专利名称：一种筛选活性组分或物质的方法及依其制得的活性组分的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选、分离活性组分或物质的方法及依其所得的活性组分，特别涉及一种结合生物传感器技术和分离技术，从天然药物中筛选、分离具有结合PBP2a活性组分或活性物质的方法，以及采用该方法从天然药物中筛选、分离得到的能与PBP2a发生结合作用的活性组分。
背景技术：
国内外研究经验表明，从来自于天然的先导化合物中很有希望得到治疗疑难病症的新药，从天然化合物筛选得到的有效单体的命中率比合成化合物高。临床及实验研究表明，某些天然药物制剂可通过各种机制发挥对症病中病原分子的治疗作用，但由于天然药物组成成分复杂，尤其是受方法学的限制，天然药物中具有抗病原分子作用的有效物质基础尚不清楚。
例如耐甲氧西林金葡菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus，以下简称MRSA)感染已成为全球性问题，其感染率逐年上升，不仅对β-内酰胺类抗生素均耐药，而且对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹诺酮类、磺胺类、利福平均产生不同程度的耐药，甚至出现了耐万古霉素金葡菌。
葡萄球菌是引起院内感染最重要的病原菌，根据有无凝固酶可将葡萄球菌分为凝固酶阳性菌(主要为金黄色葡萄球菌，staphylococcus aureus，SA)和凝固酶阴性菌(coagulase-negative staphylococcus，CNS)。金黄色葡萄球菌(金葡菌)是临床上最常见的毒性较强的致病菌之一。20世纪30年代末，磺胺药物首次用于治疗金葡菌感染性疾病，由于细菌耐药性的产生使其广泛应用受到限制。20世纪40年代初青霉素问世后，金葡菌引起的感染性疾病曾受到较好的控制，但随着青霉素的广泛使用，有些金葡菌产生青霉素酶水解β-内酰胺环，表现为对青霉素的耐药。因而人们又研究出一种新型的耐青霉素酶的半合成青霉素，即甲氧西林，1959年应用于临床后曾有效的控制了金葡菌产酶株的感染，但1961年英国Jevons首次发现了MRSA。MRSA与其他葡萄球菌具有相同的毒力和致病力，在美国许多家医院，临床分离的金葡菌中MRSA所占的比例逐年攀升，从1975年占2.4％，到1991年占29％，2002年已达50％。尤其是当氟喹诺酮类药物应用于临床后，迅速出现的金葡菌耐药株中MRSA的比例急剧上升。
MRSA感染最大危害在于它是医院感染的重要病源，院内一旦发生流行，往往迅速传播，较难控制。随着时间的推移，这种耐药菌逐渐从医院扩散至社区中，1999年，美国发生首例由于社区获得性MRSA感染所致的死亡事件。目前，MRSA已成为院内外感染的重要致病菌之一。MRSA不再仅从医院内获得，社区获得性MRSA(community-acquired MRSA，C-MRSA)感染也同样常见。在美国社区获得性MRSA感染病例逐年增多，1980～1981年美国底特律市还出现了社区获得性MRSA感染的爆发，患者中2/3为静脉药物使用者，1995年有报道41％的MRSA感染来源于院外。1998～1999年我国9大城市MRSA社区获得感染患者的检出率亦达21.84％(19/87)。
2002年6月在美国出现了第一例万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌(vancomycin-resistant staphylo-coccus aureus，以下简称VRSA)的报道，同年9月再次报道一例，这两例VRSA均检出mecA基因与vanA基因，分别决定耐甲氧西林与耐万古霉素的特性。国内尚未见到万古霉素中介敏感的金黄色葡萄球菌(vancomycin-intermediate staphylococcus aureus， VISA)或VRSA的报道，但在我国细菌耐药监测中心调查中，观察到1994～2000年万古霉素对MRSA抑菌圈呈缩小趋势，提示其敏感性较前有所下降，随着选择压力的不断增大，VISA、VRSA的出现是不可避免的。有入认为，MRSA感染与乙肝、AIDS同为当今世界三大感染性疾病。
MRSA耐药特点为不均一耐药性和多重耐药MRSA耐药性的表达分为同质性和异质性两种。同质性耐药菌株表现为所有细菌为单一性耐药的群体，而异质性耐药菌株则在同一群体中有2个或2个以上耐药程度不同的业群体，其中仅有极少部分菌株表现出高度耐药。MRSA除对甲氧西林耐药外，对其他所有与甲氧西林结构相似的β-内酰胺类抗生素均耐药，MRSA还可通过改变抗生素作用靶位，产生修饰酶，降低膜通透性，产生大量对氨基苯甲酸等不同机制，对氨基糖苷类、大环丙酯类、四环素类、氟喹诺酮类、磺胺类、利福平均产生不同程度的耐药。
MRSA耐药机制很复杂，MRSA的耐药性来源于(1)质粒介导产生的β-内酰胺酶，属获得耐药，来源为DNA的转导、转化、或其他类型的DNA插入，其表达受BlaR-BlaI-BlaZ调控；(2)染色体DNA介导的固有耐药性，主要是由于mecA基因编码的MecR-MecI-MecA调控的青霉素结合蛋白PBP2a，后者在MRSA耐药中起主要作用。mecA基因大量表达一种特殊的青霉素结合蛋白PBP2a，PBP2a与β-内酰胺类抗生素结合活性很低，可替代高亲和力的青霉素结合蛋白(penicillinbinding proteins，以下简称PBPs)行使功能，是引起β-内酰胺类抗生素耐药的主要原因。
PBPs是一种源于丝氨酸蛋白酶的膜结合转肽酶，催化肽聚糖中五甘氨酸间桥一端肽链上的L-赖氨酸与另一端肽链上的D-丙氨酸-D-丙氨酸的连接，使胞壁酸短链间相互连接，从而构成细胞壁肽聚糖的多层网状立体结构。金葡菌的耐药株和敏感株都产生4种主要的青霉素结合蛋白PBP1、PBP2、PBP3和PBP4，分子量分别约为85、81、75和45kd。MRSA对β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制是由于过度表达一种外源性的低亲和力的青霉素结合蛋白PBP2a。PBP2a是一种可以诱导的蛋白质，当有适当浓度抗生素存在时，其他PBP被β-内酰胺类抗生素抑制，PBP2a替代正常PBPs继续催化粘肽的交联，使细菌得以生存。MRSA的均一性耐药(同质性耐药)及高水平耐药需要有PBP2a足够的表达量、理想的肽聚糖前体物质形成率以及前体物特定的结构。PBP2a约含有668个氨基酸，相对分子质量为78×103KD。该蛋白由N-末端跨膜区、非青霉素结合区和转肽酶区三部分组成。第1～23位氨基酸为N-末端跨膜区，将PBP2a锚定于细胞膜表面；第27～326位氨基酸为非青霉素结合区，其功能目前还不清楚；第327～668位氨基酸为转肽酶区，内含β-内酰胺类抗生素作用位点，含有PBP转肽酶或丝氨酸β-内酰胺酶共有的折叠结构。但PBP2a具有独特的位于一个α螺旋的丝氨酸活性部位(Ser403-Thr-Gln-Lys406)，位于一个狭窄α螺旋的沟里，阻碍活性部位丝氨酸与β-内酰胺类抗生素的接触。
PBP2a是MRSA对-内酰胺类抗生素主要耐药机制，从分子水平了解MRSA的耐药性，必须认识三个相关因子mec-MRSA的遗传决定子；mecA-MRSA的主要耐药因子；mecI(抑制)-mecR1(诱导)-MRSA的耐药调节因子。
mec基因为MRSA所特有，敏感菌(methicillin-sensitive staphylcoccusaureus，MSSA)不具有此基因。mec基因为大小约30～50kb的外源性染色体片段，位于在pur-nov-his基因簇附近，mec片段中包含青霉素结合蛋白PBP2a的结构基因mecA，控制mecA基因转录的调节因子mecI和mecR1以及20～45kb的mec相关DNA。mecA基因编码PBP2a，为4.3kb大小的DNA片段，位于一个独特的可移动的遗传因子-葡萄球菌mec染色体盒上(staphylococcal cassette chromosomemec，SCCmec)。mecA编码产生PBP2a，其来源目前尚不清楚，但不同菌株的mec片段均插入在Sma I-G段上编码A蛋白的spa基因和腺嘌呤生物合成必须的purA基因之间。mecA的转录受两套调控系统控制，即mecA调控系统和β-内酰胺酶调控系统。在mecA上游区有一操纵基因(mecR1和mecI)，mecI编码抑制蛋白MecI，mecR1编码诱导蛋白MecR1，其中MecR1是细菌产生PBP2a所必需的。MecR1接触到诱导物时，结合而被活化。一般地，MecI与mecA处于结合状态，抑制其转录活性，活化的MecR1可直接或间接破坏MecI与mecA的结合，去抑制的mecA经RNA多聚酶转录，翻译产生PBP2a。携带mecI和mecR1操纵基因的MRSA具有缓慢诱导的、低水平的甲氧西林耐药性，有时表现为临界耐药性(borderlineresistance)。在高度耐药株中，mecA操纵基因的mecR1部分缺失，PBP2a的产生不受操纵基因控制，但菌株质粒的β-内酰胺酶调控蛋白Bla I、BlaR1的作用与MecI、MecR1的作用完全相同，mecA受Bla I和BlaR1的调节产生可诱导的耐药。
如此众多的调控机制使MRSA的治疗问题非常棘手。万古霉素曾是治疗MRSA感染的理想药物，但随着万古霉素的广泛应用，已出现一些耐万古霉素金黄色葡萄球菌的报道，因而寻找新的治疗方法就十分必要。PBP2a作为MRSA的主要耐药机制，以PBP2a为靶点的防治研究正在广泛开展，近年来一些新的抗MRSA抗生素研究陆续有报道，包括β-内酰胺类，其中有头孢菌素类(BMS-247243、BAL 9141、RWJ-54428、S-3578、NB2001)、新碳青霉烯类(Cs-023、J-111，225、J-114，870和J-114，871)、甘氨四环素类(GAR-936)、十七糖酐(saccharomicins A和B)、糖肽类(oritavancin、dalbavancin)、肽聚糖合成的抑制剂(katanosin B和plusbacin A3)、脂肽类(达托霉素、雷莫拉宁)，这些药物在以下方面有所进展(1)提高抗菌活性；(2)克服产β-内酰胺酶的耐药机制；(3)阻碍了细胞壁的形成，但都不能根好地与PBP2a结合。目前尚没有单独的PBP2a抑制剂，因此可以寻找合适的与PBP2a高亲和力的物质来有效地、竞争性地抑制PBP2a的结合位点使其活性降低或失活、协同β-内酰胺类抗生素应用后恢复MRSA对β-内酰胺类抗生素的敏感性。
光学生物传感器是现代生物和物理技术相结合的产物，其主要原理是激光以一定的角度范围照射棱镜，其中某一特定角度的光线(共振角度)，通过低系数偶联层进入共振层并进行光线放大。在共振层内放大的光线能够敏感地检测到传感器表面的生物分子之间的作用信息。通过样品池上固定的已知物，可以判断出一种待测物(如单干克隆抗体)在不同浓度、或混合物(如多克隆抗体)在一定浓度条件下，监控和定量生物分子间的相互作用，相互作用力及作用强度。通过共振传感器，能够直观、快速地反映出它们之间的反应动力参数，并通过系统的反应体系，运用FASTfit数据处理程序，精确地计算出结合平衡态参数和浓度。
天然药物在我国具有得天独厚的资源优势，其品种多，药理作用复杂，人们应用天然药物抗感染也有久远的历史。大黄、诃子、黄连等天然药物具有明确的抗菌抗炎作用，诃子、丹皮、黄连、厚朴、夏枯草等天然药物对MRSA有不同程度的体外抗菌活性，国内外研究经验表明，从来自于天然的天然药物中很有希望得到治疗MRSA感染的新药，从天然药物中筛选得到的有效单体的命中率比合成化合物高。同时，临床及实验研究表明，内服或者外敷某些天然药物制剂治疗MRSA感染，但由于天然药物组成成分复杂，尤其是受方法学的限制，天然药物中抗MRSA感染的有效物质基础尚不清楚。如果用分子克隆技术获得PBP2a并以此为靶点，以博大精深的中医天然药物理论为基础，应用现代生物技术对种类繁多的天然药物成分进行高通量筛选，无疑是寻找PBP2a抑制物的一个快速、准确的途径，PBP2a抑制物的获得将极大地缓解目前MRSA严峻的耐药局势。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种结合生物传感器技术和分离技术、从天然药物中筛选、分离具有结合PBP2a活性组分或活性物质的方法。其具有操作简单、省时、准确、稳定可靠等优点，可适用于高通量筛选和分离提取具有结合PBP2a作用的天然药物有效成分。
本发明的另一个目的是通过对黄连根或须的分离提供能与PBP2a发生结合作用的活性组分，为药物单体的进一步研究提供实验依据，也为药物研发和生产减少资源的浪费。
本发明的另一个目的是提供上述活性组分在制备协同β-内酰胺类抗生素治疗MRSA感染的药物或先导化合物中的用途。
本发明一方面提供一种结合生物传感器技术和分离技术、从天然药物中筛选、分离具有结合PBP2a活性组分或活性物质的方法。该方法的原理是通过利用光学原理的光学生物传感器技术，在生物传感器的样品池表面包被固相受体，当受体与其流动相的配体发生结合作用时，以共振角度进入光线衰减区的激光就会发生共振角度的改变，这一变化通过计算机处理(内含fastplot和fastfit程序)后就可以检测到传感器表面受体与其配体分子之间的相互作用及亲合力。通过特异性的洗脱及回收，即可得到纯度极高的配体分子。其包括以下步骤(1)将PBP2a直接包被于生物传感器的羧基化样品池或生物素化的PBP2a包被于生物传感器的亲和素化样品池作为固定相配基，使PBP2a结构上发挥重要生物学作用的C末端外露并游离，以此作为天然药物中活性物质与固定相发生结合作用的靶点；(2)以待筛选的天然药物提取物溶液为作为流动相，利用上述生物传感器使其与上述固定相配基作用，筛选能够与PBP2a发生结合作用的天然药物或天然药物提取物；(3)将筛选出的与PBP2a具有较强结合活性的天然药物提取物，经柱层析法和/或高效液相色谱法进行分离纯化，对所得到的不同纯化组分再通过生物传感器进行至少一次结合活性的检测，得到能与PBP2a发生结合的活性组分或单体化合物。
MRSA的主要耐药机制与其mecA基因编码的PBP2a(也称为PBP2’)密切相关，该蛋白由668个氨基酸组成，分子量为76.1kDa，对所有β-内酰胺类抗生素亲和力低，而天然药物提取物中与之结合的活性物质通过阴阳离子的静电势作用结合后具有中和作用，即改变了病原分子的特性从而减弱或消除MRSA的生物学活性。
根据本发明的一实施例，上述PBP2a由MRSA来源的DNA经常规基因工程方法将其在大肠杆菌中表达后分离纯化制得。
优选地，上述靶点为耐药性金黄色葡萄球菌PBP2a的第27～668位氨基酸或第327～668位氨基酸。
根据本发明一实施例，在将PBP2a包被于生物传感器的样品池之前，还可以包括PBP2a生物素化的步骤，其采用生物素化试剂BAC-SulfoNHS，通过与可溶性PBP2a片段上的游离氨基端形成稳定的酰胺键完成。
上述生物传感器优选为亲和型生物传感器或特异选择性生物传感器，更优选地，也可以为亲和型特异选择性生物传感器IAsys Plus。
根据本发明的一实施例，上述PBP2a的包被包括以下步骤(1)以PBST反复清洗样品池，至基线平衡；(2)向样品池PBST中加入亲和素；(3)PBST反复清洗，加入生物素标记的PBP2a；(4)PBST清洗2-5次后，采集数据曲线3～10min，计算包被值。
上述天然药物的提取物优选为水提取物和/或有机溶剂提取物。
上述柱层析法优选为离子交换柱层析或硅胶柱层析。
上述高效液相色谱法优选为反相高效液相色谱法或正向高效液相色谱法。
当上述靶点是PBP2a的全片段蛋白或者其c-末端时，上述作为流动相的天然药物为具有抗炎作用的天然药物，其抗炎基础在于本身含有可与PBP2a结合的活性组分，上述活性组分通过静电势作用实现与PBP2a发生特异性结合作用。
上述具有抗炎作用的天然药物为毛冬青、金荞麦、雷公藤、黄药子、五倍子、半枝莲、山豆根、黄连、草果、核桃根等115种天然药物(见下表1)中的一种或一种以上的组合。
表1 抗炎天然药物名称及优势产地
上述从天然药物中筛选、分离活性组分或活性物质的方法，可以是从具有抗菌/抗炎的然药物中筛选、分离并具有治疗MRSA感染作用的能结合PBP2a的有效组分或活性物质，具体可以包括以下步骤(1)PBP2a的生物素化严格按照Sigma公司试剂盒说明书及Thermo公司生物素样品池包被说明书操作用30ul DMSO 溶解 BAC-Sulfo NHS1 支，再加0.1MPBS 1ml，立即取出10ul加入0.2ml(8mg/ml)的PBP2a中；室温轻柔振荡30min，将微量层析柱处理后，加入上述的PBP2a，700gx 2min离心，收集管底溶液即为纯化的生物素标记的PBP2a。
(2)根据亲和型特异选择性生物传感器IAsys plus(Affinity-sensor IAsys plus)生物素板样品池的包被流程，将PBP2a包被在样品池中，并计算包被的PBP2a的量，具体如下①仪器包被温度设定为20℃～25℃，搅拌速率设定为85次/秒，数据采集为1次/秒；②放入样品池，50μlPH7.4的PBST清洗3次，平衡基线10min后再收集数据曲线3min；③向样品池PBST中加入2mg·ml-1的亲和素20μl，留置10min；④PBST清洗3次，采集数据曲线3min；⑤加入生物素标记的PBP2a 5μl，留置10min；⑥PBST清洗3次，采集数据曲线5min；⑦计算包被值；⑧检查包被后的共振图形；在样品池中包被PBP2a。
(3)回收与PBP2a结合的物质①将黄连根或须5～10μl提取液加入样品池；②与PBP2a的结合、解离反应；③分别用亲合反应液反复冲洗，盐酸溶液梯度洗脱，平衡后吸出再生反应液；④回吸收的再生反应液用NaOH调至pH接近7.0后，冷冻抽干，作为下一步分离的参考标准品。
(4)离子交换柱或硅胶柱流出组份与PBP2a结合①pH3～5的黄连根或须提取液静置2～3小时后离心弃沉淀；②上清加入pH6.0～7.0的双蒸水复溶；③HCl滴定调整pH值为6.0～6.5；
④静置2～3小时后离心收集上清；⑤过离子交换柱或硅胶柱层析，收集与PBP2a具有高结合活性的组分，旋转蒸发浓缩，低温冷冻抽干即得到与PBP2a高结合的天然药物活性成分。
(5)高效液相色谱分离与制备将所得到的天然药物活性成分用高效液相色谱法进行进一步的分离，收集与PBP2a具有高结合活性的组分，对所得到的组分进行纯度检测。
本发明的另一个方面，是提供一种能与PBP2a发生结合作用的活性组分，其采用上述方法从天然药物，优选为从黄连中筛选、分离得到，该组分的制备方法包括以下步骤(1)黄连根或须提取液经过与PBP2a的结合、解离反应后，分别再用亲合反应液反复冲洗，经盐酸溶液洗脱、再生后，将回吸收的再生反应液pH调为中性，冷冻抽干；(2)应用生物传感器的回收功能，通过洗脱，得到各梯度洗脱组分，对这些组分进行PBP2a结合测定，取与PBP2a结合力最高的组分；(3)将上述所得与PBP2a结合力最高的组分提取液pH值调至3.0～5.0，静置后取上清液过离子树脂，收集滤过峰、双蒸水洗脱峰和氨洗脱峰，浓缩，低温冷冻抽干；(4)分别取适量上述提取物冻干粉末，以生物传感器检测各组分与PBP2a的结合力，取结合力最高的氨洗脱峰对应的提取液；(5)上述氨洗脱峰提取液静置后离心弃沉淀，上清液调整pH值为6.0～6.5，静置后离心，合并两次上清液，上清液上硅胶柱，以不同浓度的氯仿和乙醇洗脱，并分别收集洗脱液A、B、C，浓缩，低温冷冻抽干；(6)分别取适量上述洗脱液A、B、C的冻干粉末，测定其与PBP2a的结合力，取结合力最高的C组分；(7)将上述与PBP2a结合力最高的C组分进行高效液相色谱分离，色谱条件色谱柱柱温25℃，流速15ml/min，进样浓度200mg/ml，检测波长275nm，分别收集流出峰，负压抽干；
(8)以生物传感器测定上述各流出峰与PBP2a的结合，结果95.0～100.0min流出峰的结合力最大，此流出峰对应的组分即为能与PBP2a发生结合作用的活性组分HL2。
上述活性组分具有以下生物活性性质(1)该组分与PBP2a具有较高的亲合力，其Kd值为3.0～3.5×10-6M；(2)该组分在体外实验中与青霉素等β-内酰胺类抗生素联用能降低β-内酰胺类抗生素对MRSA的最低抑菌浓度(MIC)，并能够抑制由MRSA介导的TNF-α和/或IL-6的释放；(3)该组分联用β-内酰胺类抗生素对LD100 MRSA攻击动物具有显著的保护作用，并呈明显量效关系；(4)该组分对LD100大肠杆菌攻击动物具有显著的保护作用，并呈明显量效关系。
本发明还有另一个方面，就是提供上述活性组分在制备协同β-内酰胺类抗生素治疗MRSA感染的药物或先导化合物中的应用。
按照本发明的方法以PB2a为靶点，从天然药物中筛选、垂钓，并定向分离具有结合PBP2a的天然药物活性组分，具有简便、快捷、稳定可靠的优点，目前国内外尚未见类似的研究。
本发明相对于传统方法具有以下有益效果，①省时传统方法判定一个物质的结合PBP2a功能最少需要约60分钟，本发明最多需10分钟。②省力对测定的物质不需要特殊处理。③特异性强即只选择与PBP2a结合的物质。④结果准确由于天然药物化学成份复杂，行抗菌实验时易被污染、产生干扰，假阴性、假阳性高，本发明不需要其它的成份，特异性高，因此结果准确。⑤实时监控传统的有效组分的分离由于不能建立特异性的筛选、分离靶点，因此有时需要最后才能进行结果判定，而本方法可以随时取样测定与结合PBP2a亲和力。同时由于可以微量回吸收与结合PBP2a结合的成份进行分析，为下游分离工作提供了指导。而传统的方法在分离的早期无法达到这一目的。
以下结合附图及具体实施例对本发明进行进一步说明。
图1表示PBP2a包被生物素板反应曲线。
图2A及2B表示115种中药与PBP2a的结合反应曲线。
图3表示定量消耗后25种中药提取液与PBP2a结合物质的含量变化图。
图4表示黄连过大孔阳离子树脂色谱制备图。
图5表示黄连过大孔阳离子树脂各组分与PBP2a结合力。
图6表示黄连过硅胶柱色谱制备图。
图7表示黄连过硅胶柱各组分与PBP2a结合力。
图8表示高效液相色谱分离制备图。
图9表示高效液相色谱分离各组分与PBP2a结合力。
图10表示组分HL2和PBP2a的FASTfit解离常数计算图。
图11表示组分HL2对细胞活力影响的测定(MTT法)。
图12表示组分HL2联用氨苄青霉素对LD100 MRSA攻击小鼠具有显著的保护作用。
具体实施例方式
下面参照附图并结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解的是，这些实施例是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进，都属于本发明要求保护的范围。
本发明可以采用如下技术方案(1)采用的PBP2a是从基因工程菌中分离提纯的可溶性PBP2a片段，生物素化试剂BAC-SulfoNHS通过与可溶性PBP2a片段上的游离氨基端形成稳定的酰胺键将其生物素化，继而使其成功地包被于生物素样品池表面，为实验提供了可靠的作用靶点。
(2)按照Thermo公司生物传感器操作说明，将PBP2a包被于生物传感器的样品池，本技术方案中所用的生物素样品池的表面为一层生物素，包被时先在样品池内加入亲和素，与生物素特异性结合，然后再加入生物素化的可溶性PBP2a，PBP2a通过标记的生物素再与样品池表面的亲和素结合构成夹心形式从而包被于样品池表面，用于和配体结合；根据包被图形即可知道的包被量，即建立天然药物的筛选靶点。以此包被的外露亲水端，从具有拮抗MRSA作用的天然药物提取液内垂钓与PBP2a结合的物质，并选择0.01M的HCl做为特异性洗脱液，回收到微量与PBP2a较高结合的物质。虽然与PBP2a结合的成分不只一种，但是通过特异性的梯度洗脱，便可能得到纯度较高、结合力较高的结合组分。
(3)通过对回收物进行再次的结合反应测定、PBP2a消耗试验和紫外扫描，得到对所需物质的初步吸收峰值，特别是对活性基团吸收峰值的确定，为下游的硅胶柱层析和高效液相色谱(HPLC)制备提供参考标准。
(4)硅胶柱层析和HPLC分离单体化合物，得到并明确一个与PBP2a具有高亲和力的组分HL2。在每一步组分的分离过程中，都可以利用与待分离成份与PBP2a的亲和力以监控该成份的存在的部位。
本发明还通过补充实验测定组分HL2与PBP2a的结合活性；HL2对MRSA引起的巨噬细胞产生TNF-α和/或IL-6的抑制；组分HL2联用β-内酰胺类抗生素对LD100MRSA攻击动物具有显著的保护作用，研究其用于治疗脓毒症感染。
实施例1样品池的包被1.1实验方法PBP2a的生物素化严格按照Sigma公司试剂盒说明书操作用30ul DMSO溶解BAC-Sulfo NHS 1支，再加0.01M PBS 1ml，立即取出10ul加入0.2ml(8mg/ml)的PBP2a中；室温轻柔振荡30min，将微量层析柱处理后，加入上述的PBP2a，700gx2min离心，收集管底溶液即为纯化的生物素标记的PBP2a；根据Thermo公司亲和型特异选择性生物传感器IAsys plus(Affinity-sensorIAsys plus)生物素板样品池的包被流程，将PBP2a包被在样品池中，并计算包被的PBP2a的量，具体操作如下①仪器包被温度设定为20℃～25℃，搅拌速率设定为85次/秒，数据采集为1次/秒；②放入样品池，50μlPH7.4的PBST清洗3次，平衡基线10min后再收集数据曲线3min；③向样品池PBST中加入2mg·ml-1的亲和素20μl，留置10min；④PBST清洗3次，采集数据曲线3min；⑤加入生物素标记的PBP2a 5μl，留置10min；⑥PBST清洗3次，采集数据曲线5min；⑦计算包被值；⑧检查包被后的共振图形；在样品池中包被PBP2a；1.2实验结果包被后的共振图像为对称的单峰图形(见图1)，证明所包被的PBP2a在样品池中分布均匀。A、B两点间差的绝对值即为在样品池中的包被量，分别为202.82arc second(response unit，RU)，包被量则约为0.37ng·mm-2(600arc second≈1ng·mm-2)，符合实验要求。
实施例2115种天然药物提取液与PBP2a的结合反应测定结果2.1实验方法制备115种天然药物提取液，分别取5μl上样，测定其与PBP2a的结合反应，检测方法同上。
2.2实验结果毛冬青、金荞麦、雷公藤等25种中药水提物与PBP2a的结合值大于100RU。图2A及2B的结果显示，天然药物与PBP2a结合存在较大的差异，(RU0 arc second～281arc second)，说明可能这些天然药物能结合PBP2a作用的物质存在较大的差异。
实施例3中药与定量PBP2a的消耗实验3.1将筛选出的亲和力较高的25中药粉碎后准确称取2g等量分装两组试管并编号，第1组加入10ml蒸馏水100℃水浴1h，待冷却后5000r/min离心3min留取上清备用，样品最终生药浓度为1g·ml-1；取水提液样品100μl，等分为两组装于经60Co辐照的EP管，第1组分别加入等体积50ng·ml-1的PBP2a用以消耗样品中的部分活性物质，第2组加入等体积生理盐水做为对照组，将两组样品充分混合后37℃水浴30min，冷却后4000rpm离心5min，取上清液再次测定与PBP2a的结合活性。
3.2实验结果如图3所示，与对照组的结合值相比，消耗组结合值均有不同程度的降低，进行消耗实验后25种中药与PBP2a结合的物质含量均有不同程度的下降。其中雷公藤、金钱草等中药与定量PBP2a作用后，与PBP2a结合的物质含量明显降低，消耗率皆大于70％，有效成分消耗较多；黄药子、五倍子、半枝莲等7种中药则仍具有较高的与PBP2a结合的物质含量，有效成分消耗较少。
实施例4黄连根或须结合PBP2a组分的分离研究4.1回收与PBP2a结合的物质4.1.1实验方法黄连根或须5μl提取液加入样品池，经过与PBP2a的结合、解离反应后，分别再用亲合反应液反复冲洗，盐酸溶液梯度洗脱，平衡后吸出再生反应液，0.1M的HCl再生反应，回吸收的再生反应液加入NaOH调pH为中性，冷冻抽干，然后用化学法对再生反应物质进行初步定性。
4.1.2实验结果应用生物传感器的回收功能，通过非特异的洗脱去除无效组分，再经特异性的梯度洗脱，将与PBP2a结合的物质从样品池表面洗脱下来，最后将各梯度洗脱组分再次进行与PBP2a的结合测定，结果显示0.01M的HCl特异性洗脱液回收的物质(其中主要含有酸碱中和后的盐成分)与PBP2a结合力最高。该组合物初步确定为生物碱类物质。
4.2大孔阳离子树脂层析分离4.2.1实验方法黄连提取液(调pH 3-5)静置2小时后离心弃沉淀，上清过大孔阳离子树脂(pH 6.0-7.0)，收集滤过峰、双蒸水洗峰和氨洗峰，旋转蒸发浓缩，低温冷冻抽干，取适量冻干粉行生物传感器检测各组分与PBP2a的结合力。
4.2.2实验结果图4示黄连过大孔阳离子树脂色谱制备图、图5示黄连过大孔阳离子树脂滤过峰、双蒸水洗峰和氨洗峰各组分与PBP2a的结合力，其中氨洗峰的值最高，为108 arc second，故推测黄连结合PBP2a有效物质在氨洗峰。继续下一步的分离实验。
4.3硅胶柱流出组份与PBP2a结合情况4.3.1实验方法黄连氨洗峰提取液(pH 8)静置2小时后离心弃沉淀，上清用1M的HCl滴定调整pH值为6.2，静置2小时后离心，合并两次上清液，上清过硅胶吸附柱，不同浓度的氯仿和乙醇洗脱并收集，旋转蒸发浓缩，低温冷冻抽干，取适量冻干粉行生物传感器检测各组分与PBP2a的结合力。
4.3.2实验结果在实验中显示，黄连氨洗峰提取液用通过硅胶层析后，图6表示其流出组分A、B、C三部分收集，分别测定与PBP2a的结合力，经生物传感器检测显示，A、B、C等组分均与PBP2a有一定的结合，其中以C组分最高112arc second，结果见图7。
4.4高效液相色谱分离与制备4.4.1实验方法①色谱分离与PBP2a结合最高RU的C组分用60％甲醇配制成0.5mg/ml浓度，进样检测波长275nm，进行色谱分离。②色谱制备色谱柱柱温25℃，流速15ml/min，进样浓度200mg/ml，进样体积200μl，根据流出峰进行收集，负压抽干。PBS配制成1mg/ml浓度，上样，生物传感器测定与PBP2a结合。
4.4.2实验结果硅胶柱分离的C组分经过色谱分离，以乙腈为流动相在18％的条件下，分离的效果较好，以此为条件进行色谱制备，见图8。将色谱制备的样品冷冻抽干后，经生物传感器检测显示，结果见图9，40min、98min、114min等流出峰与PBP2a具有一定的结合，其中以98min的RU最大，故命名为组分HL2。
实施例5组分HL2体外结合PBP2a作用研究5.1组分HL2与PBP2a的亲合力测定5.1.1实验方法分别以不同浓度的HL2为流动相，与样品池包被PBP2a进行结合反应，具体方法见第一部分，并通过FASTplot和FASTfit作图，测定其解离平衡常数(KD)。
5.1.2实验结果组分HL2与PBP2a具有较高的结合亲合力，其KD值为3.2×10-6M，见图10。
5.2组分HL2降低β-内酰胺类抗生素对MRSA的MIC值5.2.1实验方法用二倍微量稀释法测定组分HL2对MRSA的MIC值。
5.2.2实验结果组分HL2对MRSA的MIC为256μg/ml，发现其对MRSA有较低的抗菌作用，对MRSA不敏感。
5.3组分HL2降低β-内酰胺类抗生素对MRSA的MIC值5.3.1实验方法用二倍微量稀释法测定组分HL2联用青霉素、舒安西林、苯唑西林对MRSA的MIC。
5.3.2实验结果组分HL2联用青霉素、舒安西林、苯唑西林对MRSA的MIC，发现其能显著降低青霉素、舒安西林、苯唑西林对MRSA的MIC值，其MIC分别由128μg/ml、64μg/ml、258μg/ml降为16μg/ml、8μg/ml、16μg/ml，推测可以用于治疗MRSA感染。
5.4组分HL2对MRSA刺激的人外周血单核细胞(hPBMC)释放TNF-α和IL-6的抑制作用5.4.1实验方法①量效作用培养4h后的hPBMC加入终浓度为2*108CFU/ml的MRSA，并同时加入不同终浓度的组分HL2，以MRSA2*108CFU/ml阳性对照，以加入PBS为阴性对照，4h后取上清，ELISA法测定TNF-α和IL-6。②时效作用培养4h后的hPBMC，分别于2*108CFU/ml的MRSA加入的前20、10min(表示为“-”)、同时加入及后10、20min(表示为“+”)加入终浓度为80μg/ml的组分HL2，以MRSA2*108CFU/ml阳性对照，以加入PBS为阴性对照，4h后，取上清，ELISA法测定TNF-α和IL-6。
5.4.2实验结果①量效作用组分HL2能够呈剂量依赖性地抑制MRSA刺激的TNF-α和IL-6释放(表2)。②时效作用组分HL2在MRSA刺激前20、10min加入培养细胞，对TNF-α和IL-6均有显著的抑制作用；在10min内加入，虽仍能显著抑制TNF-α和IL-6的分泌(p＜0.05)，但作用要显著弱于同时加入的0时相点(p＜0.05)；但是当在MRSA作用细胞20min后加入，其抑制效果明显降低，与MRSA对照组比较已无统计学差异；结果见表3。
表2组分HL2对MRSA刺激的hPBMC释放TNF-α和IL-6影响的量效作用
*，p＜0.05vsMRSA；**，p＜0.01vsMRSA表3 HL2对MRSA刺激的hPBMC释放TNF-α和H-6影响的时效作用
*，p＜0.05 vs MRSA；**，p＜0.01 vs MRSA；◆，p＜0.05 vs 0min；5.5组分HL2对细胞活力影响的测定(MTT法)5.5.1实验方法hPBMC加入不同浓度的组分HL2培养2h，离心去上清，每孔加入200μl新鲜RPMI 1640培养液，再加入20μlMTT溶液(5mg/ml)，37℃继续培养4h后离心去孔内培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜，振荡10min，酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。
5.5.2实验结果此浓度的组分HL2对细胞的活性不产生影响，见图11。
5.6组分HL2联用β-内酰胺类抗生素对LD100 MRSA攻击小鼠具有显著的保护作用5.6.1实验方法KM小鼠100只，雌雄各半，分为万古霉素对照组、MRSA对照组及组分HL2 20、40、80mg/kg加氨苄青霉素100mg/kg，每组各20只。万古霉素对照组由尾静脉注射10mg/kg的万古霉素；MRSA对照组注入2*1010CFU/kg的MRSA及生理盐水100μl /20g；组分HL2处理组于MRSA注入后立即分别注射20、40、80mg/kg的组分HL2加氨苄青霉素100mg/kg，每只动物液体注入总量为200μl/20g。分别于8、16、24、48、72h观察动物的存活情况。
5.6.2实验结果2*1010CFU/kg的MRSA攻击小鼠后，MRSA组小鼠在8小时即开始出现死亡，大部分动物集中在8～16h内死亡，24h后MRSA组动物已全部死亡；万古霉素对照组动物在8～16h小时也出现动物死亡，但动物的死亡数量较少，死亡时间也明显延迟，24h后动物基本上不再死亡。不同剂量的组分HL2加氨苄青霉素100mg/kg组72h保护率分别为40％、45％(p＜0.05)、60％(p＜0.01)。说明组分HL2具有较好的剂量效应关系。结果见图12。
权利要求
1.一种结合生物传感器技术和分离技术、从天然药物或天然药物提取物中筛选、分离具有与PBP2a结合活性的活性组分或活性单体化合物的方法，其特征在于包括以下步骤(1)将PBP2a直接包被于生物传感器的羧基化样品池或生物素化的PBP2a包被于亲和素化样品池作为固定相配基，使PBP2a结构上发挥重要生物学作用的C末端外露并游离，以此作为天然药物中活性物质与固定相发生结合作用的靶点；(2)以待筛选的天然药物提取物溶液为作为流动相，利用上述生物传感器使其与上述固定相配基作用，筛选能够与PBP2a发生结合作用的天然药物或天然药物提取物；(3)将筛选出的与PBP2a具有较强结合活性的天然药物提取物，经柱层析法和/或高效液相色谱法进行分离纯化，对所得到的不同纯化组分再通过生物传感器进行至少一次结合活性的检测，得到能与PBP2a发生结合的活性组分或单体化合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PBP2a由MRSA来源的DNA经常规基因工程方法将其在大肠杆菌中表达后分离纯化制得。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶点为耐药性金黄色葡萄球菌PBP2a的第27～668位氨基酸或第327～668位氨基酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，PBP2a生物素化的步骤采用生物素化试剂BAC-SulfoNHS，通过与可溶性PBP2a片段上的游离氨基端形成稳定的酰胺键完成。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PBP2a的包被包括以下步骤(1)以PBST反复清洗样品池，至基线平衡；(2)向样品池PBST中加入亲和素；(3)PBST反复清洗，加入生物素标记的PBP2a；(4)PBST清洗2-5次后，采集数据曲线3～l0min，计算包被值。
6.根据权利要求l所述的方法，其特征在于，所述天然药物提取物为水提取物和/或有机溶剂提取物；所述柱层析法为离子交换柱层析或硅胶柱层析；所述高效液相色谱法为反相高效液相色谱法或正向高效液相色谱法。
7.一种能与PBP2a发生结合作用的活性组分，其特征在于，其采用权利要求1至6中任一项所述方法从天然药物中筛选、分离得到。
8.根据权利要求7所述的活性组分，其特征在于，所述天然药物为黄连，该组分通过以下步骤制备(1)黄连根或须提取液经过与PBP2a的结合、解离反应后，分别再用亲合反应液反复冲洗，经盐酸溶液洗脱、再生后，将回吸收的再生反应液pH调为中性，冷冻抽干；(2)应用生物传感器的回收功能，通过洗脱，得到各梯度洗脱组分，对这些组分进行PBP2a结合测定，取与PBP2a结合力最高的组分；(3)将上述所得与PBP2a结合力最高的组分提取液pH值调至3.0～5.0，静置后取上清液过离子树脂，收集滤过峰、双蒸水洗脱峰和氨洗脱峰，浓缩，低温冷冻抽干；(4)分别取适量上述提取物冻干粉末，以生物传感器检测各组分与PBP2a的结合力，取结合力最高的氨洗脱峰对应的提取液；(5)上述氨洗脱峰提取液静置后离心弃沉淀，上清液调整pH值为6.0～6.5，静置后离心，合并两次上清液，上清液上硅胶柱，以不同浓度的氯仿和乙醇洗脱，并分别收集洗脱液A、B、C，浓缩，低温冷冻抽干；(6)分别取适量上述洗脱液A、B、C的冻干粉末，测定其与PBP2a的结合力，取结合力最高的C组分；(7)将上述与PBP2a结合力最高的C组分进行高效液相色谱分离，色谱条件色谱柱柱温25℃，流速15ml/min，进样浓度200mg/ml，检测波长275nm，分别收集流出峰，负压抽干；(8)以生物传感器测定上述各流出峰与PBP2a的结合，与PBP2a结合力最大的95.0～100.0min流出峰所对应的组分即为活性组分HL2。
9.根据权利要求8所述的活性组分，其特征在于，其具有以下生物活性性质(1)该组分与PBP2a具有较高的亲合力，其Kd值为3.0～3.5×10-6M；(2)该组分在体外实验中与青霉素等β-内酰胺类抗生素联用能降低β-内酰胺类抗生素对MRSA的最低抑菌浓度(MIC)，并能够抑制由MRSA介导的TNF-α和/或IL-6的释放；(3)该组分联用β-内酰胺类抗生素对LD100 MRSA攻击动物具有显著的保护作用，并呈明显量效关系；(4)该组分对LD100大肠杆菌攻击动物具有显著的保护作用，并呈明显量效关系。
10.一种根据权利要求7所述的活性组分的用途，其特征在于，其可用于制备协同β-内酰胺类抗生素治疗MRSA感染药物或先导化合物。
全文摘要
一种结合生物传感器技术和分离技术，从天然药物中筛选、分离具有结合PBP2a活性组分或活性物质的方法，该方法将PBP2a包被于生物传感器的样品池作为固相配基，以天然药物提取物为流动相，筛选能够与PBP2a发生结合作用的天然药物，将结合值较高的活性组分经过分离纯化，得到一种具有协同拮抗MRSA活性能与PBP2a发生结合作用的活性组分，该组分可用于制备协同β－内酰胺类抗生素治疗MRSA感染药物或先导化合物。该方法具有省时、高通量、省力、特异性强、结果准确、能够实时监控等优点。
文档编号A61P31/00GK101070556SQ20071007824
公开日2007年11月14日 申请日期2007年2月26日 优先权日2007年2月26日
发明者周红, 和生琦, 董燕, 郑江 申请人:中国人民解放军第三军医大学