专利名称：一种栀子苷标准物质及其类似物的制备方法
技术领域：
本发明属医药技术领域，具体涉及一种从中药栀子中分离制备栀子苷标准物 质及其类似物的方法、栀子苷标准物质及其类似物的质量评价方法。
技术背景栀子为常用中药，来源于茜草科栀子Gardenia jasminoide Ellis.的干燥成熟果 实。传统中医药理论认为栀子具有泻火除烦，清热利尿，凉血解毒的功效，主 治热病心烦、黄疸尿赤、血淋涩痛、血热吐衄、目赤肿痛、火毒疮疡、扭挫伤 痛等症，现代药理研究表明栀子具有解热、镇静、抗炎、抗微生物等多种功效， 临床广泛应用于治疗热病高热、急性黄疸性肝炎、急性胰腺炎、动脉粥样硬化 及血栓、贝切特氏综合症等症。栀子中主要含有环烯醚萜苷类等成分，药理研 究表明环烯醚萜苷类成分为其主要活性成分。迄今，未见涉及栀子苷标准物质 制备及其质量评价方法的专利报道。 发明内容本发明的目的在于提供一种栀子苷标准物质的制备方法。 本发明的另一个目的在于提供一种栀子苷类似物的制备方法。 本发明的再一个目的在于提供一种栀子苷标准物质的质量评价方法。 本发明的再一个目的在于提供一种栀子苷类似物的含量测定方法。 本发明所述原料栀子，来源于茜草科植物栀子的干燥成熟果实。本发明所述的栀子苷标准物质系从中药栀子中提取分离得到，其结构如下
本发明所述的栀子苷标准物质为白色粉末，分子式为C17H2401Q，分子量为 388.36 ，熔点163 164。C。 ESI國MSm/z: 411[M+Na]+。 1HNMR (500MHz, DMSO-d6) 5: 7.48(1H， s， H-3)， 5.69(1H， brs， H画7)， 5.12(1H， d， J=7， H-l)， 3.65(3H, s， COOCH3); 13CNMR (125MHz, DMSO-d6) 5: 96.2(C-1)， 152.1(C-3), 111.4(C-4)， 34.9(C-5), 38.4(C-6)， 125.9(C-7)， 144.6 (C-8)， 46.3(C國9)， 59.8(C-10)， 167.4(C-11)， 51.5(COOCH3)， 99.1(C-l')， 73.8 (C-2')， 77.7(C-3')， 70.4(C-4')， 77.1(C誦5')， 61.4(C-6')。本发明所述的栀子苷标准物质，HPLC法或DSC法测定其纯度为98 100 % (w/w)。本发明所述的栀子苷类似物，是指从茜草科植物栀子的干燥成熟果实提取 得到的，包含多种环烯醚萜苷类活性成分的组合物。这些环烯醚萜苷类成分主 要包括栀子苷、异栀子苷、去羟基栀子苷(京尼平苷)、京尼平龙胆二糖苷、山 栀子苷、栀子酮苷、鸡屎藤次苷甲酯、脱乙酰车叶草苷甲酯、京尼平苷酸、10-O-乙酰京尼平糖苷、6-对香豆酰京尼平龙胆双糖苷等。作为栀子苷类似物，其中各种环烯醚萜苷类成分百分含量的总和为5 100 %(w/w)，其中优选的为50 100% (w/w)。在本发明所述的栀子苷类似物所涵盖的各种环烯醚萜苷类活性成分之中， 最主要的是栀子苷，其含量占全部环烯醚萜苷含量的5 100% (w/w)。本发明还提出了所述栀子苷准物质及其类似物的制备工艺，它可以采用以 下任意一种方法，或这些方法的任意组合进行制备(l)溶剂提取法；(2)溶剂 萃取法；(3)大孔吸附树脂法；(4)超临界流体萃取法；(5)柱色谱法；(6)液 -液逆流分配色谱法。其中优选的方法为大孔吸附树脂法。在使用这些方法进行制备时， 一般包括以下几个步骤(1)提取所用溶剂可以是水或任意一种醇类、酮类及酯类溶剂，或这些 溶剂按一定比例组成的混合溶剂，或由这些溶剂与酸、碱、盐配成的酸性或碱 性溶剂。提取方法可以是煎煮、加热回流、超声提取、冷浸、渗漉、微波提取、 高压提取等。优选的提取工艺为栀子药材加30 90%乙醇，回流提取2 3次，每次提取l (2) 过滤包括离心、抽滤、超滤、压滤等方法，使用或不使用以下任意 一种澄清剂或其组合醇沉剂，明胶，高岭土，各种树脂，聚乙二醇，聚乙三 醇，壳聚糖以及天然澄清剂成品如101果汁澄清剂、ZTC+1天然澄清剂等。(3) 浓縮包括常压或减压条件下的薄膜蒸发、旋转蒸发及煎煮浓縮等。(4) 千燥包括真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等。 当采用溶剂萃取法进行制备时， 一般先将提取物混悬于水中，然后用低极性的酯类、烷烃类或醚类溶剂(如石油醚、乙醚、己垸、汽油、乙酸乙酯等)萃 取除去脂溶性杂质，然后用合适极性的溶剂，如氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁 醇等，或是这些溶剂的混合物，萃取获得其中的总环烯醚萜苷成分，得到栀子 苷及其类似物。当采用大孔吸附树脂法进行制备时，所用的大孔树脂可以是非极性、弱极性、中等极性、弱碱性或弱酸性等任意一种类型，如D101、 D4020、 HPD400、 AB-8、 S-8、 HZ-806等，其中优选的为弱极性或中等极性的树脂，如AB-8、 HPD400、 D101等。所用的洗脱剂为水和含水的乙醇、甲醇、丙酮等，其中优选的为0 100%的乙醇。优选的栀子苷及其类似物树脂纯化工艺为选用AB-8、 HPD400等中等极性或弱 极性大孔吸附树脂作为纯化用树脂，栀子乙醇提取物上样液浓度2 4mg/mL (以环 烯醚萜苷量计)，吸附流速3 9BV/h，树脂柱径高比1: 5 1:10，上样量为5 10mg/mL (以环烯醚萜苷量计)，0 20%乙醇洗脱1 4倍柳旨体积进行除杂，除杂流速为3 8BV/h,用20 90%乙醇洗脱3 6倍树脂体积，洗脱流速为5 9 BV/h。当采用超临界流体萃取法进行制备时，可以对栀子原材料直接进行萃取，也 可以对上述任一方法和步骤所获得的产物进行萃取。萃取时可以使用或不使用 以下任一种类溶剂及溶剂混合物水、醇类、酮类及酯类溶剂。当采用柱色谱法进行制备时，其处理的对象可以是上述提取步骤所获得的产 物，也可以是经上述溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、超临界流体 萃取法初步纯化后的产物。所用的固定相可以是硅胶、聚酰胺、氧化铝、葡聚 糖(S印hadex系列或S印hadex LH-20系列)、C-8、 C_18、活性炭、纤维素等， 所用的洗脱液因固定相的不同而不同， 一般是由水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、 乙酸乙酯、石油醚等组成的混合溶剂。
当采用液-液逆流萃取法进行制备时，其处理的对象可以是上述提取步骤的 产物，也可以是经上述溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、超临界流 体萃取法初步纯化后的产物。 一般先将提取物混悬于水中，然后用低极性的酯 类、垸烃类或醚类溶剂(如石油醚、乙醚、己烷、汽油、乙酸乙酯等)萃取除 去脂溶性杂质，然后用合适极性的溶剂，如氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等， 或是这些溶剂的混合物，萃取获得其中的总环烯醚萜苷成分，得到栀子苷及其 类似物。该提取物可以单独或与其它任何中西药物或食物按任意比例配伍，用于制备药物 或功能性食品，所制得的药物或功能性食品可以是胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口 服液、糖浆、冲剂、酒剂、注射剂、膏剂、散剂、饮料等。本发明质量评价方法可包括以下含量测定方法中的一种或四种1.总环烯醚萜苷精密称取栀子苷对照品适量(约4mg)，置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释 至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密吸取栀子苷对照品溶液O.O、 0.3、 0.6、 0.9、 1.2、 1.5mL置刻度试管中，蒸干，残渣加5%香草醛冰醋酸溶液0.2mL， 高氯酸0.8mL，混匀，于60'C水浴中加热15分钟，取出，迅速用冷水冷却，加 入冰醋酸5mL，混匀，放置30min，于530nm处测定吸光度。以栀子苷对照品 浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。精密称取栀子苷及其类似物样品各3份，每份25mg，置25mL量瓶中，加 30%乙醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述样品溶液2mL，栀子 苷对照品溶液0.5mL、 lmL，置刻度试管中，水浴加热蒸干，残渣加5%香草醛 冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，混匀，于60'C水浴中加热15min，取出，迅 速用冷水冷却，加入冰醋酸5ml，混匀，放置30min，于530mn处测定吸光度。 外标两点法计算总环烯醚萜苷含量。2.栀子苷色谱条件色谱柱YWG-C"柱(250mmx4.6mm， lOpm);流动相乙腈 -水(15:85);流速lmL/min;检测波长238nm;柱温室温。标准曲线绘制分别精密吸取栀子苷对照品溶液(浓度为0.144u g/u L) 3、 6、 9、 12、 15u L注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，以对照品进样量(P g)为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。含量测定精密称取3批栀子苷及其类似物样品各3份，每份约25mg，置 25mL量瓶中，加50%乙醇超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为栀子苷含量测 定的供试品溶液。精密吸取上述供试品溶液10uL，注入液相色谱仪，测定各色 谱峰峰面积，计算栀子苷含量。3. 栀子苷标准物质仪器pyris I型差示量热扫描仪。操作方法升温速率5°C/min;起始平衡温度50°C;终止温度30(TC。 准确称取栀子苷标准物质约4mg(准确至0.01mg)，把样品置于铝制坩埚内，放置时尽量使样品平铺在坩埚的底部，压紧，将死体积减至最小。用冲压模将 坩埚密封，放入量热池内进行实验。测定设置升温程序后，开始测定，记录样品的熔化曲线，利用计算机分析 程序进行数据分析。4. 栀子苷标准物质色谱条件色谱柱YWG曙C!8柱(250mmx4.6mm， 10—;流动相乙月青 曙水(15:85);流速lmL/min;检测波长238nm;柱温室温；检测时间30min。测定结果采用归一化法，计算栀子苷标准物质纯度。
具体实施方式
实施例l:栀子苷及其类似物制备工艺取栀子药材lkg，粉碎，70X乙醇8L回流提取3次，每次提取l小时，减压 回收溶剂，得提取物，加水分散溶解，使水溶液浓度为3. 00mg/mL (以栀子苷量计)， 通过5L AB-8大孔吸附树脂，吸附流速1. OmL/min，树脂柱径高比为1:8，水洗脱5 倍树脂体积进行除杂，10Q%乙醇洗脱2倍树脂体积进行除杂，除杂流速为1. 0 mL/min， 30%乙醇洗脱3倍树脂体积，洗脱流速为2. OmL/min，收集1 3倍树脂体积30%乙 醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为梔子苷及其类似物。测定总环烯醚萜苷含量 为70.26%，其中栀子苷含量为61.42%。 实施例2:栀子苷及其类似物制备工艺取栀子药材2kg，粉碎，50X乙醇15L，回流提取3次，每次提取1.5小时，
回收溶剂，提取物加水分散溶解，使7jC溶液浓度为6.00mg/mL (以栀子苷量计)，通 过6L AB-8大孔吸附树脂，吸附流速l.OmL/min,树脂柱径高比为1: 7，水洗脱4 倍树脂体积进行除杂，10%乙醇洗脱2倍树脂体积进行除杂，除杂流速为1.0 mL/min， 20%乙醇洗脱5倍树脂体积，洗脱流速为3. OmL/min，收集1 5倍树脂体 积20%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为栀子苷及其类似物。测定总环烯醚 萜苷含量为72.35%，其中栀子苷含量为63.37%。 实施例3:栀子苷及其类似物制备工艺取栀子药材5kg，粉碎，70X乙醇10L，回流提取2次，每次提取2小时，回 收溶剂，提取物加水分散溶解，使水溶液浓度为9.00mg/mL (以栀子苷量计)，通过 6L AB-8大孔吸附树脂，吸附流速1. OmL/min,树脂柱径高比为1: 9，水洗脱3倍树 月旨体积进行除杂，除杂流速为1. 0 mL/min， 20%乙醇洗脱6倍树脂体积，洗脱流速 为3.0mL/min，收集2-5倍树脂体积20。％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为 栀子苷及其类似物。测定总环烯醚萜苷含量为75. 35%，其中栀子苷含量为68. 53 %。实施例4:栀子苷标准物质制备工艺取栀子苷类似物20g，加甲醇6倍超声溶解10min，过滤，弃去不溶物，滤 液留用。取上述滤液，减压浓縮至1:1，拌入硅胶H (1:1)，进行硅胶柱层析(干 法装柱，规格5X12cm)分离，氯仿-甲醇-水(8:2:0,2)洗脱，薄层色谱检测， 合并含栀子苷流份。取上述流份减压浓縮蒸干，加甲醇(1:1)溶解，进行葡聚 糖凝胶色谱分离，甲醇洗脱，收集含栀子苷流份，回收甲醇至干，无水乙醇重 结晶。DSC法测定栀子苷纯度为98.34X， HPLC法测定栀子苷纯度为99.72X。实施例5:栀子苷标准物质制备工艺取栀子苷类似物20g，加甲醇8倍超声溶解10min，过滤，弃去不溶物，滤 液留用。取上述滤液，减压浓縮至l:l，拌入硅胶H(1:1)，进行硅胶柱层析(干 法装柱，规格5X12cm)分离，氯仿-甲醇-水(13:3:0.1)洗脱，薄层色谱检测， 合并含栀子苷流份。取上述流份减压浓縮蒸干，加甲醇(1:1.2)溶解，进行葡 聚糖凝胶色谱分离，甲醇洗脱，收集含栀子苷流份，回收甲醇至干，甲醇-乙酸 乙酯重结晶。DSC法测定栀子苷纯度为98. 52%， HPLC法测定栀子苷纯度为99. 81 %。 实施例6:栀子苷标准物质制备工艺取栀子苷类似物20g，加甲醇10倍超声溶解lOmin，过滤，弃去不溶物， 滤液留用。取上述滤液，减压浓縮至l:l，拌入硅胶H (1:1)，进行硅胶柱层析 (干法装柱，规格5X12cm)分离，氯仿-甲醇-水(15:4:0.2)洗脱，薄层色谱 检测，合并含栀子苷流份。取上述流份减压浓縮蒸干，加甲醇(1:1.5)溶解， 进行葡聚糖凝胶色谱分离，甲醇洗脱，收集含栀子苷流份，回收甲醇至干，甲 醇-乙酸乙酯重结晶。DSC法测定栀子苷纯度为98.73X, HPLC法测定栀子苷纯度 为99. 78%。
图l栀子苷uv光谱图2栀子苷工HNMR光谱 图3栀子苷"CNMR谱 图4栀子苷DEPT谱 图5栀子苷ESI-MS谱
权利要求
1、一种栀子苷标准物质，其特征在于该标准物质由中药栀子中提取获得。
2、 一种栀子苷类似物，其特征在于由中药栀子中提取获得，并含有以下环烯醚萜苷类成分栀子苷、异栀子苷、去羟基栀子苷(京尼平苷)、京尼平龙胆 二糖苷、山栀子苷、栀子酮苷、鸡屎藤次苷甲酯、脱乙酰车叶草苷甲酯、京尼平苷酸、10-O-乙酰京尼平糖苷、6-对香豆酰京尼平龙胆双糖苷等。
3、 如权利要求1所述的栀子苷标准物质及栀子苷类似物，其特征在于栀子 为市售栀子饮片或茜草科植物栀子的干燥成熟果实。
4、 如权利要求1所述的栀子苷标准物质及栀子苷类似物，其特征在于上述 栀子苷标准物质的纯度为98 100% (w/w);栀子苷类似物中各种环烯醚萜苷类 成分百分含量的总和为5 100X(w/w)，其中优选的为50 100%;栀子苷含量 占全部总环烯醚萜苷含量的5 100%,其中优选的为50 100%。
5、 如权利要求1 4所述的栀子苷标准物质及栀子苷类似物，其特征在于 采用溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、超临界流体萃取法、柱色谱 法、液-液逆流分配色谱法等任意一种方法，或这些方法的任意组合进行制备。
6、 如权利要求5所述的栀子苷标准物质及栀子苷类似物制备方法，其特征 在于，在使用这些方法进行制备时，包括以下一个或几个步骤提取所用溶剂可以是水或任意一种醇类、酮类及酯类溶剂，或这些溶剂 按一定比例组成的混合溶剂，或由这些溶剂与酸、碱、盐配成的酸性或碱性溶 剂；提取方法可以是煎煮、加热回流、超声提取、冷浸、渗漉、微波提取、高 压提取等；过滤包括离心、抽滤、超滤、压滤等方法，使用或不使用以下任一种澄 清剂或其组合醇沉剂，明胶，高岭土，各种树脂，聚乙二醇，聚乙三醇，壳 聚糖以及天然澄清剂成品如101果汁澄清剂、ZTC+1天然澄清剂等；浓缩包括常压或减压条件下的薄膜蒸发、旋转蒸发及煎煮浓缩等；干燥包括真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等。
7、 如权利要求5所述的栀子苷标准物质及栀子苷类似物制备方法，其特征 在于当使用大孔吸附树脂法时，所用的大孔树脂可以是非极性、弱极性、中等 极性、弱碱性或弱酸性等任何一种类型，如DIOI、 D4020、 HPD400、 AB-8、 S-8、HZ-806等，其中优选的为弱极性或中等极性的树脂，如AB-8、 HPD400、 D101等， 所用的洗脱剂为水和含水的乙醇、甲醇、丙酮等。
8、 如权利要求7所述的栀子苷标准物质及栀子苷类似物制备方法，其特征 在于选用AB-8、 HPD400等中等极性或弱极性大孔吸附树脂作为纯化用树脂，栀子 乙醇提取物以栀子苷量计的上样液浓度3 9mg/mL，吸附流速1 6BV/h，树脂柱径高 比1:5 1:10， 0 20%乙醇洗脱1 4倍树脂体积进行除杂，除杂流速为3 9BV/h， 用20 90%乙醇洗脱3 6倍树脂体积，洗脱流速为3 9BV/h。
9、 如权利要求5所述的栀子苷标准物质及栀子苷类似物制备方法，其特征 在于当采用柱色谱法进行制备时，其处理的对象可以是上述提取步骤所获得的 产物，也可以是经上述溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、超临界流 体萃取法初步纯化后的产物，所用的固定相可以是硅胶、聚酰胺、氧化铝、葡 聚糖(S印hadex系列或S印hadexLH-20系列)、C-8、 018、活性炭、纤维素等， 所用的洗脱液因固定相的不同而不同， 一般是由水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、 乙酸乙酯、石油醚等组成的混合溶剂。
10、 如权禾頓求l、 2所述的提取物的应用，其特征在于，该提取物可以单独或 与其它任何中西药物或食物按任意比例配伍，用于制备药物或功能性食品，所制得的 药物或功能性食品可以是胶囊剂、片抓丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆、冲剂、酒剂、 注射剂、膏剂、散剂、饮料等。
全文摘要
本发明公开了一种从中药栀子中提取得到的栀子苷标准物质及栀子苷类似物及其制备方法。栀子苷类似物主要包括栀子苷、异栀子苷、去羟基栀子苷(京尼平苷)、京尼平龙胆二糖苷、山栀子苷、栀子酮苷、鸡屎藤次苷甲酯、脱乙酰车叶草苷甲酯、京尼平苷酸、10-O-乙酰京尼平糖苷、6-对香豆酰京尼平龙胆双糖苷等。栀子苷标准物质及栀子苷类似物可由溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、超临界流体萃取法、柱色谱法、液-液逆流分配色谱法等任意一种方法，或这些方法的任意组合进行制备。所制得的栀子苷标准物质纯度为98～100％(w/w)，栀子苷类似物中各种环烯醚萜苷类成分百分含量的总和为5～100％(w/w)，其中栀子苷的含量占全部总环烯醚萜苷含量的5～100％(w/w)。
文档编号A61K36/744GK101113156SQ20071013030
公开日2008年1月30日 申请日期2007年7月16日 优先权日2007年7月16日
发明者斌 刘, 李更生, 帆 杨, 石任兵 申请人:石任兵;刘 斌