专利名称：从余甘子树皮提取天然抗氧化活性物质的方法
技术领域：
本发明涉及一种从植物材料提取天然抗氧化活性物质的方法，尤其涉及一种 从余甘子树皮提取天然抗氧化活性物质的方法。
背景技术：
余甘子(ew6&fl )在我国南方地区有广阔的资源分布。余甘子果实 具有清热、凉血、消食健胃、生津止咳、抑菌等药用功能，可加工成为食品、饮 料、保健品、药品和化妆品。近年来关于余甘子资源开发利用主要围绕余甘子人 工栽培和果实的加工利用。
余甘子树皮富含植物多酚，其主要成分为局部掊酰化(约25%)的聚原翠 雀素(polymeric prodelphinidins) _聚花青素(polymeric proanthocyanidins)的混 合物(3:1)。原翠雀素与原花青素同属于原花色素(proanthocyanidins)类。
研究表明，低聚原花色素(oligomeric proanthocyanidins， OPC)具有很强的 抗氧化生物活性，能清除人体内有害的自由基，提高人体的免疫力，可作为防癌、 抗突变、防治心血管疾病药物的主要有效成分和用作安全无毒的新型天然抗氧化 剂和自由基清除剂等，已成为医药、保健品的重要原料及食品、化妆品的重要添 加剂。
国外对原花色素(主要是原花青素)生物活性的研究已有几十年历史，特别 是自80年代以来，德国、法国、意大利、奥地利、日本、印度、匈牙利、韩国 等国家开展了大量的研究工作。我国从80年代起加入了世界研究开发原花色素 的行列。
1951年法国Jacques Masqudier首次发现了原花青素的抗氧化性能，并成功 地从海岸松皮中提取出原花青素。1967年美国Joslyn等从葡萄皮和葡萄籽中分 离出原花色素多酚化合物。1976年Bombardelli发明了从葡萄籽中提取高含量原 花青素混合物的方法。同期还有从法国海岸松树皮和从其它松属树皮中提取 pycnogenol (碧萝芷)、从葡萄籽和皮中提取grapenol等报道。国外相关专利较 为有代表性的有1969年法国Jacques Masquellier从海岸松树皮以沸水提取、乙酸乙酯萃取粗提液、三氯甲烷沉淀产物的方法。日本有贺敏明以^mc"/m /2/ppoc似tom/附树皮为原料，用水提取、石油醚洗涤、树脂吸附产物的方法。1989 年美国Tochiakl Ariga从松树皮以甲醇提取、石油醚洗涤、乙酸乙酯萃取、液相 色谱柱分离的方法。1996年波兰OszmianskiJan以丙酮为溶剂，采用超声强化从 葡萄籽中提取原花青素、乙酸乙酯萃取、三氯甲垸沉淀的方法。1997年美国 Henkel公司从葡萄籽以沸水提取、乙酸乙酯萃取粗提物、三氯甲烷沉淀的方法。 国内近些年来主要对从葡萄籽和松树皮提取原花青素抗氧化剂进行研究开发，并 有产品进入保健品市场。
从余甘子树皮提取天然抗氧化物质至今尚未见有国内外报道。
发明内容
本发明提供一种从余甘子树皮提取天然抗氧化活性物质的方法。
本发明采用如下技术方案一种从余甘子树皮提取天然抗氧化活性物质的方 法为
(1) 粉碎将洁净的余甘子树皮原料用植物粉碎机粉碎；
(2) 提取以水为溶剂，并按粉碎好的树皮原料和水的固液质量体积比为1 :5 10g/ml，将粉碎好的树皮原料浸入水中，在50 8(TC温度及超声波作用下， 浸提60 120min，得提取液；
(3) 絮凝沉降以壳聚糖乙酸溶液作为絮凝剂，将质量浓度为0.5 1%的壳聚 糖乙酸溶液加至提取液中，搅拌10 30min;壳聚糖的质量为树皮原料质量的 0.025 0.05%;
(4) 冷冻分离将加入絮凝剂的提取液降温至1 7°C，静置24 48 h，分离 出清液，沉淀物弃去；
(5) 清液在80 85t:下，加入清液中固含量的15 20%的活性炭和清液中固 含量的0.4 0.6%EDTA—2Na，搅拌0.5 — lh，过滤去炭，滤液作为树脂吸附分 离的上柱液；
(6) 树脂吸附分离将上述清液用水配成固含量为0.03 0.05g/ml的上柱液，
采用填料为预先按树脂产品说明书的要求进行净化处理的非极性或低极性大孔 吸附树脂，上柱液流速为1.2 1.8 BV/h，吸附后用纯净水洗柱，再用体积浓度 为60 80%的乙醇水溶液，以1.2 1.8BV/h的流速洗脱，收集洗脱液；
(7) 脱溶剂在常压下从醇水洗脱液中蒸出乙醇，得产物水溶液；
(8) 真空冷冻干燥产物水溶液经冷冻后真空脱水干燥，即得粉状天然抗氧化
活性物质。
与现有技术相比，本发明具有如下优点
本发明中目标产物的抗氧化活性(清除自由基的能力、抑制不饱和油脂氧化
和络合金属离子的能力)通过试验获得验证(见实验l、实验2、实验3)。
与现有的从植物资源提取原花色素的文献报道相比，本发明具有如下优点
1. 当前国内外与原花色素相关的研究主要集中在从葡萄籽、皮和松树皮原 料中提取分离天然抗氧化活性物质，而本发明是从余甘子树皮提取天然抗氧化活 性物质。余甘子在我国福建、江西、台湾、广东、海南、广西、四川、贵州和云 南等南方地区有广阔的资源分布，树皮原料来源丰富。目前余甘子树皮主要用作 生产制革鞣剂栲胶，产品附加值不高。本发明可进一步开发高附加值的新型天然 抗氧化剂，实现森林资源的高效利用。
2. 本产物的化学结构示意式为-
本产物的主要成分是局部掊酰化的原翠雀素-原花青素混合物。原翠雀素、 原花青素虽然同属于原花色素类，但分子结构上有明显的差异。余甘子树皮提取
物的占四分之三的聚原翠雀素的组成单元中，B环上3， 4， 5位共有3个邻位酚 羟基；另一特征是局部掊酰化，其底端单元为表掊儿茶素-3-0-掊酸脂，掊酰化 度约25%。原花色素类化合物分子结构中羟基数和相互位置对其生物活性起重 要作用，相邻的酚羟基多则生物活性强；局部掊酰化的结构更使化合物的生物活 性增强。因此本发明从余甘子树皮提取的以原翠雀素-原花青素为主的多酚化合
物与从松树皮和葡萄籽提取的以原花青素为主的多酚化合物相比，具有更强的抗 氧化、清除自由基的生物活性功能。
图l是产物的红外谱图。
其红外谱图表明在 3400 cnf'处的吸收属酚羟基一0H的伸縮振动，在1534 cm—'处属于B环伸縮振动吸收；729 cm—'和763 cm—1处吸收属B环C-H面外弯曲 振动；1030 cm—'、 1200 cm—\ 1336 cm—1处的吸收应属于OH面内弯曲振动；1691 cm一'处有属于C^O伸縮振动吸收，表明在C环C3位有掊酰基存在，以上特征吸 收与已有文献报道相符，证明本产物的主要成分是局部掊酰化的原翠雀素-原花 青素混合物。
具体实施方式
实施例l
一种从余甘子树皮提取天然抗氧化活性物质的方法为
(1) 粉碎将洁净的余甘子树皮原料用植物粉碎机粉碎；
(2) 提取以水为溶剂，并按粉碎好的树皮原料和水的固液质量体积比为1 :
5 10g/ml，将粉碎好的树皮原料浸入水中，在50 8(TC温度及超声波作用下， 浸提60 120min，得提取液。其中固液质量体积比可以为1: 5 10g/ml中的 任一数值，如l: 5g/ml、 1: 7g/ml、 1: 8g/ml、 1: 10g/ml等，温度可以为 50 80。C中的任一数值，如50。C、 58°C、 64°C、 75°C、 80°C，浸提可以是60min、 71min、 83 min、 96 min、 105min、 112 min、 120min等。
(3) 絮凝沉降以壳聚糖乙酸溶液作为絮凝剂，将质量浓度为0.5 1%的壳聚 糖乙酸溶液加至提取液中，搅拌10 30min;壳聚糖的质量为树皮原料质量的 0.025 0.05%;壳聚糖乙酸溶液的质量浓度可以是0.5%、 0.8%、 1%;搅拌时间 可以是10min、 19min、 30min等；壳聚糖的质量可以为树皮原料质量的0.025 %、 0.032%、 0.045%、 0.05%等。
(4) 冷冻分离将加入絮凝剂的提取液降温至1 7°C，静置24 48 h，分离
出清液，沉淀物弃去。提取液可以降温到rc、 2°C、 5r、 7'C等；静置时间可
以是24h、 35 h、 48h等。
(5) 清液在80 85'C下，加入清液中固含量的15 20%的活性炭和清液中固 含量的0.4 0.6%EDTA—2Na，搅拌0.5 lh，过滤去炭，滤液作为树脂吸附分 离的上柱液；清液可以在8(TC、 82°C、 85°C;活性炭的加入量可以是15%、 17 %、 20%; EDTA—2Na的量可以是0.4X、 0.5%、 0.6%;搅拌时间为0.5h、 0.8 h、 lh。
(6) 树脂吸附分离将上述清液用水配成固含量为0.03 0.05g/ml的上柱液， 采用填料为预先按树脂产品说明书的要求进行净化处理的非极性或低极性大孔 吸附树脂，上柱液流速为1.2 1.8 BV/h，吸附后用纯净水洗柱，再用体积浓度 为60 80%的乙醇水溶液，以1.2 1.8BV/h的流速洗脱，收集洗脱液；上液柱 固含量可以是0.03、 0.04、 0.05g/ml;流速可以是1.2、 1.5、 1.8BV/h;乙醇的体 积浓度为60%、 72%、 80%;洗脱时的流速为1.2、 1.6、 1.8BV/h。
(7) 脱溶剂在常压下从醇水洗脱液中蒸出乙醇，得产物水溶液；
(8) 真空冷冻干燥产物水溶液经冷冻后真空脱水干燥，即得粉状天然抗氧化 活性物质。
实施例2:
1. 将经净化、风干和粉碎(用植物粉碎机，通过02mm筛板)的余甘子树 皮320 g和浸提水2500 mL置于KH-200 DB型数控超声发生器槽内，在超声波 强化作用下进行提取。超声波频率为20kHz，超声波功率为200W，控制温度在 65±5°C，提取时间为60min。到时取出，过滤去渣，得提取液2180mL。
2. 将提取液浓縮至1100mL，加入浓度为P/。的壳聚糖乙酸溶液15mL，趁 热强搅拌后静置。冷至室温后将其置于7"C冰箱中静置48 h。分出清液1050 mL， 测其含固量为6.5%，总固物量为71.5g。
3. 清液在8(TC下，加入活性炭12 g和EDTA-2Na 0.4 g，搅拌0.5 h，过滤 去炭，滤液作为树脂吸附分离的上柱液。
4. 将部分清液(固含量为27.5g)用纯净水稀释至浓度为5% (w/v)，作为 上柱液，以1.5 BV/h的流速加至已经过预处理的AB-8型大孔吸附树脂分离柱
(BV=250 cm3)，而后用2.5 BV/h的纯净水洗柱，再用70%的乙醇水溶液550 mL
以1.5 BV/h的流速洗脱，得洗脱液。
5. 在常压下蒸出乙醇水洗脱液中的乙醇(回用)，用纯净水稀释，得产物水 溶液。
6. 将产物水溶液在低温下真空冷冻干燥，获得粉状目标产物19.5g。 实施例3:
1. 将按实施例1方法预处理的余甘子树皮350 g和浸提水2450 mL置于 KH-200 DB型数控超声发生器槽内，在超声波强化作用下进行提取。超声频率 为40 kHz,超声功率为100W，控制温度在70士5。C，提取时间为卯min。到时 取出，过滤去渣，得提取液2100mL。
2. 在提取液中加入17 mL浓度为1%的壳聚糖乙酸溶液，强搅拌后静置冷 至室温，放入5。C冰箱中静置24h后分出清液2000mL。
3. 清液在85。C下，加入活性炭14 g和EDTA-2Na 0.4 g,搅拌1 h，过滤去 炭，滤液作为树脂吸附分离的上柱液。
4. 将清液以1.7 BV/h的流速加至己经过预处理的AB-8型大孔吸附树脂分 离柱，而后用2.5 BV/h的纯净水洗柱，再用70%的乙醇水溶液以1.7 BV/h的流 速洗脱，得洗脱液。
5. 按实施例1中4、 5的操作，获得粉状目标产物39.6g。
实验l:本发明中目标产物清除自由基能力的测定
以二苯基-苦基-肼基自由基(DPPH，美国Sigma公司)为标准物，用分光 光度法测定试样对DPPH的清除效率。
吸取DPPH的甲醇溶液(浓度为0.025 mg/mL) 5 mL，与目标产物试样的甲 醇溶液(浓度为0.07 mg/mL) lmL混合。在A二517nm处(以甲醇为参比)跟 踪测定吸光值。当吸光值下降至恒定不变时，记录时间rs (min)和恒定吸光值 A，按下式计算清除效率S五和清除速率57 。按上述同样方法与常用自由基清除 剂茶多酚进行对比试验。
清除效率X100%
4) 清除速率Si 二^^i
附2 X K
式中
A—不加清除剂的DPPH溶液的吸光值； 附i一试液中DPPH的质量，mg; W2—试液中清除剂的质量，g; Ts—达到吸光值恒定时需要的时间，min。
在相同试验条件下，测得目标产物和茶多酚清除DPPH的效率分别为91.8 %和90.6%， DPPH清除速率分别为820 (mg . g" . min")和809 (mg g". min")。可见本产物清除DPPH的能力与茶多酚处于同一水平，且略高于茶多酚。
实验2:本发明中目标产物对不饱和油脂的抗氧化性能测定
以不含抗氧化剂的食用植物油为底物。按1 kg底物油加入0.4 g抗氧化剂的 比例，称取实施例2中制备的目标产物试样12mg，在容器中溶于6mL的40X 乙醇。加入30 g底物油和40 mg吐温60，振荡混合使其充分乳化作为试验液。 置于60土2t:恒温振荡水浴内，每隔一定时间取样3 g，用碘量法(GB/T 5538-1995
《油脂过氧化值测定法》)测定其过氧化值POV (meq/kg)，并计算抑制率/￡。 同行空白，并以茶多酚试样进行试验作为对比。24h后，测定试验液的过氧化值
(meq/kg)分别为15.35 (空白)，4.62 (加入目标产物试样)，4.33 (加入茶多 酚试样)。
由此计算各试样对底物油脂氧化的抑制率为69.9% (目标产物)，71.8% (茶
多酚)。二者近似处于同一水平。
实验3:本发明中目标产物对金属离子的络合性能测定
目标产物能与F^+离子生成有色络合物，用分光光度计在波长584 nm处有 特征吸收峰，其吸光度与络合物的浓度成正比。
在5mL浓度为0.02mg/mL的试样溶液中，分别加入0、 1、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0、 3.5、 4.0、 4.5 mL浓度为0.482 mg/mL的Fe"+溶液，再分别用蒸馏水定容至 10mL，用分光光度计在584 nm处分别测定吸光度。当F^+溶液加入量增加至
吸光度保持恒定时，表明试样溶液对F^+离子的络合已经饱和。
由此计算目标产物对F^+离子的络合能力为385 mg/g。表明目标产物具有
较强的络合金属离子的能力。
权利要求
1.一种从余甘子树皮提取天然抗氧化活性物质的方法，其特征在于(1)粉碎将洁净的余甘子树皮原料用植物粉碎机粉碎；(2)提取以水为溶剂，并按粉碎好的树皮原料和水的固液质量体积比为1∶5～10g/ml，将粉碎好的树皮原料浸入水中，在50～80℃温度及超声波作用下，浸提60～120min，得提取液；(3)絮凝沉降以壳聚糖乙酸溶液作为絮凝剂，将质量浓度为0.5～1％的壳聚糖乙酸溶液加至提取液中，搅拌10～30min；壳聚糖的质量为树皮原料质量的0.025～0.05％；(4)冷冻分离将加入絮凝剂的提取液降温至1～7℃，静置24～48h，分离出清液，沉淀物弃去；(5)清液在80～85℃下，加入清液中固含量的15～20％的活性炭和清液中固含量的0.4～0.6％EDTA-2Na，搅拌0.5-1h，过滤去炭，滤液作为树脂吸附分离的上柱液；(6)树脂吸附分离将上述清液用水配成固含量为0.03～0.05g/ml的上柱液，采用填料为预先按树脂产品说明书的要求进行净化处理的非极性或低极性大孔吸附树脂，上柱液流速为1.2～1.8BV/h，吸附后用纯净水洗柱，再用体积浓度为60～80％的乙醇水溶液，以1.2～1.8BV/h的流速洗脱，收集洗脱液；(7)脱溶剂在常压下从醇水洗脱液中蒸出乙醇，得产物水溶液；(8)真空冷冻干燥产物水溶液经冷冻后真空脱水干燥，即得粉状天然抗氧化活性物质。
2. 根据权利要求1所述的从余甘子树皮提取天然抗氧化活性物质的方法， 其特征在于步骤(l)中粉碎机的筛孔直径为2 4mm。
3. 根据权利要求1所述的从余甘子树皮提取天然抗氧化活性物质的方法， 其特征在于步骤(2)所述浸提温度为60 80。C，超声频率为20 40 kHz，功率 100 200W。
4. 根据权利要求1所述的从余甘子树皮提取天然抗氧化活性物质的方法， 其特征在于步骤(5)所述分离柱填料是AB-8树脂或D101树脂。
全文摘要
本发明涉及一种从植物材料提取天然抗氧化活性物质的方法，公开了一种从余甘子树皮提取天然抗氧化活性物质的方法(1)粉碎；(2)提取以水为溶剂，并按粉碎好的树皮原料和水的固液质量体积比为1∶5～10g/ml，将粉碎好的树皮原料浸入水中，在50～80℃温度及超声波作用下，浸提得提取液；(3)絮凝沉降以壳聚糖乙酸溶液作为絮凝剂，将壳聚糖乙酸溶液加至提取液中，搅拌10～30min；(4)冷冻分离将加入絮凝剂的提取液降温，静置，分离出清液，沉淀物弃去；(5)清液中加入清液中固含量的15～20％的活性炭和清液中固含量的0.4～0.6％EDTA-2Na，搅拌0.5-1h，过滤去炭，滤液作为树脂吸附分离的上柱液；(6)树脂吸附分离，脱溶剂，真空冷冻干燥即得粉状天然抗氧化活性物质。
文档编号A61K36/47GK101204417SQ20071019131
公开日2008年6月25日 申请日期2007年12月18日 优先权日2007年12月18日
发明者吴冬梅, 吴在嵩, 曼 徐, 汪咏梅, 陈笳鸿 申请人:中国林业科学研究院林产化学工业研究所