专利名称：吸附树脂法分离汉防己总生物碱中的单体生物碱的制作方法
技术领域：
本发明涉及高选择性吸附树脂的合成和中药有效成分的分离技术领域。
背景技术：
汉防己为防己科多年生木本藤本植物粉防己的根。防己的英文名Fourstamen StephaniaRoot；处方名防己、汉防己、粉防己、广防己、炒防己、木防己、木防己；商品名汉防己，又名粉防己。防己在我国分布广泛，主产于安徽、浙江、江西等地。在临床应用方面，防己可以用于治疗冠心病、矽肺、肺癌。
汉防己含多种生物碱，已分离出的有汉防己甲素(tetrandrine，汉防己碱，又称汉甲素)、汉防己乙素(fangchinoline，汉防己诺林碱)、汉防己丙素、汉己素(轮环藤酚碱)、汉防己β6以及黄酮甙、酚类、有机酸、挥发油等。汉防己生物碱中含量较高的为汉防己甲素和汉防己乙素，粉防己的块茎中甲素含量约为1％，乙素约为0.5％。随着研究的深入，发现这两种生物碱的功效有一定的差异，汉防己甲素具有解热镇痛、抗炎、利尿及抗过敏性休克、治疗矽肺等作用；汉防己甲素可以逆转GLC-82/ADR耐药肺癌细胞对阿霉素的耐药，下调化疗耐药肺癌细胞MRP蛋白表达，协同阿霉素增强对化疗耐药肺癌细胞凋亡作用[徐萌，周蓓等，汉防己甲素逆转肺癌化疗耐药和凋亡抗性的实验研究，新中医NEW JOURNAL OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE，2006，38(6)90-91]；另外在抗炎、镇痛、降压作用和抗肿瘤等作用方面，汉防己乙素的作用比甲素弱。正是由于二者药效的差别以及用药的质量稳定性考虑，目前的汉防己生物碱制剂均需以汉防己甲素纯度高于98％的提取物为原料，因此分离汉防己生物碱粗提物中的甲素和乙素成为汉防己制剂研究和生产的关键技术。汉防己甲素和乙素都属于双苄基异喹啉类生物碱，分子结构如下 (A)汉防己甲素 (B)汉防己乙素其N原子呈叔胺状态，碱性比较强，亲脂性较强，具有脂溶性生物碱的一般溶解性，但两者分子结构中C7位置取代基的不同，前者为甲氧基，后者为酚羟基，所以汉防己甲素的极性相对较小，能溶于冷苯，而汉防己乙素则因为极性较大，难溶于冷苯，所以目前的分离方法主要是溶剂萃取法[药学保健论坛，中药化学，2007年1月]，以冷苯为萃取溶剂，根据溶解度不同分离甲素和乙素，但是此方法步骤繁杂，且消耗大量强毒性溶剂苯，环境污染较强，生产成本高。另外有文献报道用层析法和高速逆流色谱法分离汉防己甲素和汉防己乙素[徐娟华，姚爱平，调整工艺路线改革天然药物化学实验，实验室研究与探索，2004年，1卷23期；蔡定国等，应用高速逆流色谱分离粉防己主要生物碱，中草药，1993年，24卷7期]，但是上述两种方法成本高，操作复杂，处理量较低，难于得到大量样品，不适于工业化生产。目前也有把吸附树脂用于提取汉防己总碱的文献报道，陶曙红，喻蓉等利用D101大孔吸附树脂和硅胶柱层析进行分离、提取汉防己甲素和乙素，得到纯度较高的汉防己甲素和乙素，得率分别为0.06％，0.016％，总碱含量大于98％[陶曙红，喻蓉，大孔吸阳树脂在提取粉防己中汉防己甲素和汉防己乙素中的应用，时珍国医国药，2005年05期]，但是目前所使用的树脂仍是全聚苯乙烯型或者含有少量的弱极性基团的吸附树脂，此类树脂的疏水作用力很强，对于具有大部分相同疏水结构的汉防己甲素和汉防己乙素具有相同的吸附能力，无法对二者进行有效分离，因此目前未见利用吸附树脂分离汉防己甲素和乙素的文献报道。
发明内容本发明目地是解决现有技术中存在的上述问题，提供一种高选择性的高极性基团含量的聚苯乙烯型吸附树脂，并用于传统中药汉防己中主要两种生物碱-汉防己甲素和汉防己乙素的分离，利用偶极、疏水等多种弱相互作用的协同效应，使树脂对汉防己甲素和乙素的吸附能力产生差别，通过“吸附-梯度洗脱”一个工艺流程即可达到汉防己甲素和汉防己乙素的完全分离。
本发明提供的吸附树脂法分离汉防己总生物碱中的单体生物碱的方法，通过以下步骤实现(1)将汉防己粗提物溶解在2％-5％盐酸的水溶液中，制得上柱液；(2)将高极性基团含量的聚苯乙烯吸附树脂装入吸附柱中，吸附柱的径长比为1∶5-1∶20；(3)树脂的处理量为0.2-0.6mg汉防己粗提物/ml湿树脂；(4)室温下，将上柱液以0.5-3.0BV/小时的流速通过树脂柱，汉防己甲素和汉防己乙素被吸附在树脂上；(5)室温下，以30-50％乙醇水溶液和70-90％乙醇水溶液分步洗脱，分别接收洗脱液，在30-50％乙醇洗脱液中主要含有汉防己乙素，在70-90％乙醇洗脱液中主要含有汉防己甲素；(6)将两部分洗脱液分别经旋转蒸发回收乙醇水溶液、真空干燥，即得所需产品，汉防己甲素和乙素的外观均为白色固体。
上述方法(2)步中使用的高极性基团含量的聚苯乙烯吸附树脂通过以下步骤制备而成
在常温下，将分散剂聚乙烯醇(PVA)或明胶溶解于NaCl的水溶液中，配成0.5％-5％的水相，将水相加热至30-50℃，以丙烯酸甲酯和二乙烯苯的混合物为反应单体(丙烯酸甲酯与二乙烯苯的质量比为1∶2.5-1∶1)，以甲苯和液蜡为混合致孔剂，用量为反应单体质量的80-100％，且甲苯和液蜡的质量比为2∶1-1∶1，以偶氮二异丁氰或过氧化苯甲酰为引发剂，用量为反应单体质量的0.5-2.0％，混合均匀后配成反应的油相。将油相加入水相中，水相和油相的体积比为3∶1，经悬浮聚合，升温至60-80℃反应2-6小时，再继续升温至80-90℃反应3小时；最后经过滤、洗涤处理后得到所需的高极性基团含量的聚苯乙烯吸附树脂。
所述的高极性基团含量的聚苯乙烯吸附树脂的外观特征和结构参数为树脂为球形，乳白色，粒径0.3-1.0mm，比表面积为120-600m2/g干树脂，含水量为50-70％，平均孔径为10-100nm，孔隙率50-65％。
本发明的优点和积极效果本发明根据汉防己总碱中汉防己甲素和汉防己乙素的结构特征，合成了一种以聚苯乙烯为骨架的、高极性基团含量的新型吸附树脂，利用该树脂偶极、疏水等多种弱相互作用的协同效应，可使极性差别极小、分子结构极相似的汉防己甲素和汉防己乙素与树脂的结合力产生差别，通过“吸附-梯度洗脱”一个工艺流程，即可达到汉防己甲素和汉防己乙素的有效分离，解决了现有吸附树脂法只能制备汉防己总生物碱提取物而无法进行汉防己单体生物碱分离的局限，同时也避免现有溶剂萃取分离工艺中使用大量强毒性、易挥发、易燃的有机溶剂且分离工艺烦琐的缺陷，本发明工艺简单，不使用低沸点、强毒性有机溶剂，环境友好，树脂可再生使用，生产成本低，制备的汉防己甲素纯度高于98％，可为进一步的药用研究和制剂生产提供大量试验样品和原料药。
具体实施方式实施例1高极性基团含量的聚苯乙烯吸附树脂的制备常温下，在1000ml三口瓶中将4.8g聚乙烯醇、24gNaCl溶于450g水中，加热至30-50℃。将40g丙烯酸甲酯、40g二乙烯苯、53g甲苯、27g液蜡、0.8g偶氮二异丁氰混合均匀，配成油相。将油相加入水相中，悬浮聚合。首先升温至68℃反应5小时，再继续升温至85℃反应3小时；最后经过滤、洗涤处理后得到所需的吸附树脂，其外观特征和结构参数为树脂为球形，乳白色，粒径0.3-0.7mm，比表面积为428m2/g干树脂，含水量为65.4％，平均孔径为34.8nm，孔隙率61.2％。
实施例2高极性基团含量的聚苯乙烯吸附树脂的制备常温下，在10升三口瓶中将54g明胶、540gNaCl溶于4.8Kg水中，加热至30-50℃。将400g丙烯酸甲酯、600g二乙烯苯、400g甲苯、400g液蜡、10g偶氮二异丁氰混合均匀，配成油相。将油相加入水相中，悬浮聚合。首先升温至66℃反应6小时，再继续升温至85℃反应3小时；最后经过滤、洗涤处理后得到所需的吸附树脂，其外观特征和结构参数为树脂为球形，乳白色，粒径0.3-1.0mm，比表面积为502m2/g干树脂，含水量为62.1％，平均孔径为31.3nm，孔隙率65.4％。
实施例3将汉防己粗提物10.5mg(含汉防己甲素90.5％，汉汉防己乙素5.2％)，溶解于30ml、0.3M的盐酸水溶液中，制成上柱液，将其通过装有上述树脂的树脂柱吸附(树脂柱内径1.5cm，柱长30cm，装有30ml湿树脂)，吸附速度为0.5BV/h，吸附完成后，用30％乙醇和80％乙醇分步洗脱，流速均为0.5BV/h，两部分洗脱液分别蒸干得固体样品，经Waters484高效液相色谱仪检测，30％乙醇解吸液蒸干后的固体中未检测到汉防己甲素，汉防己乙素含量为30.2％，而80％乙醇解吸液蒸干后的固体中汉防己甲素含量为99.1％，汉防己乙素含量为0.8％。
实施例4将汉防己粗提物12.6mg(含汉防己甲素90.5％，汉汉防己乙素5.2％)，溶解于40ml、0.3M的盐酸水溶液中，制成上柱液，将其通过装有上述树脂的树脂柱吸附(树脂柱内径1.5cm，柱长30cm，装有30ml湿树脂)，吸附速度为1.0BV/h，吸附完成后，用50％乙醇和80％乙醇分步洗脱，流速均为1.0BV/h，两部分洗脱液分别蒸干得固体样品，经Waters484高效液相色谱仪检测，50％乙醇解吸液蒸干后的固体中汉防己甲素含量为1.5％，汉防己乙素含量为32.4％，而80％乙醇解吸液蒸干后的固体中未检测到汉防己乙素，汉防己甲素含量为98.6％。
实施例5将汉防己粗提物9.9mg(含汉防己甲素90.5％，汉汉防己乙素5.2％)，溶解于40ml、0.3M的盐酸水溶液中，制成上柱液，将其通过装有上述树脂的树脂柱吸附(树脂柱内径1.5cm，柱长30cm，装有30ml湿树脂)，吸附速度为2.0BV/h，吸附完成后，用40％乙醇和80％乙醇分步洗脱，流速均为2.0BV/h，两部分洗脱液分别蒸干得固体样品，经Waters484高效液相色谱仪检测，40％乙醇解吸液蒸干后的固体中未检测到汉防己甲素，汉防己乙素含量为35.8％，而80％乙醇解吸液蒸干后的固体中未检测到汉防己乙素，汉防己甲素含量为98.8％。
实施例6将汉防己粗提物37.9mg(含汉防己甲素90.5％，汉汉防己乙素5.2％)，溶解于120ml、0.3M的盐酸水溶液中，制成上柱液，通过装有上述树脂的树脂柱(树脂柱内径2.5cm，柱长40cm，装有100ml湿树脂)，吸附速度为1.5BV/h，吸附完成后，用40％乙醇和80％乙醇分步洗脱，流速均为1.0BV/h，两部分洗脱液分别蒸干得固体样品，经Waters484高效液相色谱仪检测，40％乙醇解吸液蒸干后的固体中未检测到汉防己甲素，汉防己乙素含量为32.6％，而80％乙醇解吸液蒸干后的固体中未检测到汉防己乙素，汉防己甲素含量为99.4％。
实施例7将汉防己粗提物15.2mg(含汉防己甲素62.5％，汉防己乙素30.6％)，溶解于40ml、0.3M的盐酸水溶液中，制成上柱液，将其通过装有上述树脂的树脂柱吸附(树脂柱内径1.5cm，柱长30cm，装有30ml湿树脂)，吸附速度为1.0BV/h，吸附完成后，用40％乙醇和80％乙醇分步洗脱，流速均为0.5BV/h，两部分洗脱液分别蒸干得固体样品，经Waters484高效液相色谱仪检测，40％乙醇解吸液蒸干后的固体中未检测到汉防己甲素，汉防己乙素含量为62.6％，而80％乙醇解吸液蒸干后的固体中汉防己甲素含量为98.8％，汉防己乙素含量为0.86％。
实施例8将汉防己粗提物52.3mg(含汉防己甲素62.5％，汉防己乙素30.6％)，溶解于120ml、0.3M的盐酸水溶液中，制成上柱液，通过装有上述树脂的树脂柱吸附(树脂柱内径2.5cm，柱长40cm，装有100ml湿树脂)，吸附速度为1.5BV/h，吸附完成后，用40％乙醇和80％乙醇分步洗脱，流速均为1.0BV/h，两部分洗脱液分别蒸干得固体样品，经Waters484高效液相色谱仪检测，40％乙醇解吸液蒸干后的固体中未检测到汉防己甲素，汉防己乙素含量为58.2％，而80％乙醇解吸液蒸干后的固体中汉防己甲素含量为98.4％，汉防己乙素含量为1.1％。
权利要求
1.一种吸附树脂法分离汉防己总生物碱中的单体生物碱的方法，其特征是通过以下步骤实现(1)将汉防己粗提物溶解在2％-5％盐酸的水溶液中，制得上柱液；(2)将高极性基团含量的聚苯乙烯吸附树脂装入吸附柱中，吸附柱的径长比为1∶5-1∶20；(3)树脂的处理量为0.2-0.6mg汉防己粗提物/ml湿树脂；(4)室温下，将上柱液以0.5-3.0BV/小时的流速通过树脂柱，汉防己甲素和汉防己乙素被吸附在树脂上；(5)室温下，以30-50％乙醇水溶液和70-90％乙醇水溶液分步洗脱，分别接收洗脱液，在30-50％乙醇洗脱液中主要含有汉防己乙素，在70-90％乙醇洗脱液中主要含有汉防己甲素；(6)将两部分洗脱液分别经减压蒸馏回收乙醇、真空干燥，即得所需产品，汉防己甲素和乙素的外观均为白色固体。
2.根据权利要求1所述的吸附树脂法分离汉防己总生物碱中的单体生物碱的方法，其特征是(2)步中使用的高极性基团含量的聚苯乙烯吸附树脂通过以下步骤制备而成在常温下，将分散剂聚乙烯醇或明胶溶解于浓度为5-10％NaCl的水溶液中，配成0.5％-5％的水相，将水相加热至30-50℃，以丙烯酸甲酯和二乙烯苯的混合物为反应单体，其中丙烯酸甲酯与二乙烯苯的质量比为1∶2.5-1∶1，以甲苯和液蜡为混合致孔剂，用量为反应单体质量的80-100％，且甲苯和液蜡的质量比为2∶1-1∶1，以偶氮二异丁氰或过氧化苯甲酰为引发剂，用量为反应单体质量的0.5-2.0％，混合均匀后配成反应的油相；将油相加入水相中，水相和油相的体积比为3∶1，经悬浮聚合，升温至60-80℃反应2-6小时，再继续升温至80-90℃反应3小时；最后经过滤、洗涤处理后得到所需的高极性基团含量的聚苯乙烯吸附树脂。
3.根据权利要求2所述的吸附树脂法分离汉防己总生物碱中的单体生物碱的方法，其特征是所述的高极性基团含量的聚苯乙烯吸附树脂的外观特征和结构参数为树脂为球形，乳白色，粒径0.3-1.0mm，比表面积为120-600m2/g干树脂，含水量为50-70％，平均孔径为10-100nm，孔隙率50-65％。
4.根据权利要求2所述的吸附树脂法分离汉防己总生物碱中的单体生物碱的方法，其特征是所述的分散剂为聚乙烯醇或明胶。
全文摘要
吸附树脂法分离汉防己总生物碱中单体生物碱的方法。包括汉防己粗提物溶解在盐酸水溶液中，室温下通过树脂柱，汉防己甲素和乙素被吸附；以30－50％和70－90％乙醇水溶液分步洗脱，两部分洗脱液分别经减压蒸馏回收乙醇、干燥，即得白色固体，经HPLC测定，第一步洗脱液只含有汉防己乙素，第二步洗脱液中只含有汉防己甲素。本发明利用树脂偶极、疏水等多种弱相互作用的协同效应，可使分子结构极相似的汉防己甲素和乙素与树脂的结合力产生差别，通过“吸附－梯度洗脱”一个工艺流程即可使二者分离，且制备的汉防己甲素纯度高于98％，可为进一步的药用研究和制剂生产提供大量试验样品。
文档编号A61K36/185GK101033229SQ20071005675
公开日2007年9月12日 申请日期2007年2月9日 优先权日2007年2月9日
发明者王春红, 施荣富, 夏建军, 任萍 申请人:南开大学