功能，从而产生胰岛 素抵抗，也使得胰岛素分泌不足(Karaskov E.et. al. Endocrinology,2006, 147-7:3398-407;Haber，ERet.al Int. Rev Cytol. 2006,248:1-41)。有研究 证实Exenatide对FFA所引起的P -细胞凋亡具有保护作用，其作用机 理主要是通过cAMP/PKA信号途径减弱FFA诱导的P -细胞凋亡(Kwo n G et al，J Biol Chem 2004 279:8938-45)。
然而，并非肥胖病患者都同时患有2型糖尿病。人们发现某些肥 胖病患者虽然呈现胰岛素抵抗特征，但血糖值正常，尚未造成葡萄糖 象性，可以认为过高FFA导致P-细胞功能降低，并呈现逐步凋亡，即 形成2型糖尿病有一个较长的时间过程。如果在此期间利用药物抑制 该过程的发展即可有效地预防FFA所诱导的2型糖尿病的形成。p53 是一个序列特异性的转录因子，该蛋白质的表达在维护基因组稳定性、细胞周期正常运转方面具有重要作用。当细胞遭受各种压力，其中包
括DNA损伤，DNA合成和有丝分裂阻滞，p53被激活，p53的表达激 烈增加，同时引起几个促进细胞死亡的基因表达(Gradzka Let al.Postepy Biochem.2006，52-2:157-65)。在RINm-5F细胞中发现p53蛋白移动进入 线粒体调节由FFA所诱导产生的e-细胞凋亡(Ortega -Camarillo C.et al.Mol Cell Biochem.2006，281:163-71).。
有研究报导过多的FFA将导致P -细胞的DNA损伤。我们研究也 证明在肥胖病的早期FFA造成DNA的损伤，导致p53活化，同时p53 途径被激活，激活的p53途径与体系中形成的ROS协同作用，促进P -细胞凋亡。
通过对RINm-5F细胞的研究证明肥胖早期FFA诱导的p53途径使 P -细胞生长停止和凋亡，Exenatide可防止该过程的发生和发展。
发明内容
本发明提供一种Exenatide在制备用于逆转FFA对P53活化作用的 药物中的应用。
Exenatide在制备用于逆转FFA对序列特异性转录因子P53活化作 用的药物中的应用。
该应用抑制了由FFA引起的P53、 P21、 bax的mRNA表达增加 和bcl-2、 CyclinDl、 CyclinB2的mRNA表达下降。
Exenatide在制备预防肥胖早期经P53途径引起的2型糖尿病的发 生和发展的药物的应用。
本发明以FFA中引起的胰岛瘤细胞RINm-5F细胞凋亡为模型，通过研究Exenatide对胰岛瘤细胞RINm-5F细胞凋亡模型P53 (序列特异 性转录因子)途径的作用，确立了 Exenatide对细胞保护功能和方法， 从而进一步确立早期使用Exenatide对肥胖病人预防2型糖尿病形成的 有效方法。在肥胖患者体内存在过量的游离脂肪酸，该类患者在形成2 型糖尿病之前有相当长时间P -细胞暴露在FFA中，从而引起DNA损 伤，并形成2型糖尿病。
本发明Exenatide的作用是反转了 FFA对P53、 P21和细胞周期蛋 白Dl表达的影响，从而使P细胞从Gl期的积累得到释放。P53和 P21mRNA表达增加，而细胞周期蛋白Dl (CyclinDl)表达降低(当 RINm-5F细胞暴露于FFA中)，引起P53蛋白质表达水平的变化是决 定P -细胞是否停止在Gl期或S期的关键，而P21基因是一个细胞周 期蛋白的依赖性激酶的抑制剂。P21基因表达的激活引发了细胞周期蛋 白D1表达的抑制，从而阻断细胞循环在G1期。也就是说，由于细胞 暴露于FFA中引起DNA损伤，从而激活细胞周期循环调节因子P53 通路，活化的P53引起P21表达增加，继而抑制细胞周期蛋白的表达， 使细胞循环停止在G1期，即细胞生长受到抑制。
本发明Exenatide的作用是保持bax/bcl-2比例正常，抑制了凋亡通 路。FFA增加bax mRNA表达，降低bcl陽2 mRNA表达，艮卩bax/bcl-2 比例的增高，从而导致细胞凋亡。bcl-2蛋白是抗凋亡蛋白家族的成员 之一，位于线粒体膜的外层。另一个基因bax表达产物是前凋亡蛋白 和胞质蛋白，该蛋白质促进细胞蛋白凋亡。bax和bcl-2形成同源共聚 物，bax/bcl-2比例水平与细胞存活相关。前凋亡蛋白是细胞损伤和受压力的传感指标。该聚合物与Bad基因产物结合引起线粒体形成可穿 透的孔，细胞色素c从线粒体膜间隙中释放，导致Caspase-3活化，从 而完成核DNA降解，即FFA引起bax/bcl-2比例增加，引发细胞色素 c释放，激活凋亡途径Caspase-3，导致细胞凋亡。
从肥胖病向2型糖尿病过度过程中FFA水平的增高，并作用于P53 途径，若及时使用Exenatide可有效地对抗FFA对P53途径的作用，抑 制P -细胞凋亡并预防糖尿病的发生。
图1. RT-PCR测定游离脂肪酸及游离脂肪酸和Exendin-4处理48 hRINm-5F细胞对p53, p21, Bax， Bcl-2， cyclinDl and cyclinB2 mRNA表
达的影响。
图2. Real time-PCR定量测定游离脂肪酸及游离脂肪酸和 Exendin-4处理48 hRINm-5F细胞对p53, p21, Bax, Bcl-2, cyclinDl and cyclinB2 mRNA表达的影响。p值小于0.05为统计学有意义(用"*" 代替)而p值小于O.Ol为显著差异(用"**"代替)。
图3. RINm巧F细胞的流式细胞周期图谱。(A)空白对照组；(B)用 0.02 mM的游离脂肪酸分别处理RINm-5F细胞24, 36, 48 h。 (C)用 0.02 mM的游离脂肪酸和O.lmM的Exendin-4共同作用分别处理 RINm-5F细胞24， 36, 48 h。
图4.游离脂肪酸或游离脂肪酸与Exendin-4处理RINm-5F细胞的 p53通路参与的调控示意图。游离脂肪酸能够诱导DNA损伤而激活细 胞周期负调控因子p53，激活的p53 —方面通过提高bax/bcl-2 mRNA表达比例致使细胞色素C释放而将凋亡信号传递给caspase3，最终导 致细胞凋亡；另一面激活的p53通过提高p21 mRNA表达而抑制 CyclinDl的mRNA表达，因此导致细胞周期阻滞而使细胞生长停止。 Exendin-4能够抑制游离脂肪酸诱导的细胞DNA损伤，因此能够抑制 p53信号通路激活而抑制游离脂肪酸诱导的细胞凋亡和细胞生长抑制。
具体实施例方式
下面的实施例，可以更详细地说明本发明，但不以任何形式限制 本发明。 实施例l
Exenatide的固相合成
称取15.4gRink Amide MBHA树脂，并装入肽自动合成仪的反应 瓶中，各氨基酸衍生物、偶联试剂，DMF溶剂分别装入各溶剂瓶中， 设定反应程序并开始合成。反应温度为25°C，偶联反应时间为1小时， 脱除氨基酸a氨基保护基为30分钟，偶联及脱Fmoc基团反应溶剂添 充量为200ml，树脂洗涤次数为3分钟/次X5次。当偶联最后一个氨基 酸反应结束后，用甲醇洗树脂5次，通入N2干燥30分钟。每次偶联 及脱保护反应结束后取出几粒树脂检测反应的完成程度。检测试剂为 A:茚三酮的无水乙醚溶液，试剂B为苯酚的无水乙醇溶液，试剂C 为氰化钾的吡啶溶液。待测几粒树脂放入试管中，分别加入上述试剂 各2滴，12(TC加热5分钟。树脂颗粒呈亮黄色标志偶联完成，树脂变 兰或紫红色标志脱保护反应完成。
以TFA/EDT/苯甲硫醚/茴香醚(92.5: 2.5: 2.5: 2.5)试剂300ml，在N2保护下，25"C反应1小时。过滤，收集滤液。
向反应液中加入冷无水乙醚，于-20。C沉淀20分钟，6000rpm离心 8分钟收集沉淀，再用100ml无水乙醚洗两次后真空干燥，得Exenatide 粗品23.6g，收率为93.7%。
Exenatide粗品配成100mg/ml水溶液，以RP-HPLC纯化，流动相 A为10%乙腈、0.1%三氟乙酸水溶液，B为90%乙腈、0.1%三氟乙酸 水溶液。B乙腈浓度从28%到35%梯度洗脱30分钟，收集产物峰，减 压除去乙腈，冷冻干燥得Exenatide 3.05g，收率为12.1%,纯度为95%。
实施例2
游离脂肪酸FFA (palmitate-pal)复合BSA制剂的制备 游离脂肪酸盐与5%的BSA磷酸盐缓冲液混合，将混合液加入到 含10%小牛血清的细胞培养基中，游离脂肪酸与BSA在培养基中的摩 尔比是6.6: 1 。加入游离脂肪酸BSA混合物后，培养基的PH值不发 生很大变化，未结合的游离脂肪酸在实验过程中保持可溶状态。
实施例3
RINm-5F细胞培养胰岛瘤细胞RINm-5F(ATCC， CRL-11605 , USA) 在RPMI1640介质中含10%胎牛血清，3。/。(v/v)谷氨酰胺，lmM酮戊 二酸钠盐，100单位/ml青霉素，100单位/ml链霉素和最终葡萄糖浓度 达16.8mM培养基中培养。实施例4
Exenatide降低FFA对胰岛瘤细胞影响的作用。
RINm-5F细胞(4-5乂106个细胞)在25cm2培养皿上培养，并分别以 0.02rnM FFA (pal)、 0.02mM FFA禾tl O.lmM Exenatide混合制剂处理细 胞48小时。在6个独立的实验中进行RT-PCR分析p53、 p21、 bax、 cyclinDl 、 cyclinB2、 bcl-2的mRNA表达情况。应用EZ-10 spin column RNA纯化试剂盒，(TaKaRa Code: DRR033A)提取RNA，用TaKaRa RNA PCR试剂盒(AMV) ver(TaKaRa Code: DRRO19A)进行RT-PCR测 定，实验中以e-肌球蛋白表达为对照。为避免基因组DNA干扰检测， 采用所有PCR产物都通过3%凝胶电泳显示，以溴乙锭染色电泳胶。 为更进一步证实在低浓度下FFA对细胞周期调节因子及相关因子的影 响，以及Exenatide降低FFA影响的作用，本发明对上述样品进行定量 Real time PCR的检测。实验是在ABI Prim 7000 real time PCR System 上进行，所用引物列于表1中，并使用TaKaRa real time PCR反应试 剂盒。
0.02mM FFA处理RINm-5F细胞，使细胞周期负调节因子P53， P21，和其相关基因表达发生变化，其中包括bax,bcl-2,CyclinDl和 CyclinB2(图1)，其中P53 ， P21 ， bax mRNA表达增加，而bcl-2 ， CyclinD 1 和CyclinB2表达下降。从图1可见Exenatide抑制了 P53， P21和bax 的增加，也抑制了 bcl-2、 CyclinDl和CyclinB2的mRNA表达下降。 real time PCR定量化上述基因表达的变化结果表明(图2): FFA使P53 增大表达2.77倍、P21增大表达1.98倍、bax表达增大1.80倍。FFA降低bcl-2表达0.38倍、CyclinDl表达0.77倍、CyclinB2为0.73倍。 Exenatide能降低FFA存在时这些基因的mRNA表达，其中P53从2.77 降到1.59倍，P21从1.98到1.22倍，bax从1.80到1.06倍。同时Exenatide
也促进bcl-2表达从0.38到0.78倍、促进CyclinDl从0.77到0.93倍。
表1.PCR基因引物序列_
Genes Amplified length(bp) Sense Antisense
)3-actin
bax
bcl-2
p53
p21
cyclinB2 cyclinDl
138 121 99
121 112
122 147
5'-ctgggtatggaatcctgtggc-3' 5'-cagaggatgattgctgacttgg-3' 5'-ggctgggatgcc加gtg-3' 5 '-cacgcactcaacttccct-3' 5'-cttgtcgctgtcttccactc-3' 5'-ccgacggtgtccagtgat-3' 5'-ctacaggtctgcgaggagc-3'
5'-cctgtcagcgatgcctgggta-3' 5 '-caaagtagaagagggcaaccac-3' 5'-ccagggtgagcagcgtctt-3' 5'-tgtgacttcttgtagatggc-3' 5 '-aaatctgttaggcctggtctg-3' 5'-gcgggtctggctctaact-3' 5 '-catcttagagggcacgaac-3'
实施例5
Exenatide恢复FFA诱导的细胞周期阻滞使RINm-5F细胞周期平 衡的作用。
将RINm-5F细胞放在3个25cm2的培养皿中，其中包括一个对照， 2个实验皿。4小时之后，2个实验皿中的一个改变成2%胎牛血清 RPMI1640介质，其中有0.2mMPal，另一个实验皿加入2%胎牛血清 RPMI1640介质，并含有0.2mMPal和0.1 mM Exenatide。 3个培养皿继 续培养48小时之后，收集细胞，在PBS溶液中(4°C)洗2次。混合 后固定于3ml 75°/。冰乙醇中，随后储存于-2(TC水箱中待用。固定的细 胞(1X 106)以PBS洗2次，并再次悬浮于lml碘化丙啶溶液中(5ug/ml PBS),其中含有5ul无DNA酶的RNA酶A，该细胞在碘溶液中保温 30分钟(室温，暗处)。以流式细胞仪分析该碘化丙啶和绿的GFP荧 光(488nM)。该数据表示为平均+SEM,以Students t-test计算P值，P值〈0.05 被认为有明显差别。为测定FFA和Exenatide是否对细胞循环分布有影 响，我们用流式细胞仪分析了细胞循环中在不同阶段的细胞百分数， 如图3和表2所示，FFA诱导了 P细胞循环G期阻滞。单纯FFA处理 后细胞在G期的积累和细胞在S和G2期的比例降低，但Exenatide加 入后诱导了细胞Gl期瞬时增加，整体Exenatide维持了细胞循环的平 衡，抑制了细胞凋亡。
表2.游离脂肪酸和Exendin-4对RINm-5F细胞作用的流式细胞周期数据
Percentage of cells inapoptosis(
Hours of treatGlSG2
FFA
070.1015.2214.683.02
2473.4916.629.904.35
3679.6812.787,546.08
4883.147.169.7110.29
FFA+Ex4
070.1015.2214.683.02
2471.8013.6914.512.38
3674.0914.0811.830.74
4871.0914.6914.220.5权利要求
1、Exenatide在制备用于逆转FFA对序列特异性转录因子P53活化作用的药物中的应用。
2、 如权利要求1所述的Exenatide在制备用于逆转FFA对序列特 异性转录因子P53活化作用的药物中的应用，其特征在于抑制了由FFA 引起的P53、 P21、 bax的mRNA表达增加和bcl-2、 CyclinDl 、 CyclinB2 的mRNA表达下降。
3、 Exenatide在制备预防肥胖早期经P53途径引起的2型糖尿病 的发生和发展的药物的应用。
全文摘要
本发明涉及一种Exenatide在制备用于逆转FFA对P53活化作用的药物中的应用，属于医药领域。Exenatide在制备用于逆转FFA对序列特异性转录因子P53活化作用的药物中的应用，抑制了由FFA引起的P53、P21、bax的mRNA表达增加和bcl-2、CyclinD1、CyclinB2的mRNA表达下降。Exenatide可预防肥胖早期经P53途径引起的2型糖尿病的发生。
文档编号A61P3/00GK101293090SQ20071005556
公开日2008年10月29日 申请日期2007年4月25日 优先权日2007年4月25日
发明者惟 李, 王丽萍, 洁 陈 申请人:长春百克生物科技有限公司