具有仿生功能界面骨软骨复合组织一体化工程支架的制作方法

专利名称：具有仿生功能界面骨软骨复合组织一体化工程支架的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于修复人体关节骨软骨缺损的组织工程支架，尤其是具有仿生功能界面骨软骨复合组织一体化工程支架。
背景技术：
创伤、感染及退变等导致的可动关节端骨软骨缺损是骨科临床常见疾病，常表现为顽固性疼痛、关节活动障碍，严重者可丧失运动功能。据统计，美国关节骨软骨缺损的发病率约为1.5‰～3‰，我国是其5～6倍。由于关节软骨没有血管、神经和淋巴系统，直径超过2mm～4mm的骨软骨缺损几乎不能完全修复。现有治疗方法均存在明显缺陷，且难以使其真正达到自然修复再生。关节清理术暂时缓解症状，不能阻止病程发展；关节融合术、关节切除成形术使关节功能严重丧失；人工关节置换术存在远期骨溶解和假体松动等问题；关节镜下骨软骨块移植术，自体移植造成供区缺损且来源有限、异体移植则存在排斥反应及潜在传染疾病等弊端。组织工程技术的迅速发展，为关节骨软骨缺损的再生修复提供了新策略。
国内外对骨软骨复合组织的构建研究日趋重视。常用构建策略可分为2类(1)分层构建分层构建是研究者最先采用的构建策略，即分别构建软骨和骨组织，然后用可吸收线缝合或纤维蛋白胶粘合等方式将两者接合成一个整体，体外继续培养一段时间或不进行培养直接植入体内修复缺损。Schaefer等将新生牛股骨髁来源的软骨细胞接种于聚乙交酯(PGA)非编织纤维网状支架构建软骨，将尺骨骨膜来源的成骨细胞接种于聚丙交酯-聚乙交酯共聚物(PLGA)和聚乙二醇(PEG)的混合物(80∶20)构建软骨下骨；两者按促进成软骨和成骨条件单独培养1周或4周，然后用可吸收线将两者缝合体外继续共培养4周，形态学检测显示两者结合形成了骨软骨复合组织，动物实验表明软骨下骨与周围宿主骨整合良好，但构建的软骨与周围宿主软骨整合欠佳。Alhadlaq等利用双丙稀酸聚乙醇脂(PEGDA)分别构建软骨和骨组织，然后采用紫外光聚合方法使两种组织的支架材料聚合成为一个整体后用于体内实验，术后12周检测发现在相应区域有软骨样或骨样组织形成，但组织间未形成潮线结构；国内曹谊林、胡蕴玉等有类似研究；(2)一体构建首先制备成分与结构相同或不同的一体化骨软骨复合支架，然后在软骨区域接种成软骨性种子细胞，成骨区域接种或不接种成骨性种子细胞，构建骨软骨复合组织。Guoping Chen等用胶原海绵制作软骨支架，聚丙交酯-聚乙交酯共聚物(PLGA)和胶原构成骨支架，两层之间由胶原海绵连接；然后将狗MSCs接种于双相支架，体外培养一周植入体内修复狗膝关节骨软骨缺损，术后4个月组织学检测结果表明，修复组织分别形成软骨和骨，但机械性能较差。Sherwood等用TheriFormTM三维打印技术制作由不同成分构成的一体化骨软骨复合支架，软骨部分由D，L-PLGA/l-PLA构成，孔隙率90％，呈柱状，内有交错通道；骨部由L-PLGA/TCP构成，孔隙率55％，呈cloverleaf(四叶苜蓿)形，在软骨和骨交界区材料和孔隙率呈梯度改变。软骨支架接种软骨细胞，骨部不接种细胞体外培养6周，组化检测表明有软骨部有软骨形成，骨部力学性能与人新鲜松质骨强度相似。国内王迎军、张人佶等有相关研究。采用组织工程技术再造细胞成分单一的骨或软骨组织获得广泛成功，部分成果已进入临床应用。工程化骨软骨复合组织的再造研究起步稍晚，但进展迅猛，从构建可行性初探到动物实验研究取得了阶段性成果；再造组织质量缺陷、移植物与宿主整合欠佳及缺乏相应的机械功能是限制其临床应用的主要瓶颈。
人体关节骨软骨复合组织是组成和结构极为复杂的功能组织，理想的工程化骨软骨复合体构建策略不是将再造的软骨和骨组织简单地缝合或粘合在一起，具有功能界面的一体化三维支架构建是决定成败的关键。因此，构建仿生功能界面(钙化层结构)的设想势必解决再造组织质量缺陷、移植物与宿主整合欠佳等问题，这是因为(1)通过仿生钙化层特殊界面结构可以将软骨牢固地固定在软骨下骨上，防止植入体内后软骨从软骨下骨上脱离体，从而有利于移植物与宿主界面整合。(2)利用钙化层结构致密性使植入体内的骨软骨复合组织象宿主一样自然分为氧和营养丰富的成骨微环境、氧和营养缺乏的成软骨微环境，防止植入细胞在成骨性和成软骨性支架间迁移，促进特定区域细胞利用各自微环境向特定方向增殖、分化。
以往研究多采用层压、熔融铸形及纤维粘结等传统方法制作骨软骨复合支架，工艺复杂、重复性较差，难以实现产业化生产；并且制造的三维支架形状规则，常为长方形或圆柱形，难以满足形状多变的骨软骨缺损。近年来三维打印技术逐渐成熟并在单一组织工程骨和软骨构建中试用，采用该技术不但可以实现骨软骨复合支架一体化制造，同时还可以使其具有临床需要的特定解剖外形和内部空间结构，更为优越是制备支架的同时可以将细胞接种于支架多孔内。支架材料选择和修饰是制备骨软骨复合支架的另一重要因素，理想的支架材料应具有良好的生物相容性，利于细胞粘附、增生和分化；可降解吸收性，通过人工调控可以使其降解吸收速度与体内新生组织生长速度相匹配；良好的机械特性，能满足植入部位的力学要求。
现有技术构建的骨软骨复合组织缺乏理想的功能界面；存在再造组织质量缺陷、移植物与宿主整合欠佳及机械强度较差等问题，不能满足临床修复关节骨软骨缺损需要。

发明内容
本发明针对现有技术构建的骨软骨复合组织缺乏理想的功能界面；存在再造组织质量缺陷、移植物与宿主整合欠佳及机械强度较差等问题，提供一种具有良好的生物相容性、可控降解性和足够机械强度及具有仿生功能界面的骨软骨复合组织一体化工程支架。采用本发明支架结合种子细胞制备技术、双相凝胶接种技术及组织块体外培养技术可以构建出能够满足临床需要的工程化骨软骨复合修复组织。
本发明的技术方案具有仿生功能界面骨软骨复合组织一体化工程支架，其特征在于该支架自上至下由软骨层、钙化层和软骨下骨层三部分组成，各层具有不同的组成成分和内部空间结构，各层之间借助钙化层特殊组成和结构紧密连接。(1)软骨层由II型胶原和壳聚糖组成，II型胶原重量比为80％～90％、壳聚糖重量比为10％～20％；上表面平整、下表面呈波浪状与钙化层的上表面相匹配，波高为50μm～80μm、波宽为200μm～300μm；厚度为3mm～5mm；孔隙率为85％～90％、孔径为100μm～150μm、孔通率为100％；(2)钙化层由II型胶原和羟基磷灰石组成，II型胶原重量比为60％～70％、羟基磷灰石重量比为30％～40％；上表面呈波浪状与软骨层的下表面相匹配；下表面呈凸凹不平梳齿状与软骨下骨上表面相锚合，梳齿呈圆锥状，锥高为250μm～300μm、锥底直径为200μm～250μm；厚度为50μm～350μm、结构致密。(3)软骨下骨层由I型胶原和羟基磷灰石组成，I型胶原重量比为70％～80％、羟基磷灰石重量比为20％～30％；上表面呈凸凹不平梳齿状与钙化层下表面相锚合；下表面也呈梳齿状利用植入体内与宿主界面稳固锚合，锥高为1mm～2mm、锥底直径为2mm～3mm；厚度为8mm～10mm；孔隙率为55％～60％、孔径为200μm～500μm、孔通率为100％。
本发明采用三维打印技术依照仿生学原理研制的具有功能界面骨软骨复合组织一体化工程支架，具有以下特点1、结构--功能特点(1)软骨层支架具有适合软骨细胞增殖、分化的内部空间结构；(2)软骨下骨层支架具有适合成骨细胞增殖、分化的内部空间结构；(3)利用钙化层凸凹不平的界面结构增加支架间的连接面积和连接强度，将软骨支架牢固地锚合在软骨下骨上，植入体内后利于组织间应力分散，防止组织间分层。利用钙化层致密结构阻止植入细胞在成骨性和成软骨性支架间迁移，利于特定区域的细胞利用各自微环境向特定方向增殖、分化，从而加强移植物与宿主之间的界面整合。
2、组成--功能特点(1)选用II型胶原和壳聚糖作为软骨层支架材料，一方面仿生材料具有良好的生物相容性利于软骨细胞粘附、增生和分化；另一方面可以通过控制II型胶原和壳聚糖的组成比例来调控软骨支架的降解速度和机械强度；(2)选用I型胶原和羟基磷灰石作为软骨下骨层支架材料，一方面有利于成骨细胞粘附、增生和分化；另一方面可以增加支架的机械强度；(3)选用II型胶原和羟基磷灰石作为钙化层支架材料，使界面组成同时具有与软骨相同的II型胶原和与软骨下骨相同的羟基磷灰石，即加强了组织间的连接强度，同时避免因不同组织伸缩性和溶胀性不同导致的界面分离。(4)通过人工调控仿生材料的组成及比例，实现支架机械强度和降解吸收速度的可控性，使其具有良好的机械特性，移植到患者体内后能够承受正常状态的应力作用，满足植入部位的力学要求；使其降解吸收速度与宿主体内新生组织生长速度相匹配。


下面结合附图对本发明作进一步的说明图1是本发明支架结构示意图(剖视)；图2是本发明支架第二种实施例结构示意图(剖视)；
具体实施例方式
如图1中，1-软骨层，2-钙化层，3-软骨下骨层，4-孔隙，本发明一体化工程支架，从上至下由软骨层1、钙化层2和软骨下骨层3组成，软骨层1与钙化层2之间、钙化层2和软骨下骨层3之间有机连接，软骨层1和软骨下骨层3借助钙化层2特殊组成和结构紧密连接，相互之间有机连接，各层之间不存在界线，只是各层之间的结构、组成成分不同。软骨层1的组成材料为医用II型胶原和壳聚糖；II型胶原重量比为80％～90％、壳聚糖重量比为10％～20％，II型胶原/壳聚糖以共价键形式连接；钙化层2的组成材料为医用II型胶原和羟基磷灰石，II型胶原重量比为60％～70％，羟基磷灰石重量比为30％～40％，II型胶原/羟基磷灰石之间以共价键形式连接；软骨下骨层3的组成材料为医用I型胶原和羟基磷灰石，I型胶原重量比为70％～80％，羟基磷灰石重量比为20％～30％，I型胶原/羟基磷灰石之间以共价键形式连接；羟基磷灰石可采用南京海泰纳米材料有限公司生产的产品，医用I型胶原和II型胶原可采用四川铭让科技有限公司生产的产品；壳聚糖可以从美国sigma公司购买。在软骨层1和软骨下骨层3内都设置有一个以上的多个孔隙4，孔隙4的孔径一般在100μm～500μm，软骨层1的孔径一般在100μm～150μm之间，其孔隙4的孔隙率在85％～90％之间，孔通率为100％；软骨下骨层3的孔径一般在200μm～500μm之间，其孔隙4的孔隙率在55％～60％，孔通率为100％。
为了使支架植入体内后能够与骨软骨缺损周边宿主完全整合，其外形设计通常与人体骨软骨缺损部位相匹配，软骨层1的厚度一般为3mm～5mm；钙化层2的结构致密、厚度一般为50μm～350μm；软骨下骨层3的厚度一般为8mm～10mm，新颖之处在于将软骨下骨支架与宿主骨的连接面设计成稀疏的梳齿状，此种结构设计增加了移植物与宿主骨部的连接面积，加强了连接强度，从而有利于移植物的牢固固定。
如图2中，本发明支架第二种实施例结构，软骨层1与钙化层2之间、钙化层2和软骨下骨层3之间的连接界面的形状，软骨层1的上界面是平面，软骨层1的下界面是波浪状；钙化层2的上界面(与软骨层1的下界面相连接的面)是与软骨层1的下界面相吻合的波浪状，钙化层2的下界面(与软骨下骨层3的上界面相连接的面)是梳齿状；软骨下骨层3的上界面是与钙化层2的下界面相吻合的梳齿状，软骨下骨层3的下界面为梳齿状。上述的软骨层1的下界面、钙化层2的上界面的波浪状，可以是有规律的正弦波形状，波高为50μm～80μm、波宽为200μm～300μm；也可以是没有规律的波浪状；软骨下骨层3上表面呈凸凹不平梳齿状，与钙化层2的下表面相锚合，梳齿可以是有规律的圆锥状，锥高为250μm～300μm、锥底直径为200μm～250μm，也可以是没有规律的锯齿状；软骨下骨层3的下表面呈稀疏的梳齿状，便于植入体内后与宿主骨界面稳固锚合，锥高为1～2mm、锥底直径为2mm～3mm。
实际中，软骨层1的上、下界面的形状，钙化层2的上、下界面的形状，软骨下骨层3的上、下界面的形状，根据实际需要，可以有多种，本领域的技术人员根据本启示，不需花费创造性的劳动就可以得到。
实际中，除了上述所选用的仿生材料外，制作工程化骨软骨复合组织一体化支架还可以选用其他天然材料与人工合成材料。(1)软骨层支架可以选择天然材料有脱细胞的软骨基质材料、甲壳素、藻酸钙、纤维蛋白、透明质酸等；可以选择的人工合成的有机高分子材料包括脂肪族聚酯[聚丙交酯(PLA)、PGA、PLGA等]、聚酸酐、聚原酸酯、聚醚[PEG、聚丙二醇(PPG)]等；还可以是上述天然材料与人工合成有机高分子材料复合起来形成的新材料。(2)钙化层和软骨下骨支架可以选择的天然材料包括各种经过物理、化学处理的天然骨组织(异种骨和同种异体骨，如陶瓷化、冻干骨、脱钙骨、脱钙骨基质、脱蛋白骨等)、天然珊瑚及珊瑚人工骨等；可以选择的人工合成材料包括陶瓷材料，如磷酸三钙(TCP)、双相钙磷陶瓷(BCP)、生物活性玻璃陶瓷(BGC)等；有机高分子材料，如脂肪族聚酯[聚丙交酯(PLA)、PGA、PLGA等]、聚酸酐、聚原酸酯、聚醚[PEG、聚丙二醇(PPG)]等；还可以是上述天然材料与人工合成有机高分子材料复合起来形成的新材料。本领域的技术人员根据本启示，不需花费创造性的劳动就可以得到。
实际中，软骨层1的组成材料中的II型胶原蛋白和壳聚糖，钙化层2的组成材料中的医用II型胶原蛋白和羟基磷灰石，软骨下骨层3的组成材料中的医用I型胶原蛋白和羟基磷灰石，其配比范围不限于前述的比例范围，可以有多种其他配比，如软骨层1的II型胶原(医用)重量比可达99.99％，钙化层2的组成材料中的医用II型胶原蛋白重量比可达90％甚至更高，软骨下骨层3的组成材料I型胶原重量比可达90％甚至更高，都可根据实际需要进行调整。如选用其他复合材料，其配比与上述公开的比例也基本相似，还可根据实际需要进行调整。本领域的技术人员根据本启示，不需花费创造性的劳动就可以得到。
实际中，所选生物材料除了上述的以共价键形式连接以外，制作时也可用粘结剂将软骨层1的医用II型胶原与壳聚糖复合体干粉进行粘结；制作时将钙化层的医用II型胶原和羟基磷灰石复合体干粉用粘结剂粘结而连接；将软骨下骨层的医用I型胶原和羟基磷灰石复合体干粉用粘结剂粘结而连接；如选用其他复合材料方法相同。粘结剂可选用现有的产品，如北京福爱乐科技发展有限公司生产的福爱乐医用剂粘胶或北京瞬康科技发展有限公司生产的瞬康医用剂粘胶。
本发明支架的制造过程1、根据人体正常关节骨软骨复合组织的超微结构相关数据及以往对单一组织工程软骨和骨构建研究结果，设计并制定构建骨软骨复合支架所需相关参数包括各层支架的厚度、形状及内部孔隙率、孔径和孔通率等(详见本发明的技术方案)，然后应用计算机辅助设计软件(CAD)制作骨软骨复合组织一体化支架模型。本发明所用的计算机辅助设计软件(CAD)，是一种现有技术，本领域的技术人员根据本文披露的内容，能够设计或编制出该设计软件，该设计软件不属于本发明的保护范围，在此不做详述。
2、按照仿生学原理确定支架各层的组成成分和比例(详见本发明的技术方案)，从生物材料公司获得医用I型、II型胶原(四川铭让生物科技有限公司研制)；壳聚糖(美国sigma公司生产)和羟基磷灰石(南京海泰纳米材料有限公司生产)。采用交联、矿化及喷雾干燥技术对选定生物材料进行修饰、制成胶原/壳聚糖、胶原/羟基磷灰石微聚体干粉，胶原/壳聚糖和胶原/羟基磷灰石之间以共价键形式连接。其共价键形式连接结构、方法等，具体可参见名称为“一种用于引导组织再生的复合膜制备方法”、专利申请号为03150163.X，名称为“多孔胶原复合纳米羟基磷灰石人工骨的制备方法”、专利申请号为200510107942.0的中国发明专利申请文件，以及名称为“复合血管生产素的肝素化胶原/壳聚糖多孔支架的制备方法”、专利申请号为200510060749.3，以及名称为“胶原-壳聚糖和硅橡胶双层皮肤再生支架及其制作方法”、专利申请号为200510061872.的中国发明专利申请文件，公开了胶原/壳聚糖、胶原/羟基磷灰石的共价键形式连接结构。上述内容不作为本发明的保护范围，在此不进行详述。
3、将设计好的CAD模型转化成快速成型文件格式输入三维打印机，采用紫外线、戊二醛等理化交联方法将微聚体干粉在三维打印机的帮助下按设计方案粘结成具有功能界面的骨软骨复合组织一体化工程支架。打印完成后去离子水反复漂洗，低温冻干，X-射线消毒后密封低温储存。用三维打印技术制作本发明的支架，软骨层1与钙化层2之间、钙化层2和软骨下骨层3之间不存在界线，只是各层之间的结构、组成成分不同。该制备过程采用的三维打印技术，是一种现有技术，可参阅名称为“三维打印成型设备及方法”、专利申请号为200510029726.9的中国发明专利申请文件，或参阅名称为“一种制作三维物体和支撑的打印成型方法”、专利申请号为200610038580.9的中国发明专利申请文件4、依据ISO10993系列标准，采用SEM、XRD、FTIR、力学实验、降解性试验、细胞毒性试验、遗传毒性试验等方法对支架的形态结构、力学性能、生物安全性和降解吸收性等理化性能进行检测。检测结果证明本发明的骨软骨复合组织工程支架具有设计要求的内部空间结构和组成比例；具有良好的组织相容性和生物安全性，利于细胞粘附、增生；具有良好的机械强度，能够满足植入部位的力学要求；具有可控降解吸收性，通过人工调控可以使其降解吸收速度与体内新生组织生长速度相匹配。
5、采用该支架结合种子细胞制备技术、双相凝胶接种技术及组织块体外培养技术构建工程化骨软骨复合组织；大动物(猪)体内植入修复实验结果表明采用本发明的骨软骨复合组织工程支架构建的工程化骨软骨复合组织植入体内后与周围正常组织完全整合，降解时间与周围新生组织生长速度基本匹配；修复组织软骨部分具有类似天然关节软骨的生物学特性、软骨下骨部分能够在较短时间内与宿主骨组织产生骨性结合。
权利要求
1.具有仿生功能界面骨软骨复合组织一体化工程支架，其特征在于从上至下由软骨层(1)、钙化层(2)和软骨下骨层(3)组成，软骨层(1)与钙化层(2)之间、钙化层(2)和软骨下骨层(3)之间有机连接；软骨层(1)的组成材料为II型胶原和壳聚糖，II型胶原/壳聚糖以共价键形式连接；钙化层(2)的组成材料为II型胶原和羟基磷灰石，II型胶原/羟基磷灰石以共价键形式连接；软骨下骨层(3)的组成材料为I型胶原和羟基磷灰石，I型胶原/羟基磷灰石以共价键形式连接；在软骨层(1)和软骨下骨层(3)内都设置有一个以上的孔隙(4)，孔隙(4)的孔径为100μm～500μm。
2.根据权利要求1所述的具有仿生功能界面骨软骨复合组织一体化工程支架，其特征在于软骨层(1)中的II型胶原重量比为80％～90％，壳聚糖重量比为10％～20％。
3.根据权利要求1所述的具有仿生功能界面骨软骨复合组织一体化工程支架，其特征在于在钙化层(2)中，II型胶原重量比为60％～70％，羟基磷灰石重量比为30％～40％。
4.根据权利要求1所述的具有仿生功能界面骨软骨复合组织一体化工程支架，其特征在于在软骨下骨层(3)中，I型胶原重量比为70％～80％，羟基磷灰石重量比为20％～30％。
5.根据权利要求1至4任一所述的具有仿生功能界面骨软骨复合组织一体化工程支架，其特征在于软骨层(1)的上界面是平面，软骨层(1)的下界面是波浪状，钙化层(2)的上界面是与软骨层(1)的下界面相吻合的波浪状，波高为50μm～80、波宽为200μm～300μm；钙化层(2)的下界面是梳齿状，软骨下骨层(3)的上界面是与钙化层(2)的下界面相吻合的梳齿状；梳齿是有规律的圆锥状，锥高为250μm～300μm、锥底直径为200μm～250μm；软骨下骨层(3)的下表面呈梳齿状，便于植入体内后与宿主骨界面稳固锚合。
6.根据权利要求1至4任一所述的具有仿生功能界面骨软骨复合组织一体化工程支架，其特征在于软骨层(1)孔隙(4)的孔径在100μm～150μm之间，孔隙(4)的孔隙率在85％～90％之间，孔通率为100％。
7.根据权利要求1至4任一所述的具有仿生功能界面骨软骨复合组织一体化工程支架，其特征在于软骨下骨层(3)孔隙(4)的孔径在150μm～500μm之间，孔隙(4)的孔隙率在55％～60％之间，孔通率为100％。
8.根据权利要求5所述的具有仿生功能界面骨软骨复合组织一体化工程支架，其特征在于软骨层(1)孔隙(4)的孔径在100μm～150μmμm之间，孔隙(4)的孔隙率在85％～90％之间，孔通率为100％；软骨下骨层(3)孔隙(4)的孔径在150μm～500μm之间，孔隙(4)的孔隙率在55％～60％之间，孔通率为100％。
9.根据权利要求1至4任一所述的具有仿生功能界面骨软骨复合组织一体化工程支架，其特征在于软骨层(1)的厚度为3mm～5mm，钙化层(2)的厚度为50μm～350μm，软骨下骨层(3)的厚度为8mm～10mm。
全文摘要
本发明公开了一种具有仿生功能界面骨软骨复合组织一体化工程支架，从上至下由软骨层、钙化层和软骨下骨层组成，软骨层与钙化层之间、钙化层和软骨下骨层之间有机连接；软骨层的组成材料为II型胶原和壳聚糖，II型胶原/壳聚糖以共价键形式连接；钙化层的组成材料为II型胶原和羟基磷灰石，II型胶原/羟基磷灰石以共价键形式连接；软骨下骨层的组成材料为I型胶原和羟基磷灰石，I型胶原/羟基磷灰石以共价键形式连接；在软骨层和软骨下骨层内都设置有一个以上的孔隙，孔隙的孔径为100μm～500μm。本发明的支架，具有良好的生物相容性、可控降解性和足够机械强度及具有仿生功能界面；移植到患者体内后能够承受正常状态的应力作用，满足植入部位的力学要求；使其降解吸收速度与宿主体内新生组织生长速度相匹配。
文档编号A61F2/30GK101020083SQ20071007826
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月8日 优先权日2007年3月8日
发明者王富友, 段小军, 杨柳, 戴刚 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院