重组人甲状旁腺素相关蛋白的制作方法

专利名称：：重组人甲状旁腺素相关蛋白的制作方法
技术领域：
：本发明涉及蛋白质工程领域。具体地，本发明涉及重组人甲状旁腺素相关蛋白及其应用。
背景技术：
：恶性肿瘤患者常出现恶性肿瘤高钙血症综合征(HHM)"'a，表现出与甲状旁腺功能亢进相似的临床症状和血液生化改变，但患者血清中甲状旁腺激素(PTH)水平却未明显增高。研究人员于是推测一种生理功能类似于PTH的物质是引起高钙血症的原因。1983年，研究人员证实这种物质不是PTH，而是由肿瘤细胞分泌的另一种与钙磷代谢有关蛋白质[3]。1987年，研究人员克隆了这种物质的cDNA，将这种蛋白命名为甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrPf'"。随着研究的进一步深入，在多种不同的正常机体组织中均检测到了PTHrP的存在[6'7]，证实其在大多数组织器官都有所表达，提示其在正常细胞生长分化中的重要性[8]。PTHrP基因被敲除的小鼠在胚胎期发生死亡，不能正常发育[9'10]，从另一个侧面证实了PTHrP对于机体的生长发育是至关重要的。PTH是由甲状旁腺分泌到血液，被运送至靶细胞发挥其生理作用，即人们所熟知的内分泌(endocrine)方式。而PTHrP却不是这样，它的释放方式主要为自分泌(autocrine)、旁分泌(paracrine)和胞内分泌(intracrine)[6,7,11]PTHrP被认为是PTH家族的第二个激素[7]。PTHrP与PTH氨基酸序列的N端序列有很大的相似性——PTHrP与PTH在N端前13个氨基酸中有8个(第2、3、4、6、7、9、12、13)是完全一样的[12]，最初研究人员推断他们在生理功能上具有相似性。经研究证实，PTHrPN端片断与PTH作用于共同的受体——PTH1型受体(PTH1R)[7]，在调节钙磷代谢中具有相似的作用。然而，随着对其研究的深入，研究人员发现二者无论是在基因结构还是在生理功能上都存在着极大的差异，PTH和PTHrP缺乏或过量分泌所引起出的临床表现也迥然不同[7]。PTHrP的基因结构远比PTH复杂得多，编码人PTH和PTHrP的基因分别位于11号与12号染色体的短臂[13]。PTHrP共包含有3个启动子和9个外显子，而PTH只有3个外显子(见图l.l)。由于转录后mRNA不同的剪接加工方式，翻译后，PTHrP共有3种成熟蛋白形式(PTHrPl-139、PTHrPl-141和PTHrPl-173)[13一15]。此外，不同种属间PTHrP基因也存在明显差异。大鼠和小鼠的PTHrP基因较人更为简单，只有5个外显子，它们编码的PTHrP成熟肽只有PTHrPl-139和PTHrPl-141两种形式问。最初翻译的PTHrP前体要经过复杂的翻译后加工过程，其中包括信号肽(-36--1)的去除及蛋白内切酶的酶切作用。PTHrP被酶切后产生多种不同的多肽片段，形成了具有不同生物学活性的一组多肽。现在己经证实了3个具有生物活性的分泌型片段N端片段(1-36/37)，中间部分片段(38-94/95/101)，C端片段(107-139/141)[12'16'17]。它们的生物学功能明显不同，而且这些多肽片段很可能各有其不同的受体["'，N端片段与PTH在生物学性质上最为相似，表现出相似的生理活性。它们通过与共同的受体(PTH1R)结合，激活腺苷酸环化酶和/或磷脂酶C，发挥多种多样的生理功能[19-21]。由于蛋白酶作用的位点不同，中间部分的边界不是很确定，中间部分多肽片段88-91和89-106区域还含有核定位序列(NLS)，结构与病毒和哺乳动物的转录因子相似。在它的作用下，PTHrP可以进入核内，发挥对于基因转录的调节作用。虽然进入到细胞核的PTHrP很少，但是，在细胞的增殖分化过程中，这些极少量PTHrP却起到了极其重要的作用。C端片段同样含有NLS，可入核发挥转录调节作用，引起细胞增殖。此外还可通过特异性分布在骨和脑组织的相应受体，发挥其它两个片段所不具有的生物学效应[6'7]。PTHrP在机体内是广泛分布的，它的作用靶组织与靶器官涉及包括骨骼、肾脏、血管、平滑肌、角质细胞、胎盘、胰岛、中枢神经系统等在内的几乎全身所有组织器官[6'7]。在骨组织，PTHrP与其受体(PTH1R)结合后，促进软骨细胞增殖，抑制其终末分化，抑制软骨细胞凋亡，这样的结果是促进骨骼生长和软骨内成骨。PTHrP对促进胎儿骨骼发育非常重要，不能为PTH所替代。PTHrP还可以促进成骨细胞增殖，抑制破骨细胞活动，刺激骨组织形成[7'9'23]。在肾脏，PTHrP和PTH共同参与钙磷代谢调节，间接影响骨组织代谢；还可以降低肾血流速度及肾小球滤过率，还可以促进肾小管和肾小球细胞的增生，在肾组织损伤的修复过程中起到了一定的作用[6'23-28];PTHrP在平滑肌细胞(VSMC)和血管内皮细胞也有表达，对平滑肌具有强大的松弛作用，能够降低空腔器官及血管的紧张性，从而调节消化吸收，降低血压，维持血压平衡[2^34];在胰腺，PTHrP能够推迟fi细胞的凋亡，促进fi细胞聚集以及胰岛素的分泌P5—371。此外，在乳腺、胎盘、皮肤、小肠、心脏、垂体、中枢神经等组织器官，PTHrP都能发挥其特定的生理作用[7]。PTHrP的这些生理功能，预示着PTHrP未来在临床上广泛的应用前景，可被用于对于骨质疏松、肾功能衰竭、糖尿病、高血压等多种疾病的治疗。近年来有关PTHrP的研究日趋增多，也己经对PTHrP有了一定的了解。然而，直到现在，它的许多生理特性、作用机制人们还不是很清楚。由于PTHrP在血清及组织细胞中的表达量极低，单靠纯化蛋白的方法提取样品很难满足科学研究的需要。基因工程技术是利用酶学的方法，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割、重新连接，拼接成一个新的杂合DNA分子，进而转化宿主细胞，使得目的基因在体外进行大量表达。进一步纯化后，就可以得到大量目的蛋白。对于那些在体内表达量很低的蛋白，很难通过单纯的蛋白提取和纯化的方法获得大量较高纯度的样品，而基因工程技术可以在短时间内获得大量纯品，因而日益受到重视。目前国内外利用基因工程获得PTHrP都限于较短片段，合成PTHrPl-141这样长度的多肽片段还没有报道。巴斯德毕赤酵母(P/t^'a;wton's)表达系统既有大肠杆菌(Eco/0系统操作方便、经济、能大规模发酵生产等优点，又能对重组蛋白进行正确折叠和翻译后修饰(如糖基化)，而且分泌型表达使产物易于纯化，它可以在以甲醇为唯一碳源的培基中生长，这是因为该细胞的过氧化酶体中含有甲醇代谢途径的必需酶，如醇氧化酶l(alcoholoxidasel，AOXl)、是甲醇利用途径中的第一个酶，在甲醇培养的酵母中，该酶可占细胞总蛋白的30%以上。甲醇强诱导A0X1启动子，使其下游的外源基因易于调控，并具有很高的表达。毕赤酵母相对于酿酒酵母而言，重组蛋白的糖基化程度减低，后者表达重组蛋白糖基化程度高，可能产生超敏反应。因而，临床应用来自毕赤酵母的重组蛋白更安全。动物实验广泛用于检测生物样品的生物活性。对不同片段的甲状旁腺素相关蛋白进行动物实验，可以通过检测一些反映骨重建的生物力学、骨计量学及生化指标，以了解甲状旁腺素相关蛋白在动物体内对成骨作用的影响，确认不同片段的生物活性。
发明内容本发明的一方面是提供甲状旁腺素相关蛋白PTHrPl-86,其氨基酸序列包含SEQIDNO:8所示的序列，或包含SEQIDNO:8所示的序列经一个或多个(优选几个)氨基酸的保守性替代、缺失、添加后所得到的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，所述氨基酸序列是SEQIDNO:8所示的序列。本发明的另一方面提供编码本发明的甲状旁腺素相关蛋白PTHrPl-86的核苷酸序列，其包含SEQIDNO:7所示的序列或包含在严格杂交条件下与SEQIDNO:7所示的序列杂交的序列。在一个优选的实施方案中，所述核苷酸序列是SEQIDNO:7所示的序列。在本发明中，"在严格条件下的杂交"是指核酸能在T.Maniatis等.(编辑),MolecularCloning:ALaboratoryManual2nded.，ColdSpringHarborLaboratory(1989)所述的条件或类似条件下进行杂交。例如，它是指在下述条件下的杂交能力在含有0.5。/。SDS、0.P/。牛血清白蛋白(BSA)、0.1%聚乙烯吡咯垸酮、0.1%菲可(Ficoll)400和0.01%变性的鲑鱼精子核酸的6xSSC(lxSSC:0.15MNaCl，0.015M拧檬酸钠，pH7.0)中，于50。C将其上固定有核酸的膜与探针孵育12-20小时。孵育后，在37i:，在含有0.5%SDS的2xSSC中洗涤膜，同时将SSC浓度下调至O.lx且温度上调至50°C，直到来自固定的核酸的信号能从背景中区分开，然后检测探针。在本发明的另一个方面，提供包含编码甲状旁腺素相关蛋白PTHrPl-86的核苷酸序列的载体及宿主细胞。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是毕赤酵母细胞。在本发明的另一个方面，提供了本发明的人甲状旁腺素相关蛋白(PTHrPl-86或PTHrPl-141)在制备用于治疗骨质疏松的药物中的应用。在本发明的另一个方面，提供了一种治疗骨质疏松的方法，其包含对患者给药治疗有效量的本发明的人甲状旁腺素相关蛋白(PTHrPl-86或PTHrPl-141)。在本发明的另一个方面，提供了一种治疗骨质疏松的试剂盒，其包含治疗有效量的本发明的人甲状旁腺素相关蛋白(PTHrPl-86或PTHrPl-141)。在本文中所用的术语"保守性替代、缺失、添加"意指经上述修饰后的氨基酸或核苷酸序列仍具有与原序列相同的功能。本领域的普通技术人员基于所述序列，完全可以确定经保守性替代、缺失、添加后所得到的具有相同功能的序列。在本文中所用的术语"治疗有效量"意指医师可以根据患者的病症确定的可有效发挥治疗作用的剂量。本发明以pGEM-Teasy/PTHrPl-141，1-86为模板，PCR扩增得到了PTHrPl-141，l-86成熟肽cDNA，将该片段克隆入pGEM-Teasy中，再利用pGEM-Teasy多克隆位点中的Xhol和EcoRI位点，将该片段定向连入相同内切酶处理过的pPIC9K连接，实现定向克隆。毕赤酵母的转化方法主要有电穿孔法、原生质法、PEG1000法和氯化锂法。电穿孔法的转化效率最高，每昭质粒DNA可产生103-104个转化子，但需要特殊设备电转化仪。原生质法也可获得较好的转化效率，但需要价格较昂贵的Zymolyase来部分水解细胞壁，实验过程也较为烦琐。PEG1000转化方法简单、经济，每昭质粒DNA可产生102-103个转化子。本研究采用这种方法也取得了较好的转化效果，转化后每个7cm平板平均获得100-200个转化子。优点及效果由于PTHrP在人体中的表达量极低，仅靠单纯从组织中提取目的蛋白难以得到预期产量。用本发明方法制备重组人甲状旁腺素相关蛋白1-86，1-141，操作简便，安全可靠。经纯化后，重组多肽PTHrPl-86，l-141可以满足生物活性测定以及动物实验的要求，并可用于骨质疏松的治疗。大鼠作为实验动物，成本较低，操作简便，结果具有可重复性。该治疗及给药方法操作简便，作用直接，效果明显。图l.以基因组DNA为模板PCR扩增PTHrPl-141基因，其中1为DNAMarkerDL2000:2000,1000,750，500,250,100bp2为PTHrPl-141的PCR扩增产物。图2.重组质粒pGEM-Teasy/PTHrPl-141酶切鉴定，1.DNAMarkerDL2000:2000,1000,750,500，250,100bp2.pGEM-Teasy3.pGEM-Teasy/PTHrPl-141重组质粒经酶切产物。图3.以pGEM-Teasy/PTHrPl-141为模板PCR扩增PTHrPl-141基因，1.DNAMarkerDL2000:2000,1000,750,500，250，lOObp2.PTHrPl-141PCR扩增产物。图4.以pGEM-Teasy/PTHrPl-141为模板PCR扩增PTHrPl-86基因，1.DNAMarkerDL2000:2000,1000，750,500,250,lOObp2.PTHrPl-86PCR扩增产物。图5.pQE-30Xa/PTHrPl-141和pQE-30Xa/PTHrPl-86表达载体的构建。图6.pQE-30Xa/PTHrPl-141重组质粒酶切鉴定图，其中l为l.DNAMarkerDL2000:2000,1000,750,500，250,100bp;2.重组质粒pQE-30Xa/PTHrPl-141经PvwII酶产物；3.重组质粒pQE-30Xa/PTHrPl-141。图7.pQE-30Xa/PTHrPl-86重组质粒酶切鉴定图，其中l为l.DNAMarkerDL2000:2000,1000,750,500,250，100bp;2.重组质粒pQE-30Xa/PTHrPl-86经PvuII酶切产物；3.重组质粒pQE-30Xa/PTHrPl-86。图8pQE-30Xa/PTHrPl-141在Eco〃M15[pREP4]中表达产物的SDS-PAGE电泳结果，其中l为M15[pREP4]诱导表达，碎菌沉淀；2为M15[pREP4]诱导表达，碎菌上清；3为空pQE-30Xa质粒转化的M15[pREP4]诱导表达，碎菌沉淀；4为空pQE-30Xa质粒转化的M15[pREP4]诱导表达，碎菌上清；5为pQE-30Xa/PTHrPl-141重组质粒转化的M15[pREP4]诱导表达(0.1mmol/LIPTG)，碎菌沉淀；6为pQE-30Xa/PTHrPl-14I重组质粒转化的M15[pREP4]诱导表达(0.Immol/LIPTG),碎菌上清；7为pQE-30Xa/PTHrPl-141重组质粒转化的M15[pREP4]诱导表达(2.0mmol/LIPTG)，碎菌沉淀；8为pQE-30Xa/PTHrPl-141重组质粒转化的M15[pREP4]诱导表达(2.0mmol/LIPTG)，碎菌上清；9为蛋白质分子量标志116.0kD、66.2kD、45.0kD、35.0kD、25.0kD、18.4kD、14.4kD。图9.pQE-30Xa/PTHrPl-86在五.co/z'M15[pREP4]中表达产物的SDS-PAGE电泳结果，其中l为M15[pREP4]诱导表达4小时，碎菌上清；2为空pQE-30Xa质粒转化的M15[pREP4]诱导表达4小时，碎菌上清；3为pQE-30Xa/PTHrPl-86重组质粒转化的M15[pREP4]诱导表达4小时(1.Ommol/LIPTG)，碎菌上清；4为pQE-30Xa/PTHrPl-86重组质粒转化的M15[pREP4]诱导表达4小时(2.0mmol/LIPTG)，碎菌上清；5为多肽分子量标志16.95kD、14.44kD、10.60kD;6为M15[pREP4]诱导表达4小时，碎菌沉淀；7为空pQE-30Xa质粒转化的M15[pREP4]诱导表达4小时，碎菌沉淀；8为pQE-30Xa/PTHrPl-86重组质粒转化的M15[pREP4]诱导表达4小时(1.Ommol/LIPTG)，碎菌沉淀；9为pQE-30Xa/PTHrPl-86重组质粒转化的M15[pREP4]诱导表达4小时(2.0mmol/LIPTG)，碎菌沉淀。图IO.重组蛋白PTHrPl-141的WesternBlotting鉴定，其中1为蛋白质分子量标志(氨基黑染色)66.2kD，45kD，35kD,25kD,18.4kD,14.4kD;2为诱导表达产物显色结果。图11.重组蛋白PTHrPl-86的WestemBlotting鉴定，其中1为多肽分子量标志(氨基黑染色)16.95kD、14.44kD、10.60kD;2为诱导表达产物显色结果。图12.重组PTHrPl-141和PTHrPl-86生物活性测定。图13.酵母表达穿梭质粒pPIC9示意图。图14.质粒pPIC9K-PTHrPl-86的PCR鉴定.1:以空质粒pPIC9K为模板的PCR产物；2，3，5，6，7:以重组质粒pPIC9K-PTHrpl-86为模板的PCR产物；4:DNA分子量Marker2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp，100bp。图15.酵母培养基上清经SDS-PAGE电泳后凝胶银染结果。1:pPIC9K转化子诱导表达120小时培养液上清电泳；2:pPIC9K/PTHrP转化子诱导表达12小时培养液上清电泳；3:pPIC9K/PTHrP转化子诱导表达24小时培养液上清电泳；4:pPIC9K/PTHrP转化子诱导表达48小时培养液上清电泳；5:蛋白质分子量标志97.4KD，66.2KD,43.0KD，31.0KD,20.0KD,14.4KD;6:pPIC9K/PTHrP转化子诱导表达72小时培养液上清电泳；7:pPIC9K/PTHrP转化子诱导表达％小时培养液上清电泳；8:pPIC9K/PTHrP转化子诱导表达108小时培养液上清电泳；9:pPIC9K/PTHrP转化子诱导表达120小时培养液上清电泳。图16.对大鼠骨密度值的影响，去势组P0.05,其余组无差别。图17.对大鼠血清骨钙素水平的影响，去势组P<0.05,PTHl-34高剂量组、PTH1-141高剂量组与PTHI-141低剂量组相比PO，05。图18.对大鼠肱骨的影响，去势组P〈0.05，余组无差别。图19.对大鼠血清碱性磷酸酶的影响，PTHl-34高剂量组、PTHrPl-141高剂量组高于其余各组。图20.对大鼠血清钙磷的影响，假手术组PO.05,去势组、PTH1-141高剂量组分别和PTH1-141低剂量组相比P<0.05。图21.对大鼠股骨最大应力的影响。图22.对大鼠股骨最大载荷的影响。图23.对大鼠股骨最大变形能力的影响。图24.对大鼠股骨伸长率的影响。图25.对大鼠股骨骨体积的影响。图26.对大鼠股骨单标记表体积的影响。图27.对大鼠股骨双标记表体积的影响。图28.对大鼠股骨单双标记表体积比的影响。图29.对大鼠股骨类骨质表体积的影响。图30.对大鼠股骨类骨质宽度的影响。图31.对大鼠股骨吸收表面积的影响。图32.对大鼠股骨矿化率的影响。图33.对大鼠股骨矿化时间的影响。图34.对大鼠股骨骨重建时间的影响具体实施方式下面通过实施例详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解，下述实施例仅是用于举例说明的目的，并不应被解释为对本发明的限制。本发明的保护范围由后附的权利要求所限定。大肠杆菌JM109菌株购自QIAGEN公司，大肠杆菌￡.co//M15[pREP4]菌株购自QIAGEN公司；大鼠骨肉瘤细胞系UMR106为本室保存购自美国ATCC(AmericanTissueCultureCollection);;pGEM-TEasy载体购自Promega公司，pQE-30Xa购自QIAGEN公司。限制性核酸内切酶EcoRUa/UmUvMII，r7^DNA聚合酶、iVo6e^DNA聚合酶，核酸分子量标志物DL2000，dNTP购自TaKaRa公司；T4DNA连接酶购自Promega公司；多肽分子量标志物购自Sigma公司；中分子量蛋白标志物、RNase购自Fermentas公司。氨苄青霉素、卡那霉素、异丙基硫代-P-D-半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-(3-D-半乳糖苷(X-gal)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三羟甲基甘氨酸(Tricine)、十二烷基硫酸钠(SDS)购自华美生物工程公司。3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、琼脂糖、甘氨酸、溴化乙锭(EB)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、环磷酸腺苷(cAMP)为美国Sigma公司产品。过硫酸铵(AP)、四甲基乙二胺(TEMED)、丙烯酰胺及亚甲基双丙烯酰胺购自美国USB公司。HRP标记的兔抗山羊IgG购自北京鼎国生物工程公司。山羊抗人PTHrP(N-19)IgG购自SANTACRUZ公司。hPTHl-34购自BACHEM公司。其他试剂均为进口或国产分析纯。酵母提取物(YeastExtract)、胰蛋白胨(Tryptone)、琼脂(Agar)、DMEM培养基均为GIBCO产品。胎牛血清购自Hyclone。DNA快速纯化回收试剂盒购自北京鼎国生物科技公司。ProbandNi-NTA亲和层析蛋白纯化试剂盒购自Iiwitrogen公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒为P正RCE公司产品。DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。实施例1.pGEM-Teasy/PTHrpl-141重组质粒的构建(1)PTHrPl-141基因的获得按照TKM法[38]自全血中提取人基因组DNA。以提取的人基因组DNA为模板，以下列引物通过PCR扩增PTHrPl-141基因.-上游引物5'---GCa^TTCATGGCTGTGTCTGAACATCAGCTCCTC—3，(SEQIDN0:1)，其中^ia为起始密码子；斜线表示的碱基为E"RI酶切位点。下游引物5,-—GGGrCG^giTAATGCCTCCGTGAATCGAGCTC-—3，(SEQIDN0:2)，其中斜线表示的碱基为酶切位点，XIA.为终止密码子TAA的反密码子。PCR反应体系如下基因组DNA为l.OW，10xPCR缓冲液为2.5^1，dNTP(各2.5mmol/L)为1.5jil，上游引物(5pmol/L)为1.0^1，下游引物(5pmol/L)为l.OW，rragDNA聚合酶(IU/^iL)为l.Opl，ddH20为PCR反应条件为95。C预变性5min;95'C变性45sec，58。C退火45sec，72。C延伸45sec，30个循环；最后72"延伸10min。取2(ilPCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，以核酸分子量标志物DL2000为参照，扩增产物分子量大小为423bp(SEQIDNO:3)，见图l。(2)构建重组质粒pGEM-Teasy/PTHrP-141将上述PCR扩增产物经DNA快速纯化回收试剂盒(购自北京鼎国生物科技公司)回收后与pGEM-Teasy载体进行连接。然后转化到按照Nishimmra法[39]制备的感受态菌￡.co//JM109中。碱裂解法[39',小量提取质粒。经限制性内切酶&oRI(8-20U/Ml)0.5pl，(8-20U/Ml)0.5Ml酶切鉴定，可见3000bp和450bp左右两条片段，见图2。将重组质粒命名为pGEM-T/PTHrPl-141。实施例2.pQE-30Xa/PTHrPl-141和pQE-30Xa/PTHrPl-86重组质粒的构建和表达(1)扩增PTHrPl-141和PTHrPl-86片段以上述重组pGEM-Teasy/PTHrP1-141质粒为模板，如下通过PCR扩增PTHrPl-141和PTHrPl-86片段上游引物(PTHrPl-141和PTHrPl-86共用)5，-—ATGGCTGTGTCTGAACATCAG-—3，(SEQIDNO:4)下游引物(PTHrPl-141用)，其中斜线表示的碱基为&n酶切位点5，-CCGrC04GIIMTGCCTCCGTGAATC-3，(SEQIDNO:5〉(PTHrPl-86用)5，-GTCAATGCG论GACH4AGGTGTCTTGAGCGGCTG-3'(SEQIDNO:6)PCR反应条件为95。C预变性5min;95。C变性45sec，58。C退火45sec，72°C延伸45sec，30个循环；最后72。C延伸10min。PTHrPl-141片段的大小为423bp(SEQIDNO:3)，见图3。PTHrPl-86片段的大小为258bp，见图4(SEQIDNO:7，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示)。(2)pQE-30Xa/PTHrPl-141和pQE-30Xa/PTHrPl-86重组质粒的构建将pQE-30Xa载体经&MI和1双酶切后，分别与部分(l)中得到的PCR扩增产物PTHrPl-141和PTHrPl-86的1单酶切产物连接。质粒pQE-30Xa、PTHrPl-141和PTHrPl-86序列上都有一个限制性核酸内切酶尸v"II的酶切位点。连接产物若为pQE-30Xa/PTHrPl-141重组子，则酶切后会产生3285bp和613bp两个酶切片段；若为pQE-30Xa/PTHrPl-86重组子，则酶切后会产生3285bp和448bp两个酶切片段；若为载体自连，则酶切产生一个3509bp的酶切片段，即线性化的质粒pQE-30Xa。将上述质粒经尸v"II酶切鉴定证实获得上述重组质粒(见图6和7)。对酶切鉴定有阳性结果的重组子进行DNA序列分析，进一步证实为正确的重组子。(3).PTHrPl-141和PTHrPl-86在Eco"M15[pREP4]中的表达将重组子pQE-30Xa/PTHrPl-141和pQE-30Xa/PTHrPl-86转化Eco//M15[pREP4]。IPTG(终浓度为lmmol/L)诱导分别转化重组pQE-30Xa/PTHrP1-141和pQE-30Xa/PTHrPl-86质粒的Eco/z'M15[pREP4]菌6个小时。通过SDS-PAGE[39',鉴定pQE-30Xa/PTHrPl-141诱导表达产物。以不含有pQE-30Xa质粒的M15[pREP4]宿主菌和含空白pQE-30Xa质粒的宿主菌为对照，表达的融合蛋白包括担体蛋白(2.2kD)和PTHrPl-141(16.2kD)，故应在约18-19kDa处可见深染蛋白条带。目的条带比预测分子量略大结果。见图8。通过SDS-PAGE鉴定pQE-30Xa/PTHrPl-86诱导表达产物。以不含有pQE-30Xa质粒的五.co/z'M15[pREP4]宿主菌和含空白pQE-30Xa质粒的宿主菌为对照，表达的融合蛋白包括担体蛋白(2.2kD)和PTHrPl-86(10.0kD)，故应在约12-13kDa处可见深染蛋白条带。结果见图9。碎菌上清中融合蛋白质的产量随IPTG终浓度增加而增加，在1.0mmol/L时达到高峰。半干法将凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜上，以山羊抗人PTHrP(N-19)多克隆抗体为一抗，辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG抗体为二抗进行WesternBlot网鉴定。用于WesternBlotting检测的PVDF膜经底物显色后有一条约22kD的深染条带，其位置与重组质粒诱导表达产物的特异性条带位置一致，见图IO。用于WesternBlotting检测的PVDF膜经底物显色后有一条约12kD的深染条带，其位置与重组质粒诱导表达产物的特异性条带位置一致，见图11。同时，使用Invitrogen公司ProBandPurificationSystem试剂盒纯化重组蛋白。实施例3.重组PTHrPl-141和PTHrPl-86生物活性测定[45'46]PTH与PTHrP是通过共同的受体发挥生理功能的"9，，具有生物活性的PTH或PTHrP与受体结合后可触发一系列由细胞内第二信使cAMP引发的级联反应，因而细胞内cAMP浓度将显著升高。通过测定大鼠成骨肉瘤细胞系UMR106细胞内的cAMP的变化(见下表1)，检测重组PTHrPl-86及PTHrPl-141是否具有生物学活性。测定结果显示，重组PTHrPl-141及PTHrPl-86均能使细胞内cAMP水平呈剂量依赖性升高,前者作用更为明显，但二者作用强度都低于PTHl-34，见图12。具体过程如下。1.细胞培养与样品处理复苏大鼠骨肉瘤细胞系UMR106["，传代2-3次后，接种到24孔板。37°C，5%C02，以DMEM完全培养液培养，当细胞达到80%融合(106以上)时，弃去培养液，以冷PBS淋洗细胞2次，加入无血清DMEM培养液，5。/。C02下37。C培养24hr。弃去无血清培养液，以冷PBS溶液淋洗2次。加入含lmmol/LIBMX的上述无血清培养液，作用60min，以抑制磷酸二酯酶的活性。以生理盐水为空白对照，hPTHl-34为阳性对照，三种样品(hPTHl-34、重组PTHrPl-141禾tlPTHrPl-86)终浓度分别为10—10mol/L、l(T9mol/L、10—8mol/L、l(T7mol/L、l(T6mol/L、l(T5mol/L。5%C02，37t:作用5min。4。C冰浴终止反应，弃去培养液，冷PBS洗2次，加入lmL冷酸乙醇(0.01mol/LHC1、95%乙醇)，一20。C放置24小时，萃取cAMP。反复冻融3次，将细胞刮下，收集细胞悬液。超声破碎细胞(40W，每次3sec，间隔3sec，共20次)。4°C，15000xg离心10分钟，上清置新管中，8(TC烘干，以100pLTE复溶，用于cAMP测定。2.cAMP含量测定HPLC测定cAMP含量。以峰上面积值与cAMP标准曲线峰下面积值相比，得出待测样品的cAMP值。cAMP标准品购自SIGMA公司，将标准品稀释成不同浓度，建立标准曲线。3.以细胞裂解液的总蛋白浓度对cAMP含量测定结果进行校正BCA法测定细胞裂解液的总蛋白浓度，并将测得的细胞内cAMP含量测定结果与之相比，以二者比值作为校正后的cAMP含量测定结果。表1重组PTHrPl-86及PTHrPl-141对细胞内cAMP水平的刺激作用<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>rhPTHrPl-86io-1047.38rhPTHrPl-86lO-957.45rhPTHrPl-8610'8154.12rhPTHrPl-86l(T7200.22rhPTHrPl-86265.87rhPTHrPl-86l(T5315.99rhPTHl-34lO.1061.59rhPTHl-3410-9144.86rhPTHl-34l(T8283.06rhPTHl-34lO-7495.59rhPTHl-34l(T6729.05PTH1-3410-5948.15实施例3.pPIC9k/PTHrPl-141和pPIC9k/PTHrPl-86重组质粒的构建和表达(1).重组质粒pPIC9K/PTHrPl-86的构建将实施例2中得到的PTHrPl-86片段连入pGEM-Teasy(方法同前)后，经过XhoI、EcoRI酶切后回收纯化所需DNA片段，与经过同样酶切处理的表达质粒pPIC9(图13)进行连接。将重组质粒pIC9/PTHrPl-86进行酶切鉴定及序列测定(测序引物为Iiwitragen提供的5，A0X1)以确定获得正确的重组子。(2).重组子的转化将空质粒pPIC9K和上述重组质粒pIC9/PTHrPl-86经Sail酶切线性化后，利用电转化法转化毕赤酵母菌株GS115(购自Iiwitrogen公司)。涂布于MD平板(1.34%YNB(酵母氮源，是不含任何碳源的完全人工合成培养基)，4"0-5%生物素，2%葡萄糖，1.5%琼脂)3(TC倒置培养两天，将生长出的各个菌落接种于YPD培养基(10g/L酵母粉;20g/L蛋白胨;20g/L葡萄糖)，震荡培养后，提取酵母基因组DNA作为模板，利用上述PCR法(同实施例2)筛选重组子。结果可见重组质粒pIC9/PTHrPl-86与空pPIC9转化的酵母菌株有不同大小扩增带，重组质粒扩增出两条带一条大小为2200bp，是酵母A0X1基因的PCR扩增产物；另一条为771bp,是pPIC9上下游引物相对应之间的片段492bp与插入片段279bp之和。结果见图14。说明重组质粒pIC9/PTHrPl-86已整合到酵母染色体上。(4).重组酵母菌株的诱导表达挑取上述重组的毕赤酵母单菌落(分别是空质粒转化产物，及重组质粒转化产物)接种于100mLBMGY培养液(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，10g/L甘油，13,4g/LYNB，0.4mg/L生物素，0.1mol/L磷酸钾缓冲液)中，3(TC振荡培养直到OD6,4.0。离心收集菌体，弃去BMGY培养液，换上25mlBMMY培养液(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，10g/L甘油，13.4g/LYNB,0.4mg/L生物素，O.lmol/L磷酸钾缓冲液)，3(TC继续振荡培养，每过24h加入甲醇0.125ml(终浓度为0.5%V/V)开始诱导表达。5天后停止培养，15000xg离心保留上清，并取适量进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。含PTHrP成熟肽编码序列的重组酵母菌株在10KD处可见一明显的蛋白着色带，而对照酵母菌株(空质粒转化的酵母细胞株)则无该条带，见图15。(5).发酵(5L):5.1种子液的培养挑取上述鉴定的重组的毕赤酵母单菌落接种于100mLBMGY培养基中，3(TC振荡培养至OD60(T3.0(约18hrs)。5.2发酵将种子液转移到5LBMGY培养基中，加入7.5%的卡那霉素5ml(终浓度为75pg/ml)，30°C，进行发酵培养。每Ihr取样测定培养基OD,的吸光度值，培养至OD6of2.0(约10hrs)。5.3诱导表达2OOOxg室温离心5min收集菌体，以500mlBMMY培养基悬浮菌体，3(TC继续震荡培养，每隔24hr加入甲醇2.5ml(终浓度为0.5%V/V)。共诱导表达144hr，期间于72hr、96hr及120分别留取少量样本。5.4电泳鉴定15OOOxg离心保留上清，取少量如上用于SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。实施例4.重组质粒pPIC9K/PTHrPl-141的构建(1)重组质粒pPIC9K/PTHrPl-141的构建将上述获得的pGEM-Teasy/PTHrPl-141转入大肠杆菌JM109，培养后经碱裂解法提取质粒，经过XhoI、EcoRI酶切后回收纯化所需DNA片段，与经过同样处理的表达质粒pPIC9进行连接。重组质粒进行酶切鉴定。同时进行序列测定，领,引物为Irwitrogen提供的5，A0X1。(2).重组子的转化pIC9/PTHrPl-141经Sail酶切线性化采用PEG法[39]转化毕赤酵母GS115感受态细胞(同时用空质粒进行转化)，涂布于MD平板(1.34。/。YNB,4xl0。生物素，2%葡萄糖，1.5%琼脂)3(TC倒置培养两天，将生长出的各个菌落接种于YPD培养基，震荡培养后，提取酵母基因组DNA作为模板，PCR法(同实施例2)筛选重组子。结果可见重组质粒pIC9/PTHrPl-141与空pPIC9转化的酵母菌株由不同大小扩增带，重组质粒扩增出两条带.-一条大小为2200bp，是酵母A0X1基因的PCR扩增产物，另一条为936bp，是pPIC9上下游引物之间的片段492bp与插入片段444bp之和。说明重组质粒pIC9/PTHrPl-141已整合到酵母染色体上。(4).重组酵母菌株的诱导表达挑取重组的毕赤酵母单菌落(空质粒转化产物，及重组质粒转化产物)接种于100mLBMGY培养液中，30。C振荡培养直到OD6Q()=4.0。离心收集菌体，弃去BMGY培养液，换上25mlBMMY培养液,30。C继续振荡培养，每过24h加入甲醇0.125ml(终浓度为0.5%V/V)开始诱导表达。5天后停止培养，15OOOxg离心保留上清，并取适量进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。含PTHrPl-141成熟肽编码序列的重组酵母菌株在22KD处有一明显的蛋白着色带可见，而对照酵母菌株(空质粒转化的酵母细胞株)则无该条带。(5).发酵(5L)同实施例3的部分(5)实施例5.治疗作用鉴定1.动物选择和分组选择雌性SD(Sprague-Dawley)大鼠160只，12周龄，体重225-308克，平均262.87±18.68克，购自北京大学医学部实验动物科学部(实验动物质量合格证编号0034797)，动物级别为二级(清洁级)。试验期间动物自由饮水，进食。饲料为标准颗粒饲料，饮水为自来水，铁笼喂养，自然昼夜光线照明，室内通风良好(相对湿度40-70%，室温保持在18-20°C)。动物分组所选动物按体重分组，遵循随机原则分为6组假手术组、阴性对照组、PTHl-34高剂量组、PTHl-34低剂量组、PTHrPl-86高剂量组、PTHrPl-86低剂量组。每组动物20只，除假手术组外，其余各组均行去势手术。2..去势动物模型的制备使用10%水合氯醛，按0.3mL/100g体重经腹腔注射麻醉大鼠。麻醉后，将大鼠按俯卧位固定，备皮消毒后，经背部切口，钝性分离肌肉组织后，打开腹膜腔，确认卵巢后予以结扎、切除。将组织送回体内，庆大霉素冲洗腹腔后缝合伤口，待其自然苏醒。去势手术16周后，测定大鼠腰椎骨密度，确认动物模型造模成功。3.给药过程术后20周后，每日经颈背部皮下给药一次，持续给药6周。各组给药如下假手术组给溶媒(酸化生理盐水)，阴性对照组给溶媒，PTH1-34高剂量组给PTH1-34蛋白购自上海赛金生物医药有限公司。(40nmol/kg体重)，PTHl-34低剂量组给PTHl-34(5nmol/kg体重)，PTHrPl-86高剂量组给重组PTHrPl-86蛋白(40nmo歐g体重)，PTHrP1-86低剂量组给重组PTHrPl-86蛋白(5nmol/kg体重)，PTHrPl-141高剂量组给重组PTHrPl-141蛋白(40nmol/kg体重)，PTHrPl-141低剂量组给重组PTHrPl-141蛋白(5nmol/kg体重)。给药结束前10天和给药结束前3天分别经腹腔注射四环素标记。给药结束后，经股动脉放血处死动物。4.检测如下指标按照现有技术[57,58，59]，检测如下指标(1)常规生化检查(a)对大鼠骨密度值的影响(见图16)去势组PO.05,其余组无差别。(b)对大鼠血清骨钙素水平的影响(见图17)去势组PO.05，PTHl-34高剂量组、PTH1-141高剂量组与PTHl-14i低剂量组相比P0.05(c)对大鼠肱骨的影响(见图18)去势组P0.05，余组无差别(d)对大鼠血清碱性磷酸酶的影响(见图19)PTH1-34高剂量组、PTHrPl-141高剂量组高于其余各组(e)对大鼠血清钙磷的影响(见图20)假手术组P^.05,去势组、PTH1-141高剂量组分别和PTH1-141低剂量组相比P<0.05。(2)对成骨作用的影响——生物力学试验，骨计量学检测在WDW-10KN微机控制电子万能试验机做三点弯曲实验，加载点位于股骨干上1/3处，两侧支点标距为20mm，试验机匀速加载，加载速度为2mm/min。检测如下指标对大鼠股骨最大应力的影响(见图21)对大鼠股骨最大载荷的影响(见图22)对大鼠股骨最大变形能力的影响(见图23)对大鼠股骨伸长率的影响(见图24)对大鼠股骨骨体积的影响(见图25)对大鼠股骨单标记表体积的影响(见图26)-对大鼠股骨双标记表体积的影响(见图27)对大鼠股骨单双标记表体积比的影响(见图28)对大鼠股骨类骨质表体积的影响(见图29)对大鼠股骨类骨质宽度的影响(见图30)对大鼠股骨吸收表面积的影响(见图31)对大鼠股骨矿化率的影响(见图32)对大鼠股骨矿化时间的影响(见图33)对大鼠股骨骨重建时间的影响(见图34)综合以上结果可见，去势组各项力学指标显著降低，而PTHrPl-86和PTHrPl-141组的结构力学和材料力学指标显著增高，说明PTHrPl-86和PTHrPl-141可使骨的力学性能提高，抗弯曲强度高，抗变形能力增强，韧性增高，脆性降低。不易发生断裂。证明PTHrPl-86和PTHrPl-141能有效提高骨的抗骨折能力，对治疗和预防骨质疏松有一定疗效。实验结果证实，PTHrPl-86和PTHrPl-141可使骨转换加快，促进新骨生成，使骨的力学性能提高，抗弯曲强度高，抗变形能力增强，韧性增高，脆性降低，不易发生断裂。证明PTHrPl-86能有效提高骨的抗骨折能力，对治疗和预防骨质疏松有一定疗效。同时证明该动物实验方法该方法行之有效，可以很好地测定PTHrPl-86对骨质疏松的治疗作用。参考文献1.BurtisWJ，BradyTG,OrloffJJ,eZImmunochemicalcharacterizationofcirculatingparathyroidhormone-relatedproteininpatientswithhumoralhypercalcemiaofcancer.A/^wg/JMW.1990;322:1106-11122.StewartARHypercalcemiaassociatedwithcancer.TV/她d.2005;352:373-3793.StrewlerGJ,WilliamsRD，NissensonRA.Humanrenalcarcinomacellsproducehypercalcemiainthenudemouseandanovelproteinrecognizedbyparathyroidhormonereceptors.JC7/"/"v饥1983;71:769-7744.StewartAF,InsognaKL,GoltzmanD,&a/.Identificationofadenylatecyclase-stimulatingactivityandcytochemicalglucose-6-phosphatedehydrogenase-stimulatingactivityinextractsoftumorsfrompatientswithhumoralhypercalcemiaofmalignancy.jV"/Jcaci7&4.1983;80:1454_14585.SuvaLJ,WinslowGA,WettenhallRE,a/.Aparathyroidhormone-relatedproteinimplicatedinmalignanthypercalcemia:cloningandexpression.5We亂1987;237:893-8966.PhilbrickWM，WysolmerskiJJ,GalbraithSa/.Definingtherolesofparathyroidhormone-relatedproteininnormalphysiology,尸/z戸'o/ogy./卯(5;76:127-1737.StrewlerGJ.MechanismsofDisease:ThePhysiologyofParathyroidHormone—RelatedProtein.屈"g〃Med2000;342:177-1858.MartinTJ,MoseleyJM,^VilliamsED.Parathyroidhormone-relatedprotein:hormoneandcytokine.J￡>2<ic>cn>2o/.1997;154:S23-S379.KaraplisAC,LuzA,GlowackiJ,a/.Lethalskeletaldysplasiafromtargeteddisruptionoftheparathyroidhormone-relatedpeptidegene.Gew&sDev.1994;8:277-289lO.SoegiartoDW,KiachopoulosS,SchipaniE，a/.PartialrescueofPTH/PTHrPreceptorknockoutmicebytargetede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