β葡聚糖合酶抑制剂与抗HSP90抗体联合治疗真菌感染的制作方法

专利名称：β葡聚糖合酶抑制剂与抗HSP90抗体联合治疗真菌感染的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的作为有效抗真菌剂的组合物及制剂，以及一种可组合到该组合物及制剂中的新抗体。

背景技术：
真菌感染是重症监护病房病人死亡的一个主要原因，较多发生于免疫减弱和身体衰弱的病人中(Gold，J.W.M.，1984，Am.J.Med.(美国医学杂志)76458-463；Klein，R.S.等人，1984，N.Engl.J.Med.(英国国家医学杂志)311354-357；Burnie，J.P.，1997，Current Anaesthesia & Critical Care(现代麻醉与急救)8180-183)。真菌感染的存在和持续可以归结为广谱抗真菌剂的选择性压力、病人经常性延长在如重症监护病房等设施中的停留、诊断感染中的问题、以及治疗中所应用的真菌试剂缺乏效力。虽然严格的卫生控制可能在某种程度上预防医院或其它环境中真菌的感染，但感染的暴发仍是一个严重的问题，需得到重视。
全身性真菌感染如侵袭性念珠菌病和侵袭性曲霉病可能由多种真菌病原体所引起，如毒性念珠菌属的白色念珠菌、热带念珠菌、克柔克柔念珠菌以及次毒性的种类近平滑念珠菌和光滑球拟酵母(后者在某些文章中指光滑假丝酵母)。尽管白色念珠菌一度是从重症监护病房获得的最常见的真菌分离物，但最近的研究显示，热带念珠菌、光滑假丝酵母、近平滑念珠菌和克柔念珠菌现在占该类分离物的大约半数(Pfaller，M.A.等人，1998，J.Clin.Microbiol.(临床微生物杂志)361886-1889；Pavese，P.等人，1999，Pathol.Biol.(生物病理学)46579-583)。非白色念珠菌种类的上升提示念珠菌属出现对传统抗真菌治疗的耐药性(Walsh，T.J.等人，New Eng.J.Med.(新英格兰医学杂志)340764-771)。
对造成感染的真菌病原体的检测和诊断对随后的治疗至关重要，这是由于抗真菌剂可能对某些菌种更有效。英国专利2240979和EP专利0406029(在此将它们全部引入本文作为参考文献)揭示了一种真菌应激蛋白和它的抗体，可用于一种灵敏的且高特异性的检测真菌病原体的实验中。
传统上，用抗真菌剂两性霉素B治疗白色念珠菌、热带念珠菌和近平滑念珠菌，被认为是全身性抗真菌治疗的“金标”(Burnie，J.P.，1997，见上文)。遗憾的是，两性霉素B本身具高毒性，它的应用被其副作用如寒战、发烧、肌痛或血栓性静脉炎所影响。其它抗真菌剂包括口服吡咯药物(咪康唑，酮康唑，伊曲康唑，氟康唑)和5-氟胞嘧啶。然而，真菌种类如克柔念珠菌和光滑球拟酵母对氟康唑具耐药性，这些菌类经常发生于已预防性施用了氟康唑的患者中。另外，已报道白色念珠菌对氟康唑具耐药性的菌株(Opportunistic Pathogens(机会致病菌)，1997，127-31)。因此，尽管近期研究在治疗药物如氟康唑，伊曲康唑以及系统性基于脂质体的两性霉素B变异物上取得了进展(Burnie，J.P.，1997，见上文)，但是对有效治疗真菌感染试剂的需求仍是很急迫的。


发明内容
本发明通过提供一种新的组合物，致力于满足以上所发现的需求，该组合物相对于本技术领域以前治疗人类或动物真菌感染的抗真菌剂有明显的改进，并且本发明也提供了一种可组合到该组合物中的新抗体。本发明所述组合物包括与已知的抗真菌剂混合的、可结合真菌应激蛋白的一个或多个抗原决定簇的抗体。发明者非常意外地发现，该抗真菌剂抗真菌感染的效力得到明显的增强，从而允许使用低剂量或使原剂量发挥更好的效果，这样降低了非必需的副作用。另外，本发明中的组合物可有效治疗对该组合物中所使用的真菌试剂自身具耐药性的真菌感染。
本发明提供一种组合物，该组合物包括一种可特异性结合一种真菌应激蛋白的一个或多个抗原决定簇的抗体或其中的抗原结合片段和一种抗真菌剂，该抗真菌剂包含至少一种选自多烯抗真菌剂和棘白菌素(echinocandin)抗真菌剂。
本发明进一步提供一种组合制剂，该制剂包含一种可特异性结合一种真菌应激蛋白的一个或多个抗原决定簇的抗体或其中的抗原结合片段、一种包含至少一种选自多烯抗真菌剂和一种棘白菌素抗真菌剂的抗真菌剂，用于在治疗真菌感染时同时、单独或相继使用。
抗体可能针对来源于念珠菌属或球拟酵母属成员的一种热休克蛋白有特异性。(一般认为，念珠菌属或球拟酵母菌属是同义的)。特别地，抗体可能对来源于白色念珠菌的hsp90的热休克蛋白有特异性，正如英国专利2240979和EP专利0406029中所描述的。
抗体或其中的抗原结合片段可能对含有SEQ ID NO1所示序列的抗原决定簇具特异性。抗体及其生产和应用已熟知并得到阐明，如Harlow，E和Lane，D.，AntibodiesA Laboratory Manual(抗体实验室手册)，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，1999。
抗体可经本技术领域所熟知的标准方法进行生产。抗体的例子包括(但不限于)多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、由Fab表达文库所产生的片断、以及抗体的抗原结合片段。
抗体可由多种宿主生产，例如山羊、兔子、大鼠、小鼠、人等。宿主可由来源于念珠菌属的热休克蛋白进行注射免疫，如白色念珠菌的hsp90，或它的具有免疫原性的任何片段或寡肽。根据宿主的种类，可使用不同的佐剂以增强其免疫应答。这类佐剂包括，但不限于，福氏佐剂，矿物凝胶如氢氧化铝，和表面活性物质如溶血卵磷脂，聚醚多元醇，聚阴离子，多肽，油乳胶，匙孔血蓝蛋白，和二硝基苯酚。在用于人类的佐剂中，BCG(结核菌苗)和小棒状杆菌尤为有用。
抗来源于念珠菌属的热休克蛋白如白色念珠菌hsp90的单克隆抗体或其中的任何片段或寡肽，可由可连续培养的细胞系经任何生产抗体分子的方法所制备。这些方法包括，但不限于，杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术、和EBV(EB病毒)杂交瘤技术(Koehler等人，1975，Nature(自然)，256495-497；Kosbor等人，1983，Immunl.Today(今日免疫)472；Cote等人，1983，PNAS USA，802026-2030；Cole等人，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症治疗)，Alan R.Liss Inc，纽约，pp 77-96)。
另外，随着“嵌合抗体”技术的发展，可采用将鼠抗体基因与人抗体基因拼接来获得具合适的抗原特异性和生物活性的分子(Morrison等人，1984，PNAS USA 816851-6855；Neuberger等人，1984，Nature(自然)，312604-608；Takeda等人，1985，Nature(自然)，314452-454)。可选择的，可采纳已经描述过的生产单链抗体的技术，利用本技术领域已知的方法，生产念珠菌热休克蛋白的特异性单链抗体。具有相关的特异性、但具有不同的独特型组成的抗体，也可以从随机组合的免疫球蛋白文库中通过链改组进行生产(Burton，D.R.，1991，PNAS USA，88，11120-11123)。
抗体的生产也可通过诱导体内淋巴细胞系的产生、或通过重组免疫球蛋白文库进行筛选、或通过高特异性结合试剂面板筛选(Orlandi等人，1989，PNAS USA，863833-3837；Winter G等人，1991，自然，349293-299)。
也可以生产抗原结合片段，如F(ab’)2片段可通过用胃蛋白酶消化抗体分子而得到，Fab片段可通过还原F(ab’)2片段的二硫键而产生。可选择的，可通过构建Fab表达文库而快速、简单地鉴定具所需特异性的单克隆Fab片段(Huse等人，1989，Science(科学)，2561275-1281)。
可以应用各种免疫分析来筛选鉴定具有所需特异性的抗体。在本技术领域中已熟知有多种该类方法，可以利用已建立特异性的多克隆抗体或单克隆抗体做竞争性结合或免疫放射量分析。这类免疫分析特异地涉及来源于念珠菌属的热休克蛋白与其特异性抗体的复合物形成的测量，其中的热休克蛋白来源于念珠菌属，例如白色念珠菌的hsp90或其任何片段或寡肽。可采用一种双位点、基于单克隆的免疫分析，其中所使用的是特异性针对念珠菌热休克蛋白的两个无关抗原决定簇的，但也可采用一种竞争性结合实验(Maddox等人，1983，J.Exp.Med.(实验医学杂志)，1581211-1216)。
抗体可能含有SEQ ID NO2所示的序列。
抗真菌多烯试剂可能含有例如两性霉素B、两性霉素B的衍生物、或制霉菌素。两性霉素B的衍生物可使用包括制剂如脂质体两性霉素B(由英国剑桥NexStar制药公司提供样品)、两性霉素B脂质体复合物(Abelcet)，两性霉素B胶体分散体(Amphocil)和两性霉素B英脱利匹特乳剂(Burnie JP，1997，见上文)。两性霉素B可以和另一种抗真菌剂5-氟胞嘧啶联合使用(Burnie JP，1997，见上文)。
棘白菌素抗真菌剂可以是如LY303366(Eli Lilly公司，Indianapolis，美国)。棘白菌素是环脂质肽，可抑制真菌中β-1，3葡聚糖的合成(Redding，JA等人，1998，Antimicrob.Agents Chemo.Ther.(抗微生物试剂化学治疗学)42(3)1187-1194)。
本发明也提供一种在这里所描述的用于治疗真菌感染的组合物。可用该组合物或组合制剂治疗的真菌感染可能是由念珠菌属、隐球菌属、组织胞浆菌属、曲霉菌属、球拟酵母菌、毛霉菌、芽酵母菌、球孢子菌或副球孢子菌所引起。球孢子菌在本领域中也指粗球酵母菌，而副球孢子菌是近粗球酵母菌的同意词。真菌感染可能对抗真菌剂本身具耐药性，即真菌感染本身是不能用特定的试剂所治疗的，这是因为这些特定的抗真菌剂传统上用于自身时是无效的。
本发明也提供一种在这里所描述的组合物或组合制剂，用于人或动物体的真菌感染的治疗方法中。
本发明也提供一种用于治疗人或动物真菌感染的药剂的生产方法，其特色是应用本申请中所描述的组合物或组合制剂。药剂的生产方法已熟知。例如，药剂可能另外含有一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences and USPharmacopoeia，1984，Mack Publishing Company，Easton，PA，美国)。
本发明也提供将本申请中所描述的组合物或组合制剂在一种药剂的生产方法中的应用，该药剂用于治疗真菌感染。真菌感染可能对抗感染试剂本身具耐药性。
本发明也提供一种用于治疗人或动物体真菌感染的方法，包括给予有相同需要的患者根据本申请的组合物或组合制剂。给予患者的组合物或组合制剂的确切剂量(即药学可接受剂量)可由本技术领域的熟练人员所轻易确定，如通过应用简单的剂量依赖性实验。组合物或组合制剂可口服。
本发明中还进一步提供一种试剂盒，该试剂盒包括一种可特异性结合一种真菌应激蛋白的一个或多个抗原决定簇的抗体或其中的抗原结合片段、一种包含至少一种选自多烯抗真菌剂和棘白菌素抗真菌剂。该试剂盒可用于治疗真菌感染。
本发明也提供一种针对含SEQ ID NO1所示序列的抗原决定簇的特异性抗体或它的抗原结合片段。
本发明中的抗体可能具有诊断价值。因此用于诊断时，可利用抗体来检测宿主中是否存在应激蛋白，从而确定宿主是否有特异的真菌感染，如由于念珠菌属、隐球菌属、组织胞浆菌属、曲霉菌属、球拟酵母菌、毛霉菌、芽酵母菌、球孢子菌或副球孢子菌所引起的感染。例如可用于诊断真菌性脓肿，特别是肝脏念珠菌病，和/或监测针对此类感染的治疗进程。这类诊断方法形成了本发明的另一个目的，而且可以使用一些标准技术，如像酶联免疫吸附的免疫学方法、放射免疫方法、乳胶凝集方法或免疫印迹法。
本发明中的抗体可用一种可检测的标记物进行标记，或用一种效应分子应用传统的方法进行共轭结合，效应分子如一种药，例如抗真菌剂像两性霉素B或氟胞嘧啶或一种毒素，如篦麻毒素，或一种酶。本发明可扩展到这类经标记的抗体或抗体共轭物。
本发明也提供一种诊断剂的制剂。该制剂是用本发明中的抗体或抗原结合片段来诊断一种或多种真菌感染。该诊断剂可以由试剂盒所提供。该试剂盒可能包括用于诊断一种或多种真菌感染的操作说明。这里所描述的试剂盒也根据本发明而提供。
如果需要，根据本发明可将抗体混合物用于诊断或治疗，如识别一种真菌应激蛋白不同抗原决定簇的两种或以上抗体的混合物，和/或者不同种类抗体的混合物，如识别本发明中相同或不同的抗原决定簇的IgG和IgM的混合物。
这里所讨论的每一条参考文献的内容，包括它所引用的文献，以参考文献的全部进行引用。
本发明将进一步从以下的描述中得到明确，描述仅通过实施例来显示本发明中的组合物和其实验的特定的实施方案。

具体实施例方式 实验 以下所描述的实验研究了抗体与抗真菌剂如两性霉素B或氟康唑联合使用的抗真菌效果，其中所述抗体是抗来源于白色念珠菌的hsp90抗原的抗体。结果显示，在一些情况下，与单独应用一种化合物本身相比较，抗体和抗真菌剂的联合应用使抗真菌的效果得到增强。实验证实，两性霉素B与抗白色念珠菌hsp90的抗体联合应用，对于多种常见的难以解决的真菌病原体具有非常令人吃惊的强协同效果。这种协同效果对于临床上治疗真菌感染具有非常重要的意义。一项涉及四名念珠菌感染患者的临床初步试验证实了本发明对于人类的有效性。
材料和方法 菌株 实验采用一种非曲霉菌的酵母菌株(表1)，将菌株涂布于萨布罗氏(Sabouraud’s)葡聚糖琼脂(Oxoid，Basingstoke，英国)中并在37℃培养24小时。菌株用API 20C系统(BioMerieux，MarcyL’Etoile，法国)进行鉴定。如果需要，可用在玉米粉琼脂(Oxoid)上的形态学显微检测对鉴定进行证实。
将曲霉菌所有种(表1)的分离物在萨布罗氏葡聚糖琼脂(Oxoid，Basingstoke，英国)于35℃培养24小时。
接种物 对于非曲霉菌，其悬液的制备是将单个菌落(直径≥1毫米)悬于5毫升消毒过的0.85％生理盐水中形成1×104细胞/毫升的浓度，通过用血球计数器计数栅进行计数而获得。对于曲霉菌，见下文。
抗真菌剂 两性霉素B作为一种冻干粉剂购于Sigma公司(Poole，Dorset)，并用于静脉注射(Fungizone)。氟康唑以静脉注射用的溶剂形式(Diflucan)由Pfizer公司提供。两性霉素B以1.2mg/ml的浓度溶于二甲基亚砜，氟康唑也以1.2mg/ml的浓度溶于0.85％生理盐水。贮存液保存于-70℃至使用。临床研究中所使用的Abelcet(脂质体两性霉素B)由Bristol-Meyers Squid(美国)生产，并根据生产者的说明书进行配制。
抗体 对于英国专利2240979和EP专利0406029所揭示的一种针对白色念珠菌hsp90抗原决定簇的特异性抗体的以前的DNA序列，通过密码子优化进行遗传改造，用于在大肠杆菌(Operon Technologies Inc公司，Alameda，CA，美国)中进行表达，并插入到大肠杆菌表达载体中。本发明中抗hsp90抗体的氨基酸序列包含SEQ ID NO2所示序列(包括重链、轻链和间隔区结构域)。本发明的抗体可识别含SEQ ID NO1所示序列的抗原决定簇。
抗hsp90抗体在大肠杆菌宿主中表达，然后用亲和层析和咪唑交换柱进行纯化，纯度高达95％。应用了标准分子生物学方法(参考，例如，Harlow和Lane，supra；Sambrook J.等人，1989，MolecularCloningA Laboratory Mannual(分子克隆实验室手册)，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Sambrook J.和Russell D.，2001，Molecular CloningA Laboratory Mannual(分子克隆实验室手册)，第三版，冷泉港实验室出版社，冷泉港)。
Mycograb(RTM)配制品的制备如下将小瓶中装有的10毫克纯抗hsp90抗体，150毫克药学级(Ph Eur)尿素和174毫克L-精氨酸(PhEur)，重新溶于5毫升水中。
分析培养液 RPMI肉汤的制备是在每升RPMI1640肉汤培养液(Sigma R7880)中添加0.3克谷氨酰胺，然后用34.6克/每升吗啉基丙磺酸(MOPS)进行缓冲，调ph至7.0。
肉汤微量稀释实验 两种贮存液用RPMI肉汤进行两倍稀释(将两性霉素B从40稀释至0.024毫克/毫升，将氟康唑从400至0.4毫克/毫升)。将100微升经1∶10稀释的接种物悬液(相当于1×103菌落形成单位)加入到微量滴定板中。然后在其中加入50微升抗真菌剂和50微升抗体。抗体可以为原液(0.4毫克/毫升)或1/10或1/100稀释液。无抗体存在时，用RPMI补足50微升体积。每孔的总体积为200微升。实验中抗体的终浓度为100微克/毫升(原液)，10微克/毫升(1/10抗体)，或1微克/毫升(1/100抗体)。
滴定板在37℃培养过夜，最低抑制浓度(MIC)定义为抑制生长的最低浓度。
对有肉眼可见的酵母生长减少的培养孔进行菌落计数。结果表示为每毫升肉汤的菌落形成单位(cfu/ml)。
曲霉菌研究 烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉的分离物由RPMI1640培养液制备。接种物悬液的终浓度为每毫升1×104分生孢子，然后分别以100微升/孔加入到平底微量滴定板。对两性霉素B进行系列双倍稀释(浓度范围为250微克/毫升至0.75微克/毫升)并加入到相应的滴定孔中。将Mycograb加入到每孔中，使其在配制缓冲液中的终浓度为100微克/毫升。每种分离物的系列对照只含配制缓冲液。然后将测定板在35℃/200rpm孵育48小时，每种分离物的最低抑制浓度(MIC)值以有无菌生长的滴定孔来决定。
动物协同性 30只CD1小鼠(每只体重约25克)用100微升爆发型白色念珠菌菌种注射接种(相当于1.5×107cfc)，2小时后将小鼠分为三组并注射 (A)第一组100微升10毫摩尔醋酸铵溶液(AAT，pH 9)，然后是100微升以5％(w/v)葡萄糖溶液配制的两性霉素B，相当于0.6毫克/千克； (B)第二组100微升含500微克抗hsp90抗体的10毫摩尔醋酸铵溶液(pH9)，然后是100微升以5％(w/v)葡萄糖溶液配制的两性霉素B，相当于0.6毫克/千克； (C)第三组100微升含50微克抗hsp90抗体的10毫摩尔醋酸铵溶液(pH9)，然后是100微升以5％(w/v)葡萄糖溶液配制的两性霉素B，相当于0.6毫克/千克。
48小时后将动物挑出而杀掉，并在萨布罗氏板上进行肝、脾以及肾组织的酵母计数。
临床研究 在英国曼切斯特的曼切斯特健康护理中心和Wythenshawe两家医院进行了抗hsp90抗体(以Mycograb的形式，见上)的开放标记安全性和药物动力学研究，有四名受念珠菌感染的患者参加。对患者进行了念珠菌脓毒症体征检测，包括对多个部位或深创面进行白色念珠菌阳性培养；高温或变温(发热)检测；高脉搏率(心动过速)以及高白细胞计数(WBC)。
继传统的Abelcet(脂质体两性霉素B)和/或氟康唑治疗后，然后再给予患者各种剂量的Mycograb，包括可选择的实验剂量(0.1毫克/公斤)和治疗剂量1毫克/公斤。对患者进行临床和实验室感染体征监测(监测的实验室参数包括血液化学、血液学和凝血因子)，并对患者血清及尿中的Mycograb水平进行了检测。
结果 体外实验检测联合应用抗白色念珠菌hsp90抗体(抗体)和抗真菌剂的效果以表2到表18表示。动物实验结果用表19表示。
体外实验 含抗体和氟康唑的组合物 表2显示氟康唑抗所检测的真菌病原体的最低抑制浓度(MIC)，其中存在或不存在不同稀释度的抗hsp90抗体，MIC用肉汤微量稀释实验进行评价。在抗体以原液或10倍稀释液存在时，爆发型白色念珠菌菌株的最低抑制浓度(MIC)降低了4倍(1.56微克/毫升至0.39微克/毫升氟康唑)，而100倍稀释的抗体使氟康唑的最低抑制浓度(MIC)降低了2倍。
在抗体以原液存在时，观察到对氟康唑耐药的白色念珠菌株和克柔念珠菌的氟康唑最低抑制浓度(MIC)有轻微的降低。而当抗体以1∶10或1∶100稀释后，与不含抗体进行比较，发现对这些菌株的氟康唑最低抑制浓度(MIC)无影响。
对剩余的菌株如热带念珠菌、近平滑念珠菌和光滑球拟酵母，抗白色念珠菌hsp90抗体对氟康唑最低抑制浓度(MIC)无可识别的影响。
对每一种真菌菌株在不同的氟康唑浓度、不同抗白色念珠菌hsp90抗体稀释度条件下，进一步的存活细胞菌落数的定量实验表示于表2中。
在所检测的不同的氟康唑浓度中，白色念珠菌(爆发型)的存活率在加入抗体原液或1∶100稀释液时没有减少(表3)。
对于氟康唑耐药性的白色念珠菌菌株，在氟康唑浓度为12.5微克/毫升、抗体以原液存在时，观察到菌落存活减少2倍(表4)。在抗体以原液存在、而氟康唑为低浓度时，该相同菌株的存活率有少量降低，而抗体为1∶100的稀释度时，无可见的影响。
在所检测的氟康唑浓度范围内抗体原液或稀释液对克柔念珠菌无明显的抗真菌效果(表5)。
无论抗体存在与否，每种检测的氟康唑浓度对热带念珠菌的存活率无显著的影响(表6)。
表7显示抗体的存在与否在每种检测的氟康唑浓度中，对光滑球拟酵母的菌落存活率无影响。
表8表明抗体的存在与否在不同的氟康唑检测浓度中，对近平滑念珠菌的菌落存活率无显著的影响。
抗体和两性霉素B的组合物 表9显示在无抗体或抗白色念珠菌hsp90抗体以不同稀释度存在时，两性霉素B对所检测真菌病原体的最低抑制浓度(MIC)，检测方法为肉汤微量稀释法。
与氟康唑的结果相比(见前面的表2-8)，这里检测的所有菌株在培养的肉汤中加入未稀释的抗体时，两性霉素B的最低抑制浓度(MIC)至少降低4倍(表9)。另外，在所有检测的菌株中，即使在培养的肉汤中加入100倍稀释的抗体时，两性霉素B的最低抑制浓度(MIC)至少降低2倍(抗体的终浓度为1微克/毫升)。
含抗体和两性霉素B的组合物在降低两性霉素B的最低抑制浓度(MIC)时，观察到的最显著效果是对氟康唑耐药的白色念珠菌菌株。抗体原液使两性霉素B的最低抑制浓度(MIC)降低10倍，即使是100 倍稀释的抗体，也使两性霉素B的最低抑制浓度(MIC)降低了大约25％(表9)。
在不同的两性霉素浓度和不同的抗白色念珠菌hsp90抗体稀释度条件下，对每一种真菌菌株所进行的细胞存活菌落数定量的详细实验结果表示于表9中。
表10显示爆发型白色念珠菌菌株在有或无抗体的情况下，加入两性霉素B进行培养时的存活率。在检测的所有两性霉素浓度中，抗体显著降低了菌落的存活数(至少10倍)。例如，在两性霉素B的浓度为0.078微克/毫升时，与无抗体时菌株的存活率进行比较，抗体为100倍稀释液时，白色念珠菌(爆发型)的存活率为0.2％。两性霉素B的浓度为0.078微克/毫升，稀释度为100的抗体的抑制效果相当于该菌株在0.156微克/毫升的两性霉素B(无抗体)中的存活率。因此，即使相当低浓度的抗体，也可降低使该菌株达到特有的死亡率所需的两性霉素B的量。
表11显示在不同两性霉素B浓度和不同抗体稀释度情况下，白色念珠菌(氟康唑耐药菌株)的菌落存活率。在抗真菌剂为低浓度时，抗体或两性霉素B无明显的效果。然而，当两性霉素B的水平接近抗真菌剂的最低抑制剂量时(见上面的表9)，抗体对菌落存活有显著影响。例如，在两性霉素B的浓度为0.078微克/毫升时，与无抗体时菌株的存活率进行比较，抗体在100倍稀释时，该菌株的存活率为0.1％。
在有两性霉素B和不同浓度的抗体时，克柔念珠菌的菌落存活率 显示于表12。在所检测的高浓度两性霉素B条件下，发现抗体对该菌株非常有效。即使在100倍稀释度，当两性霉素B的浓度为0.312微克/毫升时，可检测的克柔念珠菌的菌落数量与无抗体时相比为0.01％。
对于检测的两性霉素B的所有浓度(范围为0.019-0.156微克/毫升)，观察到抗体可降低热带念珠菌株的菌落存活率(表13)。这种效果在高浓度抗体和高浓度两性霉素B时得到增强。
表14表示在各种浓度的两性霉素B和抗体存在时光滑球拟酵母的存活率。在检测的所有两性霉素B的浓度，观察到抗体对光滑球拟酵母的生长具显著的抑制效果。例如，当两性霉素B的浓度为0.009微克/毫升时，抗体稀释100倍对该菌株生长的抑制率为99.2％，两性霉素B的浓度为0.019微克/毫升时为99.99％，两性霉素B的浓度为0.039微克/毫升时为99.91％。
在不同水平的抗体和两性霉素B条件下，真菌近平滑念珠菌的存活率表示于表15。对所检测的所有浓度的两性霉素B，观察到抗体原液均降低了该菌株的存活率。当抗体为低浓度时，效果低于所检测的其它菌株。
含抗体但不含抗真菌剂的组合物 在一个进一步的实验中，检测了不同浓度抗白色念珠菌hsp90抗体(无抗真菌剂)对不同真菌菌株(如上面表2-15所使用的)的影响。表16所示的结果表明对所测的多数菌株，抗体本身对这些菌株的存活无影响。然而，对于菌株光滑球拟酵母，热带念珠菌和近平滑念珠菌，观察到抗体自身可降低它们的部分存活率。
所有曲霉菌实验 烟曲霉对两性霉素B的最低抑制浓度(MIC)是2.5μg/ml。加入Mycograb以后，MIC变为0.125μg/ml(降低2倍)。黄曲霉对两性霉素B的最低抑制浓度(MIC)是2.5μg/ml。加入100μg/ml Mycograb以后，MIC变为0.125μg/ml(降低2倍)。黑曲霉对两性霉素B的最低抑制浓度(MIC)是2.5μg/ml。加入100μg/ml Mycograb以后，MIC变为0.125μg/ml(降低2倍)。
体外实验结果小结 表2-16的结果显示，抗白色念珠菌hsp90抗体自身可抑制某些真菌的生长，当抗体和两性霉素B联合应用时，观察到对所有检测菌株均具令人惊奇的极高抗真菌活性。抗体与两性霉素B之间的这种令人惊奇的作用在其它被检测的抗真菌剂中未发现；氟康唑与抗体的联合应用不产生明显的和可能有用的结果。
采用对MIC有4倍差异的截止标准，表2的数据显示，氟康唑与抗体原液(终浓度100μg/ml)或抗体的10倍稀释液(终浓度10μg/ml)联合使用时，仅对爆发型白色念珠菌有效。然而当应用同样的标准，从表9可以看出，当两性霉素B与抗体原液或10倍稀释液联合使用时，对检测的所有菌株均有效。因此可得出结论，当用MIC上的改进来衡量时，两性霉素B与抗白色念珠菌hsp90抗体之间存在很强的协同作用。
对于用不同抗真菌剂和抗体处理的定量真菌菌落的实验(见以上的表3-8和10-15)，可以引用另一种不同的截止标准来检测联合治疗的可能有效性，这种标准定义为存活菌落下降2个对数级(100倍)。
氟康唑与抗白色念珠菌hsp90抗体联合治疗效果的总结表示于表17。这里，显示了能起所需作用的最低氟康唑浓度(或实验中采用的最高浓度)，并由截止标准提示，真菌的存活率可至少降低100倍。结果显示，当联合应用氟康唑和抗体原液时，只有对白色念珠菌氟康唑耐药菌株可产生明显的效果。
两性霉素B与抗白色念珠菌hsp90抗体联合治疗效果的总结表示于表1 8。可看出，抗体原液针对所有检测菌株满足截止标准(真菌菌落生长降低100倍)，10倍稀释的抗体对(爆发型和氟康唑耐药型)白色念珠菌菌株、克柔念珠菌和光滑球拟酵母以及100倍稀释的抗体对(爆发型)白色念珠菌菌株和光滑球拟酵母满足截止标准。
值得注意的是，观察到两性霉素B与抗体之间的协同效应不仅针对氟康唑敏感型白色念珠菌菌株，而且也针对氟康唑耐药型白色念珠菌菌株和酵母菌如克柔念珠菌和光滑球拟酵母，这些菌株本身对氟康唑具有耐药性。
所有曲霉菌实验结果显示，两性霉素B与Mycograb之间对最常见的曲霉菌具有协同效应。
(2)动物实验 以爆发型白色念珠菌菌株感染的小鼠分为三组，只用两性霉素B处理(第一组)，用两性霉素B和500微克抗hsp90抗体处理(第二组)和用两性霉素B和50微克抗hsp90抗体处理(第三组)。治疗48小时后对小鼠各种组织的酵母菌落计数结果列于表19。结果显示，与只用两性霉素B处理(第一组)的动物相比，以两性霉素B和500微克抗体(第二组)处理的动物酵母数量显著减少(至少一个数量级)。用两性霉素B和50微克抗体处理(第三组)的动物与只用两性霉素B处理(第一组)的动物相比，酵母计数也减少。因此，体内实验数据验证了体外实验数据，证实抗hsp90抗体与抗真菌剂两性霉素B之间在治疗真菌感染时具协同效应。
(3)临床研究 对4位有念珠菌感染且对传统的抗真菌治疗无应答的患者，给予抗真菌剂和以Mycograb形式的抗hsp90抗体(见上文)联合治疗，并对他们的病情进行监测。
患者1最初被诊断为急性胰腺炎，并患有术后成人呼吸窘迫综合征(ARDS)，需换气。病人多部位包括胰腺床白色念珠菌体外培养阳性。该患者白细胞计数(WBC)非常高(78.4)，尽管这个计数变化很大，可能不仅是单独由脓毒症所引起。最初采用3mg/kg的Abelcet进行治疗。
Abelcet治疗开始5天后，另外给予患者1第一剂0.1mg/kg检测剂量的Mycograb(第1天)。第3天，给予该患者1mg/kg临床剂量的Mycograb。由于多种原因，如至少4天的低血小板计数，给予临床剂量的Mycograb之后，在第3天病人的Abelcet和Mycograb治疗中断。然而，6天后(第9天)患者1腹水中又有白色念珠菌生长，给予氟康唑治疗(400mg)。随后一天(第10天)，给予患者最后两剂临床剂量的Mycograb，每剂剂量为1mg/kg。
尽管患者1的Abelcet治疗进行了7天，在该患者从第3天开始接受临床剂量Mycograb治疗前，病人的气管造口部位仍有白色念珠菌生长，且病人心动过速。第3天给予的Abelcet和Mycograb联合治疗导致随后5天内无白色念珠菌生长。在Mycograb治疗期间，没有观察到与Mycograb有关的血液化学、血液学和凝血因子的改变。对随后的复发使用氟康唑和Mycograb的联合治疗(第10天两剂)与体外实验的协同结果(例如，见表2和17)的期望值比较，不太成功，但最终该患者确实从念珠菌病康复。
在给予Mycograb治疗后，患者1在不同时间间隔的血清Mycograb水平列于表20。第1天给予的检测剂量没有达到血清检测水平。第3天和第10天给予的1mg/kg的剂量达到血清检测水平，这些检测结果与体外实验中与两性霉素B的协同作用具可比性(见表9和表18)。在第10天给予第二剂后，血清Mycograb水平提高，提示第一剂后Mycograb在某些组织中有累集。1.0mg/kg剂量的Mycograb在尿中可检测到(数据未显示)。
患者2被诊断患由于粘连引起的小肠狭窄，并患有成人呼吸窘迫综合征，需换气。病人多部位包括腹水有白色念珠菌生长，并有与感染相关的波动性体温(35.8-38.2℃)、升高的白细胞计数(11.4)和偶发的心动过速(110)。患者最初采用3mg/kg的Abelcet治疗。
Abelcet治疗开始后4天，患者2仍有波动性体温潴留、升高的白细胞计数和偶发的心动过速。给予患者0.1mg/kg检测剂量的Mycograb(第1天)。随后一天，给予该患者1mg/kg临床剂量的Mycograb(第2天)。为完成一个5天的疗程，第2天又给予患者最后一剂Abelcet。2天后(第4天)，患者接受了最后2剂临床剂量的Mycograb。
患者对Mycograb有很好的耐受性。第2天给予的临床剂量的Mycograb使体温下降并趋于稳定(第2天接受临床剂量的Mycograb后为38.2-36.7℃，一直到第3天维持在36.7-37.4℃)，而且白细胞计数下降(从11.9下降到9.6)。第4天，患者临床表现好转，而且腹水、血培养物或尿中无白色念珠菌生长。治疗期间，无与Mycograb相关的血液化学、血液学和凝血因子改变。后续的恢复并发了细胞脓毒症，但这种脓毒症对抗生素应答，患者完全康复。
在给予Mycograb治疗后，患者2在不同时间间隔的血清Mycograb浓度列于表21。第1天给予的检测剂量没有达到血清检测水平。第2天给予的1.0mg/kg的剂量确实达到血清检测水平，这些检测结果与体外实验中与两性霉素B的协同作用具可比性(见表9和表18)。1.0mg/kg剂量的Mycograb在尿中可检测到(数据未显示)。
患者3有6个星期的胰腺炎病史并导致80％的胰腺切除。患者有中度的肝功能水平(LFT)增高，可能与酗酒有关，而且是耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(MRSA)的携带者。患者多部位有白色念珠菌生长，因此给予静脉氟康唑治疗。12天后，失去对氟康唑的应答，患者改为300mg的Abelcet治疗。3天后，患者仍发热(38.5℃)，而且多部位仍有白色念珠菌生长(腹部引流管和胃镜检测管)，因此在Abelcet的基础上给予临床剂量的Mycograb(1mg/kg)治疗(第1天)。
在给予Mycograb剂量的同一天，患者3急性革兰氏阴性型脓毒症休克发作(体温高达39.5℃，低血压性)，这可能由于铜绿假单胞菌感染所引起，在患者的胰液中发现该菌生长，虽然在患者的血培养中也有粪肠球菌生长。由于这次发病，没有进一步给予Mycograb治疗。患者后来对抗生素治疗有反应(万古霉素和头孢他啶)。
由于细菌性并发症，很难对患者3进行单剂量Mycograb作用的评估。尽管如此，注意到给予Mycograb 48小时后该患者白色念珠菌生长中止(例如，从他的胃镜检测管和创面引流液中)，而且在第2和第3天没有发热。没有观察到与Mycograb相关的实验室参数的改变(血液化学、血液学和凝血因子)。第4天，患者在仍进行Abelcet治疗时复发白色念珠菌，但后来完全康复。
在给予Mycograb治疗后，患者3在不同时间点的血清Mycograb浓度列于表22。第1天的1.0mg/kg单剂量给出了血清检测水平，这些检测结果与体外实验中与两性霉素B的协同作用具可比性(见表9和表18)。1.0mg/kg剂量的Mycograb在尿中可检测到(数据未显示)。
患者4被诊断为白色念珠菌脓胸，尽管该患者最初由于米氏链球菌(从血培养中分离出来)引起的肺脓肿收入重症治疗室(ITU)。患者两处支气管灌洗标本(右和左肺)有白色念珠菌生长。3天和4天后两处脓胸液标本中也有白色念珠菌生长。随后一天开始Abelcet治疗(5mg/kg)。Abelcet治疗开始5天后，注意到一些临床恶化，接下来的早晨(第1天)出现了白细胞计数高(15.7)和肋间引流液中白色念珠菌的再生长。
患者4在第1天早晨8点半和晚上8点半分别给予Mycograb(1mg/kg体重)。除了在第1天晚上有暂时的体温升高以外，患者的临床症状得到改善。第3天的脓胸液样品培养没有白色念珠菌生长，患者日益好转。
患者4对Mycograb有很好的耐受性。没有观察到与Mycograb相关的实验室参数的改变(血液化学、血液学和凝血因子)。因此，尽管患者开始Abelcet治疗后6天在胸积液中仍有白色念珠菌生长，而且就在接受第一剂Mycograb之前其白细胞计数很高(15.7)，但随后患者渐趋稳定而且停止了白色念珠菌的生长。
在给予Mycograb治疗后，患者4在不同时间点的血清Mycograb浓度列于表23。第1天给予的1.0mg/kg剂量达到了血清检测水平，这些检测结果与体外实验中与两性霉素B的协同作用具可比性(见表9和表18)。在第一天的第二次剂量之后，血清中Mycograb的浓度升高，表明在第一次剂量之后，某些组织发生积累。1.0mg/kg剂量的Mycograb在尿中可检测到(数据未显示)。
结论 这里呈现的数据明显证实，在抗白色念珠菌hsp90抗体与抗真菌剂两性霉素B之间存在惊人的协同作用，这种作用增强了对大量病理学的重要真菌菌株的抗真菌活性。这些结果允许将新的、高效的组合物以及一种可组合到该组合物中的新的抗体应用于人和动物体真菌感染的治疗。本发明允许使用低剂量或使原剂量发挥更好的效果，因此可降低非必需的副作用。
本发明的临床意义包括(i)两性霉素B和抗hsp90抗体联合后协同作用应当成为治疗传播性酵母感染的特别好的治疗方法。这将导致这些感染所致的死亡率和发病率的降低。这里提供的临床初步试验结果证实了与已存在的治疗方法比较，本发明所具的效力；(ii)两性霉素B是一种有毒性、特别是肾毒性的药物。本发明所提供的协同作用意味着可应用低剂量的两性霉素B而保持其效果并伴随毒性的降低；而且(iii)抗hsp90抗体的减毒效果允许临床上探索使用高剂量的两性霉素B，并进一步有助于取得更好的临床效果。
序列表
<110>神经技术制药有限公司
<120>β葡聚糖合酶抑制剂与抗HSP90抗体联合治疗真菌感染
<130>N00/0101/PCT
<140>
<141>
<160>2
<170>PatentIn Vet.2.1
<210>1
<211>9
<212>PRT
<213>念珠菌
<400>1
Leu Lys Val Ile Arg Lys Asn Ile Val
1 5
<210>2
<211>248
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述合成的
<400>2
His Met Ala Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
1 5 10 15
Pro Gly Glu Set Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Cys Ile Ile
20 25 30
Ser Ser Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Met Gly Lys Ile Asp Pro Gly Asp Ser Tyr Ile Asn Tyr Ser
50 55 60
Pro Ser Phe Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ash
65 70 75 80
Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Arg Asp Phe Gly Asp Set Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Set Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Set Phe Leu Ser Ala Phe Val Gly Asp Arg Ile Thr Ile Thr
145 150 155 160
Cys Arg Ala Ser Ser Gly Ile Ser Arg Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Ala Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu
180 185 190
Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu
195 200 205
Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
210 215 220
Tyr Cys Gln His Leu Asn Set Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr
225 230 235 240
Lys Val Asp Ile Lys Arg Ala Ala
24权利要求
1.一种对针对包含SEQ ID NO1所述序列的抗原决定簇特异的抗体或其抗原结合片段。
2.一种含SEQ ID NO2所述序列的抗体。
3.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段或如权利要求2所述的抗体，其中所述抗体或抗原结合片段是用可检测标记进行标记的。
4.如权利要求1或3中任一项所述的抗体或抗原结合片段，或如权利要求2或3中任一项所述的抗体，其中所述的抗体或抗原结合片段是与一种效应分子共轭结合的。
5.如权利要求1、3或4中任一项所述的抗体或抗原结合片段或如权利要求2至4中任一项所述的抗体在制备用于诊断一种或多种真菌感染的诊断剂中的用途。
6.如权利要求5所述的用途，其中所述的诊断剂是由试剂盒提供的。
7.如权利要求6所述的用途，其中所述的试剂盒包括用于诊断一种或多种真菌感染的使用说明。
8.一种由权利要求6或7中的任一项所描述的诊断试剂盒。
9.一种组合物，其中包括权利要求1或2的抗体或其抗原结合片段、一种包含至少一种选自多烯抗真菌剂和棘白菌素抗真菌剂的抗真菌剂。
10.一种组合制剂，该制剂包含权利要求1或2的抗体或其抗原结合片段、一种包含至少一种选自多烯抗真菌剂和棘白菌素抗真菌剂的抗真菌剂，其在治疗真菌感染时同时、分别或相继使用。
11.如权利要求9的组合物，或权利要求10的组合制剂，其中所述的多烯抗真菌剂包含两性霉素B或两性霉素B的衍生物。
12.如权利要求9的组合物，或权利要求10的组合制剂，其中所述的棘白菌素抗真菌剂包含LY303366。
13.如权利要求9、11或12任一项的组合物在治疗真菌感染中的应用。
14.如权利要求13的组合物，或权利要求10-12任一项的组合制剂，其中所述的真菌感染是由于念珠菌属、隐球菌属、组织胞浆菌属、曲霉菌属、球拟酵母菌、毛霉菌、芽生菌、球孢子菌或副球孢子菌所引起。
15.如权利要求13或14的组合物，或权利要求10-12、或14任一项的组合制剂，其中所述的真菌感染是对所述抗真菌剂本身耐药的。
16.如权利要求9-15任一项的组合物，或权利要求10-12、14或15任一项的组合制剂在治疗人或动物体真菌感染的方法中的应用。
17.一种生产用于治疗人或动物体真菌感染的药物的方法，其特征为使用权利要求9-16任一项的组合物或权利要求10-12或14或16任一项的组合制剂。
全文摘要
本发明涉及新的作为有效抗真菌剂的组合物及制剂，以及一种可组合到所述组合物及制剂中的新的抗体。
文档编号A61K31/70GK101095952SQ20071011266
公开日2008年1月2日 申请日期2001年3月20日 优先权日2000年4月6日
发明者J·P·伯尼 申请人:神经技术制药有限公司