一种dna疫苗真核表达载体及其在制备基因疫苗中的应用的制作方法

专利名称：：一种dna疫苗真核表达载体及其在制备基因疫苗中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及载体及其应用，特别是涉及一种DNA疫苗真核表达载体与其在制备抗肿瘤等基因疫苗中的应用。
背景技术：
：当前，恶性肿瘤已经成为威胁人类健康的最重要杀手之一，因此，加强恶性肿瘤的防治研究具有重大意义。目前，手术切除、化疗和放疗仍然是治疗恶性肿瘤的主要治疗方法。传统的手术治疗方法虽可使患者的生存率有所提高，但是术后5年的复发率依然在半数以上，这是因为手术虽然能够有效地切除肉眼所见的瘤块，但无法保证去除所有的肿瘤细胞，也未能改变肿瘤发生的内环境；而化疗和放疗除了有严重的毒副作用外，许多肿瘤如肾癌等对其不敏感或产生抗性。肿瘤的转移和复发是影响病人预后的重要因素，更是恶性肿瘤发生和演进中最危险的阶段，目前，上述传统治疗方法在克服肿瘤复发和转移方面存在很大的局限性，成为肿瘤治疗的瓶颈。近年来逐步发展的免疫基因治疗手段，因其具有特异性高、针对性强和副作用小的特点，已经成为恶性肿瘤治疗的重要发展方向。DNA疫苗也称基因疫苗或核酸疫苗，是20世纪90年代发展起来的一种新型疫苗，它是指将外源抗原基因克隆到真核表达载体上，然后再将该重组的质粒DNA免疫动物。外源抗原基因能够在宿主体内表达，并刺激其产生体液免疫和细胞免疫。许多动物模型和人体实验都证明，DNA疫苗可以有效地激发机体的体液免疫应答和细胞免疫应答，被誉为第三次疫苗革命。DNA疫苗具有许多突出的优点①DNA质粒表达的抗原接近天然构象，抗原性强；②激发机体全面的免疫应答，其保守抗原的保护性免疫应答对不同亚型的病原体有交叉抵御作用；③制备简单，成本低廉，易进行规模化生产，且运输、保存方便；④使用安全，没有感染病原的危险，DNA疫苗仅仅是病原体某种抗原的基因片段，而不是整个病原体的基因，且利用质粒作载体，不涉及感染性因子；⑤免疫具有持续性，一次接种可获得长期免疫力，避免了灭活疫苗、重组亚单位疫苗等需多次加强免疫的繁琐；⑥能联合免疫，即可将编码不同抗原的基因构建在同一个质粒中或将含不同抗原基因的多种质粒联合应用，制备多价DNA疫苗；⑦DNA疫苗既有预防作用，也有治疗作用；⑧接种途径多样化，既能采用注射方式接种(包括皮内、皮下、肌注、基因枪注射技术)，亦能采用口服或喷雾接种方式。Survivin属于凋亡抑制蛋白(IAP)家族成员，研究显示，Survivin是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子，也是IAP家族成员中最小的一个。人Survivin基因定位于染色体(17q25)，包含4个外显子和3个内含子，编码一种分子量为16.5kD的胞质蛋白，含有一个杆状病毒重复(BIR)结构功能区，羧基末端缺乏锌指结构而代之以a螺旋结构。其mRNA在体内经过不同的剪切方式可产生三种异构体Survivin、Survivin-2B禾卩Survivin-EX3。Survivin在胚胎组织及恶性肿瘤中普遍表达，如胃癌、结直肠癌、乳腺癌和肺癌等；但在分化成熟的组织及癌旁正常组织中无表达。这一特点使得Survivin成为肿瘤靶向治疗的重要靶点，具有良好的特异性及安全性。研究证实，靶向Survivin治疗可以促进肿瘤细胞凋亡并抑制其增殖，而对正常组织几乎无不良影响，这一显著优势使Survivin逐渐成为抗肿瘤免疫治疗研究中的一大热点。RongXiang等将鼠全长Survivin和分泌型趋化因子CCL21的基因连接至pBudCE4.1真核表达载体上，制备成DNA疫苗，在C57BL/6J小鼠体内的免疫实验结果显示，该0亂疫苗发引发008+CTL反应，对肺癌细胞具有很好的杀伤效果[RongX，NorikoM,Yu叩ingL，etal.ADNAvaccinetargetingsurvivincombinesapoptosiswithsuppressionofangiogenesisinlungtumoreradication.CancerResearch,2005，65(2):553-561]。MarcSchmitz等人证实凋亡抑制蛋白Survivin的自氨基端第5-14位氨基酸(TLPPAWQPFL)和第95-104位氨基酸(ELTLGEFLKL)可在体外有效地激发特异性CD8+CTL杀伤肿瘤细胞(MarcS，PetraD,BerndW，etal.GenerationofSurvivin-specificCD8+TEffectorCellsbyDendriticCellsPulsedwithProteinorSelectedP印tides.Cancerresearch,2000，60(17):4845-4849)。KerstinOtto等人又用这段短肽在IV期黑色素瘤患者体内进行了功能实验，ELISP0T检测结果表明，该短肽可以激发强烈的T细胞免疫反应(Kerstin0，MadsHA，AndreasE，etal.Lackoftoxicityofther即y-inducedTcellresponsesagainsttheuniversaltumourantigensurviving.Vaccine,2005，23(7):884-889)。YoshihikoHirohashi等研制的抗肿瘤多肽疫苗是以人Survivin-2B的自氨基端第80-88位氨基酸(AYACNTSTL)为耙点，这段短肽是HLA-A24限制性T淋巴细胞表位，可被CD8+细胞毒T淋巴细胞特异性识别，实验结果证明，以这段短肽为靶抗原制备的疫苗对结肠癌细胞具有很好的杀伤抑制作用，目前该疫苗己经进入II期临床试验阶段(YoshihikoH，ToshihikoT，AkikoM,etal.AnHLA—A24—restrictedCytotoxicTLymphocyteEpitopeofaTumor—associatedProtein,Survivin.ClinicalCancerResearch,2002，8(6):1731-1739)。人绒毛膜促性激素(humanchorionicgonadotropin,hCG)是由胚胎合体滋养层细胞所分泌的糖蛋白激素，正常hCG由a链和p链亚单位以非共价键连接构成二聚体。几乎所有的恶性肿瘤细胞均能表达异位hCG。hCGP是多种肿瘤的特征性蛋白，多种组织的肿瘤细胞均选择性分泌单链hCGP或hCG0的核心片段，研究表明，该蛋白与恶性肿瘤转移特性、恶性化程度以及肿瘤微环境和免疫耐受的形成等均有一定关系，具体表现为hCG的糖基序列大多集中在hCGe的梭基末端多肽(hCGp-CTP)区域，肿瘤细胞表面表达的hCGP链越多，糖基化程度越高，肿瘤细胞表面所带的负电荷就越多，而肿瘤细胞表面带负电荷可促进肿瘤细胞与血管内皮细胞的粘附、刺激有关粘附分子和趋化因子的生成，从而使肿瘤细胞越容易转移。同时，由于强负电荷的存在，可以抑制NK、T细胞、巨噬细胞等免疫细胞的活化，导致免疫细胞的活性降低，甚至无能，造成肿瘤的免疫耐受。由于hCGP亚基与促黄体激素(LH)有较高的同源性，因此以hCGP亚基为免疫原产生的抗体会与LH产生交叉反应。只有hCGe羧基端自109-145位氨基酸残基组成的37肽(hCGP-CTP37)是hCG分子所特有的，并存在hCG的特异抗原表位，其诱导产生的抗体才具有更好的抗原特异性。以异位hCGP亚基为靶抗原激发的体液和细胞免疫反应可有效地攻击肿瘤细胞，已成为肿瘤生物治疗新的研究热点。国外利用该靶点设计的胰腺癌肿瘤疫苗Avicine已经结束II期临床试验，结直肠癌疫苗已进入III期临床试验的关键时期，显示该靶点对多种恶性肿瘤术后复发和转移具免疫保护功能，具有良好的应用前景。hCGP链的核心片段-CTP37，是多种肿瘤的特征性蛋白，与恶性肿瘤转移、恶性化程度以及肿瘤微环境和免疫耐受的形成等均有一定关系。研究表明，以CTP37为耙抗原激发的体液和细胞免疫反应，可有效地攻击肿瘤细胞，现已成为肿瘤生物治疗的另一研究热点。Li-ZhenHe等将hCG0的全基因连接在抗DC细胞抗体Bll重链的3'端构成融合基因，再将其插入真核表达载体pMMV4中构成DNA疫苗，体外实验证明该疫苗可激发产生强烈的T细胞免疫反应杀死肿瘤细胞(HeLZ，RamakrishnaV,ConnollyJE，etal.Anovelhumancancervaccineelicitscellularresponsestothetumor-associatedantigen,humanchorionicgonadotropinbeta[J].ClinCancerRes，2004,10(6):1920-7.)。Moulton等将含有hCGP的C00H-末端37个氨基酸残基(CTP37)的短肽与白喉类毒素相偶连制备成蛋白质疫苗，可激发机体产生抗CTP37的抗体抑制肿瘤生长，现在该疫苗治疗结直肠癌的实验已经进入III期临床试验的关键日寸期(MoultonHM，YoshiharsPH，MasonDH，etal.Activespecificimmunotherapywithabeta-humanchorionicgonadotropinpeptidevaccineinpatientswithmetastaticcolorectalcancer:antibodyresponseisassociatedwithimprovedsurvival[J].ClinCancerRes，2002，8(7):2044-51)。HeYi等于近期发表的一篇论文中介绍了他们研制的一种新型的以CTP37为耙点的核酸疫苗，是将CTP37与分枝杆菌热休克蛋白HSP65相连，并将这段融合基因插入真核表达载体构成核酸疫苗，在小鼠体内进行了抑瘤效果的实验。结果发现该核酸疫苗可诱发机体产生高滴度的亲和性抗体，体内和体外实验结果均表明该疫苗可有效抑制乳腺癌细胞的生长，为肿瘤的免疫治疗提供了一条新思路(YiH，RongY，YankaiZ，etal.ImprovedefficacyofDNAvaccinationagainstbreastcancerbyboostingwiththerepeatbeta-hCGC-terminalpeptidecarriedbymycobacterialheat-shockproteinHSP65[J].Vaccine,2006，24(14):2575-84.)。基因治疗的关键环节除了正确选取最特异、高效、广泛的靶抗原之外，还包括合理选择适当的真核表达载体，这也是核酸疫苗研制的前提条件。pVAXl载体是被美国药品及食物鉴定委员会承认的用于疫苗临床使用的真核表达载体，它具有卡那霉素抗性，非常适合于人体应用。当前，DNA疫苗研究领域的一个关键性问题是如何提高疫苗的免疫保护力，这一问题关系到DNA疫苗最终能否转化为产品。以往人们为了构建多价DNA疫苗及增强DNA疫苗的免疫原性，多构建双启动子表达载体、重组表达融合蛋白或通过携带不同抗原基因和佐剂基因的质粒共同免疫，虽然双启动子载体可用于两个基因的协同表达，但启动子之间的相互千扰会造成转录效果的不一致，减弱甚至丧失某些基因的表达(TaharaH,ZitvogelL，StorkusWJ"，etal.EffectiveeradicationofestablishedmurinetumorswithIL-12genetherapyusingapolycistronicretroviralvector[J].JImmunol,1995，154(12):6466-74.);此外，多载体共免疫的效率也较低，常常不能取得令人满意的效果。采用IRES元件构建双顺反子表达载体，可允许两个目的基因同时有效表达(Wa.gstaffM，LilleyC,SmithJ,etal.GenetransferusingadisabledherpesvimsvectorcontainingtheEMCVIRESallowsmultiplegeneexpressioninvitroandinvivo.GeneTher.1998，5(11):1566-70.)，是近年来多基因表达的重要方法。内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite,IRES)是最早发现于动物病毒基因组5'非编码区的一段DNA序列，它具有不依赖于5'帽子结构的翻译起始功能，可以使来源于同一mRNA的2个开放读码框架正确表达，是一种双顺反子表达元件。在两个蛋白编码序列之间插入IRES，在上游启动子的控制下，转录后为同一条mRNA;翻译时，IRES上游基因翻译起始遵循一般的真核生物基因的翻译起始规律(即帽结构依赖方式)，而IRES下游基因则通过IRES引导核糖体进入，启始基因的翻译，从而实现两个基因的同时表达。由于两个基因翻译自同一条mRNA，表达出的蛋白在时间和空间上接近，尤适用于研究相互作用的两个蛋白质或通过报告基因追踪待检测蛋白的转录及表达，也可作为多表位DNA疫苗的表达载体。正常情况下，机体对自身抗原具有耐受性，不产生免疫应答。利用异种同源基因作为抗原，通过生物种与种之间基因的同源性，设法诱导机体产生交叉免疫反应，有利于打破机体的自身免疫耐受，能够使疫苗有效地诱导体液和细胞免疫保护反应，高效发挥抗肿瘤转移和复发的作用。异种同源抗原是打破肿瘤免疫耐受的有效策略。研究发现，生物在由低级物种向高级物种进化演变过程中，不同种属的同一基因表现为一定的同源性。可利用异种同源细胞或分子诱导肿瘤细胞的自体免疫反应达到抗肿瘤的目的。通过利用生物种与种之间基因的同源性，设法诱导机体产生交叉免疫反应(cross-reaction),可能会打破自身免疫耐受(CiesielskiM丄ApfelL，BaroneTA，etal.AntitumoreffectsofaxenogeneicsurvivinbonemarrowderiveddendriticcellvaccineagainstmurineGL261gliomas.CancerImmunolImmunother，2006，55(12)，1491-503)。研究表明，使用与肿瘤抗原(HER-2/neu)高度同源的蛋白质，可以诱导出比使用肿瘤抗原本身大得多的机体免疫反应。国内魏于全院士等发现用异种血管内皮生长因子极其受体作为疫苗免疫小鼠，可诱导针对肿瘤新生血管的自身免疫反应，从而可抑制肿瘤生长，在动物体内取得了较好的抑瘤效果(WeiYQ，HuangM丄YangL，etal.ImmunogenetherapyoftumorswithvaccinebasedonXenopushomologousvascularendothelialgrowthfactorasamodelantigen.[J]ProcNatlAcadSciUSA.2001S印25:98(20):11545-50)。目前，以异种抗原作为免疫原研制抗肿瘤疫苗已经成为重要的设计策略，国内外在多种疫苗设计上均应用此策略，并取得了令人满意的免疫保护效果。肿瘤免疫基因治疗的主要目的是使机体产生具有抗肿瘤特异性和细胞毒活性的T淋巴细胞，从而达到特异性攻击肿瘤的作用。T细胞的活化需双信号刺激第一信号由T细胞抗原受体(TCR)与抗原提呈细胞(APC)上的抗原肽-MHC分子复合物结合提供，第二信号由APC上的共刺激分子与T细胞上的相应配体结合提供。只有双信号共同刺激才能有效激活特异性的T细胞，缺乏第二信号造成T细胞克隆凋亡，使肿瘤细胞产生免疫逃避。APC上的共刺激分子主要是一些粘附分子，其中，B7分子是当今的研究热点。B7.1是APC上的主要共刺激分子，它与配体CD28分子的相互作用是T细胞激活的第二信号。B7.1与其配体CD28结合后，可促进T细胞增殖、阻止T细胞凋亡、产生T细胞趋化因子(HeroldK，Lu丄RulifsonT,etal.RegulationofC-CchemokineproductionbymurineTcellsbyCD28/B7costimulation[J].JImmuno1，1997，159(9):4150-53.);上i周IL-2Ra、P和Y，增加IL-2mRNA的转录，增强细胞因子分泌。上调CD40L的表达和CTLA24的mRNA水平；还可增强T细胞对超抗原的敏感性，介导CTL对靶细胞的效应功能；介导T-B细胞间的粘附，促进体液免疫应答等。B7.1主要共刺激CD8+T细胞向CTL分化CD4+T细胞向Thl细胞分化，这在增强和维持有效免疫应答中起到关键作用。同时，B7.l还具有较强的共刺激GM-CSF产生的作用(BoussiotisV，FreemanG，GribbenJ"，etal.TheroleofB7.1/B7.2:CD28/CTLA-4pathwaysinthepreventionofanergy，inductionofproductiveimmunityanddown-regulationoftheimmuneresponse[J].ImmunolRev,1996，153:5-26,)。粒细胞巨噬细胞集落束纖因子(granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor,GM-CSF)主要由T细胞和巨噬细胞产生，是一种具有多种生物活性的细胞因子，可以促进DC等APC分化、成熟和活化及上调CD86的表达以激发对肿瘤的免疫应答(KassE，ParkerJ"，Schlom，etal.ComparativestudiesoftheeffectsofrecombiantGM-CSFandGM-CSFadministeredviaapoxvirustoenhancetheconcentrationofantigenpresentingcellsinregionallymphnodes[J].Cytokine，2000，12(7):960-71.);在体外具有促进髓样袓细胞增殖，增强中性粒细胞、单核巨噬细胞、嗜酸性粒细胞对肿瘤细胞的吞噬作用和ADCC效应等活性(Yu丄BurwickJ,DranoffG，etal.Genetherapyformetastaticbraintumorsbyvaccinationwithgranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactortransducedtumorscells[J].Humangenetherpy，1997，8(9):1065—72.);促进Th、Tc、NK在肿瘤部位浸润，从而杀伤肿瘤(NakazakiY，TaniK，LinZT，etal.Vaccineeffectofgranulocyte—macrophagecolony-stimulatingfactororCD80gene-transducedmurinehematopoietictumorcellsandtheircooperativeenhancementofanti-tumorimmunity[J].GeneTher，1998，5(10):1355-62.)。大量文献表明，GM-CSF具有很好的协同抗肿瘤作用(ArmstrongC，BotellaR，GallowayT，etal.Anti-tumoreffectsofgranulocytemacrophagecolony—stimulatingfactorproductionbymelanomacells[J].CancerRes,1996,56(9):2191-98;WakimotoH，AbeJ,TsunodaR，etal.Intensifiedanti-tumorimmunitybyacancervaccinethatproducesgranulocyte-macrophagecolonystimulatingfactorplusinterleukin4[J].CancerRes，1996，56(8):1828—33.)。仅靠肿瘤特异性抗原难以有效激发机体抗肿瘤免疫，尚需B7.1共刺激分子与其配体等相互作用参与激活T细胞。许多研究也已证实多数肿瘤细胞不表达B7.1共刺激分子，从而逃避了机体免疫监视，以至肿瘤逃避免疫监视而在体内无限制生长(杨旭伟，陈元仲，林振兴.人B7.l基因cDNA的克隆及其逆转录病毒表达载体构建[J].福建医科大学学报，2001，35(2):109-111.)。而GM-CSF具有激活树突细胞等专职抗原递呈细胞作用，使抗原特异的辅助T淋巴细胞和抗肿瘤效应细胞增生，在体内能激活较强的抗肿瘤免疫反应。若将两者联合应用，即可启动针对肿瘤抗原的免疫，又可促进辅助T淋巴细胞和抗肿瘤免疫效应细胞增生，产生协同的抗肿瘤效应。目前已有研究证实，将GM-CSF与B7.1分子联合应用会提高疫苗对肿瘤细胞的杀伤作用。S咖imoto等人的研究结果表明，B7.1基因和GM-CSF基因共转染的肺癌细胞株LLC制备的瘤苗(LLC/GM+B7)，诱发的CTL细胞杀伤活性明显高于单独转染B7.1或GM-CSF基因的LLC细胞(SumimotoH，TaniK，NakazakiY,etal.GM-CSFandB7-1(CD80)co-stimulatorysignalsco-operateintheinductionofeffectiveanti-tumorimmunityinsyngeneicmice.IntJCancer.1997，73(4):556-61.)。Nakazaki等人的研究结果表明，胸腺淋巴瘤细胞/GM-CSF与胸腺淋巴瘤细胞/B7.1瘤苗联合使用具有协同抗肿瘤免疫效果，其机制可能是GM-CSF基因转导的瘤苗主要是通过APC介导的间接途径影响Th细胞进而激活CTL;B7.1基因转录的瘤苗是通过直接途径影响CTL，而将两者联合使用可诱发系统性抗肿瘤免疫反应，导致肿瘤部分根除(NakazakiY，TaniK,LinZ，etal.VaccineeffectofgranulocytemacrophagecolonystimulatingfactororCD80genetransducedmurinehematopoietictumorcellsandtheircooperativeenhancementofanti-tumorimmunity[J].GeneTher，1998，5(10):1355-62.)。LDH法测定细胞CTL效应的原理如图27所示乳酸脱氢酶(LDH)是活细胞胞浆中的内含酶之一，当效应细胞和耙细胞共同孵育后，靶细胞的细胞膜受损，膜的通透性发生改变使胞浆中的LDH释放到胞外。取含有LDH的培养上清，经酶促反应使底物(tetrazoliumsalt)转化成一种紫红色的甲肷类化合物(formazan)，在490nm处有很高的吸收峰，测定其A490值就能间接反映出效应细胞对耙细胞的杀伤状况。
发明内容本发明的目的是提供一种可用于构建基因疫苗且可同时启动两种基因共表达的DNA疫苗真核表达载体。为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案一种DNA疫苗真核表达载体，是在pVAXl载体骨架中含有内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite,IRES)编码序列的重组真核表达载体。由于所述内部核糖体进入位点的上、下游均可以启动基因表达，因此为方便外源基因的插入，在上述DNA疫苗真核表达载体中的内部核糖体进入位点编码序列的两端还可再添加一种或多种限制性内切酶识别位点，所述限制性内切酶的选择是广泛的，包括EcoRV、BamHI、ClaI、BstBI、PvuI禾BPsiI、BssHII、SwaI、PacI、NsiI、SmaI、XhoI、NotI、BstXI、NheI和SalI等。具体来讲，在所述内部核糖体进入位点编码序列的5'端添加限制性内切酶EcoRV、ClaI、BstBI、PvuI和PsiI识别位点，在其3，端添加限制性内切酶BssHII、SwaI、PacI、NsiI和XhoI识别位点的DNA疫苗真核表达载体为pVAXl-IRES。所述DNA疫苗真核表达载体可按照基因工程领域的常规方法构建。所述DNA疫苗真核表达载体在制备基因疫苗中的应用也属于本发明的保护范围，所述基因疫苗包括针对多种疾病的基因疫苗，如抗肿瘤、抗流感、抗艾滋病、抗病毒性肝炎、抗结核、抗狂犬病或抗疟疾等基因疫苗。本发明另一目的在于提供所述DNA疫苗真核表达载体的一种应用，即提供一种高效广谱实体肿瘤治疗性基因疫苗。其中，以本发明的DNA疫苗真核表达载体为出发载体构建的抗肿瘤基因疫苗，其活性成分是在本发明的DNA疫苗真核表达载体的载体骨架中核糖体进入位点编码序列的上游含有Survivin-2B自氨基端第5-28位和第80-121位氨基酸残基编码序列构成的融合基因，以及人和猴的绒毛膜促性腺激素P链的核心片段CTP37区域编码序列构成的融合基因的重组真核表达载体。所述Survivin-2B的自氨基端第5-28位氨基酸残基的编码序列和自氨基端第80-121位氨基酸残基的编码序列可通过连接臂"nG"连接，其中，n可以为K(赖氨酸)、R(精氨酸)、C(半胱氨酸)、Q(谷氨酰胺)G(甘氨酸)或N(天冬酰胺)。所述由连接臂"nG"连接的Survivin-2B自氨基端第5-28位和第80-121位氨基酸残基编码序列的融合基因的核苷酸序列可如序列表中序列1所示。所述Survivin-2B的自氨基端第5-28位氨基酸残基编码序列位于Survivin-2B的自氨基端第80-121位氨基酸残基编码序列的的3'或5'端均可。所述人和猴的绒毛膜促性腺激素P链的核心片段CTP37区域编码序列也可通过连接臂"nG"连接，其中，n为K、R、C、Q、G或N。所述由连接臂"NG"连接的人和猴的绒毛膜促性腺激素0链的核心片段CTP37区域编码序列的融合基因的核苷酸序列可如序列表中序列2所示。所述人的绒毛膜促性腺激素P链的核心片段CTP37区域编码序列可位于猴的绒毛膜促性腺激素P链的核心片段CTP37区域编码序列的3'或5'端均可。此外，所述Survivin-2B自氨基端第5-28位和第80-121位氨基酸残基编码序列构成的融合基因位于人和猴绒毛膜促性腺激素P链的CTP37区域编码序列构成的融合基因的3'或5'端均可。为引导目的基因在真核细胞内获得有效表达和分泌，所述抗肿瘤基因疫苗的真核表达载体的载体骨架中内部核糖体进入位点编码序列的上游还可连接有人IgK链前导信号肽(sig)编码序列和/或人IgG-Fc段编码序列和/或糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定信号肽编码序列。此外，为进一步增强所述抗肿瘤基因疫苗激活免疫应答的能力，在所述抗肿瘤基因疫苗的真核表达载体的载体骨架中内部核糖体进入位点编码序列的下游还可连接有人GM-CSF和/或B7.l共刺激分子编码序列，以及白细胞介素、干扰素和/或肿瘤坏死因子等免疫激活细胞因子的编码序列。具体来讲，在本发明的DNA疫苗真核表达载体的载体骨架中内部核糖体进入位点编码序列的上游含有Survivin-2B自氨基端第5-28位和第80-121位氨基酸残基编码序列构成的融合基因，以及人和猴的绒毛膜促性腺激素0链的核心片段CTP37区域编码序列构成的融合基因的重组真核表达载体可为pVAX1-2PAG。在本发明的DNA疫苗真核表达载体的载体骨架中在所述内部核糖体进入位点编码序列的上游依次连接有人IgK链前导信号肽编码序列、Survivin-2B自氨基端第5-28位和第80-121位氨基酸残基编码序列构成的融合基因、人和猴的绒毛膜促性腺激素3链的核心片段CTP37区域编码序列构成的融合基因，以及人IgG-Fc段编码序列和糖基磷脂酰肌醇锚定信号肽编码序列的重组真核表达载体可为pVAXl-2PAG-Fc-GPI。在本发明的DNA疫苗真核表达载体的载体骨架中在所述内部核糖体进入位点编码序列的上游依次连接有人IgK链前导信号肽编码序列、Survivin-2B自氨基端第5-28位和第80-121位氨基酸残基编码序列构成的融合基因(抗原基因)、人和猴绒毛膜促性腺激素P链的核心片段CTP37区域编码序列构成的融合基因(抗原基因)、人IgG-Fc段编码序列和糖基磷脂酰肌醇锚定信号肽编码序列(所述人Igk链前导信号肽编码序列、人IgG-Fc段编码序列和糖基磷脂酰肌醇锚定信号肽编码序列与所述抗原基因融合表达)，在所述内部核糖体进入位点编码序列的下游连接有人GM-CSF和B7.l共刺激分子编码序列的重组真核表达载体可为pVAXl-sig-2PAG-FC-GPI-GM/B7(简称pVAX1-2PFcGB)。需要的时候，在上述疫苗的制备中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂或表面活性剂等。上述疫苗的用量一般为0.01-200ug/kg体重/天，可以一次或多次使用，疗程-一般为20-40天，剂量和疗程都可根据实际情况进行调整。为提高疗效，本发明的药物还可以与抗生素、免疫刺激剂等进行组合治疗。本发明提供了一种DNA疫苗真核表达载体。该载体是针对DNA疫苗在恶性肿瘤治疗中展现出来的优势，在真核表达载体pVAXl的基础之上，引入了双顺反子表达元件一IRES序列，并在IRES序列的两端插入了多种稀有酶切位点，从而构建成功的一种新型DNA疫苗载体pVAXl-IRES。并在此NA疫苗载体pVAX1-IRES的基础上构建了一种多靶点复合抗肿瘤基因疫苗，该抗肿瘤基因疫苗是在pVAXl-IRES中IRES编码序列的上游含有人IgK链前导信号肽(sig)、人Survivin-2B主要T细胞表位区域、人和猴绒毛膜促性腺激素e链的核心片段CTP37区域、人lgG-Fc段编码序列和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定肽的多基因融合序列，在pVAXl-IRES中IRES编码序列的IRES下游含有人GM-CSF和B7.1融合基因的重组真核表达载体pVAXl-sig-2PAG-FC-GPI-GM/B7(简称pVAXl-2PFcGB)。转染有该质粒的293T细胞的流式细胞仪和免疫荧光检测结果表明，pVAXl-2PFcGB在293T细胞中获得很好的表达，此外，本发明的抗肿瘤基因疫苗还具有较好的体液免疫和细胞免疫效果，同时对肿瘤生长具有显著的抑制作用。以本发明的真核表达载体制备的基因疫苗有望对乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌和前列腺癌等多种恶性实体瘤发挥广谱治疗作用，在肿瘤的治疗及其药物开发领域发挥重要作用，应用前景广阔。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。图1为PCR扩增的IRES编码序列的1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果图2为携带IRES编码序列的重组载体pSimplel8-EcoRV/BAP-IRES的EcoRV和XhoI双酶切鉴定结果图3为pSimple18-EcoRV/BAP-IRES和真核表达载体pVAXl的EcoRV和XhoI双酶切产物的1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果图4为真核DNA疫苗载体pVAXl-IRES的EcoRV和XhoI双酶切产物的1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果图5A为PCR扩增的DsRedl基因片段的1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果图5B为PCR扩增的EGFP基因片段的1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果图6A为携带DsRedl基因的重组载体pGEM-TEasy-DsRedl的BamHI和PvuI双酶切产物的1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果图6B为携带EGFP基因的重组载体pGEM-TEasy-EGFP的BssHII和NsiI双酶切产物的1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果图7为pGEM-TEasy-DsRedl、pGEM-TEasy-EGFP和pVAXl-IRES双酶切产物的1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果图8A为携带DsRedl基因的真核表达载体pVAXl-IRES-DsRedl的BamHI和PvuI双酶切产物的1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果图8B为携带EGFP基因的真核表达载体pVAXl-IRES-EGFP的NsiI和BssHII双酶切产物的1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果图8C为携带DsRedl和EGFP基因的真核表达载体pVAXl-DsRedl-IRES-EGFP的BamHI和XhoI双酶切产物的1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果图9为各种重组质粒在293T细胞内表达情况的激光扫描共聚焦显微镜检测结果图10为各种重组质粒在293T细胞内瞬时表达情况的流式细胞仪检测结果图11为抗原复合物2PAG融合基因的结构式意图图12为PCR扩增的Sur-SC和SC-hraCTP及抗原复合物2PAG融合基因的1%琼脂糖凝胶电泳检测结果图13为PCR扩增的人GM-CSF因子和B7.1融合基因的1%琼脂糖凝胶电泳检测结果图14为含有抗原复合物2PAG融合基因的真核表达质粒pCI-2PAG-Fc-GPI的菌落PCR及酶切鉴定结果图15为真核表达质粒pVAX-sig-2P-FC-GPI-IRES的酶切鉴定结果图16为真核表达质粒pVAX1-IRES-GM/B7的酶切鉴定结果图17为pVAXl-sig-2PAG-Fc-GPI-GM/B7(pVAXl-2PFcGB)的酶切鉴定结果图18为pVAXl-2PFcGB在293T转染细胞内的瞬时表达效率的流式细胞仪检测结果图19为pVAXl-2PFcGB在293T转染细胞内的瞬时表达效率的免疫荧光检测结果图20为Balb/c小鼠的免疫方案图21为各组免疫小鼠皮下移植瘤的平均成瘤时间的统计结果图22为各组免疫小鼠体内移植瘤的生长曲线图23为各组免疫小鼠皮下移植瘤攻击30天后离体肿瘤体积的比较结果图24为皮下移植瘤攻击35天后各组免疫小鼠体内的平均瘤重统计结果图25为皮下移植瘤攻击35天后各免疫组的肿瘤抑制率的统计结果图26为2D组、E组和F组免疫小鼠血清抗体效价的ELISA检测结果图27为LDH法测定细胞CTL效应的原理示意图图28为各免疫组小鼠脾细胞的杀伤活性检测结果图29为pVAXl-2PFcGB、pVAXl-2PAG、pVAXl-2PAG-Fc-GPI的结构示意图具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见《MolecularCloning:ALaboratoryManual》(Sambrook，J.，Russell,DavidW.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdedition,2001，NY，ColdSpringHarbor)。所用引物及DNA序列如无特别说明均由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。所有百分比浓度如无特别说明均为体积/体积(V/V)或质量/体积(W/V)百分比浓度。实施例l、DNA疫苗载体pVAXl-IRES的构建一、RES编码序列的PCR扩增与纯化首先根据pIRES-neo载体中的IRES编码序列(IRES序列的位置为1295-1880bp)设计其PCR扩增引物，并在用于PCR扩增IRES编码序列的上游引物IRES-F中添加了限制性内切酶EcoRV、ClaI、BstBI、PvuI和PsiI识别位点，在用于PCR扩增IRES编码序列的下游引物IRES-R中添加了限制性内切酶BssHII、SwaI、PacI、NsiI和XhoI识别位点，具体引物序列如下IRES-F(上游引物)5'-CCGATATCGATTCGAACGATCGTTATAACTAGGGCGGCCAATTCCGCC-3,IRES-R(下游引物)5'-GCCTCGAGCGCGCATTTAAATTAATTAATGCATTGGCTGCAGGAATTATCCCG-3'。引物合成后，用灭菌蒸馏水配制成2(^mol/L的使用液，分装，-2(TC保存备用。然后，以质粒pIRES-neo(Clontech公司)为模板，在引物IRES-F和IRES-R的引导下，在PerkinElmer公司的GeneAmpPCRSystem2400型PCR仪上PCR扩增IRES的编码序列，50ulPCR反应体系为5XPrimeSTAR缓冲液(含Mg2+)10ul，dNTPs(2.5mmol/L)4ul，上游引物(20umol/L)lul，下游引物(20umol/L)lyl，PrimeSTARHSDNAPolymerase(2.5U/u1，TaKaRa公司)0.5u1，模板(pIRES-neo质粒稀释100倍)lwl，灭菌蒸馏水32.5yl。PCR反应条件为先95'C3min;然后94°C45s，60°C45s，72°Clmin30s，共循环30次；最后72。C延伸7min，4。C保存。反应结束后，取1PCR扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检观[)，检测结果如图1所示(泳道M为DL2000DNAMarker(购自TaKaRa公司)，泳道1为IRES编码序列的PCR扩增产物)，经扩增获得了682bp的DNA条带，与预期大小一致。用博大泰克公司的PCR产物胶回收试剂盒并参照试剂盒说明书回收并纯化该目的条带。二、携带IRES编码序列的pSimple18-EcoRV/BAP重组载体的构建与鉴定1、大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备(CaCl2法)a.取-7(TC保存的大肠杆菌DH5a菌种，将其划线接种于LB琼脂平板上，在37°C温箱中培养过夜(12-24小时)；b.挑取湿润光滑，边缘整齐的大肠杆菌DH5a单个菌落接种至3mLLB液体培养基中，在37"C、200rpm下振荡培养过夜；c.将活化的菌种按l^接种于50mLLB液体培养基中，37"振荡培养2-4h，使细菌生长达到对数生长期，即0D6。。=0.3-0.6;d.在无菌条件下将菌液转移至无菌、预冷的聚丙烯管中，冰浴10min后4'C、8000rpm离心10min，使菌体完全沉淀；e.弃上清，用10mL预冷的0.lmol/LCaCl2重悬菌体沉淀，冰浴20min后，4°C、6000rpm离心10min;f.弃上清，用2raL预冷的0.lmol/LCaCl2重悬菌体沉淀，冰浴3.5h后，加入15%甘油，分装，-7(TC保存备用。2、PCR扩增的IRES编码序列的5'末端磷酸化用TaKaRa公司的DNAKinationKit高效磷酸化试剂盒并参照试剂盒说明书对步骤一扩增的IRES编码序列进行5'末端磷酸化，具体步骤如下a.在微量离心管中配制下列反应液，全量为50til;T4PolynucleotideKinase(10U/u1)ATP(10mM)10XReaction缓冲液PCR纯化产物ddH20总体积50^ilb.37。C反应30分钟；c.7(TC加热10分钟，使酶失活；d.加入50u1的ddH20，补充体积至100u1;e.加入10u1(1/10量)的3MCH3COONa(pH5.2);f.加入4u1的DNAmate溶液，均匀混合；g.加入250ul的-2(TC预冷的无水乙醇，充分混匀；h.4°C、12000rptn离心IO分钟，回收沉淀，用70%冷乙醇清洗沉淀后，室温干燥10分钟；6.将沉淀溶解于20n1的ddH20中。3、5'末端磷酸化后的IRES编码序列与pSimple18-EcoRV/BAP载体的连接用TaKaRa公司的LigationMix高效DNA连接酶将步骤2经5，末端磷酸化后的IRES编码序列与载体pSimple18-EcoRV/BAP(TaKaRa公司)进行连接，连接体系如下pSimple18-EcoRV/BAP载体1u15'末端磷酸化后的IRES编码序列4ulLigationMix5y1总体积10|il连接条件为16"连接lh。4、将连接产物转化大肠杆菌DH5ct感受态细胞取步骤l制备的新鲜大肠杆菌感受态细胞DH5a200"1，置于冰浴中，加入步骤3的连接产物10ul，轻轻混匀后冰浴30min，立即转移到42。C水浴中热休克90s，再冰浴静置2min，加入O.5mL不加抗生素的LB液体培养基，37。C水浴15min后，37°C摇床轻摇45min;随后，取200w1转化菌体，均匀涂布于含有氨苄青霉素(100ug/mL)的LB平板培养基上，在超净工作台吹干约10min，37。C倒置培养12-16h。然后，从LB抗性平板中挑取长出的单一菌落5个，分别接种于含氨苄青霉素(100ng/mL)的LB液体培养基中(5mL/管)，37。C摇床培养过夜。5、提取质粒15u15u1134u1将步骤4)获得的转化有携带IRES编码序列的pSimple18-EcoRV/BAP的重组质粒菌液过夜培养，用博大泰克公司的碱裂解法试剂盒并参照试剂盒说明书提取质粒。6、酶切鉴定及测序对步骤5用碱裂解法试剂盒提取的质粒用限制性内切酶EcoRV和XhoI进行双酶切鉴定，酶切体系如下10XNEBuffer32y1100XBSA0.2ul重组质粒质粒DNA5u1XhoI1u1EcoRV1u1灭菌双蒸水_10.8ul总体积20|al酶切条件为37'C水浴酶切过夜。对双酶切产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定结果如图2所示(泳道M为DL2000DNAMarker,泳道1为EcoRV和XhoI双酶切产物)，经酶切获得了2692bp和682bp的DNA条带，与预期结果一致，表明IRES编码序列已成功连入pSimple18-EcoRV/BAP载体中。然后，将经酶切鉴定正确的阳性克隆菌液送北京三博远志生物技术有限责任公司进行测序，测序结果表明获得了序列正确的携带IRES编码序列的pSimplel8-EcoRV/BAP重组载体，将其命名为pSimplel8-EcoRV/BAP-IRES。三、真核DNA疫苗载体pVAXl-IRES的构建与鉴定1、酶切将步骤二经测序正确的阳性重组质粒pSimple18-EcoRV/BAP-IRES和真核表达载体pVAXl(invitrogen公司)分别用限制性内切酶EcoRV和XhoI进行双酶切，酶切条件为37"C水浴过夜，酶切体系如下pSimplel8-EcoRV/BAP-IRESpVAXlDNA30u130u110Xbuffer5u15y1100XBSA0.5u10.5y1XhoIlu1lu1EcoRVllUly1双蒸水12.5u112.5u1总体积50u150u1。2、酶切产物的回收、连接和转化对步骤1的双酶切产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示(泳道M为DL2000DNAMarker,泳道1为pVAXl的EcoRV和XhoI双酶切产物，泳道2为PSimplel8-EcoRV/BAP-IRES的EcoRV和XhoI双酶切产物)，pVAXl经酶切获得了大小约为3000bp的DNA条带，pSimple18-EcoRV/BAP-IRES经酶切获得了682bp的DNA条带，与预期结果一致。用北京博大泰克生物基因技术有限责任公司的"PCR片断快速胶回收试剂盒"并参照试剂盒说明书回收并纯化经酶切过夜的重组质粒pSimplel8-EcoRV/BAP-IRES中的IRES编码序列的DNA片段和真核表达载体pVAXl。将纯化后的目的基因IRES和线性化载体pVAXl进行连接，16。C连接lh，连接体系如下目的基因IRES5^1线性化pVAXl载体5|ilLigationMix10y1总体积20^1。然后，用与步骤二相同的方法将连接产物转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞。3、阳性重组质粒的筛选与鉴定挑取在含卡那霉素(50ug/mL)LB抗性平板上长出的单菌落6个(编号1-6)，分别接种于含卡那霉素(50ug/mL)的LB液体培养基中(5mL/管)，37C摇床培养过夜，提质粒，用限制性内切酶EcoRV和XhoI进行双酶切鉴定，酶切体系如下质粒10XBSAEcoRVXhoIddH203±h心z、缓冲液pVAXl-IRES10wl2u10.5u10.5y10.5ul6.5p120y1。然后，对双酶切产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图4所示(泳道M为DL2000DNAMarker,泳道1为pVAXl空载体，泳道2为IRES的DNA片段，泳道3-8为挑选的1-6号单克隆质粒的EcoRV和XhoI双酶切产物)，阳性重组质粒经双酶切可获得3000bp和682bp的DNA条带，其中4，5，7，8号单克隆为阳性克隆，与预期结果一致，证明获得了序列及插入位置均正确的含有IRES编码序列的pVAXl重组载体，命名为pVAX1-IRES，即本发明的真核DNA疫苗载体。实施例2、真核DNA疫苗载体pVAXl-IRES的表达功能验证为了检验实施例l构建的真核DNA疫苗载体pVAX1-IRES是否具有同时启动两种基因进行共表达的功能，首先从红色荧光蛋白表达载体pDsRedl-Nl(Clontech公司)中扩增出红色荧光蛋白基因DsRedl(EF517319)，从增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-Nl(Clontech公司)中扩增出增强型绿色荧光蛋白基因EGFP(EF587314),然后将扩增出的DsRedl基因片段和EGFP基因片段分别插入pVAXl-IRES载体中IRES编码序列的上游和下游，得到重组表达质粒pVAXl-IRES-DsRedl、pVAXl-IRES-EGFP、pVAXl-DsRedl-IRES-EGFP。将这三个重组真核表达质粒瞬时转染人胚胎肾细胞293T，通过流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜分析DsRedl、EGFP的表达情况，从而检验所构建的DNA疫苗载体pVAXl-IRES是否具有同时启动两种基因进行共表达的功能，具体实验方法如下6.PCR扩增DsRedl基因和EGFP基因片段6.引物设计根据红色荧光蛋白基因DsRedl(EF517319)和增强型绿色荧光蛋白EGFP基因(EF587314)设计PCR扩增引物，引物序列如下F-DsRedl(上游引物)5，-CCGGGATCCACCGGTCGCCACCATGGTGC-3，(带下划线碱基为限制性内切酶BamHI识别位点)R-DsRedl(下游引物)5'-CCGCGATCGCTACAGGAACAGGTGG-3'(带下划线碱基为限制性内切酶PvuI识别位点)；F-EGFP(上游引物)5，-CCGATGCATCGCCACCATGGTGAGC-3，(带下划线碱基为限制性内切酶NsiI识别位点)R-EGFP(下游引物)5，-CCGGCGCGCTTACTTGTACAGCTCG-3，(带下划线碱基为限制性内切酶BssHII识别位点)。引物合成、纯化后用灭菌蒸馏水配制成20umol/L的使用液，分装，-2(TC保存备用。2、DsRedl基因片段的PCR扩增及其回收、纯化以质粒pDsRedl-Nl(Clontech公司)为模板，在引物F-DsRedl和R-DsRedl的引导下，在PerkinElmer公司的GeneAmpPCRSystem2400型PCR仪上PCR扩增DsRedl基因序列，50ulPCR反应体系为10XExT叫缓冲液5ul，dNTPs(2.5mmol/L)4yl，上游引物(20"mol/L)lul，下游引物(20umol/L)lul，TaKaRaExTaq(5U/ul，TaKaRa公司)1U1，模板(pDsRed1-Nl质粒稀释100倍)lnl，灭菌蒸馏水37ul。PCR反应条件为先95"C5min;然后94°C45s，62°C45s，72°C2min，共循环35次；最后72'C延伸10min。反应结束后，取5ylPCR扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图5A所示(泳道M为DL2000DNAMarker,泳道l为DsRedl基因的PCR扩增产物)，经扩增获得了723bp的DNA条带，与预期大小一致。用博大泰克公司的PCR产物胶回收试剂盒并参照试剂盒说明书回收并纯化该目的条带。3、EGFP基因片段的PCR扩增及其回收、纯化以质粒pEGFP-Nl(Clontech公司)为模板，在引物F-EGFP和R-EGFP的引导下，PCR扩增EGFP基因序列，反应体系及反应条件与步骤2相同。反应结束后，取5ii1PCR扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图5B所示(泳道M为DL2000DNAMarker,泳道1为EGFP基因的PCR扩增产物)，经扩增获得了746bp的DNA条带，与预期大小一致。用博大泰克公司的PCR产物胶回收试剂盒并参照试剂盒说明书回收并纯化该目的条带。二、pGEM-TEasy-DsRedl、pGEM-TEasy-EGFP重组克隆载体的构建1、将纯化后的PCR扩增产物与pGEM-TEasy载体连接及连接产物的转化将步骤一扩增并经纯化的DsRedl基因和EGFP基因分别连接入大肠杆菌克隆载体pGEM-TEasy(购自TaKaRa公司)中，16。C连接过夜，连接体系如下PCR扩增的目的基因纯化产物6.0y1pGEM-TEasy2,0u110XT4DNALigasebufferl.OulT4DNALigase(12p/u1)1.On1总体积10|il。反应结束后，用与实施例1步骤二中相同的方法将两个基因的连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。2、阳性重组质粒的筛选与鉴定挑取在含氨苄青霉素(lOOiig/mL)LB抗性平板上长出的分别转化DsRedl基因和EGFP基因的单菌落各6个(均编号1-6)，分别接种于含氨苄青霉素(Amp+)(100pg/mL)的LB液体培养基中(5mL/管)，37。C摇床培养过夜，提质粒，对携带DsRedl基因的质粒(命名为pGEM-TEasy-DsRedl)用限制性内切酶BamHI和PvuI进行双酶切鉴定，酶切体系如下质粒10X缓冲液BSABamHIPvuIddH20总共pGEM-TEasy-DsRedl10u12u10.5u10.5u10.5u16.5u120u1。对携带EGFP基因的质粒(命名为pGEM-TEasy-EGFP)用限制性内切酶BssHII和NsiI进行双酶切鉴定，酶切体系如下:_质粒10XBSABssHIINw'IddH20总共缓冲液pGEM-TEasy-EGFP10ul2ul0.5yl0.5ul0.5ul6.5ul20yl。酶切反应条件均为37'C水浴酶切过夜。然后，对双酶切产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，其中，携带DsRedl基因的质粒pGEM-TEasy-DsRedl的酶切鉴定结果如图6A所示(泳道M为DL2000DNAMarker,泳道1-6为挑选的1-6号单克隆质粒的BamHI和PvuI双酶切产物，泳道7为DsRedl基因片段)，阳性重组质粒经双酶切可获得3015bp和717bp的DNA条带，其中1,3，4，5号单克隆为阳性克隆，与预期结果一致，最后将经酶切鉴定正确的阳性克隆菌液送北京三博远志生物技术有限责任公司进行测序，测序结果表明获得了序列及插入位置均正确的含有DsRedl基因的重组大肠杆菌克隆载体pGEM-TEasy-DsRedl;携带EGFP基因的质粒pGEM-TEasy-EGFP的酶切鉴定结果如图6B所示(泳道M为DL2000DNAMarker,泳道1-6为挑选的1-6号单克隆质粒的BssHII和NsiI双酶切产物)，阳性重组质粒经双酶切可获得3015bp和740bp的DNA条带，其中1,2,4，5，6号单克隆为阳性克隆，与预期结果一致，最后将经酶切鉴定正确的阳性克隆菌液送北京三博远志生物技术有限责任公司进行测序，测序结果表明获得了序列及插入位置均正确的含有EGFP基因的重组大肠杆菌克隆载体pGEM-TEasy-EGFP。三、重组载体pVAXl-IRES-DsRedl、pVAXl-IRES-EGFP和pVAXl-DsRedl-IRES-EGFP的构建1、pVAXl-IRES-DsRedl的构建1)酶切将步骤二获得的携带DsRedl基因的阳性重组质粒pGEM-TEasy-DsRedl和实施例1构建的真核表达载体pVAXl-IRES用限制性内切酶BamHI和PvuI进行双酶切，37°C水浴过夜，酶切体系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>然后，对双酶切产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶切鉴定结果如图7所示(泳道M为DL2000DNAMarker,泳道2为携带DsRedl基因的阳性重组质粒pGEM-TEasy-DsRedl的BamHI和PvuI双酶切产物，泳道4为pVAXl-IRES的BamHI和PvuI双酶切产物)，pGEM-TEasy-DsRedl经双酶切获得717bp的DNA条带，pVAXl-IRES经双酶切可获得大小约为3600bp的DNA条带，与预期结果相符。2)酶切产物的回收、连接和转化用博大泰克公司的PCR产物胶回收试剂盒并参照试剂盒说明书回收并纯化717bp的DsRedl基因和3600bp的线性化质粒pVAXl-IRES的条带，然后将纯化后的目的基因DsRedl和线性化载体pVAXl-IRES进行连接，16。C连接lh，连接体系如下DsRedl基因5^1pVAXl-IRES载体5plLigationMix10u1总体积20^1。然后，用与与实施例l步骤二中相同的方法将连接产物转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞。3)阳性重组质粒的筛选与鉴定挑取在含卡那霉素(50iig/mL)LB抗性平板上长出的单菌落8个(编号l-8)，分别接种于含卡那霉素(50ug/mL)的LB液体培养基中(5mL/管)，37。C摇床培养过夜，提质粒，用限制性内切酶BamHI和PvuI进行双酶切鉴定，酶切体系如下质粒10XBSABamHIPvuIddH20心z、缓冲液pVAXl-IRES-DsRedl10ul2u10.5u10.5y10.5n16.5u120ii1。酶切鉴定结果如图8A所示(泳道M为DL2000DNAMarker,泳道1-8为挑选的1-8号单克隆质粒的BamHI和PvuI双酶切产物)，阳性重组质粒经双酶切可获得3600bp和717bp的DNA条带，其中1，2，4号单克隆为阳性克隆，与预期结果一致，最后将经酶切鉴定正确的阳性克隆菌液送北京三博远志生物技术有限责任公司进行测序，测序结果表明获得了序列及插入位置均正确的含有DsRedl基因的重组真核表达载体，命名为pVAXl—IRES—DsRedl。2、pVAXl-IRES-EGFP的构建1)酶切将步骤二获得的携带EGFP基因的阳性重组质粒pGEM-TEasy-EGFP和实施例1构建的真核表达载体pVAX1-IRES用限制性内切酶NsiI和BssHII进行双酶切，37°C水浴过夜，酶切体系如下:_pGEM-TEasy-EGFPpVAXl-IRES<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>然后，对双酶切产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶切鉴定结果如图7所示(泳道M为DL2000DNAMarker,泳道1为携带EGFP基因的阳性重组质粒pGEM-TEasy-EGFP的NsiI和BssHII双酶切产物，泳道3为pVAXl-IRES的NsiI和BssHII双酶切产物)，pGEM-TEasy-EGFP经双酶切可获得740bp的DNA条带，pVAXl-IRES经双酶切可获得3600bp的DNA条带，与预期结果相符。2)酶切产物的回收、连接和转化用博大泰克公司的PCR产物胶回收试剂盒并参照试剂盒说明书回收并纯化740bp的EGFP基因和3600bp的线性化质粒pVAXl-IRES的条带，然后将纯化后的目的基因EGFP和线性化载体pVAXl-IRES进行连接，16。C连接lh，连接体系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>然后，用与与实施例l步骤二中相同的方法将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。3)阳性重组质粒的筛选与鉴定挑取在含卡那霉素(50yg/mL)LB抗性平板上长出的单菌落3个(编号l-3)，分别接种于含卡那霉素(50ug/mL)的LB液体培养基中(5mL/管)，37'C摇床培养过夜，提质粒，用限制性内切酶NsiI和BssHII进行双酶切鉴定，酶切体系如下<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>酶切鉴定结果如图8B所示(泳道M为DL2000DNAMarker,泳道1-3为挑选的1-3号单克隆质粒的NsiI和BssHII双酶切产物)，阳性重组质粒经双酶切可获得3600bp和740bp的DNA条带，其中3号单克隆为阳性克隆，与预期结果一致，最后将经酶切鉴定正确的阳性克隆菌液送北京三博远志生物技术有限责任公司进行测序，测序结果表明获得了序列及插入位置均正确的含有EGFP基因的重组真核表达载体，命名为pVAXl-IRES-EGFP。3、pVAXl-DsRedl-IRES-EGFP的构建1)酶切将步骤1获得的携带DsRedl基因的真核表达载体pVAXl-IRES-DsRedl用限制性内切酶NsiI和BssHII进行双酶切，37。C水浴过夜，酶切体系如下pVAX1—IRES—DsRed1DNA30y1iox缓冲液5w1100XBSA0,5u1NsiIIn1BssHIIlu1双蒸水12.5ix1总体积50ii1。然后，对双酶切产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，经双酶切可获得大小约为4300bp的DNA条带，与预期结果相符。2)酶切产物的回收、连接和转化用博大泰克公司的PCR产物胶回收试剂盒并参照试剂盒说明书回收并纯化大小约为4300bp的线性化质粒pVAXl-IRES-DsRedl的条带，然后将纯化后的EGFP基因和线性化质粒pVAXl-IRES-DsRedl进行连接，16'C连接lh，连接体系如下EGFP基因5|ilpVAX卜IRES-DsRedl5^1LigationMix10y1总体积2(^1。然后，用与与实施例l步骤二中相同的方法将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞。3)阳性重组质粒的筛选与鉴定挑取在含卡那霉素(50ug/mL)LB抗性平板上长出的单菌落3个(编号1-3)，分别接种于含卡那霉素(50yg/mL)的LB液体培养基中(5mL/管)，37"C摇床培养过夜，提质粒，用限制性内切酶XhoI和BamHI进行双酶切鉴定，酶切体系如下质粒10xBSAXhoIBamHIddH20总共缓冲液pVAXl-DsRedl-IRES-EGFP10ul2ul0.5u10.5ul0.5u16.5ul20ul。酶切鉴定结果如图8C所示(泳道M为DL2000DNAMarker,泳道1为挑选的单克隆质粒，泳道2为挑选的单克隆质粒的XhoI和BamHI双酶切产物)，阳性重组质粒经双酶切可获得3600bp和2100bp左右的DNA条带，与预期结果一致，最后将经酶切鉴定正确的阳性克隆菌液送北京三博远志生物技术有限责任公司进行测序，测序结果表明获得了序列及插入位置均正确的含有DsRedl基因和EGFP基因的重组真核表达载体，命名为pVAXl-DsRedl-IRES-EGFP。4)大量提质粒将鉴定正确的分别转染有质粒pVAXl-IRES-DsRedl、pVAXl-IRES-EGFP及pVAXl-DsRedl-IRES-EGFP的重组克隆菌液过夜培养，按照Promega公司WizardPlusMinipr印sDNAPurificationsystem并参照产品说明书提取质粒。四、重组真核表达质粒瞬时转染293T细胞及表达水平检测1、转染293T细胞采用脂质体法将步骤三构建的三种真核表达载体pVAXl-IRES-DsRedl、pVAXl-IRES-EGFP及pVAXl-DsRedl-IRES-EGFP分别转染人胚肾293T细胞，具体方法为将293T细胞(购自协和医科大学细胞中心)培养于含10X胎牛血清的RPMI1640培养基(GibcoBRL公司)中，取对数生长期的293T细胞，用0.25%胰酶(或EDTA)常规消化后接种入6孔培养板中，于37°C、50mL/L0)2孵育箱中培养24h(细胞生长密度为80-90%)，然后将阳性对照质粒pEGFP-Nl、pDsRedl-Nl和鉴定正确的重组质粒pVAXl-IRES-DsRedl、pVAXl-IRES-EGFP和pVAX卜DsRed1-IRES-EGFP分别在Invitrogen公司的转染试剂Lipofect.amine2000的介导下转染293T细胞，具体操作参照试剂盒说明书，空白对照组只加入等量的空白脂质体。2、激光扫描共聚焦显微镜检测各种重组质粒在293T细胞内的表达情况用Bio-Rad公司的Radiance210(T激光扫描共聚焦显微镜检测步骤1的各种重组质粒在293T转染细胞内的表达情况，检测方便包括以下步骤a.转染48h后用0.25%的胰酶消化293T转染细胞，轻轻吹打制备成单细胞悬液；b.用冰浴预冷的含有2%新生小牛血清的PBS清洗细胞3次；c.用1%多聚甲醛重悬细胞，调整细胞浓度，将细胞悬液滴到载玻片上，封片剂封存；d.用激光扫描共聚焦显微镜检测各种重组质粒的表达情况。瞬时转染48小时后的293T细胞的激光扫描共聚焦显微镜检测结果如图9所示(a:pDsRed1-Nl;b:pEGFP-Nl;c:pVAXHRES-DsRedl;d:pVAXHRES-EGFP;e-g:pVAXl-DsRedl-IRES-EGFP;h:空白对照)，转染阳性对照质粒pDsRedl-Nl和pEGFP-Nl的293T细胞均有红色或绿色的荧光呈现(a,b)，证明转染体系建立成功；转染重组质粒pVAXl-IRES-DsRedl、pVAXl-IRES-EGFP的293T细胞也发出红色或绿色的荧光(c，d)，证明连入的DsRedl、EGFP基因均可以在已构建的pVAXl-IRES载体中正常表达；分别在575nm或518nm两种波长激发下观察转染重组质粒pVAXl-DsRedl-IRES-EGFP的293T细胞，可见红色或绿色荧光呈现(e,f)，当用575nm和518nm两种波长共同激发时，可见某些293T细胞呈黄色(g)，证明连入pVAXl-IRES载休中IRES编码序列上游的DsRedl基因和下游的EGFP基因不仅可以分别在293T细胞中表达，而且可以在同一个细胞中通过IRES的作用进行共表达，证明本发明的DNA疫苗载体pVAXl-IRES具有同时启动两种基因进行共表达的功能。3、流式细胞仪测定各种重组质粒的瞬时表达效率用BD公司的FACSCalibur流式细胞仪测定步骤1瞬时转染48小时后各种重组质粒在293T转染细胞内的瞬时表达效率，具体方法如下a.转染48h后用0.25%的胰酶消化293T转染细胞，轻轻吹打制备成单细胞悬液；b.用冰浴预冷的含有2%新生小牛血清的PBS清洗细胞3次；c.用0.5mL1%多聚甲醛重悬细胞，最后用流式细胞仪测定各种重组质粒在293T转染细胞内的表达情况。瞬时转染48小时后的各种重组质粒在293T细胞内的瞬时表达效率的流式细胞仪检测结果如图10所示(A:空白对照；B:pDsRedl-Nl;C:pEGFP-Nl;D:pVAXl-IRES-DsRedl;E:pVAXl-IRES-EGFP;F:pVAXl-DsRedl-IRES-EGFP(UL表示up-left，左上角，575nm，反应的是只单独表达红色荧光蛋白的细胞；LR即low-right,右下角，518nra，反应的是只单独表达绿色荧光蛋白的细胞；UR即up-right,右上角，575nm+518nm，双表达即同一个细胞中既表达红色荧光蛋白又表达绿色荧光蛋白；LL即low-left,左下角，表示的是双阴的细胞)，可见质粒pVAXl-DsRedl-IRES-EGFP中DsRedl基因的表达情况为(10.24%+18.86%=29.10%),EGFP基因的表达情况(5.24%+18.86%=24.10%)，DsRedl基因和EGFP基因同时表达的情况(18.86%)。表明连入pVAX卜IRES载体中IRES编码序列上游的DsRedl基因和下游的EGFP基因不仅可以分别在293T细胞中表达，而且可以在同一个细胞中通过IRES的作用进行共表达，进一步证明本发明的DNA疫苗载体pVAXl-IRES具有同时启动两种基因进行共表达的功能。实施例3、多耙点复合抗原抗肿瘤基因疫苗的构建及真核表达一、抗原复合物2PAG融合基因的设计Survivin主要激发细胞免疫反应，Survivin的mRNA在体内经过不同的剪切方式可产生三种异构体Survivin、Survivin-2B和Survivin-EX3,其中以Survivin-2B的自氨基端第80-88位氨基酸残基为特异性靶点的抗肿瘤疫苗已经进入II期临床试验阶段。经大量文献调研发现，Survivin-2B的T细胞抗原表位主要集中在自氨基端第5-28和第80-121位氨基酸残基之间，因此选取这两个区域作为本发明多靶点复合抗原抗肿瘤基因疫苗的靶点之一。从Genebank中查找人Survivin2B(醒-001012271)中相对应于上述两个区域的碱基序列(134-205，359-513),再通过连接臂"-nG-，其中n可以为K(赖氨酸)、R(精氨酸)、C(半胱氨酸)、Q(谷氨酰胺)、G(甘氨酸)或N(天冬酰胺)，本实施例n为N(天冬酰胺)"编码序列将两段DNA序列连接从而构成Sur融合基因，其核苷酸序列如序列表中的序列1所示，全长273bp，编码91个氨基酸残基。CTP37是位于hCGe链羧基端第109-145位氨基酸残基的37肽，存在hCG的特异抗原表位。将人和猴的CTP37联合使用构建复合耙抗原，方法为从Genebank中查找人和猴的hCGP-CTP37的编码序列[人:NM一033043;猴丽一001032928(同源性比较结果，猴人二76%;猴小鼠二100%)，通过连接臂-nG-(n可以为K、R、C、Q、G或N，本实施例n为N)将两个物种的CTP37编码序列相连接构成融合基因hmCTP，其核苷酸序列如序列表中的序列2所示，全长为228bp，编码76个氨基酸残基。将融合基因Sur的3'端和融合基因hmCTP的5'端相连接即得到抗原复合物2PAG融合基因，其结构式意图如图ll所示。二、抗原复合物2PAG融合基因的PCR扩增1、引物设计根据Sur和hmCTP基因的核苷酸序列设计两对引物(带下划线碱基为限制性内切酶识别位点)，其中Sur-Fl的5，端含有限制性内切酶XhoI识别位点，hmCTP-Rl的5'端含有限制性内切酶EcoRI识别位点，Sur-SC-Rl和Sur-SC-Fl有20bp的互补区域，具体引物序列如下Sur-Fl:5'-CCCGGCTCGAGACATTGCCCCCTG-3'Sur-SORh5，-CATCACAGGTCTTCTTATTGTTGG-3'Sur-SC-Fh5，-CAATAAGAAGACCTGTGATGACCCCCG-3，MCG-R1:5,-GGCCCGAATTCTTGTGGAAGGAAAGGG-3，。2、抗原复合物2PAG融合基因的PCR扩增首先，由北京擎天生物技术有限公司合成上述两条融合基因Sur和hmCTP，并分别连接至T-easy载体pGEM-TEasy(TaKaRa公司)中，将含有融合基因Sur的重组载体命名为Sur-T-easy,将含有融合基因hmCTP的重组载体命名为hmCTP-T-easy。然后，分别以含有合成基因的质粒Sur-T-easy和hmCTP-T-easy为模板，PCR扩增出融合基因Sur-SC和SC-hmCTP。其中，Sur-SC的3'端和SC-hmCTP的5'端含有20bp的互补序列。PCR扩增体系为10xPCR缓冲液5jal，dNTPsMixture(2.5raM)5yl，引物(20pM)Sur-Fl和Sur-SC-Rl(或Sur-SC-Fl和hmCTP-Rl)各lpl，模板Sur-T-easy(或hmCTP-T-easy)1^1,TaqDNA聚合酶(5U/ul)lul，加去离子水至50ul。PCR反应条件为先94。C预变性5rain;然后94。C变性30s，58'C退火30s，72。C延伸45s，共5个循环最后72t:继续延伸10rain。反应结束后，取5n1PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图12所示(泳道M为DL2000DNAMarker,泳道l为融合基因Sur-SC，泳道2为融合基因SC-hmCTP)，经扩增获得了273bp和228bp的DNA条带，与预期大小一致。用博大泰克公司的PCR产物胶回收试剂盒并参照试剂盒说明书回收并纯化融合基因Sur-SC(273bp)和融合基因SC-hmCTP(228bp)的目的条带。再以PCR扩增的融合基因Sur-SC和SC-hmCTP稀释50倍后各取1^1共同为模板，用搭桥PCR的方法扩增抗原复合物2PAG融合基因，在引物Sur-Fl和hmCTP-Rl的引导下进行PCR扩增，反应结束后，取5nlPCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图12所示(泳道M为DL2000DNAMarker(购自TaKaRa公司)，泳道3为PCR扩增的抗原复合物2PAG融合基因)，经扩增获得了523bp的DNA条带，与预期大小一致。用博大泰克公司的PCR产物胶回收试剂盒并参照试剂盒说明书回收并纯化该抗原复合物2PAG融合基因的目的条带。三、人GM-CSF和B7.l融合基因的获得按GeneBank上公开的人GM-CSF(NM-000758)和B7.1(腿-005191)的编码序列设计其PCR扩增引物序列，序列如下GMF1(上游引物)5'-CCG」7ATGTGGCTGCAGAGCCTG-3'(带下划线碱基为限制性内切酶NsiI识别位点)GMR1(下游引物)5'-GCCGCCGCGTCGACCCCTGCCGCCCTCCTGGACTGGCTCCCAGC-3';B7Fl(上游引物)5'-GGCGGCAGGGGTCGACGCGGCGGCGGTCTTTCTCACTTCTGTTC-3，B7R1(下游引物)5，-CCG^^TTATACAGGGCGTACACTTTCCC-3'(带下划线碱基为限制性内切酶BSSHII识别位点)。首先，由北京擎天生物技术有限公司合成人GM-CSF和B7.l的编码序列，并分别连接至pGEM-TEasy载体(购自TaKaRa公司)中，将含有人GM-CSF编码序列的重组载体命名为pGEM-TEasy-GM-CSF，将含有B7.1编码序列的重组载体命名为pGEM-TEasy-B7.1。然后，分别以含有合成基因的质粒pGEM-TEasy-GM-CSF和pGEM-TEasy-B7.l为模板，在GMF1和GMR1的引导下PCR扩增GM-CSF基因全长序列，在B7F1和B7R1的引导下PC財广增B7.l基因全长序列，然后将各自的PCR产物稀释50倍后各取lpl共同作为模板，在引物GMF1和B7R1的引导下PCR扩增GM-CSF和B7.l融合基因。具体反应体系和反应条件参见步骤二。反应结束后，取5ylPCR扩增产物进行1W琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图13所示(泳道M为DL2000DMMarker,泳道l为-人GM-CSF基因，泳道2为B7.l基因，泳道3为PCR扩增的人GM-CSF因子和B7.l融合基因)，经扩增获得了1245bp的DNA条带，与预期大小一致。用博大泰克公司的PCR产物胶回收试剂盒并参照试剂盒说明书回收并纯化该人GM-CSF和B7.l融合基因的目的条带。人GM-CSF基因和B7.l基因通过8肽编码序列连接，表达后可以在体内普遍存在的Furin蛋白酶作用下使人GM-CSF因子和B7.l分子分离，从而不影响它们的空间构象，以利于发挥各自的功能。四、DNA疫苗pVAX1-2PFcGB的构建1、含有抗原复合物2PAG融合基因的真核表达质粒pCI-2PAG-Fc-GPI的构建将步骤二获得的抗原复合物2PAG融合基因用限制性内切酶XhoI和EcoRI进行双酶切后与经相同酶双酶切的含有人Igk链前导信号肽(sig)、人IgG-Fc和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定信号肽基因序列的真核表达载体pCI-GPI(在Promega公司的真核表达质粒pCI-neo+的基础上构建而成，构建方法为在pCI-neo+原多克隆位点处的限制性内切酶NheI和XbaI之间插入通用序列构建而成，该通用序列的基因顺序为5，-Nhe1_人Igk链前导信号肽(sig)编码序列-XhoI-EcoRV-EcoRI-人IgGFc段编码序列-糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定信号肽的编码序列-Xba1-3'，外源免疫分子基因可以在NheI—EcoRI之间选择合适的酶切位点插入。pCI-GPI除含有人IgGFc段编码序列和糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定信号肽的编码序列外，还含有pCI载体的主要骨架结构，如CMV早期启动子、嵌合内含子、Neo筛选标记、SV40增强子和氨节抗性基因A即r+等)连接，将连接产物转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆，用引物Sur-Fl和hmCTP-R1进行菌落PCR鉴定，然后提质粒，用限制性内切酶Nhe工和NotI进行双酶切鉴定，PCR及酶切鉴定结果如图14所示(泳道M:DL2000DNAMarker;泳道l:2PAG融合基因的XhoI+EcoRI酶切产物；泳道2:pCI-GPI的XhoI+EcoRI酶切产物；泳道3:菌落PCR鉴定结果；泳道4:pCI-neo-2PAG-Fc-GPI质粒；泳道5:pCI-neo-2PAG-Fc-GPI的NheI十NotI酶切产物)，阳性克隆质粒经酶切可获得5472bp和2473bp的DNA条带，将鉴定正确的阳性克隆菌株由北京三博生物有限公司进行测序，测序结果表明获得序列及插入位置均正确含有抗原复合物2PAG融合基因的真核表达质粒，命名为pCI-2PAG-Fc-GPI。2、真核表达质粒pVAX-sig-2P-FC-GPI-IRES的构建将测序正确的阳性重组质粒pCI-2PAG-Fc-GPI先用限制性内切酶NotI进行单酶切并经纯化后，用Klenow酶(TaKaRa公司)并参照试剂盒说明书补平单酶切后产生的粘性末端，然后将纯化后的产物再用限制性内切酶NheI进行单酶切，随后切胶回收含有2473bp线性化的sig-2PAG-FC-GPI的目的片段(5'端为NheI酶切后产生的粘性末端，3'端为IQenow补平后产生的平端)。然后，将实施例l构建的真核表达载体pVAXl-IRES用限制性内切酶NheI和EcoRV进行双酶切和纯化后与sig-2PAG-Fc-GPI进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌DH5ci感受态细胞，筛选阳性克隆，用引物Sur-Fl和hmCTP-Rl进行菌落PCR鉴定，然后提质粒，提质粒，用限制性内切酶NheI和ClaI进行双酶切鉴定，菌落PCR及酶切鉴定结果如图15所示(泳道M:DL2000DNAMarker;泳道l:sig-2PAG-Fc-GPI/NotI—Klenow—NheI;泳道2:pVAXl-IRES的NheI+EcoRV酶切产物；泳道3:菌落PCR鉴定结果；泳道4:pVAXl-sig-2PAG-Fc-GPI-IRES质粒；泳道5:pVAXl-sig-2PAG-Fc-GPI-IRES的NheI+ClaI酶切产物)，阳性克隆质粒经酶切可获得3600bp和2473bp的DNA条带，将鉴定正确的阳性克隆菌株由北京三博生物有限公司进行测序，测序结果表明获得序列及插入位置均正确含有sig-2PAG-FC-GPIDNA片段的真核表达质粒，命名为pVAX-sig_2P-FC-GPI-IRES。3、pVAXl-IRES-GM/B7的构建将步骤三扩增的GM-CSF和B7.l融合基因用限制性内切酶NsiI和BSSHII进行双酶切后与经同样酶双酶切的载体pVAXl-IRES进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，用限制性内切酶NsiI和BSSHII进行双酶切鉴定，酶切鉴定结果如图16所示(泳道M:DL2000DNAMarker;泳道l:pVAXl-IRES-GM/B7质粒；泳道2:GM-CSF和B7.l融合基因;泳道3:pVAXl-IRES-GM/B7质粒的NsiI+BSSHn酶切产物)，阳性克隆质粒经酶切可获得3600bp和1245bp的DNA条带，将鉴定正确的阳性克隆菌株由北京三博生物有限公司进行测序，测序结果表明获得序列及插入位置均正确含有GM-CSF和B7.l融合基因的真核表达质粒，命名为pVAX1-IRES-GM/B7。4、DNA疫苗pVAX卜2PFcGB的获得将步骤2鉴定正确后的阳性重组质粒pVAXl-sig-2PAG-Fc-GPI-IRES用限制性内切酶NheI和ClaI进行双酶切后，对酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化2473bp的含有sig-2PAG-FC-GPI的目的片段，然后再与经NheI和ClaI双酶切的真核表达质粒pVAX卜IRES-GM/B7进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，用限制性内切酶NsiI和BSSHII进行双酶切鉴定，酶切鉴定结果如图17所示(泳道M:DL2000DNAMarker;泳道l:sig-2PAG-Fc-GPI的NheI+ClaI酶切产物；泳道2:pVAXl-IRES-GM/B7的NheI+ClaI酶切产物；泳道3:PCR鉴定；泳道4:pVAXl-sig-2PAG-Fc-GPI-GM/B7质粒；泳道5:pVAX卜sig-2PAG-Fc-GPI-IRES的NheI+ClaI酶切产物)，阳性克隆质粒经酶切可获得大小约为2000bp的DNA条带，将鉴定正确的阳性克隆菌株由北京三博生物有限公司进行测序，测序结果表明获得序列及插入位置均正确的真核表达质粒，即本发明的多靶点复合抗原抗肿瘤基因疫苗，命名为pVAX1-sig-2PAG-Fc-GPI-GM/B7(简称pVAXl-2PFcGB)。五、多靶点复合抗原抗肿瘤基因疫苗的真核表达1、DNA疫苗pVAX1-2PFcGB的真核表达采用与实施例2中相同的脂质体法将步骤四构建的DNA疫苗pVAXl-2PFcGB转染人胚肾293T细胞，同时设立三个实验组和空白对照组，空白对照组只加入等量的空白脂质体，分别用于流式细胞仪检测和免疫荧光检测。2、流式细胞仪检测采用与实施例2中相同的方法用BD公司的FACSCalibur流式细胞仪测定歩骤1瞬时转染48小时后pVAXl-2PFcGB在293T转染细胞内的瞬时表达效率，在pVAXl-2PFcGB中，2PAG融合基因的羧基端融合了人IgGFc段基因，可作为检测融合蛋白表达的标签，因此分别用FITC标记的兔抗人IgG(购自北京中杉金桥技术有限公司)、PE标记的兔抗人B7的抗体(EBioScience公司)与转染48小时后的细胞进行孵育，用以检测插入片段2PAG-Fc-GPI和载体中GM-CSF/B7.1融合基因在293T细胞中的表达情况，流式细胞仪检测结果如图18所示(A:空白对照组(FITC);B:实验组(FITC);C:空白对照组(PE);D:实验组(PE))，转染48小时后，293T细胞中插入片段2PAG-Fc-GPI的阳性表达率为44.46%，平均荧光强度为334.17;载体中GM-CSF/B7.1的阳性表达率为52.26%，平均荧光强度为497.86，表明连接入pVAXl-IRES载体中IRES编码序列上游的2PAG-Fc-GPI基因片段和下游的GM-CSF/B7.1融合基因均获得表达。3、免疫荧光检测采用与实施例2中相同的方法处理细胞，滴片后在荧光显微镜下直接进行免疫荧光检测。分别用FITC标记的兔抗人IgG、PE标记的兔抗人B7的抗体与转染48小时后的细胞进行孵育，用以检测插入片段2PAG-Fc-GPI和载体中GM-CSF/B7.1融合基因在293T细胞中的表达情况，免疫荧光检测结果如图19所示(A:经FITC-IgG抗体孵育的293T细胞；B:经PE-B7抗体孵育的293T细胞)，经荧光显微镜观测发现，瞬时转染pVAXl-2PFcGB48h后的293T细胞均有荧光显示，且主要分布于细胞膜上(图6)，而未转染重组质粒pVAXl-2PFcGB的293T细胞检测结果均为阴性，证明插入片段2PAG-Fc-GPI和载体中GM-CSF/B7.1融合基因均可以有效表达。实施例4、多靶点复合抗原抗肿瘤基因疫苗pVAXl-2PFcGB的抑瘤活性检测用下述方法检测本发明多靶点复合抗原抗肿瘤基因疫苗pVAXl-2PFcGB的抑瘤活性，同时以实施例3构建的质粒pVAX1-2PAG、pVAXl-2PAG-Fc-GPI(结构示意图见图29)和pVAX1-IRES-GM/B7为对照，检测方法如下一、多靶点复合抗原抗肿瘤基因疫苗pVAXl-2PFcGB免疫小鼠1、免疫用质粒DNA的大量提取与纯化用北京博大泰克生物基因技术有限责任公司"B型超纯质粒大量快速提取试剂盒"并参照试剂盒说明书大量制备免疫用质粒DNA，具体方法包括以下步骤a.将200mL携带pVAXl-2PFcG的大肠杆菌DH5a重组菌37"C培养12小时后收集菌体，加入7mL溶液l，振荡至彻底悬浮；b.加入10.5mL溶液2，轻轻颠倒混匀，使菌体充分裂解，随后冰上放置5分钟；c.加入IO.5mL溶液3，轻轻颠倒混匀，室温放置10分钟，4°C、12，000rpm离心15min;d.将上清与0.6倍体积的异丙醇混匀后，4'C、10,000rpm离心20min;e.收集沉淀，溶于2mL双蒸水中并加入80u110mg/mLRNaseA，37。C保温30分钟；f.加入等体积的结合缓冲液，混匀后移入吸附柱，室温、12，OOOrpm离心lmin;g.倒掉废液，加入500nl去内毒素缓冲液，室温、2，000rpm离心lmin，重复l次后，再次于室温、12，000rpm离心3min;尽量去除去内毒素缓冲液；h.倒掉废液，加入800yl漂洗缓冲液，静置l分钟后12,000rpm离心lmin，重复2次后，再次12,000rpm离心2min，尽量去除漂洗缓冲液；1、将吸附柱放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中央加入50nl无菌水，室温下静置2-5min，12,000rpm离心2min，收集洗脱液，-20。C贮存备用。收集洗脱液即为提纯的质粒DNA，加入10XPBS使质粒咖A溶于PBS溶液。紫外分光光度法测定DNA含量和纯度，结果DNA含量约为l^gAa，纯度达90%，-20'C保存。2、动物分组将6周龄、体重18-20g的雌性Balb/c小鼠(购自军事医学科学院实验动物中心)随机分为6组，每组9只，A组为PBS对照组，B组为pVAXl空载体组，C组为pVAXl-IRES-GM/B7组，D组为pVAX1-2PAG组，E组为pVAXl-2PAG-Fc-GPI组，F组为pVAXl-2PFcGB组(基因疫苗pVAX1-2PFcGB)。3、皮下移植瘤攻击收获对数生长期的小鼠乳腺癌细胞EMT6(购自中国科学院上海细胞资源中心)，制备单细胞悬液，用PBS洗2次，调整细胞浓度至2X106个/mL，于-d5天在小鼠背部右侧皮下接种100W细胞悬液即2Xl()S个/只。4、Balb/c小鼠的免疫免疫方案如图20所示，Balb/c小鼠经皮下移植瘤攻击5天后，开始接种疫苗。免疫方式采用股四头肌肌肉注射，A组注射100WraS，其余各组分别注射相应的DNA质粒100Hg/只，分别于dO、d5、dl5和d20共免疫4次。每次免疫前，首先注射100y10.25%布比卡因预处理接种部位，72h后在相同部位接种疫苗。于末次免疫后第5天(d25)检测小鼠体内抗体的产生情况并收集每组2只小鼠的脾细胞，准备CTL杀伤实验；d30天断颈处死每组其余各只小鼠并摘取肿瘤组织称重。二、免疫效果检测1、疫苗免疫保护效果观察和检测1)免疫小鼠的成瘤时间首先给Balb/c小鼠皮下注射接种2Xl(f个EMT6细胞，接种细胞后5d，开始给各组小鼠股四头肌分别注射相应的质粒DNA或PBS，观察并记录各组小鼠的肿瘤结节形成时间(可扪及，长径约2-3mm)。各组免疫小鼠皮下移植瘤的成瘤时间统计结果如表1和图21所示，可以看出，各免疫组的肿瘤结节形成时间存在不同程度的差别。A组的成瘤时间最甲-，约6天左右；B组、C组的成瘤时间相差不多，无显著性差别(P>0.05)。含有抗原复合物2PAG的D、E和F组小鼠成瘤时间均晚于对照组，其中D组小鼠的成瘤时间较早，约8天左右；E组次之，而F组小鼠的成瘤时间最晚，直到12天左右才可以检测到肿瘤结节的形成。E组和F组与对照组相比，小鼠的成瘤时间差异显著(P<0.05)。表l各组免疫小鼠皮下移植瘤的成瘤时间平均成瘤时间(天)A组(PBS)6±1.01B组(pVAXl空载体)6.28±0.81C组(pVAXl-IRES-GM/B7空载体)6.57±1.13D组(pVAXl-2PAG)8.14±0.99E组(pVAXl-2PAG-Fc-GPI)9.57±1.23《F组(pVAXl-2PFcGB)12.29±1.26※注※与对照组比较，该组小鼠成瘤潜伏期延长(P<0.05)2)免疫小鼠体内移植瘤生长情况检测预先选定各免疫组中的7只小鼠，皮下注射接种2X1()5个/只EMT6细胞后第5天开始接种疫苗。从小鼠皮下移植瘤攻击后开始至处死小鼠的35天内，每2天用游标卡尺测量一次肿瘤的垂直长径和垂直短径，并通过如下公式计算每组小鼠体内肿瘤的平均体积，绘制其肿瘤生长曲线，对肿瘤生长曲线进行线性回归并对其斜率做t检验，小鼠体内肿瘤的平均体积的计算公式如下肿瘤体积(nim3)=L垂直长径X垂直短径的平方免疫小鼠体内移植瘤的生长曲线如图22所示，pVAXl空载体组(B组)和不含复合抗原2PAG的pVAXl-IRES-GM/B7组(C组)小鼠体内的内移植生长情况与PBS对照组之间无显著差别(P>0.05);经疫苗治疗的D、E和F组内的小鼠，其无瘤潜伏期均比对照组延长，肿瘤的生长均比对照组缓慢(P<0.05)。其中，E组和F组与PBS对照组相比，差异极其显著(P<0.01)。F组内小鼠的无瘤潜伏期最长，在d22前其肿瘤的生长速度最为缓慢，与E组相比有显著性差异(P<0.05)，但当d22之后差异不显著(P>0.05)，这可能与第二次与第三次免疫之间时间的延长有关，未能及时抑制住肿瘤的生长。3)皮下移植瘤攻击后35天小鼠的存活情况皮下注射接种2X105个/只EMT6细胞后35天内，各组小鼠(7只/组)的存活情况如表2所示，PBS对照组和pVAXl空载体组均有l只小鼠自然死亡，其余各组的7只小鼠均存活，表明本发明的基因疫苗具有较高的安全性。表2皮下移植瘤攻击后35天各组免疫小鼠的存活情况<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>4)免疫小鼠对皮下移植瘤的抑制作用皮下注射接种2X105个/只EMT6细胞后35天断颈处死各组内的存活小鼠，摘取肿瘤组织，并拍照。称量各组瘤重后，根据公式计算各组疫苗对肿瘤的抑制率，肿瘤抑制率的计算公式如下.-对照组平均瘤重一免疫组平均瘤重肿瘤抑制率(％)=-xlOO%对照组平均瘤重皮下接种EMT6细胞并经疫苗免疫30天后，各免疫组小鼠的离体肿瘤体积比较结果如图23所示(A:PBS空白对照组;B:pVAXl组;C:pVAXl-IRES组;D:pVAXl-2PAG组；E:pVAXl-2PAG-Fc-GPI组；F:pVAXl-2PFcGB组)，皮下移植瘤攻击35天后各组小鼠的平均瘤重如图24所示，各免疫组的肿瘤抑制率的统计结果如表3和图25所示，结果显示，A组、B组和C组的平均瘤重相近，没有显著性差异(P>0.05);与对照组相比，D组、E组和F组的平均瘤重均明显降低，表明本发明含复合抗原基因2PAG的基因疫苗具有较高的肿瘤抑制率(P<0.01);其中F组的平均瘤重最小，具有最高的肿瘤抑制率，与对照组的差异极其显著(P<0.001)。表3各组免疫小鼠对肿瘤的抑制作用平均瘤重(g)肿瘤抑制率(％)A组(PBS)3.78±0.59—B组(pVAXl空载体)3.50±0.447.4C组(pVAXl-IRES-GM/B7空载体)3.33±0.5111.9D组(pVAXl-2PAG)1.98±0.7547.6※E组(pVAXl-2PAG-Fc-GPI)1.41±0.3362.7※F组(pVAXl-2PFcGB)0.86±0.3177.27碰注※与对照组相比，该组小鼠对肿瘤的抑制作用非常显著(P〈0.01);《《P<0.001。2、血清抗体的ELISA检测末次免疫后第5天(d25)，取D、E和F组免疫小鼠的尾静脉血，室温放置3h后3000卬m离心10min，取上层血清，用Sur融合蛋白包板，用ELISA法检测抗体滴度，同时设立免疫前鼠血清的阴性对照组，检测方法包括以下步骤a.包被蛋白用包被液稀释至终浓度为3ug/mL，包被ELISA板，4'C过夜；b.洗涤甩弃ELISA板孔中包被液，PBST洗涤1次；c.封闭2X酪蛋白室温封闭4h，弃去封闭液，拍干ELISA板；d.检测:免疫鼠血清用PBS倍比稀释后加入各孔，飾l/孔，37°C、30min;e.标记PBST洗涤后加入服P标记的羊抗鼠IgG(购自北京中杉金桥技术有限公司)，37"C反应20min;f.显色PBST洗涤后，TMB显色10min，2M硫酸终止反应。用SPECTRAIII酶联仪检测450mn的OD值。结果判定待测样品的OD值(P)与阴性对照的OD值(N)之比大于或等于2.1(P/N》2.1)为阳性，显示阳性结果的最大抗体稀释度为免疫小鼠血清的抗体效价。D、E和F组免疫小鼠血清的抗体效价的ELISA检测结果如图26所示，D、E和F组免疫小鼠血清中均有特异性抗体出现，D组的血清抗体效价为1:3200，E组和F组相同，均为1:6400。上述检测结果表明本发明的基因疫苗具有较好的免疫原性。3、免疫小鼠CTL杀伤活性的测定测定免疫小鼠CTL杀伤活性，具体方法包括以下歩骤1)免疫小鼠脾脏单个核细胞悬液的制备末次免疫后第5天(d25)，断颈处死各组中剩余的两只小鼠，在无菌条件下取小鼠的脾脏制备脾细胞悬液，具体操作如下a.打开超净工作台的紫外灯照射30分钟，取小鼠拉颈处死，自来水冲洗后浸泡于75X乙醇中5min，随即放入超净台内小鼠解剖板上左侧卧位；b.用75%乙醇消毒小鼠腹部，无菌手术开腹腔取出脾脏，去除脂肪和结缔组织，剪成(5-7段)放于200目不锈钢网筛，将网筛置于预先放入2-3mL无血清RPMI-1640培养液的平皿中，用研磨棒挤压出脾细胞，尽量挤压干净；c.用适量无血清RPMI-1640培养液冲洗钢网，冰浴中静置3-5min，取上清部分移入离心管中，补加培养液到10mL;d.准备两只透明刻度离心管，分别加入4mL淋巴细胞分离液，将脾细胞悬液缓慢加在分离液上方，1500rpm离心20min;e.离心后取白膜，加入10mL培养基洗2次(1000rpm离心10min);f.最后将细胞重悬于淋巴细胞培养基中(不完全培养基中加入20XFCS)。用淋巴细胞计数液对细胞进行计数，一般来讲，脾细胞悬液中可以收获108的细胞，经淋巴细胞分离液分离后可获得107的细胞，调整细胞浓度至1X107ihL，加入维持淋巴细胞生长的细胞因子PHA-P2Pg/mL和IL-220IU/mL，放入C02孵箱中培养。2)效应细胞的制备取免疫后小鼠的脾单个核细胞悬液，力卩PHA-P2Pg/mL和IL-21011VinL维持淋巴细胞生长，为检测特异性杀伤效应，加入常规方法制备的重组Sur原核蛋白，工作浓度25M/mL，与细胞共刺激，C02孵箱中培养3天后用作效应细胞。3)耙细胞的制备将小鼠乳腺癌细胞EMT6在C02孵箱中培养备用。4)乳酸脱氢酶(LDH)-释放法测杀伤活性A、反应体系的建立效耙细胞共孵育杀伤过程，在96孔圆底细胞培养板中进行，整个反应体系要设置严格的对照孔和试验孔，每组设3个复孔，均为200W体系，包括以下内容a.不同浓度效应细胞LDH自然释放孔(由效应细胞与无血清RPMI-1640培养基组成)收集效应细胞，调整细胞浓度倍比稀释，每孔50W;b.靶细胞LDH自然释放孔(靶细胞与无血清培养基组成)每孔加入靶细胞(1X107mL)50W，用无血清培养基补足至100W;c.耙细胞最大释放孔(由耙细胞、无血清RPMI-1640培养基和随后加入的10X裂解液组成)每孔加入靶细胞(1X107mL)50W，用无血清培养基补足100W;d.培养基背景值孔加入100W无血清RPMI-1640培养基，用于校正培养基中LDH的自然释放；e.体积校正孔加入100W无血清RPMI-1640培养基和10X裂解液(Promega公司的CytoTox96@Non-RadioactiveCytotoxicityAssay试剂盒提供)，校正10W裂解液引起的体积误差；f.实验孔每孔加入靶细胞(5X107raL)5(M，加入倍比稀释好的效应细胞50W，使效靶比为60:1;30:1;15:1;7.5:1。所有反应设置完成后，于室温300rpm离心4min。B、细胞培养和收获上清将96孔培养板放入C02孵箱中培养4小时，培养结束前45min，在耙细胞最大释放孔中，加入10X裂解液，继续培养并在显微镜下观察最大释放孔中靶细胞的裂解情况，如果裂解不完全可补加入10X裂解液。结束培养后，在室温下250rpra离心4min。C、LDH测定用Promega公司的CTL活性检测试剂盒CytoTox96@Non-RadioactiveCytotoxicityAssay并参照试剂盒说明书测定各免疫组小鼠脾细胞的杀伤活性，方法为准备另一块96孔酶联板，从96孔圆底培养板中取上清50W移入酶联板中相对应位置，每孔中加入50W底物液，盖好盖室温避光反应30min后，再加入50W终止液，490nm处读取吸光值。D、计算实验结果先求出各组实验数据所设复孔的平均值，然后计算各组数据的纠正值，即实验组和自然释放组减去培养基背景释放值；最大释放组减去体积纠正释放值，应用各组实验数据的纠正值，按如下公式计算-,、实^#方文-效i^ffilffi自然ff方文-耙^ia自然释放杀伤率(％)=-X100%靶细胞最大释放-耙细胞自然释放各免疫组小鼠脾细胞的杀伤率统计结果如表4和图28所示，实验结果显示，D、E和F组免疫小鼠体内均产生了不同程度的细胞免疫反应，随着效耙比的增加，CTL特异性杀伤率也逐渐上升，与对照组具有显著性差异(P<0.05)，其中F组的CTL杀伤率最高，在效靶比为60:1、30:1和15:1时均与对照组具有极其显著性差异(P〈0.01);D组和E组的CTL杀伤率基本相同。表4不同效靶比的各免疫组小鼠脾细胞的杀伤活性CTL平均杀伤率(％)60:130:115:17.5:1A组(PBS)7.736.035.462.69B组(pVAXl空载体)12.098.056.064.48C组(pVAXl-IRES-GM/B7空载体)175714.3611.019.71D组(pVAX卜2PAG)40.75※31.21※28.04《23.99《E组(pVAXl-2PAG-Fc-GPI)48.56《30.97》24.56《18.48《F组(pVAXl-2PFcGB)68.7444.3『30.9『20.6(f注:《与对照组相比，该组小鼠对肿瘤的抑制作用非常显著(P〈0.05);冊P〈0.01。序列表<160〉2<210>1<211〉273〈212〉DNA<213〉人工序列<220><223>〈400〉1acattgccccctgcctggcagccctttctc肌ggaccaccgcatctctac60tggcccttcttgaacggcgcttacgcctgt肌taccagcactttgggaggccg鄉cggg120cggatcacaag卿gga^cat犯aaagcatagctccggttgcgctttcctttxtgtcaag180aagcagtttgaag肌ctgacccttggtgaa"tttttgaaactggacag.a^gagcca^g240aac3a犯ttgca^3gga^ac肌g273〈210〉2<211>228〈212〉DNA〈213>人工序列〈220〉<223>〈400〉2acctgtgatgacccccgcttccaggactcctcttcctcaaaggcccctccccccagcctt60ccaagtccatccagactccctgggcccagcgacacccctatcctcccacaaaacggcacc120tgtgatgacccccacctccaggcctcctcttcctcaaaggaccctccccccagccctcca180agtccatccggactcctggagccagcagacaaccctttccttccacaa228权利要求1、一种DNA疫苗真核表达载体，是在pVAX1载体骨架中添加内部核糖体进入位点编码序列得到的重组pVAX1真核表达载体。2、根据权利要求1所述的DNA疫苗真核表达载体，其特征在于在所述DNA疫苗真核表达载体中的内部核糖体进入位点编码序列的两端还添加有一种或多种稀有限制性内切酶识别位点；所述稀有限制性内切酶包括EcoRV、ClaI、BstBI、PvuIPsiI、BssHII、SwaI、PacI、NsiI和XhoI。3、根据权利要求2所述的DNA疫苗真核表达载体，其特征在于所述DNA疫苗真核表达载体为pVAXl-IRES。4、权利要求1-3任一项所述的DNA疫苗真核表达载体在制备基因疫苗中的应用。5、根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述基因疫苗为抗肿瘤、抗流感、抗艾滋病、抗病毒性肝炎、抗结核、抗狂犬病或抗疟疾的基因疫苗。6、根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述抗肿瘤基因疫苗的活性成分为在权利要求1-3任一项所述的DNA疫苗真核表达载体的载体骨架中核糖体进入位点编码序列的上游含有Survivin-2B自氨基端第5-28位和第80-121位氨基酸残基编码序列构成的融合基因，以及人和猴的绒毛膜促性腺激素P链的核心片段CTP37区域编码序列构成的融合基因的重组真核表达载体。7、根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述Survivin-2B的自氨基端第5-28位氨基酸残基的编码序列和自氨基端第80-121位氮基酸残基的编码序列通过连接臂"nG"连接，其中，n为K、R、C、Q、G或N;所述人和猴的绒毛膜促性腺激素e链的核心片段CTP37区域编码序列通过连接臂"nG"连接，其中，n为K、R、C、Q、G或N。8、根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述抗肿瘤基因疫苗的真核表达载体的载体骨架中内部核糖体进入位点编码序列的上游还连接有人IgK链前导信号肽编码序列和/或人IgG-Fc段编码序列和/或糖基磷脂酰肌醇锚定信号肽编码序列。9、根据权利要求6或7或8所述的应用，其特征在于所述抗肿瘤基因疫苗的真核表达载体的载体骨架中内部核糖体进入位点编码序列的下游还连接有人GM-CSF和/或B7.l共刺激分子编码序列，以及白细胞介素、干扰素和/或肿瘤坏死因子的编码序列。10、根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述含有Survivin-2B自氨基端第5-28位和第80-121位氨基酸残基编码序列构成的融合基因，以及人和猴绒毛膜促性腺激素P链的核心片段CTP37区域编码序列构成的融合基因的重组真核表达载体重组真核表达载体为pVAXl-2PAG或pVAX1-2PAG-Fc-GPI或pVAX1-2PFcGB。全文摘要本发明公开了一种DNA疫苗真核表达载体及其应用。其目的是提供一种DNA疫苗真核表达载体与其在制备抗肿瘤等基因疫苗中的应用。所述DNA疫苗真核表达载体是在pVAX1载体骨架中添加内部核糖体进入位点编码序列得到的重组pVAX1真核表达载体。本发明的基因疫苗有望对乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌和前列腺癌等多种恶性实体瘤发挥广谱治疗作用，特别是以上述真核表达载体构建的抗肿瘤基因疫苗具有较好的体液免疫和细胞免疫效果，对肿瘤生长具有显著的抑制作用，将在肿瘤的治疗及其药物开发领域发挥重要作用，应用前景广阔。文档编号A61K48/00GK101096680SQ20071009988公开日2008年1月2日申请日期2007年5月31日优先权日2007年5月31日发明者于继云,宁刘,亮张,浩王,锐贾,阎瑾琦申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所