一种具有护肝排毒功效的黄乌三国草提取物的制作方法

专利名称：：一种具有护肝排毒功效的黄乌三国草提取物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有护肝排毒功效的国老草、黄芪、三七、土黄连、车前草等组成的6009提取物，用于预防抢救急慢性中毒和急慢性肝炎、酒精肝的治疗。技术背景本产品研究是依据民间验方与中医药理论结合通过动物实验筛选形成的6009中草药方剂。60年代，我国人民生活比较艰苦，常常发生食入野生果菜引起中毒的情况，特别是山西省曾一度发生大面积人群中毒事件，当时苦于没有好的急救药品，单靠洗胃、输液实难凑效，于是提出了收集、应用民间解毒验方的举措，结果证明，兴欧方应用效果比较好，随后在此基础上深入研究，通过与中医药理论结合，以解动物中毒为指标得出了比兴欧方效果更好的新型的具有护肝排毒功效的6009提取物。当时本产品应用面极广，也曾引起政府、医药界的关注与重视，仅三个地区的报告中毒—1人有2468人，有临床记录的有644人，它们大多是苍耳、农药、氟化钠、乌头碱、野菇、砷酸钙、碳酸钡、三硝基甲苯、沙门氏菌引起的食物中毒等服用本产品23小时后，中毒者的呼吸、血压均达到正常水平，原来中毒后饮食不进、瞳孔散大、昏睡不醒的患者服用本品45小时后，瞳孔复原，清醒过来后主动要吃喝，且小便通畅，临床认为只要抢救及时，中毒没有发展到内脏组织器官严重坏死的程度，一般均可收到起死回生的功效。随着研究的深入开展，"6009"用于急性黄疸性肝炎、慢性肝炎、以及三硝基甲苯慢性^中毒的治疗，据184例临床观察，均收到较一般常规方法起效快，疗程短的显著效果。目前中毒病人较60年代少了，专一性的解毒药多了，治疗乙肝、甲肝、酒精肝的药品也已不少，'但由于本产品具有广谱解毒功能，又具有保护肝fi及其它组织器官免受损伤，增强肝细胞非特异性免疫功能，利尿排毒功能较强，这是目前国内外解毒药中所不具备的，故在不明中毒物之前，医院将其作为对中毒病人抢救常规——洗胃、输液、喝"6009"对排除毒物，保护肝脏等器官免受损害，增强机体抗毒能力十分有价值的。同样也可为治疗肝炎增加了一种手段，用于预防从事有毒物生产工人的慢性节毒，特别是防止延缓、在粉尘环境的々产工人矽肺的形成，如果本产品在人体应用成功，那无疑会是世界创举。凌术内容:本发明的目的是在民间验方基础上提高疗效，縮小剂量，符合现代化要求的产品，以下将6009提取物的组方与工艺研究；功效与毒理研究；几种剂型制备实施举例，分述如下-一、组方与工艺研究1.1组方与工艺研究为了确认兴欧方解毒效果与提取溶媒的关系，设计了表l研究方案表l<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>表l用Lt(23)安排，得表2结果表2解砒霜中毒实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>表2动物死亡数的K、R按U(2"要求计算得表3结果。※只有死亡时间有差异表3<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>由表3K、R值所示；解砥中毒作用主要是兴欧一号，加上兴欧二号配方后，效果可以加强，用水、或70%酒精作溶媒对解砒中毒没有显著差异。1.2、八处方八工艺研究实验证明兴欧方解毒有效，拟在兴欧方基础上找到更好的方剂，我们按中医药理论提出了一个新配方，于是形成了有单兴欧一号方、兴欧二号方、新配方以及其他配方共八种、再加上主配方用l:.比例共16种，以及不同溶媒、不同剂型，提取溶媒用量共八种，总计128种组合，为了节约动物和时间，提出表4设计方案。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>表4方案用Ls(23)表安排，按Ls(23)要求制成500%制剂用小白鼠80只分成8组，各组小鼠分别将解药灌胃(0.1ml/10g体重)30分钟后再给以砷9g/kg体重下注射，观察五天小白鼠死亡数得表5结果表5<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>由表6所示A、C、E为显著因子，对解砷中毒来讲兴欧一号加新配方比兴欧一号方加兴欧二号方；用酒精比用水提提取，效果显著高，主方与配方用量比例1:1与1:0.7、颗粒剂与口服液对解砷中毒效果没有显著差异。由此确定由兴欧一号与新配方组合解毒效果最好，于是形成了6009新方为国^^、黄芪、田七、土黄莲、车鹏等用酒精提取浸膏粒剂，并命名为6009护肝排毒方。1.3、6009制备方法比较为了便于精制分离，我们重点抓住新方用不同溶媒处理，进行了多种制备方法比较，以确定粗制剂的最佳制备方案，得表4结果。表7四种粗制剂解砒霜中毒比较卿6卿7卿S<5卿实验动物数85878成活数53372死亡数32506成活％62.537.537.510020.0由表7所'示，以解砒霜中毒而言，6009制剂最好，其次是6006制剂。表8四种粗制剂解三种毒物效果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>由表8所示以解氰化钾、酒石酸锑钾、酒精急性中毒为指标，6009制剂方法解毒效果最好，其次为6006、6008,6007可说无解毒作用。由此确定6009粗制剂用70%乙醇于逆流提取收膏机中提取3小时后浓缩成500%不经任何处理，其提取物可以制成颗粒或口服液。1.4、6009提取物分离精制临床用药反映6009用于肝炎病人，普通反映消失症状快，'问题是服用量大，有的还说味道不好，甚至有个别还会引起恶心反映。为此我们进一步就6009作了分离工作，得到7个有效组分，现将其效果介绍如下1.4.1.AP22e解砒中毒作用以砒霜50mg/kg灌胃，AP22e37mg/20g体重毒前10分钟皮下注射九批实验结果如表9:表9<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>1.4.2,AP咖解砒中毒作用AP22A的4~7%浓度毒前10分钟皮下注射0.1ml/10g体重，砒霜50mg/kg灌胃得表10结果表10.AP22A组对照组死亡数死亡时间成活％死亡数死亡时间成活％17/64567.6+46.773.4432/50256.7+67.936.001.4.3.APee解六种毒物中毒作用APee30mg/20g体重小鼠毒前10分钟皮下注射，磷化锌1.5%,0.1ml/10g体重氰化钾0.2n/。0.1ml/10g，砒霜50mg/kg，氯化汞mg/20g酒石酸锑钾0.45mg/20g体重灌胃，其结果得表ll表11"^\^品观磷化锌.士的宁氰化钾'砒霜氢化衆酒石酸锑钾察项2/1515/3014/4010/4012/203/10对照组9/1527/3038/4030/4018/207/10.减少死亡％46.7040.0060.0050.0030.0040.001.4.4.AP22、AP23、AG，在小白鼠体内预防放射线的作用1.4.4.1、实验材料和方法.使用动物是18~25g体重的小白鼠,放射线照射剂量为80伦;药物是从6009提取分离物分离出的AP22、APa、AC,，]tb药在放射线照射前半小时每10g给予灌胃或注射O.lml。对照组只给予放射线照射，不给予药物治疗。—1.4.4.2、实验结果1)近期作用在放射线照射后20天内，AP23组见到非常显著的预防作用；AP22、AC,组与对照组无显著差别(表13)2)远期作用在放射线照射后2140天内，A就无显著的预防作用，相反死亡率显著比对照组增加；而AC,组则出现显著的预防作用，(表12);AP23无显著的预防作用(表12);从死亡者的死亡速度来看，只有AP"才有非常显著的延缓作用(表13)3)总的来看，AP23、AC,均有显著的预防作用；能减少小白鼠死亡，其预防作用主要在于放射线照射后的后期，AP22无显著减少小白鼠死亡作用，但在放射线照射后20天内有非常显著作用；对死亡者的死亡时间有非常显著的延缓作用,而A&、AG,则无(表12、13)。表12、死亡数情况分析<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表13死亡速度分析<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>以上实验结果均重复3~5次,—表示有杀菌作用土表示杀菌作用不稳定二、6009护肝排毒功效研究6009方是在民间流行的解毒剂基础上，结合中医药理论与现代技术形成的。现在广泛用于中毒抢救和急、慢性肝炎治疗。为了阐明其解毒制理，并上升到新药申报审批，本研究进行了6009护肝排毒功效研究，研究结果证明6009方具有1、利尿排毒功效；2、解除毒物对肝组织细胞呼吸抑制功效；3、解除毒物对肝损伤时的组织氨基移换酶活力改变的功效；4、解除毒物对肝损伤时的肝及血液中谷胱甘肽分布改变的功效；5、免除肌体组织细胞损伤，增强肝细胞非特异性免疫功效和增强肝功能。6009由国老草、黄芪、田七、土黄连、车前草等组成，用溶媒于提取收膏制粒机中制成500%颗粒剂，实验时根据实际需要用蒸溜水冲成一定浓度进行各项实验。2.1、6009对大白鼠利尿排毒研究6009对于砷中毒具有解毒作用，这种解毒疗效是否该解毒剂对毒物的排泄有所影响，是值得考虑的，为此进行了6009对砷排泄速度影响的研究。方法选用200克以上的大白鼠若干支分成二组，一组仅皮下注射砒霜5mg/kg作对照组，另一组以6009解毒剂10ml/kg灌胃三次后第二日皮下注射5mg/kg的砒霜，在给砒后每隔12小时又给一次解毒剂(10ml/kg)。对照组则同法给予同量的水分。两组均每隔24小时收集小便一次，取小便一定量采用古采氏(1、2)检砷法定砷的含量(各大自鼠均在给砒前测定正常尿的砷含量均为阴性始录用)，据此法所得砷斑与标准砷斑进行比较，而再换算一天尿量中的总砷量(即为一天总排砷量)，连续进行五天其实验结果见表一、表二表一6009对大鼠排砷量(r)百分比较<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>x系皮下注射砒霜15mg/kg由砷排泄测定结果说明6009对大白鼠急性砒中毒的砷的排泄具有显著的加快作用，即将已吸收的砷较快地排出体外，其每鼠五日平均排砷总量是由对照组22.69r提高到83.47r，这种砷量排泄加多显然与尿量的排泄增加有关，实验组的每支大白鼠每天的排尿量均较对照组为高，因此砷的总排泄量有所增加，其排砷高峰两组均在1~3天前是总砷排出量的90~98%，平均在80°/。以上，其实验组排砷量是对照组的4.23倍，由此证明临床将6009作为中毒病人抢救措施之一是正确的。因为喝6009水比喝白开水可使进入血活中的.寧物迅速排出体外量增加4.25倍。因而可起到减轻中毒保护组织细胞受害。2.2、6009对砷中毒小白鼠解毒的病理组识学研究为了探求6009解小白鼠砷中毒的机制，进行了砷中毒及经过解毒后的小白鼠内脏器官病理形态变化的比较。采用体重18—20.5克之健康小白鼠共50支，第一组(中毒组)14支，按每公斤体重给AS20345毫克计算给1%八3203溶液口服，使其中毒(L.D5。=41.5mg/kg体重)，其中10支在服药后3—5小时内死亡；第二组(解毒组)14支，每支先给口服解毒剂0.5毫升，半小时后口服P/。AS203溶液(药量同第一组)，于服药后15小时用钳夹颈部窒息死亡；第三组(6009对照组)11支，每支给解毒剂0.5毫升，，15小时后窒息处死；第四组(空白对照组)11支，不给药物，用同法窒息死亡。以上动物^E死后立即解剖，肉眼观察病变后采取心、肺、肝、脾、肾、胃、肠、脑、皮肤、睾丸、胸腺、胰腺等组织，作下列切片染色(1)以上各组织用5%甲醛固定，作HE染色，观察一般病理形态改变。(2)取肝组织用无水乙醇固定，石腊切片，根据Best胭脂红染色法显示糖元。(3)取各种组织用Serra氏液固定石腊切片根据Brachct的MefhylGreenPyronin法显示RNA。(4)取各种组织用5%中性甲醛液固定。4.1石腊切片，用Feylgen-Schiff氏反应显示DNA。4.2石腊切片，根据Gomori的钙钴法，显示硷性磷酸酶。以上各种染色，第一、二组各10例，三、四组各7例。为了进一步肯定结果，每组又增加4例糖元染色(肝)，RNA染色(肝、胃、肠)，冰冻切片苏丹m染脂肪(肝、心)。在每批制片、染色过程，都包括有中毒、解毒、解毒剂对照及正常对照的动物，以便于对染色进行技术鉴定及比较观察切片所显示之结果，观察结果见图二、表二、三、四。砷汞等重金属在机体内使机体中毒，主要由于重金属离子与组织内的-SH基结合，从而破坏了组织蛋白的正常结果以及抑制氧化酶的活性。由于毒物的作用，常可致血管壁损伤而致麻痹性血管扩张、充血、水肿、出血，以及胃、肠、肝、肾、心脏等主质细胞发生营养性不良退变，以致于坏死。由于机体对病原性因子的积极防御性反应，在病变组织内可出现炎症现象。本实验中毒组胃、肠、肝、肾、脾、肺、心脏等脏器有明显充血、水肿，肺组织常有灶性出血，肝细胞、肾小管上皮、消化道粘膜上皮细胞有变质环死现象；部分动物的肺、胃>肠壁出现有轻度炎细胞渗出，这些结果与过去一些学者所观察的急性砷中毒病变一致。解毒组动物各内脏器官有明显的充血、水肿，肺内灶性出血，肝细胞，肾小管上皮细胞退变，但这些征象的病变程度皆较中毒组轻，肺内未发现急性炎细胞渗出现象，消化道粘膜坏死现象较中毒组显著减轻，肠管内未发现急性砷中毒时所常有之米汤样稀大便。其余二组动物为对照组，仅见一般内脏充血、肺气肿等现象，并且远较以上二组动物的病变程度轻，这些征象是由于机械性窒息所引起。从以上形态学观察，.证明了解毒剂可以减轻毒物对机体组织细胞的损害，根据该解毒剂药理性质研究的结果，我们认为6009由于可以直接增强机体机能，加速毒物在体内的排泄，从而使组织细胞受到病原性因子作用所表现的病理形态学变化较中毒.组动物轻微。(图二)虽然过去许多人提到砷中毒时肝、心、肾等脏器的主质细胞常出现脂肪性变，可能是由于我们的实验中毒过程较短，所以这种病变并不明显。在砷中毒过程，由于砷离子与组织内的-SH基结合，破坏了组织内氧化酶系统，特别是脱氢酶的作用，而致生物氧化不完全，动员肝糖过多，因此，有人会提到中毒死亡的机体肝脏内糖元含量减少。本实验中毒组及6009与正常组对照肝糖元稍有减少现象(表二)，但由于例数太少，这种变化不够明显，另外，应考虑到一些阴性结果的出现，可能与我们实验前未给动物足够的含糖食物有关系。核蛋白中，DNA(脱氢核醣核酸)的变化不明显，可能由于DNA存在于细胞核内，在代谢过程比较稳定，因而不易受到损害。由于RNA(核醣核酸)直接参加细胞内蛋白质代谢，砷中毒过程由于酶系统破坏，RNA的合成减少，因而在组织内含量减少，这可用来解释中毒组动物的肝、胃、肠组织细胞中RNA明显减少现象。由于解毒剂的解毒作用，因此，在解毒组动物这些组织中的RNA减少现象，较中毒组轻微。(表三)。磷酸酶并不含-SH基，其性质较稳定，在我们实验结果观察到砷中毒的组织内硷性磷酸酶的含量改变不大。(表四)以上实验，从病理形态及组织化学成分的改变上证明6009解毒剂对实验性砷中毒小白鼠的解毒作用的良好效果。表二6009对砷中毒小白鼠肝脏内糖元含量的影响。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表三2006对砷中毒小白鼠肝、胃、肠组织中KNA含量的影响。脏器名称肝胃肠别编中毒组解毒组解对毒照剂组i照吊组中毒组解毒组解对毒照剂组正对照常组中毒组解毒组解对毒照剂组正对昭常s1———卄±+—2一+一±———一蚤3卄+并卄+卄4—————±——蚤:5±土+++卄6卄+一+++++十+卄卄+卄+卄—+卄卄—+9卄+卄卄卄10++卄如11卄卄卄卄卄卄普12卄廿朴卄卄+卄卄14卄卄+卄卄注一细胞内无RNA。+普遍细胞有淡红，粒."""部分细胞内有红feS粒,+红，粒丰富，在细胞内出现极化现象向细胞之一侧集中。表四6009解毒剂对砷中毒小白鼠肝、脾、肠组织内磷酸酶含量的影响。脏器名称胃肾肠\组、编号\中毒组解毒组解对毒照剂组正常对照组中毒组毒组解对母照剂组if对i照吊组中毒组解毒组解对毒照制组正对喊常组中毒组解毒组解对毒照剂级正对昭常11+++2+廿+++卄++普卄3+±卄*+4井+5±±±±±.+卄卄++6+卄++++7卄—8±+++910+---——f卄————■■++-i卜注-一无琮黑色之硫化钻沉淀，表示组织内无活动的磷酸酶。1卜组织有大量棕黑色之硫化钴沉淀，表示有丰富之硷性磷酸酶活动。+、*与一与力||间，表示有不同程度的磷酸酶活动。2.3、6009解除毒物对肝组织细胞呼吸抑制功效研究方片用青蛙的新鲜肝组织切片，取其重量在130-150mg左右，分别置于Warburg氏呼吸仪各反应瓶中再各加入Kreho—Ringer氏磷酸缓冲液2ml。一反应瓶中加入砷酸溶液(0.012M)0.2亳升以抑制组织呼吸酶类的活性，其他反应瓶中除了加入同量砷酸溶液外，再加入6009提取液0.4ml。另取反应瓶不加砷酸及解毒药作为对照。各反应瓶支管加入0.1M葡萄糖溶液0.2毫升，中心小杯加入10%KoH溶液0.2毫升。用蒸馏水调整各反应瓶中液体容积为3ml。以高锰酸钾制取氧气通过压力计6—10分钟，并维持压力计两支管液面差在20mm左右，然后按Warburg氏呼吸仪的一般操作进行[3]恒温为37'C,另用一压力计作为温压计以校正大气压力的变化。当各反应瓶中温度恒定后，将反应瓶支管中的葡萄糖溶液倾入，每10分钟记录压力计上氧气消耗的读数。一小时后取出肝组织切片烘干，准确称量其干重，由各反应瓶常数Ko2，计算肝组织切片每毫克千重所消耗氧气的微升数，比较各瓶中不同的结果。结果我们加入葡萄糖后—-小时内每隔10分钟所测定肝组织每毫克千重消耗氧气的微升数，见图三曲线。组织每毫克千重一小时中消耗氧气的微升数(Q02值)为2.76，砷酸中毒的肝组织的Qo2值为0.卯2微升有明显的下降。同时加入砷酸及6009的Qo2值上升为1.587微升，比较三种正常，抑制及抑制加6009所消耗氧气的曲线。由上图所示，可见砷酸对组织呼吸酶类有显著的抑制作用，这与一般文献报告[4]一致，我们采用砷酸溶液的浓度与剂量几乎抑制组织呼吸酶类活力的50%左右，加入6009提取液后对砷酸中毒的组织呼吸酶类具有明显的解除抑制作用。6009在最初20分钟内解毒作用几乎完全恢复与正常无异，后来则较正常略低。可以说明6009对砷酸解毒作用起了主要作用，这与临床报告完全相同2]。我们由此结果可以推论对凡能抑制组织呼吸酶类毒物如砒霜、氰化物等亦可有解除抑制作用。究竟此解毒如何解除抑制？是激活了中毒的组织呼吸酶的活性，还是以何种方式与毒物化合中和了毒性，有待研究。2.4、解除毒物对肝损伤的组织氨基移换酶活力改变的功效研究方法实验选用体重80-120克健康雄性大鼠进行，预先用普通饲料喂养一周后，选取精神活泼，毛色正常的健康大鼠供用；实验用四氯化碳化学纯品；实验所用的基质以丙酮酸钠为受氨基体，以L谷氨酸，谷氨酰胺及天门冬酰胺分别充供氨基体均为A，R级试剂，所有基质均预先配制成一定浓度的溶液，并预先中和至PH7.4者。实验于M/15磷酸缓冲液(PH7.4)中进行之。实验用两批动物进行，第一批24只，第二批15只，分别观察注射实验物质后42小时及6小时后的组织氨基移换酶活力。第一批动物24只平均分为4组，分别按下面方法处理-四氯化碳中毒组:先按动物体重每100克皮下注射生理盐水1.5毫升，半小时后，再于另外部位皮下注射四氯化碳，其剂量按体重100克给予纯四氯化碳0.35毫升，所用的四氯化碳系于临用前用橄榄油制成20%的油剂，其取用量按动物体重100克给予1.75毫升。6009加四氯化碳组先按动物体重100克皮下给予6009提取液(1毫升相当于原生药l克)l毫升，经半小时后，再于另外部位皮下注射四氯化碳，剂量如前组动物。6009组先按上组剂量皮下给予6009溶液，过半小时后，再于另外部位皮下给予生理盐水1.5毫升/100克体重。对照组前后两次，间隔半小时，分别于不同部位皮下注射生理盐水，每次按100克体重1.5毫升给予之。各组动物经上处理后均继续摄食普通饲料，42小时后，用乙醚麻醉，断头杀死，滴尽血液，迅速取出组织，置冰箱内冷冻半小时至1小时后，取出，在冰冷条件下，分别制成切片，在扭力天秤上分别称取切片各200毫克，分置硬质厚壁玻管中，各加入丙酮酸钠20微克分子，适当的供氨基体20微克分子，次加入M/15磷酸缓冲液(PH7.4)适量，总体积为L7毫升，将各管移至Warburg器上，于38。C在空气流中保温30分钟，取下，立即加入20%三氯醋酸0.3毫升，以停止反应，并沉淀去旦白质，移离心机上以每分钟2000转速度离心半小时，取上清液按下法测氨基移换酶的活力。动物组织的氨基移换酶活力，按反应中生成的丙氨酸量判定之，丙氨酸之测定(6，7)系利用纸上层析法将氨基酸分开，所用之滤纸为江西省产滤纸，溶剂为正丁醇甲酸水(75:15:10)，将上清液适量点于滤纸上，干燥后，置层析缸中下行层析15—17小时，取出于室温凉干，用0.25%双氢，三酮的丙酮溶液显色，置50i:烘箱内30分钟后，取出，将相当于丙氨酸位置的斑痕剪下，剪成碎片置干燥试管中，在暗处用以硫酸铜饱和过的70%乙醇4毫升洗脱70分钟，离心，上清液于Fisher光电比色计上测出光密度(用525m附绿色滤光板)，并根据用丙氨酸纯品按同法制得的光密度曲线査出丙氨酸含量。为了观察四氯化碳短时作用对组织中氨基移换酶活力的影响，以及6009在此时给予的保护作用，我们另取第二批动物15只进行了以下实验系列，除单纯注射6009组，因在前一实验系列中井未观察到该组动物组织中氨基移换酶活力与对照组有何差异故未建立外，其余三组动物均照处理第一批动物方法进行，但将皮下注射改为腹腔注射，且杀死动物的时间系改为第二次注射后6小时进行之，组织之处理以及氨基移换酶活力之制定均按前述方法进行之。结果大鼠在皮下注射四氨化碳后的42小时，组织中的由丙酮酸及适当的供氨基体合成丙氯酸的能力，和在此种条件下6009给予的因四氯化碳诱致之丙氯酸合成能力之改变的解除效应结果列于表1。表1、6009的解除对鼠因四氯化碳长时间作用诱致之组织的丙氯酸合成能力改变(丙氯酸生成量微克分子新鲜组织)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注实验条件见正文第二次注射后42小时杀死动物由表l结果可以看出，不论大鼠肾或脑组织中，当四氯化碳中毒后42小时后同供氯基体和丙酮酸合成丙氯酸能力，均显著较对照组增强，但6009加四氯化碳组动物的肾及脑和合成丙氯酸力，显著较四氯化碳组为低，井与对照及6009组的数值相似，显示四氯化碳能够影响组织的氯基移换酶活力发生改变的作用。腹腔注射四氯化碳后6小时，动物组织的合成丙氯酸能力，以及在同一时间间隔的6009加四氯化碳组坳和对照组动物组织的丙氯酸合成能力的比较结果列于表2。表26009对大众因四氢化碳短时间作用诱致之组织的丙氨酸合成能力改变的解除(丙氯酸生成量微克分子。1克新鲜组织)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注实验条件见正文，第二次注射后6小时杀死动物。由表2结果可以看出，在给予了四氯化碳后6小时，动物肝中的丙氯酸合成能力显著加强，肾的合成能力亦较正常大鼠肾为强，但予先给了6009液，而后再给予四氯化碳的大鼠不论肝或肾的丙氯酸合成能力，均低于四氯化碳组动物，丙氯酸生成额均接近于正常大鼠；表明四氯化碳中毒后，可以导致组织(肝、肾)的氯基移换酶活力的升高，而6009则具有解除此种改变的作用。动物受到四氢化碳中毒引起组织氨基移换酶活力升高，有学者一认为由于肝肾心脏等严重变性和中柜神经学的障碍[7、8]，可能与组织中合成或代谢遭受破坏，而分解代谢加强有关实验证明，6009具有对抗四氯化碳诱起组织氨基移换酶活力升高的影响，由此可以说明6009具有不仅对肝还有其它组织器官具有保护其免遭毒物损伤的能力，进而维持其组织的正常代谢功能。2.5、6009解除对毒物肝损伤时的肝及血液中谷胱甘肽分布改变的功效研究方法实验选用体重8——120克的健康雄性大白鼠进行，大白鼠系医学院动物室供应，领来本实验室后，予用普通饲料饲养一周后，选取精神活泼，毛色正常的健康大白鼠供用。所用四氯化碳系本实验室原存的化学纯品。实验所用的6009液，临用时加水稀释至一定的浓度。实验大鼠20只平均分为四组，并分别按下列处理注射四氯化碳组，先按体重100克皮下注射生理盐水2毫升，半小时后，。再于另外部位皮下注射给予四氯化碳，其剂量按体重100克，给予四氯化碳0.35毫升，所以用之四氯化碳于临用前用橄榄油制成20%溶液，故每100克体重按1.75毫升油剂给予之。注射6009加四氯化碳组先按体重100克此下注射6009提取液(1毫升相当于生药L25克)2毫升，半小时后，于另外部位皮下注射给予四氯化碳如上组。注射6009组先按上组剂量皮下注射6009提取液，半小时事，再于另外部位皮下给予生理盐水如上述。正常对照组前后两次均按上述剂量于不事部位皮下注射生理盐水。在实验期间，各组动物均摄食普通饲料42小时后，用乙醚麻醉，断头杀死，用含草酸干燥试管收集血液，并取肝脏，分别测定谷胱甘肽之含量。血液的谷胱甘肽之测定，系按血液化学分析法所载方法[9、10]，略加修改于离心管内置蒸馏水0.6毫升，加入全血0.1毫升，放置5分钟使溶液血后，加入20%三氯醋酸1毫升，混匀，放置15分钟，移离心机上以每分钟2000转速离心5分钟，取上清液1毫升移碘量瓶，加入1NHCI3毫升，0.004NKBr032毫升及10%KBrl毫升，塞紧，放置8分钟加入碘化结晶数粒，再加入淀粉指示剂4滴，以0.001NNa2S203滴定，另以0.1毫升蒸馏水代替全血进地空白测定。肝脏的谷胱甘肽测定，系称取肝脏01.克，加5%三氯醋酸5毫升同志玻制匀浆器内于冰冷条件下制成匀浆，过滤，再以5%三氯醋酸3毫升洗涤匀浆及滤纸，合滤液及洗液，移碘量瓶中，按上法测定之。为了观察四氯化碳在短时间内引起的肝及血液中谷甘肽含量的变化，以及6009给予有保护作用，另取15只动物进地了实验，除单纯注射6009液组，因在前一实验系列中其肝及血液的谷胱甘肽含量与正常动物近似故未进行外，其余三组动和仍按前述方法处理，但将皮下注射改为腹腔注射，且杀死动物时间改为第二次注射后的6小时进行，其余方法均同前一实验系列。结果给予大白鼠四氯化碳后42小时，其肝及血液中的谷胱甘肽含量与预先注射过6009溶液和四氯化碳组，单纯注射过6009提取液组以及对照组动物的肝及血液谷胱甘肽含量之比较结果见表1。^表l6009对由四氯化碳诱致之大白鼠肝及血液的谷胱甘肽含量改变之解除(注射后42小时)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注实验条件见正文由表1所列结果可见，大白鼠于摄入四氯化碳后42小时，血液中的谷胱甘肽含量显较对照组动物降低，对照组动物每100毫升全血含98.8毫克，实验且则降至72.2毫克，而预先给予6009再给予四氯化碳组动物的血液谷胱甘肽含量，则与对照组接近，并无改变，单纯注射6009组动物的血液谷胱甘肽甘肽含量也与对照组相似。谷胱甘肽在肝中的含量，四氯化碳组动物，则显著对照组升高，其余两组之值亦接近于对照组。应用四氯化碳后6小时杀死的动物肝及血液的谷胱甘肽含量，与对照组以及预先给予6009再给予四氢化碳组动物之比较，结果列于表2。表26009对四方氯化碳短时作用诱致血液及肝中谷胱甘肽改变之响影<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注实验条件如止文由表2结果，可以看到大白鼠于接受四氯化碳后6小时，其血液的谷胱甘肽含量与对照组和预先注射6009后再注射给四氯化碳组动物并无显著差别；而肝中的谷胱甘肽含量，四氯化碳组动物则显著较其余两组为高，其余两组之值则近似。动物摄入四氢化碳后42小时，血液中谷胱甘肽含量较正常动物显著低，肝脏的谷胱甘肽含量则高于正常动物，这表明动物在遭到四氢化碳的作用后，组织中的谷胱甘肽分布发生改变，这种改变的机理目前没解释，可能是肝细胞受损伤后透已能力降低有关"11。而我们预先给6009后可以解除这种改变，其作用机理似不是6009直接对氨基的作用，而可能是6009与毒物对抗，加强细胞解除四氯化碳毒性，使肝免受损伤，以维持其肝细胞正常透过力。其肝细胞正常诱过力。2.6、6009的AP22、APee护肝功效研究6009对不同种类、不同性质的毒品具有广泛的解毒作用，医院用于中毒病人抢救，肝类的治疗均起到显著效果。为了提高质量，对6009以解砒中毒为手段进行了其成分分离，现己得到七个组分，其中AP44、AP66对引起食物中毒的细菌有很强的抑杀作用。AP22、APee具有广泛的解毒作用，为了证明这四个组分可否代理6009冲剂，我们从组织细胞化学着手对AP22、APee作了护肝项目功效研究。结果证明与6009功效研究一致。2.6.1、实验方法取健康18-20克小鼠，100只分成四大组。一、正常对照组，不给任何药物只给两次蒸馏水0.51111/只，共10只分两组。二、AP22、APee解毒组，共分6小组(每组5只)(浓度1%)，每组各给，AP22、APee0.5ml/只，半小时后，再服亚砷酸钠，5mg(溶于0.5mt)，各组以后分别在2h，8h，24h，3天，5天，7天，各处死5只(共60只)。三、亚神酸钠(中毒组)，单独口服5mg(溶于0.5mt，半小时后再服0.5m/只蒸馏水，共30只)按上述时间分2h，8h，24h,3天，5天，7天各处死5只处死小白鼠分别取肝或(肾组织)，用丙酮或camog固定，石蜡切片作组化，及H、E、染色化学观它其变化[1-6]。1、PAS过碘酸Sthiff反应，观察糖元(肝)。2、RNA及DNA显示核酸及核糖核酸反应carnog固定，石蜡切片。3、ALP(碱性磷酸酶)。2.6.2、结果与讨论由表一、表二所示1、6009的提取分离的AP22、APee组的肝细胞的病变轻，其变质变化反应时间较慢，在APee组只有胞质疏松及少数的性变，无特殊变质性反应，但在停止用药后24小时动物，可有少许肝细胞的脂肪性空泡出现，但最突出的是在解毒组可见大量非炎症性的柯氏细胞增大、增多，血管及肝边小血管中白血球也较正常多。2、在RNA及ALP的变化，解毒组与正常组对比，没有太明显减少，几乎在APee组完全接近正常，推断AP22、APee可能对磷酸酶系统及核酸具有保护作用。另一方面有增强柯氏细胞及白细胞等网状内皮系统的活性，增强肝组织细胞的非特异性免疫性，加强细胞的抵抗力，减轻或消除变质变化。而并非与毒物直接接合。由此看来，AP22、APee是其6009主要解毒组分，而APee似比AP22作用强些。表一肝组织病理变化组别时间疏松脂肪变形胞浆核气球球样变核增大大小不点状或性炎性柯氏细坏死反应胞变质炎性反应:.j坏死级别备注亚砷酸中毒肝炎2h8h24h3天5天7天卄卄廿—一少++VVV一V—少+++4+VVV少+++++++VV■7少+++冊VVV少+++卄VVVV少+++4+亚砷酸加AP222h8h24h3天5天7天少数V少数V少数V少都数'V少郯数vV多多VV轻度JVV++++卄卄++++++++4+亚砷酸加APtt2h8h24h3天5天7天少数V少数V个别V少数V少数V少数V少数V多多多本组主要特点是肝细胞嗜酸性变较核明显空白对照2h8h阴性注肝类动物模型按上述同时存在病变形态等决定[v]表示有变化[-]表示阴性表示肝细胞有变质，坏死表示肝细胞有变质，有坏死[++++]表示肝细胞除病变坏死外有扩大浸润表二肝细胞内核糖酸、碱性磷酸酶及糖元反应<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>"H"+整个肝细胞内有颗粒棕黑色表示有丰富的酶活动W均质灰黄.色有不同程同活性。+淡黄均i少有活性。—灰棕色无硫化含古沉淀表示无活性。注4^颗粒状整个肝细胞内均丰富^+部分细胞内有红色颗粒+少数颗粒色淡表示细胞内无叫A2.7、6009毒理，评价6009具有利尿排毒等五项功效，临床用于治疗肝炎较一般药品疗效更好，且疗程短，.为了安全用药，对6009提取物进行了毒理学评价，结果表明6009提取物对两种性别的昆明种小鼠经口毒性，LDM)〉63ml/kg.bW(相当含生药315g),—周内动物未见明显中毒症状，也无动物死亡,按急性毒性分级,该受试物属无毒级物质.三项致忽变试验(小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子试验、Ames试验)结果均为阴性。60天喂养试验表明该受试物50ml/kg.bw、100ml/kg.bw、100ml/kg.bw剂量(相当于人群推荐量150ml/60kg.bw的20~60倍)，对大鼠临床检查(含体重及食物利用率)，血液、生化、脏器病理组织学等项目测定结果均无明显的毒性影响。三、几种剂型制备实施举例-实施例l一种具有护肝排毒功效的，用于预防抢救、急慢性中毒和治疗急慢性肝炎、酒精肝的6009提取物。具有护肝排毒功效的6009提取物是以国老草2500~9500份、黄芪2000~9000份、三七1500-8000份、土黄连1SOO7800份、车前草1500~5000为主要原料，其提取物以干物质计2050份，风味剂1100份，辅助物质710000份、具有护肝排毒功效的6009提取物是醇提物、水提物、混合溶媒提取分离物、超临界流体提取物中一种或数种；实施例2一种具有护肝排毒功效的，用于预防抢救、急慢性中毒和治疗急慢性肝炎、酒精肝的6009提取物。具有护肝排毒功效的6009提取物中加入稳定剂如海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、琼脂、黄原胶中的两种或两种以上，可以较长时间保持6009提取物中的有效成分的稳定性。实施例3一种具有护肝排毒功效的，用于预防抢救、急慢性中毒和治疗急慢性肝炎、酒精肝的6009提取物。具有护肝排毒功效的6009提取物中的国老草、黄芪、三七、土黄连、车ff草等原料经前处理后用溶剂回馏提取，提取液经分馏、浓縮、干躁、粉细得到提取物成品，其溶剂是水、乙醇、或两种有机溶剂的混合液中的"种或数种，其溶剂用量是投料药材的530倍；用多功能提取罐、蒸发器或提取收膏造粒机专利设备提取，超临界液体提取设备，回流温度6010CTC，提取时间2~6小时，提取次数2次或2次以上，得到具有护肝排毒功效的6009提取物的有效成分，其余同实例1、2;实施例4一种具有护肝排毒功效的，用于预防抢救、急慢性中毒和治疗急慢性肝炎、酒精肝的6009提取物。取具有护肝排毒功效的6009提取物10~100份，含淀粉类物质10~1000份，.风味剂(乙基麦芽酚、环糊精、功能性甜味剂、香料)120份制成冲剂，冲剂中总黄酮含量4g/kg，不加稳定剂时总黄酮含量在六个月后下降为2.8§/kg,说明其疗效会下降，单独以海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、琼脂、黄原胶、作稳定剂，用量为萄、量的0.2[1.6%，6个月后其总黄酮含量分别为3.36g/kg、3.25g/kg、3.'14g/kg、3.0g/kg说明有效成分部分降解，以海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、琼脂、黄原胶中的两种或两种以上配合，用量在总量的0.16^1.5%，6个月后其总黄酮含量不低于4g/kg，说明其稳定性良好；实施例5,—种具有护肝排毒功效的，用于预防抢救、急慢性中毒和治疗急慢性肝炎、酒精肝的6009提取物。取具有护肝排毒功效的60O9提取物20100份、辅料(三氯蔗糖、B—环糊精)120/份制成胶囊加入海藻酸钠O.8%、羧甲基纤维素钠O.5%，6个月后其总黄酮含量仅下解为3.75%;实施例6一种具有护肝排毒功效的，用于预防抢救、急慢性中毒和治疗急慢性肝炎、酒精肝的6009提取物。取具有护肝排毒功效的6009提取物2060份，水1000~5000份，风味剂(乙基麦芽酚、环糊精、功能性甜味剂、香料)1100份制成口服液，以海藻酸钠O.3%、琼脂O.4%、黄原胶O.15%作稳定剂，6个月后其总黄酮含量仅下降解为3.87%;实施例7一种具有护肝排毒功效的，用于预防抢救、急慢性中毒和治疗急慢性肝炎、酒精肝的6009提取物。取具有护肝排毒功效的6009提取物1050份、核酸36份、甲壳素510份、风味剂1~20份，稳定剂O.152%制成茶剂、冲剂，用于预防慢性中毒，特别是延缓、阻止矽肺病的形成；实施例8—种具有护肝排毒功效的，用于预防抢救、急慢性中毒和治疗急慢性肝炎、酒精肝的6009提取物。取具有护肝排毒功效的6009提取物2060份，低度发te酒10005000份，风味剂l150份制成酒剂，加稳定剂O.152%，用于预防慢性中毒，特别是延缓、阻止矽肺病的形成；实施例9一种具有护肝排毒功效的，用于预防抢救、急慢性中毒和治疗急慢性肝炎、酒精肝的6009提取物。取具有护肝排毒功效的6009提取物适量，用混合溶媒分离出AP22、AP44、AG"中的两个或七个以上组分混合于冰冻干燥，IO个月后总黄酮含量没有下降，临用时用蒸馏水稀释后于静脉点滴注射，用于中毒病人抢救；图1为6009对大鼠排尿、排砷量比较；图2为6009对砷中毒小鼠各脏器病理形态比较;图3为6009对肝组织细胞呼吸抑制功效比较。权利要求1、一种具有护肝排毒功效的，用于预防抢救、急慢性中毒和治疗急慢性肝炎、酒精肝的6009提取物，其特征在于其主要中草药成分为国老草2500～9500份、黄芪2000～9000份、三七1500～8000份、土黄连1500～7800份、车前草1500～5000份；2、根据权利要求l所述的一种具有护肝排毒功效的，用于预防抢救、急慢性中毒和治疗急慢性肝炎、酒精肝的6009提取物，其特征在于，6009提取物是水提物、醇提物、超临界流体提取物、混合有机溶媒提取分离物中一种或数种；3、根据权利要求1或2所述的一种具有护肝排毒功效的，用于预防抢救、急慢性中毒和治疗急慢性肝炎、酒精肝的6009提取物，其特征在于，6009提取物可单一或混合药材用极性或非极性溶媒单一或混合溶媒提取、脱色、层析等处理所得晶体或组分制成单一或两种或两种以上制成的制剂，供临床治疗一种或数种疾病；4、根据权利要求1到3所述的一种具有护肝排毒功效的，用于预防抢救、急慢性中毒和治疗急慢性肝炎、酒精肝的6009提取物，其特征在于含有稳定剂0.15~2°/"稳定剂为海藻酸钠、羧甲基纤维素钠、琼脂、黄原胶中的两种或两种以上，以及在包装、精制时加入抗氧、抗络合、冷冻干燥等措施；5、据权利要求1到3所述的一种具有护肝排毒功效的，用于预防抢救、急慢性中毒和治疗急慢性肝炎、酒精肝的6009提取物，其特征在于提取设备为提取收膏造粒机、多能提取罐、超临界提取设备、蒸发器，制粒方法为湿法制粒、乙醇制粒、一步制粒、真空干燥制粒、冰冻干燥制备；'6、根据权利要求1到2所述的一种具有护肝排毒功效的，用于预防抢救、急慢性中毒和治疗急慢性肝炎、酒精肝的6009提取物，其特征在于6009提取物5~60份，辅助剂10-1000份，风味剂1100份，其中风味剂为乙基麦芽酚、环糊精、功能性甜味剂、香料中的一种或数种；7、拫据权利要求1到5所述的一种具有护肝排毒功效的，用于预防抢救、急慢性中毒和治疗急慢性肝炎、酒精肝的6009提取物，其特征在于6009提取物可制成多种颗粒剂、片剂、胶囊剂、酒剂、蜜膏、输液等药品或保健品；8、根据权利要求1到7所述的一种具有护肝排毒功效的，用于预防抢救、急慢性中毒和治疗急慢性肝炎、酒精肝的6009提取物，其特征在于6009提取物1050份、稳定剂^0.15~2°/。,风味剂10100份、辅助剂710000份,其中辅助物为白酒、饮用水、注射用水、淀粉类物质中的一种或数种，可制成适合不同人群需要的药品或保健品。'全文摘要本发明涉及一种具有护肝排毒功效的6009提取物为国老草、黄芪、三七、土黄连、车前草等的有效成分，可以用于预防、抢救急、慢性中毒和急、慢性肝炎、酒精肝的治疗，该提取物经动物药理试验证明具有1.利尿排毒功效；2.解除毒物对肝组织细胞呼吸抑制功效；3.解除毒物对肝损伤时的组织氨基移换酶活力改变的功效；4.解除毒物对肝损伤时的肝及血液中谷胱甘肽分布改变的功效；5.免除肌体组织细胞损伤，增强肝细胞非特异性免疫功效和增强肝功能作用。动物实验证明本品对亚砷酸钠、氰化钾、酒精、磷化锌、士的宁、对放射线杀伤、氯化汞等急性中毒可以减少死亡数和延长死亡者死亡时间的作用，对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等有很强的抑杀作用。临床用于644人的治疗结果，对苍耳、野菇、农药、氟化钠、乌头碱、砷酸钙、碳酸钡、三硝基甲苯、沙门氏菌引起的食物中毒在用药2～3小时内，中毒症状显著好转，对中毒情况严重者只要抢救及时，均可收到起死回生功效。据184例急性黄疸性肝炎、慢性肝炎的治疗均收到较一般常规方法起效快、疗程短的显著效果，临床普遍认为是一种抢救中毒病人用洗胃、输液所无法替代的护肝排毒佳品，也是一种预防慢性中毒、治疗急慢性肝炎的理想产品。文档编号A61K9/48GK101433596SQ20071010050公开日2009年5月20日申请日期2007年4月4日优先权日2007年4月4日发明者徐吉民申请人:徐吉民