丹参提取物治疗败血症的应用的制作方法

专利名称：丹参提取物治疗败血症的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药产品的新用途，特别涉及丹参提取物在治疗和/或预防败血症的应用。
背景技术：
-丹参为中国的传统中药，最早见于《神农本草经》，并被列为上品.丹参以唇型科鼠尾属多年化:草本植物乃参(Salviami Itior2rhizaBunge)的干燥根及根茎入药. 别名赤参，紫丹参,血丹参.丹参主产于山西，四川，安徽,河北，江苏，山东，浙江等 省.丹参味苦,微寒，入心，心包,肝经.具有活性化瘀,凉血消痈及养血安神的功效, 主治瘀血所致的各种疼痛，症瘕积聚,疮疡痛肿以及心悸失眠等，为临床之常用药 物，尤以治疗冠心病及缺血性脑血管病最为常用，且疗效颇佳，多用于治疗冠心病， 心绞痛，心肌梗塞，心动过速，脑血栓等，已被现代临床实验和药理实验研究所证 实活血化瘀等多方面的药理活性,其主要成份是丹参酮(I， IIA, IIB),异丹参酮 (I ， II),隐丹参酮，羟基丹参酮IIA,异隐丹参酮，丹参新酮，左旋二氢丹参酮I ,乃-参酸甲酯，次甲丹参醌,丹参酚，乙，丙，e-谷甾醇，3,4 -二羟基苯甲醛,儿茶精,芸香甙，原儿茶醛,原儿茶酸，乳酸,维生素E等. 丹参中的水溶性成分主要是二羟基苯基乳酸(DLA，见图1A) H0\ yCH2CH(0H)C00H又名丹参素-D(+) e-(3，4_二羟基苯基)乳酸(1)是丹参水溶性各种成分的基 本结构成分，已被证明有抗氧化、抗纤维化等作用。 丹酚酸B (SAB，见图1B)丹酚酸类化合物具有很强的抑制脂质过氧化、清除超氧阴离子和羟基自由基的作 用。其中丹酚酸A和B活性最强。丹酚酸B对脑缺血-再灌注损伤所致线粒体损 伤和神经细胞凋亡有明显抑制作用。可抗Caspase-3高表达PCI2细胞的凋亡， 还可抑制B淀粉样蛋白(A e 1-40)纤维形成及A e 1-40所致PC12细胞线粒体损 伤和细胞凋亡。属强抗氧化药，且能消除细胞内钙超载。败血症是致病菌或条件致病菌侵入血循环中生长繁殖，产生毒素和其他代谢产物 所引起的急性全身性感染，临床上以寒战、高热、皮疹、关节痛及肝脾肿大为特 征，部分可有感染性休克和迁徙性病灶。引起败血症的原因有 --、人体因素① 当皮肤粘膜有破损或发生化脓性炎症时，细菌则容易侵入体内。② 人体的免疫反应可分为非特异性免疫反应及特异性免疫反应两种，后者又可分 为细胞免疫与体液免疫两方面。当机体免疫功能下降时，不能充分发挥其吞噬杀 灭细菌的作用，即使入侵的细菌量较少，致病力不强也能引起败血症。③ 条件致病菌所引起的医源性感染也逐渐增多。二、细菌因素主要与病原菌的毒力和数量有关。毒力强或数量多的致病菌进入机体，引起败血 症的可能性较大。败血症的主要症状是1. 原发炎症各种病原菌所引起的原发炎症与其在人体的分布部位有关。 原发炎症的特点是局部的红、肿、热、痛和功能障碍。2. 毒血症症状起病多急骤。常有寒战、高热、发热多为弛张热及或间歇 热，亦可呈稽留热、不规则热及双峰热，后者多系革兰阴性杆菌败血症所致。发 热同时伴有不同程度的毒血症症状，如头痛、恶心、呕吐、腹胀、腹痛、周身不 适、肌肉及关节疼痛等。3. 皮疹见于部分患者，以瘀点最为多见，多分布于躯干、四肢、眼结膜、 口腔粘膜等处，为数不多。4. 关节症状可出现大关节红、肿、热、痛和活动受限，甚至并发关节腔 积液、积脓，多见于革兰阳性球菌、脑膜炎球菌、产碱杆菌等败血症的病程中。5. 感染性休克约见于l/5 l/3败血症患者，表现为烦燥不安，脉搏细速，四肢厥冷，皮肤花斑，尿量减少及血压下降等，且可发生DIC，系严重毒血症所致。6.肝脾肿大 一般仅轻度肿大。 根据研究，脂多糖(LPS)是革兰氏阳性细菌细胞壁的组成成分之一，造成了革兰氏阳性细菌导致的人败血症和感染性休克的多种表现。败血症时发生的微循环障是由LPS的过度释放造成的系统性炎症反应，由许多激活的因子所介导，这些 因子如粘附分子，活性氧成份(R0S)，以及炎症前体介质如肿瘤坏死因子一 a(TNF-a)、白介素一6 (IL-6)以及干扰素一 Y (INF-Y ) 。 LPS诱导产生的微循 环障碍对败血症时发生的器官功能障碍起着关键作用，在这个过程中白细胞沿着 内皮旋转并粘附于血管内皮，血管壁产生过氧化氢和肥大细胞脱颗粒都是文献报 道的关键步骤。当前败血症的主要临床治疗方法包括容量复苏，儿茶酚胺的运用和抗生素补 偿治疗。这些方法可以增加败血症病人的存活率，但是在临床上会导致血糖升高 以及血压和血钙的下降，并发生出血。临床研究建议采用抗TNF-a治疗对败血 症的治疗有所帮助。然而，最近的研究表明这种方法不能治愈败血症且会增加严 重败血症病人的死亡率。因而，在LPS导致的败血症中寻找防止出现严重微循 环障的方法仍然是个挑战。本发明人在对丹参中的两个重要提取物二羟基苯基乳酸和丹酚酸B进行的 研究过程中，发现二羟基苯基乳酸和丹酚酸B显著改善脂多糖诱导的大鼠肠系 膜微循环障碍，并抑制脂多糖引起的CDllb和CD18表达和嗜中性粒细胞产生 '02 —和11202，对败血症有明显的治疗作用。

发明内容
本发明提供一种丹参提取物的新的治疗用途。所述新的治疗用途，是用丹参提取 物治疗因微循环障碍引发的败血症。为此，本发明提供一种药物新用途，即用丹参提取物制备一种治疗和/或预防败 血症的药物。本发明所述丹参提取物选自两个重要提取物二羟基苯基乳酸和丹酚酸B。 本发明所述的二羟基苯基乳酸和丹酚酸B是现有技术，可以从市场上买到，也 可以根据现有技术制备，符合药用标准即可。优选纯度〉50%，更优选纯度〉90%，。本发明所述制备的药物，是用上述丹参提取物作为药物活性成分制备成的药物制 剂组合物。本发明的药物制剂组合物，根据需要可以含有药物可接受的载体，其中丹参 提取物作为药物活性成分，其在制剂中所占重量百分比可以是0.1-99.9%,其余 为药物可接受的载体。本发明的药物制剂组合物，以单位剂量形式存在，所述单 位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，口服液的每瓶， 颗粒剂每袋，注射剂的每支等。本发明的药物制剂组合物可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、 口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注 射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。本发明的中药制剂，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、 填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时 可对片剂进行包衣。适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩 解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯垸酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润 滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二垸基硫酸钠。可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合 可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或 酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种 液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、 明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体(它们可以包括食用 油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐 剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常 规的香味剂或着色剂。对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质 溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。 辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高 其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。本发明的中药制剂，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载 体，所述药物可接受的载体选自甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、 EDTA二钠、EDTA 钙钠， 一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、 磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右 旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、 藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、e _环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。本发明的制剂在使用时根据病人的情况确定用法用量，可每日服三次，每次 1-20剂，如l-20袋或粒或片，每剂lmg-1000mg。 本发明所述的治疗用途是通过以下实验证明的 材料和方法 试药二羟基苯基乳酸和丹酚酸B均购自中国药品生物制品检定所(北京，中国)。 脂多糖取自大肠杆菌血清型055: B5，甲苯胺蓝，2， ， 7， -二氯荧光素乙酰乙 酸盐(DCFH-DA)和氢化乙啡啶均购自Sigma (圣路易斯，密苏里州)。FITC-结合小鼠抗-大鼠CDllb单克隆抗体，FITC-结合小鼠抗-大鼠CD18单克隆抗体， FITC-结合小鼠IgA， k和FITC-结合小鼠IgGn k均购自BD生物科学系统(圣 地亚哥，加州)。溶血素购自BD生物科学Immunocytometer系统(美国加州硅 谷)。Mono-Pol分离液购自大日本製薬株式会社(大阪，日本)。RPMI 1640和 胎牛血清购自Hyclone (楼根，犹他州)。试验中使用的所有其它化学试剂为最 优商品级试剂。 实验动物雄性SD大鼠，体重200 250g，由北京大学医学部实验动物中心提供。所有研究经过批准，所有实验动物遵循北京大学实验动物研究委员会指南进行处 理。肠系膜微循环观察试验前SD大鼠禁食12小时，可以自由饮水。用乌拉坦将实验动物麻醉 (1.25mg/kg体重，肌肉注射)。将导管插入左颈静脉和右股静脉，供注射各种 实验药物使用。经腹正中线切开20-30mm，轻柔地将20cm肠系膜尾部的回盲肠 由腹部取出，置于透明塑料大鼠实验台上。用恒温装置将肠系膜保持在37°C， 在表面连续滴加生理盐水，保持水分。取倒置显微镜(DM-IRB, Leica， Wetzlar， 德国)，用透照法观察肠系膜微循环血液动力学。 一台摄像机(Jk-TU53H，日本 东芝公司，东京，日本)安装在显微镜上，将图像反射到彩色监视器(J2118A， TCL，徽州，中国)，使用DVD (DVR-R25， Malata， Xiamen，中国)记录图像。 研究中供测量参数使用的微静脉应为单根，非分枝，无明显弯曲，直径范围为 30(im-50fxm，长度为200nm。 脂多糖诱导的微循环障碍和药物输注将大鼠随机分成4组，每组6只。观察大鼠肠系膜微血管系统的基本血液动 力学10分钟后，给予溶媒(生理盐水溶液)或试验药品。自试验开始(第O分 钟)至试验结束(第60分钟)，自对照组实验动物左颈静脉插管灌注盐水溶液 (8ml/kg体重/hr);自试验开始(第O分钟)至试验结束(第60分钟)，自脂 多糖组实验动物左股静脉连续灌注脂多糖(2mg/kg体重/hrin盐水溶液)。自脂 多糖+二羟基苯基乳酸组实验动物左股静脉输注脂多糖(2mg/kg体重/hr)后， 自试验前20分钟至观察结束期间由左颈静脉输注二羟基苯基乳酸(5mg/kg体重 /hrin盐水溶液)。脂多糖+丹酚酸B组实验动物的处理方法与脂多糖+ 二羟基苯 基乳酸组相同，只需用丹酚酸B (5mg/kg体重/hrin盐水溶液)代替二羟基苯基 乳酸。四个实验组的总输注量相同。 微静脉直径测量使用图像-Pro Plus 5.0软件评价系统记录的微静脉动态图像，在第O， 10， 30和50分钟测量微静脉直径。 微静脉红细胞流速测量记录微静脉红细胞流速，通过CCD将监控器调节至高速度摄像机系统(FAST C層-ultima APX， photron，圣地亚哥，加州)，调节速度至2000帧每 秒(帧/秒)，以25帧/秒重新播放高速保存图像。用图像-Pro Plus 5.0软件测量 第0， 10， 30和50分钟的微静脉红细胞流速。 切变率测量遵循下述公式计算微静脉切变率(Y ): Y=8 (微静脉/微静脉直径RBCs平 均速度)。粒性白细胞粘附测量观察系统记录的粒性白细胞动态图像，鉴定粘附在微静脉壁上的粒性白细 胞。粘附的粒性白细胞是指重新播放DVD图像时粒性白细胞在同一位点粘附10 秒钟以上。在观察第O， 10， 30和50分钟图像随机选择200pm微静脉，然后沿 微静脉统计粘附的粒性白细胞数量。 趋化游走粒性白细胞测量检查记录的图像，测量趋化游走粒性白细胞数。白细胞趋化游走即每200pm 微静脉粒性白细胞的数量，在第O， 10， 30和50分钟随机选择图像。 肥大细胞脱颗粒测量输注脂多糖或盐水溶液60分钟后，用0.1%甲苯胺蓝将组织局部染色1分钟， 然后用生理盐水清洗。视野中没有脱颗粒的肥大细胞和脱颗粒的肥大细胞的数量 放大20X，每只实验动物共评价5个视野。脱颗粒的肥大细胞数量与肥大细胞 总数量的比值即为脱颗粒的肥大细胞百分数。 嗜中性粒细胞表面CDllb和CD18表达测量经腹主动脉采集其它组大鼠血样(n=6)，加肝脏素抗凝，检测嗜中性粒细胞 表面CDllb和CD18表达。样品分成四组对照组，脂多糖组(脂多糖2pg/ml)， 脂多糖+ 二羟基苯基乳酸组(脂多糖2pg/ml加二羟基苯基乳酸0.2mg/ml， 0.5mg/ml或1.0mg/ml)和脂多糖+丹酚酸B组(脂多糖2pg/ml加丹酚酸B 0.2mg/ml， 0.5mg/ml或1.0mg/ml)。样品在37。C水浴中培育2小时，然后使用 lpg/ml FITC-结合小鼠抗-大鼠CDllb抗体，lpig/mlFITC-结合小鼠抗-大鼠 CD18抗体或FITC-结合相应同种型(小鼠IgA，Kfor CD1 lb，小鼠IgG!， /cforCD18) 在室温条件下标记20分钟。然后，按照生产厂家(BD生物科学系统，美国加 州硅谷)说明，用溶血素将红细胞溶解，磷残留细胞用酸盐缓冲溶液洗涤两次。9根据前向角-/侧向角-散射表达特性，使用FACSCalibur流式细胞仪(BD生物 科学系统，美国加州硅谷)将嗜中性粒细胞分类，评价每个样本中的5000个嗜 中性粒细胞，测量平均荧光强度。 嗜中性粒细胞产生的细胞内11202和'02 —测量血样分别取自不同组大鼠，加肝脏素抗凝。遵循Ting所述方法，使用Mono-多分离液分离嗜中性粒细胞，然后将其悬浮在0.1M磷酸盐缓冲溶液中。使用 FACSCalibur流式细胞计量术(BD生物科学系统，美国加州硅谷)分析细胞内产 生的'02 —和11202。简而言之，将采集的嗜中性粒细胞在20mM2' -7， -二氯荧光 素双醋酸盐溶液中培育5分钟，温度为37。C，然后在10mM氢化乙啡P定中培育15 分钟。2' -7' -二氯荧光素双醋酸盐的硝酸盐部分被细胞内酯酶断开，释放不能 通过细胞膜的2' ，7' -二氯荧光素，被11202氧化成2' ，7' -二氯荧光素(DCF) 后发出荧光；另一方面Hydroethidium可以直接被'02 —氧化成菲啶溴红(EB)， 嵌入核酸后发荧光。然后使用二羟基苯基乳酸(0.5mg/ml)或丹酚酸B (0.5mg/ml) 处理细胞，用脂多糖(2ug/ml)刺激细胞。在冰中培育20分钟后，用流式细胞 计量术测量产生的11202和'02 —，测量发射波长为525nm (FL1， forDCF)和590nm(FL2， forEB)。 统计分析使用ANOVA和Fisher' s post hoc test计算统计显著性。统计显著水平为 p<0.05。数据以平均土S.E.M表示。 结果二羟基苯基乳酸和丹酚酸B对脂多糖诱导的微静脉红细胞流速变化的干预 作用在不同时间点测量四个实验组中微静脉红细胞流速(见表l)。脂多糖输 注30分钟后，微静脉红细胞流速降低至74%基础值水平，并且这种干预作用一 直维持观察结束。二羟基苯基乳酸或丹酚酸B处理后，脂多糖诱导的微静脉红 细胞流速降低明显降低。二羟基苯基乳酸和丹酚酸B对脂多糖诱导的肠系膜微静脉切变率变化的干 预作用表2显示四个实验组不同时间点观察的肠系膜微静脉切变率。对照组， 脂多糖组，脂多糖+ 二羟基苯基乳酸组和脂多糖+丹酚酸B组的基础值微静脉 切变率未出现显著性差异。给予脂多糖后肠系膜微静脉切变率明显降低，30分钟后变得更加显著，并且这种降低一值维持到脂多糖输注结束50分钟。二羟基 苯基乳酸或丹酚酸B处理减弱脂多糖诱导的肠系膜微静脉切变率降低，降低数 值较小，因此并不显著，脂多糖输注50分钟后可以检测到脂多糖+ 二羟基苯基 乳酸或脂多糖+丹酚酸B组切变率降低。二羟基苯基乳酸和丹酚酸B对脂多糖诱导的粘附在微静脉壁上的粒性白细胞数量变化的干扰作用评价不同条件下粘附在微静脉壁上的粒性白细胞数量随 时间的变化(见图2)。在观察期内，对照组粘附的粒性白细胞数随着时间的推 移只有少量增加。但是，脂多糖刺激后粘附的粒性白细胞数量出现显著性递增， 自脂多糖输注第IO分钟开始增加，且这种增加趋势维持了 50分钟。二羟基苯基 乳酸或丹酚酸B处理显著抑制脂多糖诱导的白细胞粘附。二羟基苯基乳酸和丹酚酸B对脂多糖诱导的沿微静脉壁趋化游走的粒性白 细胞数量变化的干扰作用沿微静脉壁趋化游走的粒性白细胞数量的变化时间过 程见图3。在所有时间点，对照组出现很少或没有出现趋化游走的粒性白细胞。 给予脂多糖引起趋化游走粒性白细胞数量在50分钟显著增加，二羟基苯基乳酸 或丹酚酸B处理后几乎完全没有出现这种增加。二羟基苯基乳酸和丹酚酸B对脂多糖诱导的肥大细胞脱颗粒的干预作用 图4显示四个实验组中微静脉中脱颗粒肥大细胞百分数。对照组中甚至可以检测 到少量脱颗粒肥大细胞。脂多糖输注60分钟后脱颗粒肥大细胞数量开始增加， 二羟基苯基乳酸或丹酚酸B处理组显著抑制脂多糖诱导的脱颗粒反应肥大细胞。二羟基苯基乳酸和丹酚酸B对嗜中性粒细胞体外CDllb和CD18表达的干预 作用本研究使用流式细胞计量术分析接受不同处理的嗜中性粒细胞表面粘附分 子CDllb和CD18表达。图5A显示，与对照组比较经脂多糖处理后嗜中性粒细胞 表面CDllb的荧光强度显著增加，加入丹酚酸B或二羟基苯基乳酸后这种由脂多 糖诱导的CDllb荧光强度增强消失，加入的丹酚酸B的有效浓度可以低至 0.2mg/ml， 二羟基苯基乳酸的有效浓度可以低至0.5mg/ml。图5B表明，粘附分 子CD18出现类似的趋势经脂多糖处理后嗜中性粒细胞表面CD18荧光强度显著 增加，使用的浓度达到0.2mg/tnl时，二羟基苯基乳酸或丹酚酸B处理后这种作 用受到抑制。二羟基苯基乳酸和丹酚酸B对嗜中性粒细胞细胞内产生'(V和&02的体外千预作用使用流式细胞计量术检测二羟基苯基乳酸和丹酚酸B的抗氧化作用。细胞 经脂多糖刺激后，嗜中性粒细胞产生大量'(V ，加入0.5mg/ml二羟基苯基乳酸或 丹酚酸B后，显著抑制细胞产生'(V (见图6A)。与对照组比较，脂多糖刺激后嗜 中性粒细胞HA荧光强度几乎增加两倍，使用O. 5mg/ml二羟基苯基乳酸或丹酚酸B 处理后这种作用显著降低(见图6B)。试验结果表明，二羟基苯基乳酸和丹酚酸B均可以改善脂多糖诱导的大鼠肠 系膜微循环障碍。包括抑制白细胞粘附和趋化游走，减弱红细胞流速和微静脉切 变率降低，抑制肥大细胞脱颗粒。可以抑制脂多糖刺激的嗜中性粒细胞粘附分子 CDllb和CD18表达和'02 —和11202产生。这些结果为LPS诱导的败血症的临床 治疗提供了一个新的可供选择的方法。 表l输注盐水溶液或脂多糖后不同时间点微静脉红细胞流速。 按照材料和方法所述方法，输注盐水溶液或脂多糖后，给予或不给予二羟基苯 基乳酸或丹酚酸B预处理，在第O， 10， 30和50分钟测量微静脉红细胞流速。 数据以6只大鼠的平均土S. E. M表示。微静脉RBCsi速度(mm/秒)对照(n=6) 脂多糖(n=6) 脂多糖+二羟基 苯基乳酸(n=6) 脂多糖+丹酚酸 B (n=6)0分钟 1,91 ±0.351.90±0.141.79±0.261.90±0.3310分钟 1.89±0.291.52±0.171.79±0.331.93 ±0.3230分钟 50分钟 2.18±0.25 1.99±0.17 1.41±0.09* 1.35±0.11*1.78 ±0.271.94±0.351.50 ±0.201.78±0.33对照组大鼠灌注溶媒(盐水溶液)(8ml/kg体重/hr);脂多糖组大鼠灌注脂多 糖(2mg/kg体重/hr);脂多糖+ 二羟基苯基乳酸组实验动物在输注脂多糖(2mg/kg体重/hr) 20分钟前灌注二羟基苯基乳酸(5mg/kg体重/hr);脂多 糖+丹酚酸B，实验动物在输注脂多糖(2mg/kg体重/hr) 20分钟前灌注丹酚 酸B (5mg/kg体重/hr).0.05。 表2输注盐水溶液或脂多糖后不同时间点的微静脉切变率。按照材料和方法所述方法，给予或不给予二羟基苯基乳酸或丹酚酸B预处理， 输注盐水溶液或脂多糖后，在第0， 10， 30和50分钟测量微静脉切变率。数据 以6只大鼠的平均士S.E.M。表示。微静脉切变率(s—')O分钟对照(n=6) 421.18±95.19脂多糖394.95±31.90(n=6) 脂多糖+ 二羟基苯基乳 417.35土64.11402.50±69.90410.05±59.77 338.48±48.86酸(n=6) 脂多糖+丹酚酸B 375.85±58,82375.15±51.61380.36±64.61 340.35±61.02(n=6)对照组大鼠灌注溶媒(盐水溶液)(8ml/kg体重/hr);脂多糖组大鼠灌注脂多 糖(2mg/kg体重/hr);脂多糖+二羟基苯基乳酸组大鼠灌注脂多糖(2mg/kg 体重/hr) 20分钟前，灌注二羟基苯基乳酸(5mg/kg体重/hr);脂多糖+丹酚 酸B组大鼠灌注脂多糖(2mg/kg体重/hr) 20分钟前，灌注丹酚酸B (5mg/kg 体重/hr)。承与对照组比较p〈0. 05。


图1. 二羟基苯基乳酸和丹酚酸B的化学结构。图2. 二羟基苯基乳酸和丹酚酸B对大鼠输注脂多糖后粘附在微静脉壁上的粒 性白细胞数量变化的时间过程干预作用。对照组大鼠灌注盐水溶液60分钟 (8ml/kg体重/hr)，脂多糖组大鼠灌注脂多糖(2mg/kg体重/hr) 60分钟。遵10分钟 30分钟 50分钟397.88±74.85459.61 ±68.58 426.06±50.02330.87±44.96295.52±24.36* 282.94±25.99*13循材料和方法所述方法，大鼠输注脂多糖(2mg/kg体重/hr) 20分钟前静脉注 射二羟基苯基乳酸(5mg/kg体重/hr)或丹酚酸B (5mg/kg体重/hr)，连续输 注直至观察结束。四个实验组的总输注量相同。统计粒性白细胞趋化游走数量， 结果以每200 u m微静脉的细胞数量表示。数据为6只大鼠的平均士S. E. M表示。 *与对照组比较P〈0. 05。， t与脂多糖比较p<0, 05。图3. 二羟基苯基乳酸和丹酚酸B对大鼠输注脂多糖后微静脉趋化游走粒性白细 胞数量变化的时间过程干预作用。对照组大鼠灌注盐水溶液60分钟(8ml/kg 体重/hr),脂多糖组大鼠灌注脂多糖(2mg/kg体重/hr) 60分钟。按照材料和 方法所述方法，大鼠输注脂多糖(2mg/kg体重/hr) 20分钟前静脉注射二羟基 苯基乳酸(5mg/kg体重/hr)或丹酚酸B (5mg/kg体重/hr)，连续输注直至观 察结束。四个实验组的总输注量相同。统计粒性白细胞趋化游走数量，结果以 每200um微静脉的细胞数量表示。数据6只大鼠的平均土S.E.M表示。*与对 照组比较p<0. 05。 ， t与脂多糖比较p〈0. 05。图4. 二羟基苯基乳酸和丹酚酸B对大鼠输注脂多糖后沿微静脉肥大细胞脱颗粒 的干预作用。对照组大鼠灌注盐水溶液60分钟(8ml/kg体重/hr)，脂多糖组 大鼠灌注脂多糖(2mg/kg体重/hr) 60分钟。按照材料和方法所述方法，大鼠 输注脂多糖(2mg/kg体重/hr) 20分钟前静脉注射二羟基苯基乳酸(5mg/kg体 重/hr)或丹酚酸B (5mg/kg体重/hr，连续输注直至观察结束。四个实验组的 总输注量相同。脂多糖输注60分钟后测量肥大细胞脱颗粒。数据6只大鼠的平 均士S.E.M表示。Hc与对照组比较p〈0.05。， t与脂多糖比较p〈0.05。 图5. 二羟基苯基乳酸和丹酚酸B对体外脂多糖刺激嗜中性粒细胞粘附分子 CDllb (A)和CD18 (B)表达的干预作用。使用流式细胞计量术分析CDUb和 CD18表达。血样用脂多糖(2Pg/ml)培育，加入或不加各种浓度的二羟基苯基 乳酸或丹酚酸B，然后使用相应抗体培育。将红细胞溶解，将嗜中性粒细胞分 类，使用流式细胞计量术评价，测量平均荧光强度。数据6只大鼠的平均士S. E. M 表示。本与对照组比较p〈0.05。， t与脂多糖比较p〈0.05。 图6. 二羟基苯基乳酸和丹酚酸B对体外脂多糖刺激嗜中性粒细胞产生'(V (A) 和H202 (B)的干预作用。嗜中性粒细胞用2化Anl脂多糖培育，加入或不加二 羟基苯基乳酸(0.5mg/ml)或丹酚酸B (0.5mg/ml)。用流式细胞计量术测量产生的.(V和HA。数据6只大鼠的平均土S.E.M表示。氺与对照组比较p〈0.05。十 与脂多糖比较p<0.05。
具体实施例方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
片剂
处方二羟基苯基乳酸或丹酚酸B100g 微晶纤维素50g 微粉
硅胶3g 硬脂酸镁1. 5g
制法取原、辅料分别过100目筛；取三七皂苷、微晶纤维素，混匀， 用60%乙醇适量作为粘合剂制软材，过20目筛制颗粒，6(TC干燥，取出， 过30目筛整粒，加入微粉硅胶及硬脂酸镁，混匀，压片，制成1000片，
即得。 实施例处方二羟基苯基乳酸或丹酚酸B75g 微晶纤维素37g 微粉硅胶 2. 3g 硬脂酸镁l.lg
制法取原、辅料分别过IOO目筛；取三七皂苷、硫酸钙、微晶纤维素， 混匀，用60%乙醇适量作为粘合剂制软材，过20目筛制颗粒，6(TC干燥， 取出，过30目筛整粒，加入适量微粉硅胶及硬脂酸镁，混匀，压片，制 成1000片，即得。 实施例处方二羟基苯基乳酸或丹酚酸B133g 微晶纤维素66g 微粉硅胶 4g
硬脂酸镁2g
制法取原、辅料分别过100目筛；取三七皂苷、硫酸钙、微晶纤维素， 混匀，用60%乙醇适量作为粘合剂制软材，过20目筛制颗粒，6(TC干燥， 取出，过30目筛整粒，加入适量微粉硅胶及硬脂酸镁，混匀，压片，制 成1000片，即得。 实施例4
胶囊，取二羟基苯基乳酸或丹酚酸B100mg，加入适量淀粉，硬脂酸镁等辅料，制粒，整粒，装入1号胶囊，即得。 实施例5
口服液，取二羟基苯基乳酸或丹酚酸B100mg，加入适量蔗糖，防腐剂，加水到 1000ml，分装成10ml—支，即得口服液。 实施例6
颗粒剂，取二羟基苯基乳酸或丹酚酸B100mg，加入适量糊精、甜菊素，干式制 粒，整粒，分装，即得。 实施例7
注射剂，二羟基苯基乳酸或丹酚酸B150g加水溶解，另氯化钠、对羟基苯甲酸 乙酯加热水溶解，混匀，调
pH值。注射用水稀释至1000ml,用中空纤维膜滤过，灌装，灭菌，即得。 实施例8
应用实例，败血症的治疗 典型病例(一)
患者孙XX，男性，30岁，印刷工人，有头痛、恶心、呕吐、腹胀、腹痛、 周身不适、肌肉及关节疼痛等，经诊断为败血症
开始注射二羟基苯基乳酸注射液，规格0.1g/支，每日三次每次2支。半月 后自觉症状有明显好转。用药期间无任何不良反应。
权利要求
1、丹参提取物在制备一种治疗败血症的药物中的应用。
2、 权利要求l的应用，其特征在于，所述丹参提取物是二羟基苯基乳酸。
3、 权利要求l的应用，其特征在于，所述丹参提取物丹酚酸B。
4、 权利要求l的应用，其特征在于，所述败血症是致病菌或条件致病菌侵入血 循环中生长繁殖，产生毒素和其他代谢产物所引起的急性全身性感染。
5、 权利要求l的应用，其特征在于，所述败血症引发微循环障碍，该微循环障 碍是由脂多糖的过度释放造成的系统性炎症反应。
6、 权利要求l的应用，其特征在于，所述应用是用二羟基苯基乳酸或丹酚酸B 处理后，脂多糖诱导的微静脉红细胞流速降低。
7、 权利要求l的应用，其特征在于，所述应用是二羟基苯基乳酸或丹酚酸B抑 制脂多糖诱导的白细胞粘附。
8、 权利要求l的应用，其特征在于，所述应用是二羟基苯基乳酸或丹酚酸B抑 制脂多糖诱导的肥大细胞脱颗粒反应。
9、 权利要求l的应用，其特征在于，所述丹参提取物是含有丹参提取物的药物 制剂组合物。
10、 权利要求9的应用，其特征在于，所述药物制剂组合物，以丹参提取物二羟 基苯基乳酸和乃酚酸B作为药物活性成分，同时含有药物可接受的载体，其中丹 参提取物在制剂中所占重量百分比是0. 1-99. 9%，其余为药物可接受的载体。
全文摘要
本发明涉及丹参提取物治疗败血症的应用，特别涉及丹参提取物二羟基苯基乳酸或丹酚酸B在治疗和/或预防败血症的应用。
文档编号A61P31/04GK101327249SQ200710111279
公开日2008年12月24日 申请日期2007年6月21日 优先权日2007年6月21日
发明者刘育英, 凯 孙, 王传社, 俊 郭, 韩晶岩 申请人:天津天士力制药股份有限公司