专利名称：三维立体式培养肝细胞的生物反应器的制作方法
技术领域：
本发明专利涉及一种医疗设备，特别是一种既可以作为体外生物 人工肝支持系统的核心装置，也可以作为一种实验装置或生物制剂装 置，还可以用于培养肝细胞的实验研究和提取细胞产品的小型生产装 置。
背景技术：
现有的用于临床上的生物反应器是中空纤维型反应器，其结构与 血液透析器完全相同，只是所用半透膜的材料、孔径及分子截留量不
同，该中空纤维型反应器是将一束(50 100根)中空纤维密封于透 明有机材料外壳内，由中空纤维将其分为内、外两腔，分别用于放置 肝细胞和流动患者血液，借助该中空纤维半透膜，进行双向物质传输 和免疫阻隔作用，从而实现生物人工肝支持与治疗作用。
这种模式的反应器在实际应用屮存在诸多的缺陷1.在结构上，
传统普通反应器的中空纤维平行密集排列，呈束状柱形，较少考虑肝
细胞的培养环境，肝细胞培养与物质转运、交换不协调；2.在细胞培 养方面，只能为肝细胞提供二维培养，不能提供三维培养微环境，不 利于肝细胞在体外的组织化培养和功能恢复；3.在细胞分布方面，当 加入细胞受重力的作用往往沉积于反应器底部，无法均匀分布于中空 纤维之间，即使细胞可以到达纤维束中间也会因氧供不足而失活；4. 在临床肝支持中，该传统反应器因细胞量少(一般仅有1% 5%的成人 肝细胞量)、活力低、功能差而难以发挥应有的生物学功能和作用。
目前，还有一种灌流床式支架型反应器，它是生物人工肝细胞培 养或生物人工肝研究和动物实验使用较多的反应器，其结构是将不同 材料或不同孔径的三维支架材料密封于外壳内，利用三维支架为肝细 胞提供三维培养微环境。当进行肝细胞培养时，不断循环地从外壳通 入培养液，培养液经三维支架与肝细胞之间的缝隙进行循环流动，为
肝细胞提供丰富的氧气及营养物质；当作为生物人工肝进行研究或临 床使用时，将患者的血液或血浆不断地从外壳通入，血液或血桨经三 维支架与肝细胞之间的缝隙进行循环流动，正常肝细胞对血浆或血液
进行解毒。
该生物反应器存在的如下的缺点l.从反应器结构上，当作为生 物人工肝研究或临床使用时，患者血液或血浆直接与三维支架内的肝 细胞接触，无任何免疫阻隔作用，不利于保护患者的免疫安全，难以
在临床推广使用；2.当进行肝细胞培养时，在营养供应方面，营养
液通过三维支架和肝细胞之间的缝隙流过，随着肝细胞的生长，缝隙 逐渐变小，使循环流动的营养液易受阻塞，导致循环不畅，灌流不均，
营养供应受限；3.血液、血浆或营养液受到泵的作用下进行循环流动， 使细胞受直接受到较大的剪切力，容易造成肝细胞的损伤。
所以，上述缺陷是目前生物人工肝治疗肝衰竭疗效难以进一步提 高的重要因素之一。
发明内容
本发明专利的目的就是提供一种结构简单和使用方便的三维立 体式生物反应器，它可以为肝细胞提供更符合生理环境的生长与培养 条件，有利于培养出具有高活性、高密度的肝细胞，最大限度地发挥 生物学作用，实现肝特异性解毒功能、生物合成与转化代谢功能，实 现肝细胞培养、免疫阻隔、物质传输的完美结合，保障以此为核心的 生物人工肝的肝支持与治疗作用。
本发明的目的是通过这样的技术方案实现的，它包括有带细胞加 入口和排气口的细胞培养腔，紧邻于细胞培养腔处设置有带培养液入口的 进流腔和带培养液出口的出流腔，位于细胞培养腔内的多根中空纤维的一 端均与进流腔相通，另一端均与出流腔相通，进流腔、出流腔与多根中空 纤维一起构成培养液过流通道，培养液过流通道与细胞培养腔之间通过中 空纤维上的微孔彼此相通，其特征在于细胞培养腔内设置有三维多孔支 架材料。
在本发明中，所述的三维多孔支架材料是生物医学领域组织工程中所 指的生物材料，它是种子细胞形成组织之前赖以生存和依附的三维支架， 它能将细胞固定于一定的位置，为其生长、繁殖、新陈代谢及细胞外基质 分泌等生理活动提供场所，并引导再生组织基本形状。因此，它既具有良 好生物相容性，又具有特定形状和三维连通多孔结构的支架材料，主 要为细胞生长提供支持和三维生K:空间，包括可降解和非可降解三维 支架材料，如壳聚糖、胶原、纤维蛋白、聚乳酸、聚乳酸一聚羟乙酸 酯、聚氨酯等。
三维多孔支架材料可以充满于整个细胞培养腔内，也可以是这样布置 在细胞培养腔内的多层三维多孔支架材料彼此相隔一段距离依次分布在 细胞培养腔内，且每层三维多孔支架材料均充满细胞培养腔所对应的横断 面上。当然，使用者或生产者可以根据实际需要将三维多孔支架材料随意 地设置于细胞培养腔内。
本发明可以用于肝细胞的培养，也可以用于体外生物人工肝，还 可以用于实验研究及用于制备生物制剂。
用本发明进行培养肝细胞培养的方法是
1、 将本发明专利放置到细胞培养箱内，予以95%的氧气、5%的二
氧化碳和100%的湿度条件。
2、 将经过体外消化技术分离的肝细胞，运用离心接种法和循环
灌流接种法接种到本发明的细胞培养腔中的三维多孔支架材料内，具
体步骤如下
(1) 、离心接种法将肝细胞悬液经肝细胞加入口加入到细胞培
养腔内，每次加入量为30 100克，并进行离心处理3分钟，将本发 明上下顺序颠倒，反复离心5次。
(2) 、循环灌流接种法肝细胞加入口通过蠕动泵和硅胶管与排
气口连通，以构成-一个循环通道，在蠕动泵的作用下，使肝细胞培养
内的肝细胞悬液以lml/分钟的速度在循环通道内循环流动，30分钟 后，使肝细胞均匀分布于肝细胞培养腔中的三维多孔支架材料内。
(3) 、去掉蠕动泵和硅胶管，封闭肝细胞加入口和排气口。
3、 将本发明进行如下的连接培养液池通过硅胶管、蠕动泵、 氧合器与本发明的培养液入口连通，本发明的培养液出口通过硅胶管通至 培养液池，从而使本发明的培养液过流通道与氧合器、蠕动泵、培养液池 一起构成一个培养液循环通道。
4、 在蠕动泵的作用下，培养液进行如下的循环流动由培养液池经氧 合器流入本发明的培养液入口，然后流过培养液过流通道，再从本发明的
培养液出口返回至贮池内；培养液循环流动的速度控制在30ml/min左右。 培养液在循环流动过程中，通过中空纤维上的微孔向细胞培养腔内的肝细 胞均匀地提供丰富的氧气及营养物质，使肝细胞在三维多孔支架材料 内呈三维立体生长，从而培养出大量、高活性、高密度的肝细胞，肝 细胞具备优良的生物学功能。
利用本发明按上述的方法培养出大量的肝细胞后，就可以将本发 明用于体外生物人工肝，此时，培养液过流通道中循环通过的不是培 养液，而是患者血液或血浆，细胞培养腔中的正常肝细胞通过中空纤 维的微孔对患者的血液或血浆进行解毒，同时，阻隔了血液或血浆直 接与肝细胞直接接触，起到了免疫阻隔作用，从而发挥更好的人工肝 支持与治疗作用。当然，也可以将本明用于实验研究，它可满足肝细 胞的生理要求；将本发明用于制备生物制剂时，可提取更多的细胞产 物。
由于采用了上述技术方案，本发明专利具有如下的优点
1. 结构合理，将三维多孔支架材料和中空纤维相结合并应用到生 物反应器中，更有效地满足人工肝生物反应器对肝细胞培养、物质传 输、免疫阻隔的要求。
2. 使用中空纤维，可以有效地进行培养液或病人血液的物质传 输，同时起到免疫阻隔的作用，显著地减轻培养液的剪切力对肝细胞 的影响。
3. 利用三维多孔支架材料为肝细胞提供三维支持作用，使肝细胞 在三维多孔支架材料内呈三维立体生长，易组织化，肝细胞密度高、 数量大、功能强。
4. 三维多孔支架材料中的小孔径微孔可使肝细胞均匀地分布在 三维多孔支架材料中，避免了肝细胞沉积于细胞培养腔底部，有效克 服原有中空纤维反应器难以高效培养肝细胞的不足。
5. 培养液以辐流和弥散两种方式同时为肝细胞均匀地提供氧气 和营养物质，明显地提高营养物质和氧气的供应距离，突破弥散作用
100, 200^im的距离限制，使肝细胞得到的氧气和营养物质更加丰
虽o
6. 肝细胞代谢产物由纤维素隔离膜上的微孔辐流至辐流腔内，能 有效降低代谢产物中的毒性物质对肝细胞的毒害作用。
本发明的
如下
图1是本发明第一种实施例的结构示意图； 图2是本发明第二种实施例的结构示意图； 图3是图2中A-A剖视图4是本发明第三种实施例的结构示意图5是图4中B-B剖视图6是本发明第三种实施例使用状态的连接关系图。 图中l.壳体；2.进流腔；3.出流腔；4.纤维素隔离膜；5.细胞 培养腔；6.辐流腔；7.三维多孔支架材料；8.中空纤维；9.培养液过 流通道；IO.培养液入口； ll.培养液出口； 12.辐流液出口； 13.细胞加入
口；14.排气口；15.滤网；16.滤网；17,培养液池；18.硅胶管；19.蠕动泵；
20.氧合器；21.蠕动泵；22.硅胶管；23.废液池。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明
如图1、 2、 3所示，本发明包括有带细胞加入口 13和排气口 14的细 胞培养腔5，紧邻于细胞培养腔5处设置有带培养液入口 10的进流腔2和 带培养液出口 12的出流腔3，位于细胞培养腔5内的多根中空纤维8的一 端均与进流腔2相通，另一端均与出流腔3相通，进流腔2、出流腔3与多
根中空纤维8 —起构成培养液过流通道9，培养液过流通道9与细胞培养腔
5之间通过中空纤维8上的微孔彼此相通，其特征在于细胞培养腔5内设 置有三维多孔支架材料7。
实施例1:如图1所示，三维多孔支架材料7可以充满于整个细胞培养
腔5内。实施例2:如图2、 3所示，三维多孔支架材料7也可以是这样布
置在细胞培养腔5内的多层三维多孔支架材料7彼此相隔一段距离依次
分布在细胞培养腔5内，且每层三维多孔支架材料7均充满细胞培养腔5 所对应的横断面上。
本发明可以用于肝细胞的培养，也可以用于体外生物人工肝，还 可以用于实验研究及用于制备生物制剂。
用本发明进行培养肝细胞培养的方法是
1、 将本发明专利放置到细胞培养箱内，予以95%的氧气、5%的二 氧化碳和100%的湿度条件。
2、 将经过体外消化技术分离过的肝细胞，运用离心接种法和循 环灌流接种法接种到本发明的细胞培养腔5中的三维多孔支架材料7
内，具体步骤如下
(1) 、离心接种法将肝细胞悬液经肝细胞加入口加入到细胞培
养腔5内，每次加入量为30 100克，并进行离心处理3分钟，将本 发明上下顺序颠倒，反复离心5次。
(2) 、循环灌流接种法肝细胞加入口 13通过蠕动泵和硅胶管 与排气口 14连通，以构成一个循环通道，在蠕动泵的作用下，使肝 细胞培养内的肝细胞悬液以lnil/分钟的速度在循环通道内循环流动， 30分钟后，使肝细胞均匀分布于肝细胞培养腔中的三维多孔支架材料 7内。
(3) 、去掉蠕动泵和硅胶管，封闭肝细胞加入口 13和排气口 14。
3、 将本发明进行如下的连接培养液池17通过硅胶管18、蠕动 泵19、氧合器20与本发明的培养液入口 IO连通，本发明的培养液出 口 11通过硅胶管18通至培养液池17，从而使本发明的培养液过流通 道9与氧合器20、蠕动泵19、培养液池17 —起构成一个培养液循环 通道，可以参照图6可知。4、在蠕动泵19的作用下，培养液进行如下的循环流动由培养 液池17经氧合器20流入本发明的培养液入口 IO，然后流过培养液过 流通道9，再从本发明的培养液出口 11返回至培养液池17内；培养
液循环流动的速度控制在30ml/min左右。培养液在循环流动过程中， 通过中空纤维8上的微孔向细胞培养腔5内的肝细胞均匀地提供丰富 的氧气及营养物质，使肝细胞在三维多孔支架材料7内呈三维立体生 长，从而培养出大量、高活性、高密度的肝细胞，肝细胞具备优良的 生物学功能。
利用本发明按上述的方法培养出大量的肝细胞后，就可以将本发 明用于体外生物人工肝，此时，培养液过流通道9中循环通过的不是 培养液，而是患者血液或血浆，细胞培养腔5中的正常肝细胞通过中 空纤维8的微孔对患者的血液或血浆进行解毒，同时，阻隔了血液或 血浆直接与肝细胞直接接触，起到了免疫阻隔作用，从而发挥更好的 人工肝支持与治疗作用。当然，也可以将本明用于实验研究，它可满 足肝细胞的生理要求；将本发明用于制备生物制剂时，可提取更多的 细胞产物。
实施例3:在细胞培养腔5外，设置有包覆细胞培养腔5的辐流 腔6，细胞培养腔5的腔壁均用纤维素隔离膜4制成，细胞培养腔5 与辐流腔6之间通过纤维素隔离膜4上的微孔彼此相通，辐流腔6的 腔体上设置有与辐流腔6相通的辐流液出口 12。实现该实施例具体结 构如图4、 5所示，它是在壳体1内左右相对两侧分别设置有进流腔2 和出流腔3，在进流腔1与出流腔3之间，由桶状的纤维素隔离膜4 的内壁与进流腔2外壁、出流腔3外壁一起围成一个细胞培养腔5， 纤维素隔离膜4的外壁与壳体1内壁、进流腔2外壁、出流腔3外壁 一起围成一个辐流腔6，细胞培养腔5内充满三维多孔支架材料7， 位于细胞培养腔5内的多根中空纤维8的一端均与进流腔2相通，另 一端均与出流腔3相通，进流腔2、出流腔3与多根中空纤维8 —起 构成培养液过流通道9，培养液过流通道9与细胞培养腔5之间通过 中空纤维8上的微孔彼此相通，细胞培养腔5与辐流腔6之间通过纤
维素隔离膜4上的微孔彼此相通，壳体1上设置有与进流腔2相通的
培养液入口 10，还设置有与出流腔3相通的培养液出口 11，壳体1 上设置有与辐流腔6相通的辐流液出口 12，壳体1上设置有与细胞培 养腔5相通的细胞加入口 13和排气口 14。
如图6所示，是本发明实施例3的使用状态的连接关系图，图中， 辐流腔6的辐流液出口 12通过蠕动泵21、硅胶管22通至培养液池 17和废液池23。其它部分的连接关系与前述的实施例1、 2相同。
将本发明放置到细胞培养箱内，予以95%的氧气、5%的二氧化碳 和100%的湿度条件，它是这样培养肝细胞的将经过体外消化技术分 离的肝细胞，运用离心接种法和循环灌流接种法接种到本发明专利的 细胞培养腔5中的三维多孔支架材料7内，利用适当的离心力和循环 灌流作用使肝细胞均匀分布到三维多孔支架材料7中；然后在培养液 过流通道9中循环通过培养液，并施以一定的压力，使培养液过流通 道9与辐流腔6之间形成压力差，在这个压力差的作用下，部分培养 液从培养液过流通道9中的中空纤维8经细胞培养腔5辐流至辐流腔 6，培养液的辐流过程中， 一方面为肝细胞均匀地提供丰富的氧气及 营养物质，另一方面还带走肝细胞代谢产物至辐流腔6内，经辐流液 出口 12排出。这一过程符合正常肝脏的肝细胞生理环境和血液环境， 因此，可以培养出大量、高活性、高密度的肝细胞，肝细胞具备优良 的生物学功能。
为了防止营养液中的杂质流进细胞培养腔5内，如图1所示，进 流腔2内可以设置有与多根中空纤维8的端口相对应的滤网15。同样， 如图2所示，出流腔3内可以设置有与多根中空纤维8的端口相对应 的滤网16。如图4所示，进流腔2、出流腔3内可以均设置有与多根 中空纤维8的端口相对应的滤网15、 16。
权利要求
1.一种三维立体式培养肝细胞的生物反应器，包括有带细胞加入口(13)和排气口(14)的细胞培养腔(5)，紧邻于细胞培养腔(5)处设置有带培养液入口(10)的进流腔(2)和带培养液出口(11)的出流腔(3)，位于细胞培养腔(5)内的多根中空纤维(8)的一端均与进流腔(2)相通，另一端均与出流腔(3)相通，进流腔(2)、出流腔(3)与多根中空纤维(8)一起构成培养液过流通道(9)，培养液过流通道(9)与细胞培养腔(5)之间通过中空纤维(8)上的微孔彼此相通，其特征在于细胞培养腔(5)内设置有三维多孔支架材料(7)。
2. 如权利要求1所述的三维立体式培养肝细胞的生物反应器，其特征 在于三维多孔支架材料(7)充满于整个细胞培养腔内(5)。
3. 如权利要求1所述的三维立体式培养肝细胞的生物反应器，其特征 在于三维多孔支架材料(7)是这样布置在细胞培养腔(5)内的多层 三维多孔支架材料(7)彼此相隔一段距离依次分布在细胞培养腔(5)内， 且每层三维多孔支架材料(7)均充满细胞培养腔(5)所对应的横断面上。
4. 如权利要求1、 2或3所述的三维立体式培养肝细胞的生物反应器， 其特征在于在细胞培养腔(5)夕卜，设置有包覆细胞培养腔(5)的辐流 腔(6)，细胞培养腔(5)的腔壁均用纤维素隔离膜(4)制成，细胞培养 腔(5)与辐流腔(6)之间通过纤维素隔离膜(4)上的微孔彼此相通，辐 流腔(6)的腔体上设置有与辐流腔(6)相通的辐流液出口 (12)。
5. 如权利要求4所述的三维立体式培养肝细胞的生物反应器，其特征 在于进流腔(2)内设置有与多根中空纤维(8)的端口相对应的滤网(15)。
6. 如权利要求4所述的三维立体式培养肝细胞的生物反应器，其特征 在于出流腔(3)内设置有与多根中空纤维(8)的端口相对应的滤网(16)。
7. 如权利要求4所述的三维立体式培养肝细胞的生物反应器，其特征 在于进流腔(2)、出流腔(3)内均设置有与多根中空纤维(8)的端口 相对应的滤网(15、 16)。
全文摘要
一种三维立体式培养肝细胞的生物反应器，包括有带细胞加入口和排气口的细胞培养腔，紧邻于细胞培养腔处设置有带培养液入口的进流腔和带培养液出口的出流腔，位于细胞培养腔内的多根中空纤维的一端均与进流腔相通，另一端均与出流腔相通，进流腔、出流腔与多根中空纤维一起构成培养液过流通道，培养液过流通道与细胞培养腔之间通过中空纤维上的微孔彼此相通，其特征在于细胞培养腔内设置有三维多孔支架材料。本发明具有可以为肝细胞提供更符合生理环境的生长与培养条件，有利于培养出具有高活性、高密度的肝细胞，保障以此为核心的生物人工肝的肝支持与治疗作用。
文档编号A61F2/00GK101199436SQ200710093069
公开日2008年6月18日 申请日期2007年11月28日 优先权日2007年11月28日
发明者张世昌, 王英杰 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院