专利名称：Dysbindin及其编码基因在筛选预防和/或治疗精神分裂症药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及Dysbindin蛋白及其编码基因DTNBP1在筛选预防和/或治疗精神分 裂症药物中的应用。
祖里JJ; A、 宵尽抆不
小鼠Dysbindin蛋白是由"to&7基因编码的352个氨基酸组成的蛋白，该基 因首次由英国的Benson等(Benson MA， Newey SE， Martin—Rendon E, Hawkes R， Blake DJ. Dysbindin， a novel coiled—coil-containing protein that interacts with the dystrobrevins in muscle and brain. 了 Biol Chem 2001; 276: 24232-24241)于2001年克隆鉴定(GenBank号:AJ404859或GI: 13940273; 提交 日期26-JAN-2001)。随后李巍等发现了一种不同的剪接体，编码一种271个氨 基酸的蛋白质，较前者缺乏N-端81个氨基酸(GenBank登录号AY265461或 GI:32965401;提交日期03-SEP-2003;提交者Li,W.[李巍]，Zhang， Q. and Swank, R.T.)。李巍等进一步的研究发现Dysbindin是溶酶体相关细胞器生物发生 复合体-l(BL0C-l)的新亚基成分(Li W， Zhang Q， 0iso N， et al. Hermansky-Pudlak syndrome type 7 (HPS-7) results from mutant dysbindin, a member of the biogenesis of lysosome-related organelles complex 1 (BLOC-l). Nat Genet 2003; 35: 84-89)。
Sandy小鼠(即纯合性s办/^H、鼠，以s办表示)起源于野生型DBA/2J(以 wt表示)的自发突变，被鉴定为一种新的人类Hermansky-Pudlak综合征(HPS)的小 鼠模型(Swank RT， Sweet H0， Davisson MT， Reddington M， Novak EK. Sandy: a new mouse model for platelet storage pool deficiency. Genet Res 1991; 58:51-62) 。 2003年，李巍等利用定位候选克隆方法发现，因编码Dysbindin蛋白 的"to力W基因的突变，是^/y小鼠的发病原因，^/7小鼠与野生型DBA/2J小鼠相 比，只有""&7基因发生突变，其它基因均一致，结果发表在2003年8月份的自 然遗传学杂志上(Li W， Zhang Q， 0isoN， et al. Hermansky-Pudlak syndrome type 7 (HPS-7) results from mutant dysbindin, a member of the biogenesis of lysosome-related organelles complex 1 (BLOC-1). Nat Genet 2003; 35: 84-89)。
这种基因突变的结果使Dysbindin在各组织中缺乏，以及血小板致密体、黑色素体 等的生物发生明显缺陷，从而表现出相应的出血时间延长、白化病等症状。
精神分裂症是一种最常见的精神疾病，全球受累人群约占0. 5-1. 0%。
发明内容
本发明的目的是提供Dysbindin蛋白及其编码基因的新用途。 本发明所提供的Dysbindin蛋白及其编码基因("to&7基因)的新用途是 dysbindin蛋白及其编码基因在筛选预防和/或治疗精神分裂症药物中的应用。
所述Dysbindin蛋白的氨基酸序列可如GenBank Accession Number AJ404859 的自氨基末端第1至352位氨基酸残基所示。
所述Dysbindin蛋白的氨基酸序歹U还可如GenBank Accession Number AY265461的自氨基末端第1至271位氨基酸残基所示。
所述Dysbindin蛋白及其编码基因在筛选预防和/或治疗精神分裂症药物过程 中，具体可用Dysbindin蛋白或其编码基因作为指标进行药物筛选，能够提高 Dysbindin蛋白或其编码基因表达量的物质即为预防和/或治疗精神分裂症的候选 药物。
本发明首次发现带有"to&7基因突变的^/y小鼠表现出社交和认知障碍，出
现类似精神分裂症病人的精神病症状。
本发明首次证实"to&7基因的突变可以导致神经元突触超微结构的改变。 本发明首次发现小鼠Dysbindin与snapin可直接相互作用，这种相互作用是
通过Dysbindin的自GenBank Accession Number AJ404859的氨基末端第90-119
位氨基酸而实现的。
本发明首次从行为学、形态结构和分子机理上阐明了 Dysbindin在精神分裂症 发生中的作用，并发现Sandy小鼠可用作研究精神分裂症研究的最适动物模型之一。
所以，Sandy小鼠可用于筛选预防和/或治疗精神分裂症的药物。
在实际应用中，可用Sandy小鼠作为药物模型进行药物筛选，能够改善Sandy 小鼠精神状态的药物即为预防和/或治疗精神分裂症的候选药物。
在实际应用中，可以90-119肽段(自GenBank Accession Number AJ404859 的氨基末端第90-119位氨基酸)或其编码基因为耙标(如利用化合物库进行筛选 获得新的先导化合物，用于精神分裂症的治疗)，筛选可提高/^7&7基因(正常 基因)或Dysbindin (正常蛋白)的表达量的药物，以提高"to紐2基因(正常基因)
或dysbindin (正常蛋白)的表达量，增加与snapin的结合力，从而预防或减缓精 神分裂症的发生。
对于"to力p7基因(正常基因)或Dysbindin (正常蛋白)的表达量低的神经变 性病，可利用该精神分裂症的动物模型(如Sandy小鼠)筛选可提高"to/^/基因 (正常基因)或dysbindin (正常蛋白)的表达量的蛋白质或化合物等，作为治疗 精神分裂症的候选药物。
图1为Sandy小鼠和DBA/2J小鼠社交行为测试结果。
图2为Sandy小鼠和DBA/2J小鼠认知行为测试结果。
图3为Sandy小鼠和DBA/2J小鼠海马突触前小泡电镜结果。
图4为Sandy小鼠和DBA/2J小鼠海马不对称突触结构电镜结果。
图5为小鼠dysbindin和已知突触小泡释放调节蛋白酵母双杂交实验结果。
图6为分段小鼠dysbindin与snapin的酵母双杂交相互作用结果。
具体实施例方式
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法。 实施例l. "to&7基因是与精神分裂症相关的基因
对10-12周龄的12对雄性Sandy小鼠(购自美国The Jackson Laboratory) 和12对雄性野生型DBA/2 J小鼠(购自美国The Jackson Laboratory)进行了社交 行为测试。具体方法是将一对互不相识的相同基因型小鼠置于一个40cm长X40cm 宽X40cm高的观察箱内，视频记录15分钟。统计每对小鼠互作行为的时间(包括 身体接触、嗅对方、相互追逐与嬉戏、玩耍、踢闹、击打、撕咬、肛门生殖器接触 等)。结果表明，Sandy小鼠(sdy)平均社交时间(75. 41±13. 82秒)较DBA/2J 小鼠(wt)的平均社交时间(122.38±10.55秒)缩短0^0.014)(图l)，即表现出 类似精神分裂症社交淡漠的阴性症状。
进一步对该批次小鼠进行了新事物认知测试。其中，随机选用Sandy小鼠13 只，DBA/2J小鼠14只。具体方法是分两个阶段进行。训练阶段，将小鼠置放于一 个放有两个完全相同物体的开放箱体内(大小为40cm长X40cm宽X40cm高)15分 钟，连续3天，每天一次。然后进入相持阶段，在同一开放箱内将其中一个物体置 换为大小相近，但形状和颜色不同的物体即新事物。视频记录15分钟。统计该小 鼠接触(包括嗅、拖、推、爬等动作)每个物体的时间。将该小鼠花在接触新事物的时间与两个物体总接触时间的比值记作认知偏好性。结果显示在相持阶段，Sandy 小鼠(sdy)的认知记忆能力(识别偏好性为51.88±3. 19%)较野生型(识别偏好性 为61.83±2.69%)减弱(图2)，表现出与精神分裂症患者类似的认知缺陷。
精神分裂症的病变主要认为集中在海马和皮层前额叶。为了观察Sandy小鼠是 否出现相应区域的病理改变，本发明分别分离DBA/2J (购自美国The Jackson Laboratory)禾口 Sandy小鼠(购自美国The Jackson Laboratory)海马脑组织，进 行组织包埋和切片，利用透射电镜观察海马CA1区神经元突触前小泡超微结构(图 3A)，发现Sandy小鼠(sdy)突触小泡的平均直径(46. 9 ± 0. 1 nra)较DBA/2J (WT) 突触小泡的平均直径(43. 8 土 0. 1 nm)增加约7% (/X0. 001)(图3B)。同时Sandy 小鼠中的单位面积内储存池中突触小泡数目较DBA/2J减少约23%(wt， 110. 1 ± 4. 2 /"m2; sdy， 85. 5 ± 4. 9; /X0.001)(图3C)。此外还发现不对称突触结构中(图 4A) ， Sandy小鼠表现为突触间隙宽度(synaptic cleft width)变狭窄(wt, 20. 5±0. 2nm; sdy， 16. 0 ± 0. 2 nni; 001)(图4B);突触后致密区厚度(PSD thickness)增加(wt， 44.2 ± 0. 7 nm; sdy， 48.6 ± 1. 0 nm; ;XO. 001)(图4C)。 这些超微结构的改变是本发明首次描述的符合精神分裂症内表型的特征病理改变。
基于上述超微病理变化，推测这些改变可能影响神经递质的释放。为了明确其 分子机制，着重从Dysbindin本身与一些已知的突触小泡释放调节蛋白的相互作用 入手，利用酵母双杂交方法(试剂来源于美国Clontech产品，AD和BD分别表示系 统的内对照)，检测了 Dysbindin分别与VAMP2， syntaxin 1, synaptotagmin 1， muncl8-l和sn即in等蛋白质的相互作用，结果仅在高严谨条件下(同时缺乏亮、 色、组氨酸和腺苷)发现Dysbindin与snapin的相互作用(图5)。这种作用方式 在小鼠中未见报道。具体方法如下按照美国Clontech公司Matchmarker 3酵母 双杂交系统的操作手册，将已构建于BD质粒(pGBKT7)的小鼠VAMP2， syntaxin 1， synaptotagmin 1， muncl8-1和snapin五种不同载体与构建于AD质粒(pGADT7) 的Dysbindin (即GenBank Accession Number AJ404859全长编码区cDNA)载体 共转化AH109酵母菌，涂于缺乏亮、色氨酸的低严谨培养基上，于30度温箱内培 养4天。然后将菌株转移到缺乏亮、色、组氨酸和腺苷的高严谨培养基上，于30 度温箱内培养3天以上，观察酵母生长情况。图5中，正负号表示对应于高严谨条 件下两两配对转化是否生长的结果，白色生长物表示可存活生长。
为了进一步研究Dysbindin是通过什么区域实现与snapin的互作，分段构建
了Dysbindin不同片段(括号内数字为各片段对应的氨基酸位置，AD和BD分别表 示系统的内对照)(图6A)，利用酵母双杂交方法(试剂来源于美国Clontech产 品)，分别检测与snapin的相互作用，结果发现在高严谨条件下(同时缺乏亮、 色、组氨酸和腺苷)，除C2和CT两个片段外，Dysbindin的其它分段均与snapin 的相互作用(图6B)。这一结果将dysbindin的互作区定位到M2肽段，即90-119 氨基酸区域。这一作用区域的发现有助于药物设计。具体的实验方法如下按照美 国Clontech公司Matchmarker 3酵母双杂交系统的操作手册，将已构建于BD质粒 (pGBKT7)的snapin与九种构建于AD质粒(pGADT7)不同大小的Dysbindin载体 (图6A中显示的片段大小是对应于GenBank Accession Number AJ404859的氨基 酸位置)共转化AH109酵母菌，涂于缺乏亮、色氨酸的低严谨培养基上，于30度 温箱内培养4天。然后将菌株转移到缺乏亮、色、组氨酸和腺苷的高严谨培养基上， 于30度温箱内培养3天以上，观察酵母生长情况。图6B中，正负号表示对应于高 严谨条件下两两配对转化是否生长的结果，白色生长物表示可存活生长。
权利要求
1、Sandy小鼠在筛选预防和/或治疗精神分裂症药物中的应用。
2、 一种筛选预防和/或治疗精神分裂症药物的方法，是用Sandy小鼠作为药物模 型，筛选预防和/或治疗精神分裂症的候选药物。
3、 Dysbindin蛋白或艽编码基因在筛选预防和/或治疗精神分裂症药物中的应用。
4、 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述Dysbindin蛋白的氨基酸序 列如GenBank Accession Number AJ404859的自氨基末端第1至352位氨基酸残基所
5、 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述Dysbindin蛋白的氨基酸序 列如GenBank Accession Number AY265461的自氨基末端第1至271位氨基酸残基所 示。
6、 一种筛选预防和/或治疗精神分裂症药物的方法，是以Dysbindin蛋白或其编 码基因作为指标进行药物筛选，能够提高Dysbindin蛋白或其编码基因表达量的物质 即为预防和/或治疗精神分裂症的候选药物。
7、 根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述Dysbindin蛋白的氨基酸序 列如GenBank Accession Number AJ404859的自氨基末端第1至352位氨基酸残基所 示。
8、 根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述Dysbindin蛋白的氨基酸序 列如GenBank Accession Number AY265461的自氨基末端第1至271位氨基酸残基所 示。
全文摘要
本发明公开了Dysbindin蛋白及其编码基因DTNBP1在精神分裂症中的新用途。该新用途是Dysbindin蛋白或其编码基因在筛选预防和/或治疗精神分裂症药物中的应用。
文档编号A61K49/00GK101204586SQ20071017943
公开日2008年6月25日 申请日期2007年12月13日 优先权日2007年12月13日
发明者新 何, 冯雅琴, 周志勇, 巍 李, 郝婵娟, 郭小黎 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所