专利名称：：葛根素在制备尿酸转运子urat1抑制药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及黄酮类单体化合物葛根素的新用途，具体是涉及葛根素在制备尿酸转运子URAT1抑制药物中的应用。
背景技术：
：尿酸排出减少或生成增加，可导致血液中尿酸浓度增髙，直接或间接引起相关疾病。尿酸的排泄是一复杂过程，尿酸随血液循环流入肾小球时，游离型的尿酸将全部滤过；在近端肾小管约99%尿酸盐被重吸收(DiamondHS,MeiselAD.Postsecretoryreabsorptionofurateinman.ArthritisAndRheumatism,1975,18(6):805-809.)。位于近曲小管的尿酸转运子(蛋白)URAT1参与尿酸重吸收过程，通过与阴离子的交换将尿酸盐由管腔转运入细胞。URAT1蛋白主要分布于肾皮质近曲小管上皮细胞向腔膜，是一个电中性的尿酸转运蛋白。URAT1基因由Enomoto等于2002年首先从人肾脏克隆出来，位于染色体1lql3，由SLC22A12基因编码，由10个内含子9个外显子组成，拥有12个跨膜结构域，其cDNA全长2642bp，编码区1659bp，编码含555个氨基酸的蛋白质。原发性肾低尿酸血症(hypouricemia)病人的SLC22A12基因缺陷病例进一步证明人的URATl(hURATl)参与尿酸的重吸收(AtsushiEnomoto，HiroakiKimura，ArthitChairoungdua,YasuhiroShigeta,etal.Molecularidentificationofarenalurate-anionexchangerthatregulatesblooduratelevels.Nature2002,417(6887):447-452)。葛根素结构式、分子式和美国化学文摘收录号(CASNo.)见下C2iH20O93681-99-0葛根素可由天然产物中分离得到，例如文献综述报道了利用溶剂法、酸水解法、盐析法、络合萃取法、大孔吸附树脂法、聚酰胺柱层析吸附法、环糊精键合固定相技术等由葛根分离纯化得到葛根素(梅林，石开云，杨元娟，李随丽.葛根中葛根素的分离纯化技术进展.广州化学2007;32(l):73-76);也有报道由化学改构/合成得到葛根素(Lee,DavidY.W.;Zhang,Wu-Yan;Karnati，VishnuVardhanR.Totalsynthesisofpuerarin,anisoflavoneC-glycoside.TetrahedronLetters(2003)，44(36)，6857-6859.)。葛根素已见有多种生理和药理活性的报道，包括扩张冠状血管的作用、对抗乌头碱和氯化钡诱发的心律失常作用、对心脏功能和心肌代谢的影响、改善微循环障碍、抑制血小板聚集、降血糖等作用(覃开羽，吴敏，葛根素的药理作用及不良反应分析.中国药业2007;16(3):60-61)。但化合物单体葛根素用于制备针对尿酸转运子URATl的抑制药物，则未见报道。
发明内容本发明的目的是提供单体化合物葛根素的新用途，具体是葛根素在制备尿酸转运子URATl抑制药物中的应用。本发明的技术解决方案之一是提供单体化合物葛根素用于制备尿酸转运子URATl抑制药物的新用途。该新用途包括了以本发明所述的葛根素，配以本领域的技术人员所熟知的药用辅料(赋形剂、助溶剂、控释剂等)，制成本领域的技术人员所熟知的剂型(包括口服液、注射剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、微囊剂等)，用于制备尿酸转运子URATl抑制药物。本发明的优点是，提供了对尿酸转运子URATl具有确切抑制调节作用的葛根素，用于制备尿酸转运子URATl抑制药物，可用于治疗与尿酸转运子URATl异常高表达相关疾病。与针对痛风或者高尿酸血病症的发明比较，本发明提供的单体化合物葛根素制备尿酸转运子URATl抑制药物新用途具有3个明显的进步和优点1、有效成分确切(单体化合物)；2、作用靶点明确(尿酸排泄过程中重吸收作用的尿酸转运子URATl);3、调节作用明确(抑制调节)。本发明利用高尿酸血动物模型在基因转录水平和蛋白表达水平上科学地评价并确定了单体化合物葛根素对尿酸转运子URATl的抑制调控作用。本发明所涉及的单体化合物葛根素对模型动物表达异常增高的尿酸转运子URATl具有确切的抑制作用；而对正常动物的正常水平尿酸转运子表达无显著抑制作用，具有很好的安全性。为了更好的理解本发明的实质，下面将用单体化合物葛根素的药理实验及结果来说明其在制备尿酸转运子URATl抑制药物中的应用。具体实施例方式以下实施例仅作为进一步阐述发明之用，不能用来限制本发明。实施例h单体化合物葛根素对尿酸转运子URATl的抑制调节作用实验动物昆明种小鼠，15-20克，雄性药物配制葛根素均匀分散于生理盐水中，用于灌胃给药，给药剂量为20mg/kg实验材料TrizolReagment(Invigen)，氯仿，异丙醇，无水乙醇，DEPC，M-MLV反转录酶，PCR试剂盒，RIPA裂解液等实验仪器高速冷冻离心机，高速匀浆机，Bio-rad垂直电泳槽，MBI-PCR仪、水平电泳槽等实验模型小鼠高尿酸血症模型。实验方法1、模型的建立动物适应环境l周后，灌胃给予氧嗪酸钾盐250mg/kg;对照给予等体积生理盐水，造模周期10天。2、给药造模期间同时给药，在给予氧嗪酸钾盐造模/生理盐水对照lh后，灌胃给予单体化合物葛根素20mg/kg;对照给予生理盐水。3、小鼠处死及组织的保存小鼠于灌胃给予葛根素/生理盐水l小时后处死，冰台上分离肾脏组织，肾组织经液氮冷冻后保存于-8(TC。4、蛋白质印迹法(Western-blotting):取组织约100mg加入lml的RIPA裂解液匀浆提取，12000g4'C离心15分钟，得肾脏组织总蛋白提取液，Bradford法测蛋白浓度，稀释蛋白样品至终浓度为5ug/ul。混合上样缓冲液变性上样，SDS-PAGE凝胶电泳后PVDF转膜，封闭液封闭1小时后加入mURATl抗体(根据NCBI数据库mURATl蛋白序列制备，使用浓度1:4000)4'C孵育过夜，二抗(1:4000)室温摇床孵育1小时，HRP-ECL发光，暗室曝光显影。胶片扫描后对图片进行灰度分析。5、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR):提取小鼠肾脏总RNA，逆转录得到cDNA模板，根据NCBI数据库的mURATl基因设计引物，进行mURATl目的基因扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后UV成像，对图片进行灰度分析。实验结果a.蛋白质印迹法Western-Blotting<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>T〈0.01与空白+生理盐水组比较尸<0.01与模型+生理盐水组比较连续10天灌胃给予氧嗪酸钾盐250mg/kg造模造成小鼠肾组织中URAT1蛋白高水平表达，灰度值达到96.3，显著高于空白对照55.3。灌胃给予20mg/kg的单体化合物葛根素可显著抑制模型小鼠肾组织中URAT1蛋白的高水平表达，灰度值为60.7，接近空白对照水平。说明单体化合物葛根素显著抑制模型动物异常增高的尿酸转运子URAT1蛋白表达。灌胃给予单体化合物葛根素对空白小鼠肾组织中URAT1蛋白表达水平无显著影响，说明单体化合物葛根素对小鼠肾组织正常水平的URAT1蛋白无显著抑制作用，具有较好的安全性。b.逆转录聚合酶链反应RT-PCRGroup空白+生理盐水空白+葛根素模型+生理盐水模型+葛根素n=5灰度值26.6±7.125.9±10.858.4±17.6"^28.8±12.4**户<0.01与空白+生理盐水组比较户<0.01与模型+生理盐水组比较连续10天灌胃给予氧嗪酸钾盐250mg/kg造模造成小鼠肾组织中URATlmRNA高水平表达，灰度值达到58.4，显著高于空白对照26.6。灌胃给予20mg/kg的单体化合物葛根素可显著抑制模型小鼠肾组织中URATlmRNA的高水平表达，灰度值为28.8，接近空白对照水平。说明单体化合物葛根素可在转录水平上抑制异常增高的尿酸转运子URAT1mRNA表达。灌胃给予单体化合物葛根素的空白小鼠肾组织中URATlmRNA表达水平为25.9，相对于空白对照组无显著变化，说明单体化合物葛根素对小鼠肾组织正常水平的URAT1mRNA无显著抑制作用，具有较好的安全性。实施例2:将单体化合物葛根素按照常规制剂方法，加入水及适量增溶剂(聚乙二醇400)溶解，分装，灭菌，制备成规格为20mg/ml的葛根素口服液；将单体化合物葛根素按照常规制剂方法，软胶囊材质选用明胶和山梨醇，制备成规格为20mg/粒的葛根素胶囊；将单体化合物葛根素按照常规制剂方法，加入赋形剂环糊精，混合均匀，制粒，压片，制备成规格为20mg/片的葛根素片剂。权利要求1.黄酮类单体化合物葛根素在制备尿酸转运子URAT1抑制药物中的应用。全文摘要本发明涉及黄酮类单体化合物葛根素的新用途，具体是涉及葛根素在制备尿酸转运子URAT1抑制药物中的应用。动物试验结果表明葛根素对高尿酸血模型动物表达异常增高的尿酸转运子URAT1具有确切的抑制作用，而对正常动物正常水平的尿酸转运子URAT1表达无显著抑制作用，具有很好的安全性，利用葛根素配以相关的药用辅料，用常规的制剂方法可制成葛根素口服液、胶囊剂、片剂、颗粒剂等尿酸转运子URAT1的抑制药物，可用于治疗与尿酸转运子URAT1异常高表达相关的疾病。文档编号A61K31/7048GK101181287SQ20071019013公开日2008年5月21日申请日期2007年11月15日优先权日2007年11月15日发明者孔令东,李建梅,颖潘,闯王申请人:南京大学