专利名称：含有jeryl－lynn病毒株的抗流行性腮腺炎疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种流行性腮腺炎疫苗，它含有从腮腺炎病毒的Jeryl-Lynn株衍生来的一种均一纯化分离株。
背景技术：
流行性腮腺炎基本上是一种儿童患疾病，通常只有轻微的临床症状。但某些病例中流行性腮腺炎感染的临床结果是严重的。例如，在英国流行性腮腺炎是15岁以下儿童患脑膜脑炎的最常见病因，也是儿童永久性感觉神经性耳聋的一个病因。尽管30～40％的自然腮腺炎感染不出现症状，但会累及唾液腺，而且在成年人群中，除了上面提到的神经性并发症外，流行性腮腺炎还会导致第一个三月期流产和睾丸炎，这些都是勿容置疑的事实，它使许多国家都施行了人群预防接种的计划。
腮腺炎病毒属于副粘病毒科，它由大约15.3kb的负链单链基因组RNA构成，基因顺序是3′N-P-M-F-SH-HN-L5′(N为核衣壳蛋白，P为磷蛋白，M为基质蛋白，F为融合蛋白，SH为潜在表达(potentially expressed)的小疏水性蛋白，HN为血凝素神经氨酸酶，L为大蛋白)。在众多腮腺炎病毒株中，Jeryl-Lynn(B-水平，B-level)是一种减毒活变种，经序列分析，其特征在于F，P，HN，M基因。
最近有两种腮腺炎病毒株已获准用于抗流行性腮腺炎的预防接种Urabe Am 9和Jeryl-Lynn。但Urabe Am 9在报道了一例无法接受的副作用水平[European Journal of Pediatrics(1993)152387]后，于1992年9月被取消。
Jeryl-Lynn病毒株多年来一直由Merck Sharp and Dohme以“MumpsVax”的商品名售出。它是从一例患流行性腮腺炎的病人身上取得临床标本，经鸡胚羊膜接种而得的(Proc.Soc.Exptl.Biol.Med.123(3)(1966))。
Afzal等人最近报道(J.ofGen.Virology 199374917)，在英国用作腮腺炎疫苗的Jeryl-Lynn病毒株事实上是JL-2和JL-5这两种病毒的混合物。
Takeuchi等人，Virology(1991)181p364-366也报道说，不同的腮腺炎病毒株在SH基因水平上会产生实质性(substantial)的核苷酸序列变异。
Afzal等人还强调，目前的“MumpsVax”疫苗商品是在严格控制的条件下制备出的，这些条件包括一个细胞库(cell bank)，有传代限度，以及倾向于在不同批的产品之间保持两种变异体的比例的条件。然而随着Jeryl-Lynn株的进一步传代，无法保证能维持上述两种变异体之间的这种平衡。而且也很难估计这两种变异体在任何一批疫苗里的比例。
发明内容
本发明提供一种疫苗，它包括基本上均一(substantially homogenous)的免疫原性Jeryl-Lynn分离株，所述病毒株为减毒Jeryl-Lynn腮腺炎病毒株，它包含如图1所示的核苷酸序列。该序列编码HN基因的N末端以及SH基因。这种病毒株在本文中被称为SBB JL-1。与现有腮腺炎疫苗商品相比，这种分离株在临床试验中能诱导出更高的零转化，并具有最高的腮腺炎抗体几何平均滴度。
所谓基本上均一是指，根据对图1所示序列区段的限定，所述分离株被另一种Jeryl-Lynn分离株污染的程度不超过10％，优选少于5％，更优选少于1％。在本发明一个优选实施方案中，该疫苗包含一个纯系Jeryl-Lynn分离株，即该疫苗未被其它在图1所示基因区段中有差异的Jeryl-Lynn腮腺炎病毒分离株污染。
本发明的一个实施方案提供了一种疫苗，它包含无JL-2污染的纯化SBB JL-1。
这种纯化分离株不会有亚毒株在不同批之间的潜在差异所带来的不便，它提供一种更易确保符合一贯质量标准(consistent quality guideline)。
本发明的均一(homogenous)Jeryl-Lynn可以如下获得将MumpsVax商品在鸡胚成纤维细胞(CEF)中传代并筛选纯培养物，所述筛选可以是进行有限稀释并检查所得分离株，或者是进行单个空斑分离。其它合适的细胞系包括Vero细胞和MRC5细胞。这就要求存在能有效检测出群体中较小比例的已知病毒变异株的方法。这类检查方法包括由Chumakov等人提出的针对减毒脊髓灰质炎病毒的Maprec检测(WO 92/07958和PNAS 1991，88；199-203)，还有直接对病毒空斑进行测序和对病毒空斑进行差异杂交。
优选本发明的疫苗还包含其它成分，诸如减毒麻疹病毒，和/或减毒风疹病毒，它们的灭活形式或亚单位形式，从而能提供抗麻疹和/或风疹感染的保护作用。三价的腮腺炎、麻疹和风疹疫苗在本领域已广为人知，本发明中的腮腺炎分离株也可以按照与现有那些疫苗相似的方式配制成三价疫苗。更进一步地，或者备选地，本发明的疫苗可包含减毒水痘-带状疱疹活病毒，以提供抗水痘(varicella，chicken pox)或带状疱疹(Zoster，shingle)的保护作用。在一优选实施方案中，水痘-带状疱疹病毒是Andre F E PostgraduateMED J.(1985)61(Suppl.4)，113-120或Veskari T等，Acta paediatr.Scand.801051-1057，1991公开的OKa株。优选本发明疫苗是四价的，能提供抗腮腺炎病毒，风疹麻疹病毒和水痘-带状疱疹病毒的保护作用。
本发明还提供了制备全病毒疫苗的方法，例如在有合适稳定剂存在的条件下将病毒冻干，或将本发明的病毒株与合适的载体或佐剂混合。还优选将本发明病毒株配制在脂质体中或是用载体颗粒进行配制。更进一步地，或者备选地，该配制剂中还可加入免疫刺激物，如3-脱氧酰基化的单磷酰类脂A(3 de-O-acyl monophosphoryl Lipid A，Ribi Immunochem)或是皂素(saponin)衍生物QS21(Cambridge Biotech)。
另一方面，本发明还提供了一种治疗人类流行性腮腺炎感染的方法，包括给有相应需要的病人施用免疫有效剂量的本发明疫苗。
本发明疫苗的施用方式，可以是任一种能将免疫保护量的病毒株和疫苗中其它免疫原性成分运送给受试者的合适途径。但优选经肌肉或深部皮下途径的非肠道方式施用所述疫苗。还可以根据需要采用其它施用方式，如口服或经其它非肠胃途径，即皮内、鼻内、或静脉。
此种疫苗的既能提供免疫保护作用又无毒的适当剂量，可以由本领域的技术人员很容易地测定出来，意即，本发明疫苗中所含有的、既引起免疫保护又无毒性的本发明病毒量，落在传统全病毒疫苗中的抗原有效量的范围之内。但应理解，任何具体病人的具体剂量水平将取决于多种因素，包括年龄，总体健康水平，性别和饮食；用药的时间，用药的途径；与施用的任何其它药物的协同效应；以及想要达到的保护反应程度。当然，如果需要的话，可以以适当的间隔重复施用。在单价疫苗中较典型的是每剂至少3.7log TCID50的病毒，而更常用的是每剂4.5log TCID50。在腮腺炎、麻疹、风疹三价疫苗中，腮腺炎病毒成分将达到4.8log TCID50左右，以补偿其它两种病素成分的干扰。
图1显示了JL-1腮腺炎病毒分离株的SH基因编码区以及SH-HN基因间区段的cDNA序列。
具体实施例方式
1)对SH基因进行初步测序在25cm2培养瓶内长满的单层Vero细胞上，用dMEM Biorich培养基(50/50V/V)加0.5％胎牛血清，接种约3.0log TCID50的MumpsVax病毒商品，进行传代。34℃温育7天，然后收获受感染的细胞，用Ferré和Garduno(Nucleic Acids Research 1989，17；2141)的方法提取RNA，置于100mcl水中，用二乙基焦碳酸盐于100℃处理5分钟。取5mcl这样的提取物加入以下试剂进行逆转录40个单位的RNAsin(Boehringer Mannheim，Germany)，4mcl 5X浓缩的逆转录酶缓冲液(Bethesda Besearch Labs)，2mcl四种脱氧核苷三磷酸的混合物浓度为10mM，10pmole NH2寡核苷酸引物，1mclMoloney鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶(Bethesda Research Labs，每mcl200个单位)，加水使终体积为20mcl。寡核苷酸NH2与腮腺炎病毒Urabe株的F基因具有同源性。将混合物在37℃温育45分钟，然后于95℃加热5分钟。以寡核苷酸NH8和NH14作引物将cDNA经连续两轮PCR反应进行扩增，用1mcl 1000倍稀释的第一轮反应物作为第二轮反应的起始物。每轮PCR由25个循环组成，每个循环均是94℃加热1分钟，53℃加热1分钟，72℃加热1分钟。在有氟二脱氧核苷酸终止物的情况下，以NH8或NH14作引物进一步进行PCR扩增，其产物用Applied Biosystems自动测序仪(373ADNA Sequencer)按仪器配有的操作程序和说明进行分析，从而从两个方向对相应于SH基因的PCR产物进行测序。结果发现，在所述序列中，有多个位置存在不同读取结果(ambiguity)，经证实两条链上都是如此。所得序列与Takeuchi等人(Viroloy 1991，181364-366)报道的Jeryl-Lynn序列相比，在361个碱基中有17个不同，其中包括4个未确定(unassign)碱基。所得基因序列与Afzal等人(J.Gen.Virol.1993，74；917-920)报道的JL-5分离株的序列相比，319个碱基中有9个不同，其中有4个未确定碱基。另一种情况是，不在Vero细胞上传代，而是用超速离心收获4.0～5.0log TCID50的MumpsVax病毒，再用随机引物将这些病毒RNA逆转录成cDNA，然后以寡核苷酸NH30bis和NH3 1bis作引物进行PCR扩增，最后直接对相同区段进行测序，结果还是会发现不同读取结果。
2)对SH基因进行克隆用MumpsVax病毒感染Vero细胞，再按上述方法制备总RNA。该RNA用随机引物进行逆转录，并用寡核苷酸NH22和NH23作引物进行PCR扩增。(NH22包含Hind III限制位点，NH23包含BamHI限制位点，从而便于对扩增的DNA片段进行克隆)。将扩增的DNA用HindIII和BamHI这两种限制性核酸内切酶切割后，克隆到载体pUC9上。最后得到11个克隆，它们各有一个相应于腮腺炎病毒SH基因区段的插入子。所有11个克隆具有与Takeuchi等的(在上述引文中)报道的序列相对应的序列。此外，有5个克隆具有DdeI酶切位点，而其它6个克隆没有。未发现与JL-5序列相应的插入子。该结果，以及测序得到的不同读取结果，都暗示由Afzal等人鉴定出的JL-2变异体是MumpsVax病毒中的一个重要或容易检测的部分。
3)直接从MumpsVax传代MumpsVax也直接在鸡胚成纤维细胞(CEF)上传代。从包括lot MJ05在内5个不同批次的细胞的第三代培养中回收病毒，以便制备MJ05A42的冻干样品用来注射动物。用这5批病毒制备物感染Vero细胞，回收RNA，按上述方法以NH8和NH14作引物进行扩增，以备DNA测序，唯一不同的是用随机引物启动逆转录酶反应。所有5批病毒均显示出与JL-2(Takeuchi等人)相同的序列，而且没有不同读取结果。
为了更进一步调查这一点，按上述方法对病毒空斑进行直接测序。用上述5批病毒感染Vero细胞培养物，对所得空斑进行处理以备测序，其中用到NH30bis和NH31bis作引物。5批中一共测了26个空斑，其中13个空斑给出与Takeuchi等报道的JL-2序列相同的序列；5个空斑给出与JL-5非常相似的序列，只有第270和279位的两个碱基有差别；8个空斑的序列有不同读取结果，暗示它是病毒混合物。
4)直接对病毒空斑进行测序MumpsVax的三种稀释液，估计每0.50ml等份有100，50和10个病毒颗粒，用它们感染5cm Petri培养皿中已铺满、并弃去培养液的单层Vero细胞，用不含血清的dMEM Biorich(50∶50 V/V)培养基(Biorich)洗皿。在34℃使病毒吸附30分钟。用保持在42℃的琼脂覆盖细胞，琼脂层包括2.5 mldMEM Biorich培养基，0.5％胎牛血清，以及2.5ml 3％(W/V)的低胶化温度琼脂糖。固化后，将该琼脂层用3ml dMEM Biorich培养基(含0.5％胎牛血清)覆盖，并在34℃温育。温育7天后，弃去表面的液体培养基，加0.03％(W/V)中性红溶液扩散1小时后，就可见到空斑。然后去掉液体和琼脂，将一张干尼龙膜用手指压在培养皿的底部。将该膜加数滴2x SSC浸湿，再提起。将膜在2x SSC中浸泡5分钟，再在含0.2％(W/V)SDS的2x SSC中浸泡30分钟，然后在UV光下暴露3至5分钟，使病毒固定在膜上。从尼龙膜上剪下20个独立的空斑，将这些膜片浸在100mcl水中，加1mcl RNAsin(Boehringer Mannheim，40个单位)，65℃加热30分钟。将100mcl液体转移到新试管里，加10mcl 3M醋酸钠，再加250mcl乙醇，使核酸沉淀。将混合物于-20℃过夜或于-70℃放置1小时，然后离心。沉淀物干燥后，加入以下溶液进行逆转录4mcl 5x浓缩的逆转录酶缓冲液(Bethesda ResearchLabs)，2mcl 0.1 M二硫苏糖醇，1mcl脱氧核苷三磷酸混合物(PerkinElmer-Cetus，10mM浓度)，1mcl N6随机引物寡核苷酸(New England Biolabs，浓度100mcg/ml)，11mcl水。然后加1mcl MMLV逆转录酶，37℃温育1小时，然后95℃温育5分钟。取此混合物10mcl，加寡核苷酸引物NH30bis和NH31bis各500ng，并加PCR缓冲液，和1mcl Stoffel DNA聚合酶(PerkinElmer-Cetus，10μg/100 mcl终体积。将此混合物加热30个循环，每循环为95℃1分钟，60℃1分钟，72℃1分钟。所得片段用Magicprep试剂盒(PromegaBiotech A7170)照其说明进行纯化。用NH30bis或NH31bis作引物，采用氟二脱氧核苷酸终止物进行不对称PCR扩增，在Applied Biosystems(373A)自动测序仪上用厂家提供的方法和反应物通过非放射性方法进行测序。结果发现，这20个来自MumpsVax的空斑中，19个与Takeuchi等人(上文)报道的JL-2序列在275个碱基中有11个碱基不同，与Afzal等人(上文)报道的JL-5序列有2个碱基不同。有1个空斑给出不同的读取结果。该结果暗示MumpsVax可能包含一或多种在这个区段内与Afzal等发现的JL-5优势株有差异的变异体。JL-5与所测序的空斑不同的两个碱基是在第279和290的位置，位于SH和HN编码区之间的基因间区段中。
5)空斑杂交为了尝试更直接地测定MumpsVax及其衍生培养物中JL-5和JL-2型变异体的比例，采用了一种空斑杂交方法。以MumpsVax病毒和传代的MJ05病毒感染Vero细胞单层，得到空斑，印到尼龙膜上，按前述方法固定核酸。尼龙膜先在200ml下述溶液中于65℃预杂交3小时5x SSC(SSC是0.15M氯化钠0.01M柠檬酸钠pH 7.2)，10x浓缩的Denhardts溶液(它是0.2％W/VFicoll 400，0.2％小牛血清，0.2％聚氯乙烯，0.1％(W/V)SDS，50mcg/ml鲑精DNA。然后在50ml溶液中于65℃轻微振荡2.5小时，以便进行杂交，所用的溶液具有与前述溶液相同的成分、已预热至65℃、还加入了放射性探针和冷的竞争探针溶液。用作变异体特异性探针的寡核苷酸是BC 252(能与JL-5变异体杂交)和BC 253(能与JL-2变异体杂交)。它们都要在包含下列成分的溶液中激活(kination)而标记为γ32P-ATP100ng待标记的寡核苷酸，3mcl 10x浓缩的激酶缓冲液(包括0.5M Tris-HCl pH7.6，0.1M MgCl2，50mM二硫苏糖醇，1mM亚精胺和1mM EDTA pH8.0)，3mcl32P-ATP(Amersham International，3000Ci/nmole，10mCi/mcl)和2mcl T4多核苷酸激酶(Boehringer Mannheim)，用无菌水补足30mcl。将此混合溶液于37℃温育30分钟后，在95℃加热5分钟终止反应，然后加入重量比为100∶1的冷的竞争寡核苷酸探针，即每100ng标记探针要加10mcg冷竞争寡核苷酸，然后将混合物加入杂交溶液中。杂交后，将膜在100ml与杂交溶液成分相同的溶液中于65℃30分钟洗涤一次，再在100ml下述溶液中65℃洗2个30分钟SSC 5x，0.1％SDS。然后使膜干燥，并用增感屏使膜在X-射线胶片上曝光。当MumpsVax用这种技术检测时，与JL-5变异体特异性BC 252寡核苷酸杂交的空斑大大多于与BC 253杂交的空斑。当检查MJ05时，虽然与两种探针杂交的空斑数基本相等，但与BC253杂交的空斑要比与BC252杂交的空斑相对多一点。
6)对纯Jeryl-Lynn分离株进行纯化为获得纯的JL-5和JL-2变异体分离株，对一份标明滴度为4-6logTCID50感染单位的商品化MumpsVax(批号92A06，来自Merck Sharp andDohme，存放在Public Heath Laboratory Services，Porton Down，Wiltshire，UK，登记号为Jeryl-Lynn Mumps strainV93110585，1993年11月5日)样品进行有限稀释，然后在96孔微滴板上以约每孔0.1感染单位的接种量感染鸡胚成纤维细胞。将这些板在34℃温育11天以使病毒增殖。全部192个接种孔中有17孔出现细胞病变效应，说明有病毒生长。将这些孔接种到另一批CEF细胞培养物中。使滴度约4.9 log TCID50的第二次传代物滤过0.8μm滤膜，并以42,000rpm离心1小时，将病毒沉淀用100mcl H2O重新悬浮，以此来确定所分离的病毒的特性(identity)。加入1mcl RNase抑制剂(BoehringerMannheim，40单位/mcl)，65℃温育30分钟，再加1/10体积的3M醋酸钠(pH4.5)，然后加2.5倍体积的乙醇。-20℃沉淀过夜或-70℃沉淀1小时，然后在Eppendorf台式(bench-up)离心机中4℃离心30分钟，并将沉淀干燥。
对所得病毒RNA进行逆转录，方法是向所述沉淀中加入20mcl下述混合物4mcl 5x核心RT缓冲液(Bethesda Research Labs)，2mcl 10nM脱氧核苷三磷酸混合物(Perkin Elmer，Cetus)，1mcl随机引物N6(Biolabs，100mcg/ml)，11mcl H2O，1mcl MMLV逆转录酶(Bethsda Research Labs)。37℃温育1小时后，95℃经历5分钟以抑制逆转录酶。取加热后的混合物10mcl，在终体积100mcl中，用引物NH30bis和NH31bis，按以下程序，进行30个循环的PCR扩增95℃1分钟，60℃1分钟，72℃1分钟。所得片段用Magic Prep(Promega)按厂家提供的实验程序进行纯化。
将6个仅与JL-5探针反应的分离株接种到Vero细胞中，获得空斑。再转印到尼龙膜上，使这些膜与BC 252和BC253寡核苷酸杂交，所述两种寡核苷酸都已如前述通过激活作用带上32P标记。杂交是在5x SSC中，用约100ng带标记的寡核苷酸和10mcg冷的竞争寡核苷酸，在终体积50ml中，于65℃进行2.5小时。每种分离株测试了大约200个空斑，无一与JL-2探针(寡核苷酸BC253)反应。所有空斑全都与BC 252反应。
有一株病毒分离株，源自微滴板上的9H2A孔，后进一步鉴定为SBB株JL-1，将它在CEF细胞上再传两代。末次传代(从最初的MumpsVax材料算起一共传了四代)后，用该病毒感染Vero细胞，得到空斑，转印至尼龙膜上，通过与经激活作用而带上32P标记的寡核苷酸BC 252和BC253杂交来进行检验。用JL-2特异性探针BC253检测了2000多个空斑，没有一个与该探针反应。用寡核苷酸BC 252测试了较少数量的空斑，所有均呈阳性反应。对CEF细胞上第四代传代物中获得的JL-1株的病毒集合物进行直接测序，方法是将病毒离心，用乙醇沉淀，然后用随机引物按前述方法进行逆转录。cDNA通过PCR反应进行扩增，采用寡核苷酸NH14和BC265作引物，按下列程序扩增30个循环94℃1分钟，60℃1分钟，72℃1分钟。所得DNA片段在Magic Prep柱(Promega Biotech)上按厂家的说明进行纯化，在Applied Biosystems 373A自动测序仪上依厂家说明并使用NH14，BC265，NH30bis和NH31bis作引物进行测序。于是得到如图1所示的序列。令人意外的是，这个序列与Afzal等得到的JL-5分离株的序列在SH和HN基因编码区之间的基因间区段有6个位点不同。
第二个鉴定为10H5F并且仅与JL-5探针反应的病毒分离株也进行了测序，方法是用第二代病毒感染Vero细胞，将空斑转至尼龙膜上，用NH14和BC265寡核苷酸作引物进行PCR扩增，然后测序。如此得到一个序列，它与上述9H2A的序列相同，但与已公开的JL-5分离株序列在SH-HN基因间区段中有6个碱基不同。
7)免疫原性用猴测试实施例6所得JL-1株的免疫原性。将一种名为MJ11A42的JL-1病毒冻干制品(MumpsVax的第四代传代物，是在CEF细胞上于34℃生长6天后获得的)，以4.2log TCID50的剂量通过皮下注射方式免疫一组4只非洲绿猴。另三组的每组4只猴子注射以下物质(a)浓度为4.3log TCID50的MumpsVax；(b)冻干制品MJ21A42，浓度为每剂4.3log TCID50，是经32℃生长9天后收获到的，衍生自MumpsVax在CEF细胞中的直接传三代，(c)冻干制品MJ05A42，浓度为每剂4.3 TCID50，是在CEF细胞中在34℃生长7天后收获的病毒，衍生自MumpsVax的三次直接传代，这三代不同于MJ21A42制品的传代物。
注射前(第0天)，以及预防接种后的第28和42天分别抽取血标本，用Behring的商品化Enzygnost Anti-Parotitis Virus试剂盒(Behringwerke AG，Marburg，Germany)，按照厂家建议测试血标本中抗腮腺炎病毒的IgG抗体的存在。如表1所示，从纯JL-1病毒株衍生的制品在所述动物体内诱导出比包括MumpsVax在内的其它制品更高的抗腮腺炎病毒抗体滴度。另外，将这些血清进行两倍系列稀释，用MumpsVax作测试病毒，在空斑减少(reduction)试验中进行测试。那些注射了MJ11A42的动物的血清比其它血清产生的空斑数减少。
8)临床研究进一步在临床试验中，用大约15个月大的血清阴性儿童，测试JL-1病毒株。使用纯的JL-1株作为腮腺炎成分，或使用MumpsVax如实施例6所述在CEF细胞上直接传代而得到的病毒，配制麻疹、腮腺炎和风疹三价疫苗，并冷冻干燥。试验中还使用了M-M-RII疫苗商品，它由Merck and CoInc生产，可从Merck Frossr Inc Kirkland，Quebec，Canada得到；它含有Jeryl-Lynn(B-水平)株作为腮腺炎成分。
这三种疫苗制品中腮腺炎病毒的滴度经测定为批号为MJR111D42(含纯JL-1株)的疫苗为每剂4.5log TCID，批号为MJR121C42(含传代的MumpsVax病毒)的疫苗为每剂4.7logTCID，批号为80391OU的商品化M-M-RII疫苗为每剂4.5logTCID。
接种前和接种后第42天抽取受试儿童的血标本。
抗腮腺炎病毒的IgG抗体的存在，用实施例6所述商品化试剂盒进行测试。如表3所示，三种制品中，纯JL-1株MMR疫苗诱导出最高的血清转换率和最高的几何平均滴度。
表1
表2
表3血清抗体反应阴性的受试者对腮腺炎病毒的血清转换和几何平均滴度(GMT)
生物材料保藏的说明以下生物材料保藏于欧洲细胞培养物保藏中心。
序列表(1)一般资料(i)申请人Smithkline Beecham Biologicals sa(ii)发明题目疫苗(iii)序列数目13(iv)通讯地址(A)收信人 Smithkline BeechamCorporate Intellectual Property(B)街道SB House L/5 Great West Road(C)城市Brentford(D)州Middlesex(E)国家United Kingdom(F)邮编TW8 9BD(v)计算机的可读形式(A)介质类型Floppy disk(B)计算机IBM PC兼容型(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类号(viii)代理/代理人资料(A)姓名Dalton，Marcus JW(ix)电讯资料(A)电话44 181 975 4093(B)传真44 181 975 3688(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度393bp
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟否(iv)反义否(vi)来源(A)生物体腮腺炎病毒(B)株系Jeryl lynn-1(xi)序列说明SEQ ID NO1TGAATCTCCT AGGGTCGTAA CGTCTCGTGA CCCTGCCGTC GCACTATGCC GGCAATCCAA 60CCTCCCTTAT ACCTAACATT TCTAGTGCTA ATCCTTCTCT ATCTCATCAT AACCCTGTAT120GTCTGGACTA TATTGACTAT TAACTATAAG ACGGCGGTGC GATATGCAGC ACTGTACCAG180CGATCCTTCT CTCGCTGGGG TTTTGATCAC TCACTCTAGA AAGATCCCCA ATTAGGACAA240GTCCCGATCC GTCACGCTAG AACAAGCTGC ATTCAAATGA AGCTGTGCTA CCATGAGACA300TAAAGAAAAA AGCAAGCCAG AACAAACCTA GGATCATAAC ACAATACAGA ATATTAGCTG360CTATCACAAC TGTGTTCCGG CCACTAAGAA AAT 393(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度15bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(iii)假拟否
(iv)反义否(vi)来源(A)生物体nh2(xi)序列说明SEQ ID NO2GTAGCACTGG ATGGA 15(2)SEQ ID NO3的资料(i)序列特征(A)长度20bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)来源(A)生物体NH8(xi)序列说明SEQ ID NO3TCTGTGTTGT ATTGTGATCC 20(2)SEQ ID NO4的资料(i)序列特征(A)长度21bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(vi)来源(A)生物体NH14(xi)序列说明SEQ ID NO4
GTCGATGATC TCATCAGGTAC21(2)SEQ ID NO5的资料(i)序列特征(A)长度33bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(基因组的)(vi)来源(A)生物体NH22(xi)序列说明SEQ ID NO5CGGTAGAAGC TTGTCGATGA TCTCATCAGG TAC33(2) SEQ ID NO6的资料(i)序列特征(A)长度32bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)来源(A)生物体NH23(xi)序列说明SEQ ID NO6CGCTGAGGAT CCTCTGTGTT GTATTGTGAT CC 32(2)SEQ ID NO7的资料(i)序列特征(A)长度18bp
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)来源(A)生物体NH30(xi)序列说明SEQ ID NO7ATCTCCTAGG GTCGTAAC 18(2)SEQ ID NO8的资料(i)序列特征(A)长度18bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)来源(A)生物体NH31(xi)序列说明SEQ ID NO8TTTGGATGCA GCTTGTTC 18(2)SEQ ID NO9的资料(i)序列特征(A)长度28bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)来源
(A)生物体NH 30 BIS(xi)序列描述SEQ ID NO9AATCTCCTAG GGTCGTAACG TCTCGTGA 28(2)SEQID NO10的资料(i)序列特征(A)长度24bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)来源(A)生物体NH 31 BIS(xi)序列说明SEQ ID NO10TTTGAATGCA GCTTGTTCTA GCGT24(2)SEQ ID NO11的资料(i)序列特征(A)长度29bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)来源(A)生物体BC265(xi)序列说明SEQ ID NO11CCGACATTAT GAATAGTTTC GAGGGCTCC 29
(2)SEQ ID NO12的资料(i)序列特征(A)长度31bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)来源(A)生物体bc252(xi)序列说明SEQ ID NO12ATATCGCACC GCCGTCTTAT AGTTAATAGT C 31(2)SEQ ID NO13的资料(i)序列特征(A)长度31bp(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓朴结构线性(ii)分子类型DNA(基因组)(vi)来源(A)生物体BC253(xi)序列说明SEQ ID NO13ATACCGAACC GCCGTATTAT GGTTAATGGT C 32
关于微生物保藏的说明(细则13之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
权利要求
1.一种减毒Jeryl-Lynn腮腺炎病毒株，其特征在于，SH基因和HN基因的N-末端包含图1所示的核酸序列。
2.减毒Jeryl-Lynn腮腺炎病毒株在制备疫苗中的用途，其中所述减毒Jeryl-Lynn腮腺炎病毒株的特征在于，SH基因和HN基因的N-末端包含图1所示的核酸序列。
3.权利要求2的用途，其中所述的减毒Jeryl-Lynn腮腺炎病毒株是免疫原性基本上均一的Jeryl-Lynn分离株。
4.权利要求2或3的用途，其中所述的疫苗是腮腺炎疫苗。
5.权利要求2或3的用途，其中所述的疫苗是联合疫苗，该联合疫苗还含有一种或多种减毒麻疹病毒、或减毒风疹病毒或灭活的麻疹或风疹病毒，或是这些病毒的亚单位。
6.如权利要求2-5之一所述的疫苗，另外还含有一种药剂以提供抗水痘或带状痘疹感染的保护。
全文摘要
本发明提出了一种新的流行性腮腺炎疫苗，它包括从腮腺炎病毒的Jeryl－Lynn株衍生来的一种均一纯化分离株。本发明优选实施方案中这种疫苗产生的血清转化率和抗体滴度都比已知的商品化疫苗要高。
文档编号A61P31/00GK101092609SQ20071010326
公开日2007年12月26日 申请日期1994年11月15日 优先权日1993年11月19日
发明者奈杰尔·M·哈福德, 布里格特·D·A·科劳, 让·迪德莱兹 申请人:葛兰素史密斯克莱生物公司