一种泌尿生殖系统疾病的治疗系统的制作方法

专利名称：一种泌尿生殖系统疾病的治疗系统的制作方法
技术领域：
本发明用于泌尿生殖系统疾病的治疗。与本发明相关的背景技术泌尿生殖系统疾病通常累及男女两性，包括泌尿系统和生殖系 统的感染和/或炎症。例如，根据美国国家少儿健康和发育研究所 (NICHD)的统计，"大多数女性一生中至少患过一种类型的阴道 炎。"《阴道炎》(Vaginitis),发表于《美国国家儿少健康和发育研 究,斤-在线刊物》(iVart'owa/ /"s份wte o/ C/w7<af //ea/A owd //w/waw Deve/opwe/i^Pi/W/cariww 2000年1月 12日1务定，<http:〃www.nichd.nih.gov/publications/pubs/vag 1 .html> )。 导致阴道 炎的原因包括从细菌、真菌或病毒感染到乳液、喷雾或者贴身衣物 所含的化学物质的刺激。同样地，对于有细菌和真菌感染的女性， 这些感染因素经常来自肛门区，从此处经过会阴到达阴道或尿道。常见的一类阴道炎是念珠菌或酵母菌感染，主要由白色念珠菌 感染引起。念珠菌属于人体正常菌群，存在于皮肤、口腔和消化道(Robbins，《疾病的病理学基础》第五版(/wrf/zo/og/c 5必& o/ 2Xyeose 5沐Saunders公司，费城(1994) p.354 )，女性阴道也 可有少量存在。它们最适合的生长环境是诸如阴道或口腔的温暖潮 湿环境.念珠菌通常不致病，但当环境改变时，例如女性绝经后、 怀孕期、或应激时发生体内激素水平的改变，会过度繁殖造成酵母 菌感染。此情况也可见于免疫抑制或身体机能受损的个体，如接受 化疗、服用免疫抑制剂的病人，或艾滋病患者。目前对于念珠菌感染的治疗包括非处方药物，其活性成分如布 康唑硝酸盐(Femstat )、克霉唑(Gyne-Lotrimh^及其它)、咪康唑 (1^01^1&1@及其它)和漆康唑(Vagistat )。这些药物作为阴道感染 的局部用药，可以裂解念珠菌的细胞壁.其它类似的治疗包括处方 药物，其活性成分来自与氟康唑(Diflucan )、三康唑(Terazol ) 和酮康唾(Nizoral )等同一系列。虽然通常的观点认为阴道炎与念珠菌有关，但据NICHD的调 查(《阴道炎》(^g/"/fe))，实际上细菌性阴道炎是育龄妇女最常 见的阴道感染疾病。阴道内的细菌过度繁殖会导致与念珠菌性阴道 炎相似的细菌性阴道炎，其治疗药物不同。另一方面，男性阴茎也可以感染念珠菌，累及阴茎头和包皮。 阴茎头包皮炎是阴茎头和包皮的非特异性感染，由多种^l生物引 起，包括真菌(如念珠菌)和化脓性细菌(如葡萄球菌)(Robbins， 《疾病的病理学基础》第五版(o/D&eose 5rt e^O ., Saunders公司，费城(1994 ) p.1008 )。葡萄球菌为革兰氏染色阳性细菌，通常存在于人体的皮肤和其 它粘膜。特别值得一提的是金黄色葡萄球菌，为毒性致病源，可以 引起皮肤损伤、心内膜炎、呼吸系统感染、食物中毒、甚至中毒性 休克综合征等多种病症。对于采用高吸收性月经棉条的女性而言， 金黄色葡萄球菌可以在阴道内形成菌落，并分泌一种称为中毒性休克综合征毒素(TSST-1 )的毒素。据FDA的统计，目前报导的大 约半数中毒性休克综合征病例与月经期棉条关，多为年轻女性(《月 经棉条与石棉、二恶英以及中毒性休克综合征》(rampo似 爿Ae对os, Z)/ojc/",在7b:ac 5/wc矢)， FDA i殳备与放射健康中 心(July 23,1999 ) ， <http:y7www.fda.gov/cdrh/ocd/tamponsabs.html> )。金黄色葡萄球菌感染一般用曱氧西林(methicillin)治疗。此药 虽然很有效，但金黄色葡萄球菌的一些菌抹已经产生抗药性，只有 少数抗生素能有效治疗耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)。常 用于治疗MRSA的抗生素之一是万古霉素(vancomycin),但是， 现已发现对万古霉素敏感性下降的金黄色葡萄球菌菌株(Khuishid， M.A.等，《对万古霉素敏感性下降的金黄色葡萄球菌》(Staphylococcus aureus with Reduced susceptibility to Vancomycin )， 发表于伊利诺斯1999《发病率与死亡率周报》(MoAW0; "wd M)W鄉 股e咏 鄉ow)， 48(51): 1165-1167(2000 ) ，<http:〃www.cdc.gov/epo/mmwr/preview/mmwrhtml/mm485 lal.htm>)。抗药性菌抹的出现使应用其他方法用于治疗细菌感染成 为必要。除真菌和细菌感染外，病毒性阴道炎也比较常见。此类感染大 多通过性交传播，包括单纯疱療病毒(HSV)或人类乳头状病毒(HPV)引起的感染。例如，HSV病毒，在生殖系统的入口处复制， 也感染支配生殖器的神经。为了躲避机体免疫系统，HSV病毒潜伏 在这些神经元中，在某些环境条件下活化，如应激、免疫抑制、放 射或病毒感染等。目前治疗HSV感染的药物包括阿昔洛韦(acyclovir )、法昔洛韦(famciclovir )、或4戈昔洛韦(valacyclovir) 等。对于泌尿系统，根据美国医药协会的调查数据，泌尿道感染 (UTIs)是促使就医的最常见疾患之一 (《女性健康》一《尿道感染治疗的患者才旨导 )，《在线《建康4言息-AMA #:康透#见》 1998年10月30日更新，<http:〃www. ama-assn. org/insight/h—focus/ wom一hlthAiti/uti. html>。此类感染性疾患主要是由埃希氏大肠杆菌(E.coli.)引起，但念珠菌和葡萄球菌也有参与。同样地，这些感 染始于尿道，向膀胱发展引起膀胱炎。最后，病菌可沿输尿管上行 至双肾，导致肾盂肾炎。男性和女性均可感染。既然泌尿-生殖系统疾病不局限于单一病因，那么目前的治疗 就需要针对特定病因采用不同的药物。当然，要先确定病因。检测 病源需要时间，但更重要的是对女性要进行妇科检查以确定是否有 特异感染因素存在。随着抗生素和其它药物应用的增加，耐甲氧西林金黄色葡萄球 菌这类的微生物就越容易对目前所用药物产生抗药性。这样，就持 续需要新的广谙抗菌药物。发明简述本发明用于治疗泌尿生殖系统疾病，它的一个方面涉及的由单 一或多种肽组成的用于泌尿生殖系统疾病的治疗体系，其中多肽的 氨基酸序列有KPV (序列号1号)，MEHFRWG (序列号2号)， HFRWGK (序列号3号)，SYSMEHFRWGLPV (序列号4号)。单 个或多个多肽也可以通过上述氨基酸序列形成二聚体。泌尿生殖系 统疾病包括感染、炎症，或者二者兼有。在本发明的一个优选实施 例中，泌尿-生殖系统疾病包括阴道、外阴、尿道、阴茎和/或直肠 的感染和/或炎症。在另一个优选实施例中，单一或多种多肽溶于载 体内。在第三个优选实例中， 一种或多种多肽与棉条结合，以避免 中毒性休克综合征。在第四个优选实施例中， 一种或多种多肽与避 孕工具相结合，以防止性传播疾病或感染。在第五个实施例中，一种或多种多肽与栓剂结合，以便于插入阴道或肛门。在本发明的第 六个实施例中， 一种或多种多肽溶于液体载体中，以用于阴道灌注。附困简要描述

图1: ot-MSH和/或其衍生物对金黄色葡萄球菌生长的抑制效应。图2: a-MSH和/或其衍生物对尿激酶(UK)诱导的金黄色葡 萄球菌生长的影响。图3: ot -MSH和/或其衍生物对白色念珠菌(C albicans )生长 的抑制效应。图4: oc-MSH和/或其衍生物与氟康唑抗真菌活性的比较。图5A-5D: ot-MSH和/或其衍生物对白色念珠菌芽管形成的 4中制效应。图6: a-MSH和/或其衍生物抗念珠菌的强化中性粒细胞杀伤 力的效应。图7、 8、 9: a-MSH和/或其衍生物抑制白色念珠菌生长的机制。图10-13: a-MSH和/或其衍生物对慢性感染细胞内病毒复制 和表达的抑制效应。图14: a-MSH和/或其衍生物抑制病毒复制、表达和活化的机制。图15: oc-MSH和/或其衍生物对急性感染细胞内病毒复制和表 达的抑制效应。图16:用于本发明一方面的一种KPV 二聚体形式的4匕学结构 示例.发明详述以下所引用的文献在此作为参考文献。本发明是关于采用oc-黑素细胞刺激素(a-MSH)和/或其衍生物治疗泌尿生殖系统疾病 的一种方法和系统。ct-MSH是经典的由13个氨基酸组成的肽(序 列号4号)，由较大的前体分子——前黑阿皮素原经翻译后修饰产 生。它与同是来自前黑阿皮素原的促肾上腺皮质激素(ACTH)的 1 — 13氨基酸序列相同。许多种细胞均可分泌a-MSH，包括垂体细 胞、单核细胞、黑素细胞和角化细胞。oc-MSH可见于大鼠皮肤、 人体表皮以及正常和垂体切除术大鼠消化道的粘膜屏障(可参阅 Eberie，A.N.，《促黑激素》(rAe Afe/a"c^o/ / >w )，瑞士巴塞尔Karger (1998 );Lipton， J.m.等，《ot-MSH神经免疫调质的抗炎影响》-MSTn，《今日免疫学》(//w附m"o/. 7b^y) 18,140-145 ( 1997 ); Thody， A丄等，《ct-MSH的免疫反应性，在正常和垂体切除大鼠消 4b道的分布》(7>w/ w"oreflC/ve "-il^fe/a"ocj^e 5W附m/a"wg i/o/vnowe,i^/ o; ;^je"o附/zec 及ato )，《生命科学》(丄z/e. Sc/. ) 18， 2127-2132 (1981 ))。现已知道oc-MSH及其衍生物具有很强的解热和抗炎特性，而 且毒性极低。它可以降低宿主细胞的离体前炎症介质的产生，并且 可以降低动物炎症才莫型的局部和全身反应。例如，oc-MSH的核心 序列(4-10)(序列号2号)具有学习和记忆行为效应，但解热和 抗炎活性很低。相反，解热和抗炎活性的活化信息序列位于oc-MSH的C-末端M酸序列，即赖氨酸 一 脯氨酸-缬氨酸("Lys-Pro-Val " 或"KPV")(序列号1号)。此三肽在体和离体情况下与母体分子 有相同的活性。a-MSH和/或其衍生物的抗炎活性在下述两项专利 有阐述，并包括在所列的参考中美国专利第5，028，592号，1991 年7月2曰提交于Lipton， J.M.，题为《Lys Pro Val解热和抗炎成分 及其4吏用方'法》(^wrt^)re"cy4w".-/^/7a/w <2fOA7 Z>w iVo CowpowY/ow flr"i/Afe^ic^ o/Ose);美国专利第5,157,023号，1992 年10月20日提交于Lipton， J.M.，题为《Lys Pro Val解热和抗炎成分 及其4吏用方'法》(y4w";p)Te"c aw/ v4"H" i/7a/w附fl^oA7丄ys尸ro Co附po础o附朋d Ms^oc/ o/ L/ie )。(参阅Catania A.等，《ct -MSH 对宿主机体反应的调节》("-Afe/朋ocyfe W附w/ariwg //o;vno"e z" fAe JWb^m/fl"ort o/ i/oW / eacrio/w)，《内分泌、综述》(endocr. Rev.) 14,564-576 ( 1993); Lipton， J. 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B. 等，《a-MSH (11-13) (lys-pro-val)对兔发热的作用》(o/物质》5,815-817 ( 1984); Hiltz M E.等，《神经肽a-MSH COOH 末端片断的抗炎活'性》(爿"f"7 /7"附w"too; o/ a COOWe加z'"fl/ Firagffie加o/决e Wewro; e/7"cfe a-A/S//)， FASEB杂志3,2282-2284 (1989 )。除了抗炎和解热功能外，本发明的另一方面涉及a-MSH和/或 其衍生物的抗孩殳生物和抗感染活性。如下所述，ot-MSH和/或其衍 生物有重要的抗感染用途，包括如下的应用降低微生物生存力， 降低酵母菌长芽，在不损害中性粒细胞对微生物的杀伤能力的情况 下杀伤孩t生物，治疗与^t生物感染有关的炎症而不降低省史生物的杀 伤力，增加微生物细胞内cAMP的积累，抑制病毒性致病源的复制 与表达。在本发明的首选实施例中，这些抗微生物或抗感染活性最主要 与C-末端^^酸序列-KPV有关。此三肽与a-MSH及其书f生物在 很大浓度范围内均有效，包括通常存在于人体浆液的皮摩尔浓度。正如在技术背景部分中所讨论的，泌尿生殖系统疾病并不局限 于单一病因。从细菌、真菌到病毒在内的多种微生物和感染因素可 以单独或联合引起多种病症，包括阴道炎、外阴炎、尿道炎、阴茎 头包皮炎、念珠菌病、行传播疾病以及中毒性休克综合征。a-MSH 和/或其《汙生物可局部用于上述疾病状态的感染和/或炎症部位以达 到治疗目的，可利用现有技术的施药方法。例如，ot-MSH及其衍 生物可以溶于一些溶液中，诸如磷酸盐緩沖液、透明质酸、甲基纤 维素、羧曱基纤维素或乙醇。还可以用一般的载体，如油骨、油脂、 胶体、可溶性弹丸、气溶胶喷雾、栓剂、灌注所用液体溶剂或者具 吸收性的物质，携带ot-MSH和/或其4汁生物作为活性成分治疗泌尿 生殖系统疾病。这些载体可用敷料器施用于感染或炎症部位，敷料 器可以是注射器或类注射器式的器具、绷带、导管、带活塞的管子、涂药用抹刀或其它类型的平面敷料器、避孕套、海绵、棉签、或手 指.更明确地说，本发明的一个优选实施例是将ot -MSH和/或其衍 生物溶于以液体基底的栽体，然后将溶有oc-MSH和/或其衍生物的 栽体储存于密封加压箱内。打开释放阀门或通过其它方式将栽体从 密封加压箱内释放时，会形成气溶胶泡沫并被装进注射器和注射器 类的器具。接着，注射器部分插入阴道，其内容物也就释放入阴道 腔内。注射器或注射器类的器具及其开口也可以有不同的大小、形 状和长度，以插入不同的泌尿生殖区，如尿道或肛门，本发明的另 一个优选实施例为包含栽体的栓剂。此载体如胶体 或甘油在常温下为固体或半固体，但是插入阴道或肛门后在体温下 便融化。载体融化后，携带所溶的ct-MSH和/或其衍生物至泌尿生 殖系统疾病的发病部位。我们采用油脂、油奮、胶体、喷雾、泡沫材料或止痛香骨等形 式将a-MSH和/或其衍生物涂于外阴、阴茎头和阴茎包皮等外生殖 器部分。其组分为本技术领域所熟知。在本发明的另一方面，还可以在棉条的生产加工过程中用cx -MSH和/或其衍生物进行处理，这样棉条中存在ot -MSH和/或其衍 生物，可以抑制分泌中毒性休克综合征(TSST-1 )的微生物的生长， 如金黄色葡萄球菌，此种棉条的加工处理技术为本领域现有技术所 熟知。采用a-MSH和/或其衍生物处理的棉条吸收性材料进行治 疗， 一种方法是将棉条的吸收性材料浸泡于含有a -MSH和/或其衍 生物的溶液，然后予以干燥。可供选择的另一种方法，是将a-MSH 以干燥4分末形式喷洒到棉条的吸收性材料上。在本发明的另 一方面，a -MSH和/或其衍生物可通过避孕工具 转运至感染部位，这些避孕工具包括避孕套、隔膜、海绵或其它用于防止怀孕或性传播疾病的屏障型工具.ot-MSH和/或其衍生物可溶于避孕套所用的润滑剂以及与隔膜共同使用的胶质或泡沫材料， 或者溶于与避孕套、隔膜或海绵共用的任何类型的杀精子溶液.在本发明的另一方面，a-MSH和/或其f汙生物可溶于灌注用的 液体。这些液体可以通过灌注被转运至阴道以治疗感染和/或炎症。下述实施例阐明了 a-MSH和/或其^t生物抗感染的效力及其应 用。实施例中所用的微生物学、分子生物学以及细胞培养的方法没 有在文中详细说明，但在科研文献中有大量的报导。本领域技术人 员熟知这些方法。下述实施例中所用的肽类包括ot-MSH (1-13)(序列号4 号)、(4-10)(序列号002号)、(6-13)(序列号003号)、和(ll - 13)(序列号1号)，均有乙酰化的N末端和酰胺化的C末端，以 及促肾上腺皮质激素ACTH ( 1 - 39)和(18 - 39) ( CLIP )。这些 肽类由固相肽合成方法制备，经保留相的高效液相色普法纯化。部 分实施例还包括氨基酸序列CKPV (序列号8号)的二聚体(KPV 二聚体)，此二聚体同样也有乙酰化的N末端和酰胺化的C末端。 图16显示了 KPV二聚体的化学结构。在上述任意一种多肽的N末 端加半胱氨酸，并4吏两个多肽的半胱氨酸形成二石危键，即可得到二 聚体，同源二聚体和异源二聚体均可由此方法获得。下述实施例中所阐述的统计学意义采用方差的单因素分析和斯 氏t检验。概率大于0.05被认为是有显著性差异的。实施例I本实施例目的在于阐明ot-MSH和/或其衍生物的抗孩i生物特 性，这里选取金黄色葡萄球菌(Stop/^/ococcM^ )为例。金黄色葡萄球菌培养物(ATCC 29213 )由Ospedale Maggiore di Milano微生物学系提供。金黄色葡萄球菌(于Hank平衡盐溶液中 lxloV毫升)在ot-MSH (1-13)(序列号4号)、a-MSH (11-13)(序列号1号)或KPV二聚体存在或缺如的情况下，37C培养 2小时，肽的浓度为10_15-10_4M。随后细胞在冷蒸馏水中沖洗， 并用HBSS稀释至100个生物体/毫升。将一微升的等分试样涂于血 浆琼脂板，37匸培养24小时。然后根据所形成的菌落评估微生物 的生存力。另一实验中是在细菌浓度为lOVlOO毫升的培养液中加 入不同的肽段和500单位的尿激酶(金黄色葡萄球菌的生长促进 剂)，并且在37*€水浴中振荡培养4小时.图l表明a-MSH (1-13)(序列号4号)、cx-MSH (11-13) (序列号1号)和KPV二聚体均抑制金黄色葡萄球菌菌落的形成。 此抑制效应在很大浓度范围内均可发生，并在10_12 - 1(T4M的浓度 范围内有显著性差异(p>0.01)。图2说明了浓度为10_6摩尔/升的 oc-MSH (1-13)(序列号4号)和oc-MSH (11-13)(序列号1 号)明显抑制尿激酶的生长促进作用。这样，a-MSH或其衍生物 可以抑制金黄色葡萄球菌的生长，此细菌会引起中毒性休克综合 症，该病征与月经棉条使用、阴道炎、泌尿道感染、以及阴茎头包 皮炎有关。实施例n本实施例的目的在于阐明a-MSH和/或其4汙生物的抗真菌特 性，这里选取的实验菌抹是白色念珠菌(Om^Wa a/6!'cam )。白色念珠菌的临床隔离林由Ospedale Maggiore di Milano微生 物学系提供，白色念珠菌的培养在沙氏琼脂斜面板上进行，并周期 性地转移到沙氏琼脂板上，28'C培养48小时.为了制备静止期酵 母菌，从琼脂板上杏t取菌落，将其转移到30毫升沙氏葡糖液体培 养基中，32C培养72小时。将所得细胞以lOOOxg离心IO分钟， 用蒸馏水冲洗沉积细胞两次.然后计数细胞个数，并悬浮于Hank 平衡盐溶液(HBSS)中至需要的浓度。通过0.01%的甲基蓝外排 实验，以此确定细菌的生存力.结果显示其生存能力大于98%,在HBSS中密度为1 x 106/毫升时，这些真菌在oc-MSH( 1 - 13 ) (序列号4号)、oc-MSH (11-13)(序列号1号)或KPV二聚体 存在或缺如的情况下，37C培养2小时，肽的浓度为10_ 15 - IO"M。 随后用冷蒸馏水沖洗细胞，并用HBSS稀释至100个生物体/毫升。 将一毫升的等分样品涂于血浆琼脂板上，37匸培养48小时。微生 物的生存力才艮据所形成的菌落估计。图3表明a-MSH (1-13)(序列号4号)、oc-MSH (11-13) (序列号1号)和KPV二聚体在10_12-10—"M浓度范围内均抑制 白色念珠菌菌落形成的能力(与对照相比pO.Ol)。此结果说明， a-MSH或其衍生物能够抑制白色念珠菌的生长，此真菌是已知导 致念珠菌病、阴道炎、尿道炎和阴茎头包皮炎的因素。实施例迈本实施例的目的在于比较a-MSH和/或其衍生物与氟康唑 (fluconazole)的抗菌活性，后者是已被承认的抗真菌药物。检测oc-MSH(l-13)(序列号4号)、(4-10)(序列号2号)、 (6-13)(序列号3号)、(11-13)(序列号1号)和ACTH (1-39 )、 ( 18 - 39 )以及氟康唑在10 —6 - 10—4M浓度下的抗白色念珠菌的能力，方法同实施例n。图4表明，与氟康唑相比，a-MSH(ll-13)(序列号l号)、(4-10)(序列号2号)、(6-13)(序列号3号)和(1-13)(序列号4号)抗白色念珠菌是非常有效的，其抑 制活性与等摩尔浓度的氟康唑是类似的.相比之下，具有行为效应^f旦极少抗炎活性的核心cx-MSH序列(4-10)(序列号2号)产生了近50 %的对菌落形成单位抑制效应。虽然此抑制效应具有显著性 (与对照相比p<0.01 )，但是明显弱于含有KPV信号序列的oc -MSH片断，这些KPV信号序列包括oc-MSH(6-13)(序列号3号)、(11 -13)(序列号1号)(pO.Ol)，或者母体分子ot-MSH (1-13) (p<0.05)。图4也表明ACTH (1-39)及其片断(18-39)不能降低白色念珠菌的生存力。甚至在IO"M浓度下(图中未显示)，ACTH肽段也同样无效。由此本实施例i兑明oc-MSH或其书f生物在抑制白色念珠菌生长 方面与氟康唑同样有效。实施例IV本实施例的目的在于阐明oc-MSH及其衍生物对白色念珠菌出 芽或芽管形成的抑制作用。芽管形成是白色念珠菌感染发病^L理的 重要方面，包括粘附于宿主上皮和内皮细胞的过程，从椭圓形的芽 生孢子到各种丝状体的形态转变，如芽管、假菌丝、菌丝。(Gow， N.A.,《白色念珠菌芽管的生长》(Gwm r"6e o/ Ca"力c/"a/6/ca似)，《当4戈医学真菌话题》(Curr. Topics Med. Myco.) 8，43-55 (1997))。蒸馏水冲洗培养所得的静止期白色念珠菌两次，然后将菌体悬 浮于HBSS中，密度为2x 106/毫升。于此菌液中加入10%的灭活 马血清(由英国Paisley GIBCO/BRL提供)，37匸振荡培养45分钟， 可以诱导白色念珠菌菌丝的生长。HBSS沖洗菌体两次以去除马血 清，然后在浓度为10—6M的ct-MSH (1-13)(序列号4号)、(6-13)(序列号3号)或(11-13)(序列号l号)存在的条件下， 37X:继续培养60分钟，并不断振荡。采用血细胞计数器在光学显 微镜下计算出丝状菌体的百分比。此实验以重复三次，至少计数了 200个细胞。采用装配在Axioskop Zeiss显微镜上的MC100相机拍 摄显微照片.图5A至5D表明cc-MSH(l-13)(序列号4号)或(11-13) (序列号1号)可以抑制由马血清诱导的白色念珠菌芽管形成。oc -MSH (1 - 13 )(序列号4号)使丝状菌体数目降低28 - 32% , a -MSH (11-13)(序列号1号)导致丝状菌体数目降低54-58%。 虽然图中未显示，a-MSH (6-13)(序列号3号)同样可以引起 丝状菌体数目降低近50 % 。由此说明oc -MSH或其书1"生物通过抑制 芽管形成可以抑制念珠菌发病机理的一种模式。实施例V对病原体杀伤力的降低是感染期间应用皮质类固醇和其它非甾 体类消炎药物治疗的负面作用(Stevens, D丄.，《非甾体类消炎药物 (NSAIDs)是否能促进细菌性感染发展为中毒性休克综合征》尸rogrew/ow o/ 5flc&Wa/ /w々c"o朋fo 7b;)ac S7zoc Syw^ome )，《'降床 感染'性疾病》(Clin.Infect.Dis.) 21,977 — 80 ( 1997 ); Capsoni， F.等， 《皮质类固醇对中性粒细胞功能的影响抑制抗体依赖的细胞介导 的细月包毒'性(ADCC )》(^fe" o/ CorricoWeWo必ow iVew^pp/n'/C^otoxzc/ ^Z)a^ ),《免疫药理学杂志》( / T)wmmo/ /w^waco/.) 5,217-30 ( 1983 ))。本实施例阐明a-MSH和/或其衍生物抑制感染 源的生长，而且不降低中性粒细胞抗感染的能力。本实施例进一步 表明oc-MSH和/或其衫f生物确实可以增强中性粒细胞杀伤感染源 的能力。来自健康志愿者的静脉血(20毫升)肝素抗凝处理后，加入右 旋糖苷沉淀剂并采用Ficoll-Hypaque (购于美国密苏里州圣路易斯 的Sigma化学制剂公司)离心机离心分离中性粒细胞，4氐渗休克下 红细胞溶解，中性粒细胞则至少占细胞悬浮液的97%。由胎盘兰排 除法得到的细胞生存力大于98%.中性粒细胞再悬浮于HBSS中， 以用于实验。将白色念珠菌(1 x 106 )与AB型血清置于37X:振荡水浴中调理 30分钟。随后，在单纯培养基上或含有浓度为l(T15 - 1(T4M的a -MSH (1-13)(序列号4号)或ot-MSH (11-13)(序列号1号)培养 基上与中性粒细胞一起培养，于振荡水浴中37'C培养2小时。2小 时后，将培养管置于冰上以中断生长，冲洗细胞外生物体两次，并 4'C离心(1000xg),于悬浮液中加入2.5%的脱氧胆酸钠溶液，振 荡试管5分钟。然后加入冷蒸馏水得到密度为106个细胞/毫升的菌 液，再在HBSS中按1/100地比例依次稀释两次，从而得到密度为 100个细胞/毫升的菌液。从此菌液中取一毫升的等分样品涂于血琼 脂板，37X:培养48小时。48小时后选取三分之一计数菌落形成单 位，并采用五个不同个体来源的血浆重复计数。图6表明a-MSH (1-13)(序列号4号)和(11-13)(序列 号1号)在10M2 - 10"M浓度范围内(pO.Ol)确实能够增强中性 粒细胞对白色念珠菌的杀伤力，同时图6表明它们在很大的浓度范 围内都可以促进中性粒细胞的杀伤力，即使是在相当于人血浆oc -MSH浓度的皮摩尔浓度条件下。由此本实施例i兌明a-MSH或其衍生物可以同时抗感染和炎 症，此特性也适用于念珠菌病、阴道炎、尿道炎、阴茎头包皮炎或 痔疮。本实施例提示oc-MSH和/或其彩于生物的抗微生物特性的一般细 胞机制，以及抗真菌特性的特殊机制。
经甲苯/乙醇渗透作用的白色念珠菌(106/毫升)，在10_6M浓 度的a-MSH (1-13)(序列号4号)、(11-13)(序列号1号)或 毛喉碎(forskolin)(已知能够增加细胞内cAMP )存在或缺失的条 件下，37X:下振荡培养.三分钟后加入用水冷却的乙醇以中止反应。 cAMP 7jc平由市售酶免疫试剂盒(购于英国Amersham )测定两次， 在测定之前根据产品说明通过液相方法对反应体系进行抽提。在另 一个相关实验中，白色念珠菌暴露于浓度为25、 50和lxi0-SM的 双脱氧腺苷(ddAdo， Sigma) 2小时，再与ot-MSH或其衍生物作 用2小时。双脱氧腺苷是蛋白抑制剂，抑制腺苷酸环化酶。采用与 实施例II相同的方法测定毛喉辟和双脱氧腺苷对白色念珠菌菌落 形成的影响。
图7表明ot-MSH (1-13)(序列号4号)和(11-13)(序列 号1号)可提高白色念珠菌内cAMP含量，其cAMP的增加量与等 摩尔毛喉萜诱导的增加量的数量级相同.图8显示与cc-MSH (l-13)(序列号4号)和(11-13)(序列号1号) 一样，毛喉萜也明 显抑制白色念珠菌生长(与对照相比p<0.01 )。图9表明双脱氧腺 苷能过扭转oc-MSH (1-13)(序列号4号)和(11-13)(序列号 1号)对白色念珠菌生长的影响。
本实施例说明ot-MSH及其衍生物抑制白色念珠菌和其它微生 物生长的作用最可能是通过增加cAMP水平实现的，cAMP含量的 提高抑制mRNA和蛋白合成(参阅Bhattacharya A.等，《cAMP对 白色念珠菌RNA和蛋白合成的作用》(E#e"o/C>c"c^MPo" AA^ /Vwe/" S7"f/1ey/sCa"J/cto a/6/ca似)，《生4匕与生理研究通ifO〉 (5/0/ /zj^/cy. i ^. Ccw附w". ) 77: 1483 - 44 ( 1997 ))。实施例vn
本实施例阐明ct-MSH或其矛;t生物抑制人体细胞内病毒复制的
能力，或者更确切地说，阐明oc-MSH抑制慢性感染的人单核细胞
内mv-i病毒的复制和表达，
fflV-l慢性感染的幼单核细胞Ul细胞系是潜伏型单核细胞 fflV感染的体外模型，这些细胞携带两套整合的HIV原病毒拷贝， HIV的基本表达较低。但是，根据RNA转录、p24抗原或逆转录酶 释放等测定的病毒复制可以被不同的刺激活化，如TNF-oc、 IL-6、 IL-IO、 PMA或细胞拥挤状态。
上述细胞置于由完全培养基(含有10毫摩尔Hepes的RPMI 1640培养基)、包含2毫摩尔L-谷氨酸(Sigma-Aldrich)、 10%热灭 活的FCS (美国犹他州Logan的Hyclone实验室提供)、100单位/ 毫升的青霉素和100微克/毫升的链霉素(纽约，Grand Island, Gibco 实验室提供)，组成的培养基中维持对数期生长，以观察ct-MSH和 /或其衍生物对HIV复制的影响。首次的试验性实验用来确定上述 培养条件下的最佳细胞密度、刺激物浓度HIV-1 p24抗原生成的动 力学。在使用前，用HBSS沖洗细胞三次以去除细胞外病毒。然后 在浓度为10_15-10—4摩尔范围的ot-MSH (1-13)(序列号4号) 或(11 - 13 )(序列号1号)存在或缺乏的条件下，将细J!包以2x 105/ 毫升的密度(1毫升的最终体积)铺于24孔的平底培一，培养皿 中只有培养基或加入TNF-a (io毫微克/毫升)(英国英格兰牛津
R&D系统提供)。
在进一步的实验中，Ul细胞中单独加入浓度为10—5M的oc -MSH(11-13)(序列号1号)，这些细胞是经过TNF-a ( 10毫微 克/毫升)、IL-6 ( 20毫孩t克/毫升)、IL-10 ( 20毫孩t克/毫升)(英国 英格兰牛津的R&D系统提供)、PMA ( 1毫微克/毫升) (Sigma-Aldrich)或细胞拥挤刺激的。将密度为2 x 105/毫升的Ul细胞在37C、 5。/。C02的条件下不更换培养基培养7天，细胞即可 达到拥挤状态。由细胞因子或PMA激活的培养只能持续48小时。 然后离心以分离上清液，采用市售ELISA试剂盒(美国纽约Buffalo 的细胞实验产品有P艮公司生产)检测p24抗原，采用市售逆转录酶 ELISA反向分析试剂盒(瑞典Lund Innovagen生产)检测逆转录酶 的释》丈。对于所有这些实验，在第一天加入oc-MSH (11-13)(序 列号l号)，每一种条件下的结果的测定均重复三次。
图10表明a-MSH(l-13)(序列号4号)和(11-13)(序列 号1号)在较大浓度范围内明显抑制TNF-ct刺激的Ul细胞的p24 抗原释放.对于上述二种肽最有效的浓度均是10—SM，分别产生52.7 %和56.0%的抑制效应。图11表明a-MSH (11-13)(序列号1 号)也抑制IL-6、 IL-IO、 PMA或细胞拥挤状态诱导的Ul细胞的 p24抗原和逆转录酶释放。此外，图12表明，根据Northern印记分 析的测定结果，oc-MSH(11-13)(序列号1号)还可以抑制PMA 刺激的Ul细胞的剪切和未剪切HIV-1 RNA的转录，
由此本实施例i兌明oc-MSH或其书f生物能够抑制由TNF-a、 IL-6和IL-10途径诱导的病毒基因的转录。
实施例Vffl
本实施例进一步阐明了 ct-MSH抑制病毒复制和活4匕的能力， 或者更确切地说，阐明了向Ul细胞中加入ct-MSH的中和性抗体 明显增加p24抗原的释放。
Ul细胞的培养方法与实施例VII中所述的类似。采用亲和纯化的 兔抗a -MSH抗体(瑞典，Malmo，Euro-Diagnostica提供)阻断Ul 细胞内源性a-MSH的产生，此抗体对介质以1:250稀释。对照抗 体选用同等稀释度的兔IgG。抗a-MSH抗体和对照抗体处理的细 胞(2 x IOV毫升)在培养基或PMA ( 1毫微克/毫升)中共同培养。37C培养48小时后，分离上清液并检测p24抗原的释放。在拥挤 状态实验中，Ul细胞的培养同上述方法，抗oc -MSH抗体和对照IgG 在第一天加入，第七天收集上清液。图13表明在静止状态、PMA诱导状态、或U1细胞拥挤状态， 阻断a-MSH会明显增加p24抗原的释放.本实施例强有力地提示 病毒复制受a-MSH的影响。实施例k本实施例阐明了 ot -MSH和/或其衍生物抑制病毒复制和表达的 机制，或者更确切地说，阐明了 a-MSH或其衍生物抑制TNF-a诱 导的NF-kB活化和结合的机制。取20 x 106个Ul细胞(在完整培养基中密度为2 x 105/毫升) 制备核提取物，以測定NF-kB活性水平，其中U1细胞先在浓度 为10—5m的oc-MSH( 11 - 13)(序列号1号)存在或缺失的条件下 用TNF-a (20毫微克/毫升)刺激4小时。用冷PBS冲洗细胞一次， 緩冲液A ( 10毫摩尔Hepes (pH7.9)， 1.5毫摩尔MgCl2, 10毫摩 尔KC1， 0.5毫摩尔PMSF和0.5毫摩尔DTT)冲洗两次，离心， 置于冰上，在加入0.1。/。NP-40的緩冲液A中培养IO分钟。随后， 弃去上清液，核碎片悬浮于15孩i升的緩冲液C (20毫摩尔Hepes(pH7.9)， 1.5毫摩尔MgCl2，0.42摩尔KC1， 0.2毫摩尔EDTA， 25%甘油，0.5毫摩尔PMSF和0.5毫摩尔DTT)中，冰上培养15 分钟，混匀，离心.用75微升标定的緩冲液D (20毫摩尔Hepes(pH7.9), 0.05毫摩尔KC1， 0.2毫摩尔EDTA， 20%甘油，0.5毫 摩尔PMSF和0.5毫摩尔DTT)稀释上清液，.80X:保存。结合反 应于室温下进行10分钟，反应体系中含有IO微克核提取蛋白和0.5 毫微克32P标记的NF - k B ( 30,000 cpm/微升)或者API混合于緩 冲液A(12毫摩尔Tris-HCl ( pH7.8 ), 60毫摩尔KC1， 0.2毫摩尔 EDTA和0.3毫摩尔DTT)，再加入10%甘油、2微克/毫升牛血清白蛋白和1孩i克/毫升单链DNA (Pharmacia Biotech )。此研究中用 于NF — k B的寡核苷酸有+GAT CCA AGG GGA CTT TCC GCT GGG GAC TTT CCA TG,和-GAT CCA TGG AAA GTC CCC AGC GGA AAG TCC CCT TG。每一个寡核苷酸退火与其互补结合，并 且用多聚核苷酸酶在末端标记"P-Y-ATP。为了确定特定链，在与 标记探针温浴之前，核提取物先与IOO倍过量的未标记探针温浴五 分钟。然后，混合物在lxTBE条件下，于5% (30:1)聚丙烯酰胺 凝胶上进行电泳，再将凝胶干燥，进行放射自显,影。图14表明TNF-oc明显增强NF-KB的结合活性，但是与浓度 为10_5M的ot-MSH (11-13)(序列号1号)共同培养明显降低 NF-kB的活化。但是oc-MSH (11-13)(序列号1号)并不改变 静止细胞NF- k B的活化。此现象il明ct -MSH和/或其书f生物通过 调控NF-kB的结合而抑制病毒复制和表达。病毒物质的复制通常依赖被感染细胞的活化状态，受病毒和宿 主的相互作用调控.这些宿主因素可能包4舌TNF-ct和其它细胞因 子，如白介素。与HIV-1感染和活化类似，单纯疱療病毒(HSV)-在宿主细月包因子作用下也可以从潜伏状态活4匕。例如，TNF-(X和 IL-6， i旦不包括IL-l和IL-3,已经确定可以活化HSV感染。用抗 IL-6抗体中和IL-6可明显抑制HSV的活化，相比之下中和ot或P 干扰素却没有影响。(参阅Baker， M.等，《白介素-6和单纯疱渗病 毒1型的关系对行为和免疫病理的提示》(7Tze及e/加'o朋/^5e/wWo/" /附附Mwo/7af/20/ogy )， 《大脑4亍为免疫》(5e/zav./附/mwo/. ) 13 (3): 201-11 ( 1999); Noisakran S.等，《体外 移植的潜伏感染的三叉神经节中HSV-1活化过程中'淋巴细胞延迟 动力学》(Z^附/ Aocj^ey Z)e/ay K&erics q/" i/SF-/及earc"va"o" /" v&ra ￡":c/7/a"e;s o/Z^ewf /"/e"eaf 7Hge/m'"a/ G^rtg〃a ),《神经免疫 学杂志》(《/ 7Veww/附www/. ) 95 ( 1-2): 126-35 ( 1999); Walev， I.等，《TNF- a对小鼠三叉神经节内潜伏单純疱渗病毒的复活和复制 的增S虽作用》(五w/wwceme/rf " o/及eac"vartVwi ep/fcario" o/Z^rfe"f //er/ es S7加/ /ex P7rws^^"o/m 7Wge/w/"a/ o/ A/zce )，《病毒学文献》(Arch. 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B.等，《兔中枢给予a -MSH 片断的解热4争'〖生》(i4wn]pyreric尸ro/ eWz'es o/ cew伊a〃y j^/m'w&fered or 掘// Frag歸"a Ae 《肽物质》(尸印"Vfes) 9,1285-8(1989); Hiltz，M.E.，《ct-MSH (11 - 13 )类似物的抗炎活性立 体化学改变的影响》(」""-// /7awwatoo^c//v/i^o/ "-MS7/ 〃7-73 J y4"a/ogs:7i^/7Mg"ces < /4/fera"。W5 /w &e/-eocAe/m'5f/y )， 《狀物质》(尸取由)12,767-71 ( 1991 ))。生物学功能相当物也可通过替换具有近似亲水值的氨基酸来获 得。例如，异亮氨酸和亮氨酸(亲水指数分别是+4.5和+3.8)可以 用来替换缬氨酸(亲水指数为+4.2),这样仍可得到具有相似生物学功能的蛋白。可供选择的另一种方法针对亲水指数为负值的氨基酸，如赖氨酸(-3.9)可用精氨酸(4.5)替换，等等. 一般而言， 和被替换氨基酸亲水指数差别在单位+/- 1范围内的氨基酸能够成 功地进行替换。此外，这些经修饰的a -MSH和/或其衍生物的类似物也能够象 图16中所描述的KPV二聚体一样形成二聚体。实施例xn女性经受着阴道、外阴和/或尿道的不适。医生的检查包括上述 部位取材的培养。确定了包括任何感染和炎症在内的不适之后，医 生可以开处方，如适当的抗生素、抗真菌药、抗病毒药或消炎药。此外，治疗也可以包括剂量达到药理学效应的a-MSH和/或其衍生 物的局部应用，a-MSH和/或其衍生物由药貪、油脂、胶体、可溶 性药丸、喷雾、栓剂、用于灌注的溶液、或者棉条吸收材料携带到 达局部，才艮据医生的判断，局部治疗可一次或多次^f吏用，直到疾病 治愈。本实施例在医生的判断下适用，也可应用于有阴茎、睾丸和/ 或尿道不适的男性病人。此外，a-MSH和/或其衍生物的局部治疗 也可不在医生的指导下进行，而以非处方药物形式使用。上迷实施例I -XII阐明了 oc-MSH和/或其衍生物的抗感染活性 和应用。其中引用数据的目的只是便于说明实施例，并不是把本发 明局限于这些实施例范围内。应该明了的是，对上述实施例的修改 并不偏离本发明的精神。而且，这些实施例可单独或联合进行。
权利要求
1.一种包含两个连接在一起的单体的二聚体，其中，两个单体中的每个单体包括具有氨基酸序列Lys-Pro-Val的C末端。
2. 根据权利要求1所述的二聚体，其中，所述单体在N末端连接。
3. 根据权利要求1所述的二聚体，其中，所述二聚体是一个同型 二聚体。
4. 根据权利要求1所述的二聚体，其中，所述二聚体是一个异质 二聚体。
5. 根据权利要求1所述的二聚体，其中，所述二聚体包括至少一 个D型氨基酸。
6. 根据权利要求1所述的二聚体，其中，每个单体具有一个N末 端的半胱氨酸，其中所述N末端的半胱氨酸通过一个二石克键将 单体连接在一起。
7. 根据权利要求1所述的二聚体，其中，所述二聚体被N端乙酰 化、或C端酰胺化、或者二者兼有。
全文摘要
本发明涉及用于治疗泌尿生殖系统疾病的一种或多种多肽所形成的二聚体。泌尿生殖系统疾病包括感染、炎症、或者二者兼有。在本发明的一个优选实施例中，泌尿生殖系统疾病包括阴道、外阴、尿道、阴茎、和/或直肠的感染、和/或炎症。在本发明的另一个优选实施例中，一种或多种多肽溶于载体内。而另一个优选实施例中，一种或多种多肽与棉条结合，用来预防中毒性休克综合症。在另一个优选实施例中，一种或多种多肽与避孕工具结合，以防止性传播疾病或感染。在一个优选实施例中，一种或多种多肽与栓剂结合，以便于插入阴道或肛门。
文档编号A61F13/20GK101240017SQ20071016672
公开日2008年8月13日 申请日期2000年3月23日 优先权日1999年3月24日
发明者安娜·卡塔尼亚, 詹姆斯·利普顿 申请人:曾根公司