专利名称：获得医用纯单唾液酸神经节苷脂gm1的方法
获得医用^唾^M神经节苷脂GM1的方法本发明涉及单唾^^神经节苷脂GM1，更确切地，涉A^得和纯4傳唾液 酸神经节苷脂GM1的方法. 背景技术神经节苷脂是一类鞘糖脂，具有一个或多个唾'^Wi基，被大量发现于人 类和动物的大脑、神^BL织中。已知单唾^M神经节苷脂GM1可用于很多药学 应用中，特别是在中才E^周围神经系统病症的修复和治疗中。按照美国专利US 4 849 413，从牛或猪的 组织中方^ _取冲经节苷 脂。为了适合于制药学的应用，单唾^M神经节苷脂GM1 ^必须被一离并纯 化。为了提高单唾' _神经节苷脂GM1的产率，已知用化学、酶的方法来处理 提取的脂质^^，以姊它神经节苷脂组^^^4唾';^^神经节苷脂GM1。 这些方法包括用弱酸水解，例如CN 1353112中所记载的，或利用唾^^酶进行 酶水解，例如在US 5296360中所记栽的。在EP0150 712中记载了^JJ氯仿甲醇^MU;匕为60: 30: 4. 5的^M^t， 通过棑阻色镨法对所述强化GM1的脂质^^物的进一步纯化。EP 0 489 352记 载了通过用a-环糊精对脂质';^^溶 :#^滤，之后用乙醇溶剂萃取而对 GM1进行萃取，对GM1强^!旨质^^物的纯化。据aii可以获得ityt为95%的 GM1。这些方法先前已经,皮证实在GM1的純度和产率、以及涉及到费用、效率和 应用于工业赠的有效'I^Ji,存在缺陷。对于制药学应用，需要生产出高舰的神经节苷脂GM1。相应地，>^#着 对获得高純度神经节苷脂GM1的迫切需求。本申请的发明者惊奇^JL，通it&于离子交换色语法的方法，可以将神 经节苷脂GM1从^f申经节苷脂质中有^i^分离出来。基于本发明，已逸发现^^含有钾或铯离子的' ^€过离子交换柱色谱 从含有单唾液酸神经节苷脂GM1作为主要神经节苷脂组分的脂质混合物中将4GM1分离出来的方法，可以制备出高^tl的神经节苷脂GM1。基于本发明，提供了一种才M^U'漆求1所述的神经节苷脂GM1的分离和 纯化方法。基于本发明的^^胁实施方式，提供了一种含有下逸悉的步骤的方法 (a MM含有钾或铯离子的洗脱M过离子交换柱色i普从含有单喻;iJt^神 经节苷脂GM1作为主要神经节苷脂组分的脂质;S^中分离出GM1，(b) 从' 6^中回^i^，(c) 对回收的^的7j^目ig^ii行渗滤，(d) 加入钠盐，并对所得^i行渗滤，并(e) 回收GM1。优选，本发明的方法允许高純度单神经节苷脂GM1的制备。才財居本发明， 单唾'^M神经节苷脂GM1可以以高于98%的^>1，甚至高于99.0%，甚至99.90/。的^t^皮制备出来。进而，本发明的方法有利^WM简单步骤，是划算的，JLit合于工业, 的应用。显现。详细说明本发明提供了-"^单神经节苷脂GMl纯化的方法，其中GM1是4M含有钾 或铯离子的^^i过离子交换柱色i普从含有单唾'^^神经节香脂GM1作为主 要神经节苷脂组賴脂质^^中分离出来的。在一个优选的实施方式中，提供了 一种制备高纯度单唾液酸神经节苷月旨 GM1的方法，包^#骤(a MM含有钾或铯离子的、3UWit过离子交换柱色镨从含有单唾^^神 经节苷脂GM1作为主要神经节苷脂组分的脂质^^中分离出GM1，(b) 从步骤(c)的^^t中回il4^:质，(c) 对步骤(d)回收的溶质的7M目^it行渗滤，从而去除残留的^f或她(d) 加入钠离子，M以适宜的钠盐的形式，以置换出与GM1结合的钾或 铯离子，并对7M目ii^ii行渗滤，以除去残留钠盐，并且(e)回收钠盐形式的GM1。月旨质;^^可以由牛、绵羊、马、猪^纟1^只的脂质*14€物制备。 有利地，含有单唾^^神经节苷脂GM1作为主要神经节苷脂组分的脂质混 杨可以由含有至少30%、 ^f^E少50%,更^Li^少70%的神经节苷脂^^ 物的脂质提取物制4#到。脂质提取的剩余物通常由确脑苷脂、脑普脂、脂肪 酸和蛋白质《M,M为约50000道尔顿的膜进4亍渗滤，从而4^Ut盐。对于渗滤，可以^JD ^^r传统的透析膜。^i^过滤盒，例如可以使用SART0C0N (赛多利斯)聚砜 ^±>虑盒类型，比如具有约50000道尔顿分离点(cut-off)的。脂质提MH^经受7jc解处理以将^i要神经节苷脂组分例如GTlb、 GTla以及GDlb转变成GMl以提高GM1的含量。水解可以使用传统方法进行。水解可以有利地/^jf]文献中已知的用于神经 节苷脂的被称为酸水解或酶7]c解的两种常^Mc解方法中的任何一种进行。酸水解可以例如^^稀itiA^例:M^盐酸、石if[^和硝^Mi行。^7jc解可 以通过调整脂质提絲7j^目溶液的pH值到衬pH3. 5到5之间，她pH4. 0左 右，然后加热il^一温度^^介于90匸到100^之间并##完成^^要神 经节苷脂组^#化成GM1所需要的时间而实现。将主要的神经节苷脂水解成GM1 所需的时间絲于pH值和所选辆温度。通常，pH鹏高，完成7傳所需要的 时间越长，而M温J^高，完成水解所需的时间越短。水解反应通常可以进 行大约2到5个小时。例如，当在pH4.0和95t:下进^7jC解时，所需的完成水 ^v^的时间U约3小时。酵水解可以4^H^f5f适宜的唾';^I^Ji行。伏选可以使用产脲节杆菌唾'; ^系s或霍舌m菌喻;^11。 ^^^产脲节杆菌唾^m系s和霍舌ui菌唾，^H对GTla、 GDla、 GDlb是有活性的，但对GM1没有活性。酶水解可以通过 例:i,整脂质提,7j^目驗的pH傲ij所^^J的S^^佳活性的pH,例如在pH4 和pH6之间，例如大约pH5而进行，通it^加适合的緩冲液例如醋酸緩沖液， 在唾、^H是霍舌Ul菌唾';^l的情况下加入Ca2+离子，并在所用酶的最佳活性 温度例如大约37。C下加热溶液，保^t所需的时间从而完A^变。水解通常可以 进行大约12-24小时，取决于添加的酶剂量。由于其属于非特异性水解过程，以及向^f申经节苷脂类的转^it常提供较低的GM1产量，所以酸水解是较不 的。而且，^7jc解过程会导致缺乏唾 ^M^的"GM1杂质的形成。由于高的化学转4沐异性，其通常提供更高的GM1产率，因jH^7jc解方法 是她的。对于酶7jc解，产脲节杆菌唾 ||是她的，因为其不需要为其活 性而添加Ca"离子。进而，由于其52 000道尔顿的衬量(相对于霍舌L^菌唾 酶的82 OOO道尔顿)，其可以有利皿ii^滤被洗去。为了 A^彰良中回收这样产生的具有提高单唾';^i^神经节苷脂GM1 ^f: 的脂质^^物，^J^液可以有利地^^滤，例M过具有10000到100000道尔 顿，絲约为50000道尔顿的微3U^寸的膜。渗滤可以^^Hi^传统的透析膜。 可以有利地^U过滤盒，例如SARTOCON (赛多利斯)聚飒的ii;虑盒类型，优 i^具有约50000道尔顿的分离点(cut-off)的，ISt^将渗透物干燥而获得包含 单唾'^i^神经节苷脂GM1作为主要神经节苷脂组分的脂质^^粉末。干燥可 以通过传统方法进行。有利地，干燥可以通过喷雾干M真空干燥进行。月旨质》^^通tT以含有10到200g/lt的GMl M, > ^少100g/lt。基于本发明的方法，神经节香脂GM1是{^)离子交换色语W旨质;^^中 的，申经节苦脂中分离出来的。已经惊奇^JL，当^^1含有#^钾离子的 ^时，从^k^唾'^j^神 经节苷脂类中成功分离出GM1是可能的，￡^现，传MJi使用的离子交^^UUt常不允许有^kA^^唾^^神 经节苦脂类中分离出GM1。特别值得注意的是在通过已知水解处理生产的猪的脂 质混合物中作为主要的神经节苷脂杂质存在的岩藻糖跣单唾液酸神经节苷脂 GM1。GM1和岩藻糖酰GM1两种衬具有非常勤以的物理特性。两絲带有单个 负电荷，由唾'滅的^iJ^团提供，并財剿以的衬量；分别是1558和1704。 从而，当^^填ffi平衡的离子交换柱中时，两种神经节苷脂^t脂的结合力 ;i相同的。已^M^到，当向'3yw中添加醋酸钠以增大'3ym的离子强度，并提供置换神经节苷脂的糾时，^目同的离子强度和相同时间下，GM1和岩藻糖酖 GM1#MC， 。不能实m两种单唾^M神经节苷脂的分离。然而，本发明者惊奇itk^现，^^)絲钾离子，例4oiiit^加曱醇钾或醋酸铯，岩藻糖酰GM1被首先洗脱，从而GM1和岩藻糖酰GM1被分别洗脱。分离 是彻底的，神经节苷脂GM1和岩藻糖酰GM1中每种树以4紛离。同时，不希望被^K理论所约束，本发明的发明人认为，所，JL^到的分离 可以归因于下述事实，与传统的离子交换理^目反，溶质GM1和岩藻糖酰GM1 不但依照其与树脂结合力的顺序，而且依照它们与为了将其^^Ji分离必须 结合的反荷离子的亲合力的顺序而净iaMi子上树出来。从而，遵循这种理论， 假如两种溶质中的一种具有与反荷离子不同的亲合力，那么i^将被以两种不 同的离子强度释改出来，并能够进^^化。本发明人已经惊奇iiyL现，尽管存在所有^H^t金属属于同一族的事实，单 唾液酸神经节苷脂GM1和岩藻糖酰GM1对钠具有相同的亲合力，^j"钾和铯的 亲合力不同。已经由本发明者发现，岩藻糖酰GM1对钾和铯比GM1具有更高的 亲合力，并^^b'皿出来。本发明的离子交换色镨方法能够方^^/使GMl M藻糖酰GM1中有^tk^ 离出来。进而，本发明的方法^利地允许GM1 ^目应的脂m中分离出来。 与神经节苷脂具有相同电荷的脂肪酸，具有对于M钟离子更高的亲合力。对于离子交换色镨，可以^^HW可适宜的树脂。有利地可以使用具有季氨 基的树脂，例如FRACTOGEI^EMD窗E (S)或琼脂^t:^M^t脂例:^Q"琼脂^t凝 胶HP树脂。在第一步骤中，用合适的溶剂平 悄旨。^i复的溶剂^t乙醇、曱醇或甲 醇和氯仿的混合物。伏i4i^剂为曱醇，因为其是神经节苷脂、钾和铯盐都育膝 解的。然后用月旨质^^在合适的，Mf^剂中的溶^^^ti子。 ^剂应当包 含与用于平IW脂的溶剂相同的溶剂组分。^^斤选择的溶剂是甲醇。用'舰 溶剂初步'W6^^键^^质例如脑苷脂得以'WL1^#^或铯离子加入 ^剂中。4f或铯离子皿以钾或铯的醋,、 甲酸盐、丙酸盐或^^W的盐的曱醇M的形式提供。醋酸钠或醋酸钾的 曱醇溶^i优选的。有利地，醋酸钾或醋酸#^皿液中可以以足够将洗皿 中的导电率减少到110(KU00nS/cm, 1200~1300pS/cm的量而存在。这种 包^t内或钾盐的洗脱液可以以任何^复的沐速，例如介于100inl/h到140ml/h之间的;腿均匀通过柱子。假如^u按照本发明的离子交换色谱方法进行分离，脂肪酸和岩藻糖酰GM1在GM1之前被' ,同时仍然和柱子结合的石細苷脂可以錄洗^Ht程中被含有GM1的洗出液被收集，有利地，M^子上'皿的^M^剂可以通过蒸 馏而回l含有GM1的溶质可以通过将洗出溶液干燥而回收，从而生产出含有GM1的 粉末。干燥可以^^I传统方法iMi行，例如喷雾干絲真空干燥。随后，含有GM1的溶质可以通过具有微《LX寸为10000到100000道尔顿， M约50000道尔顿的薄膜的水相i^^滤而初婉化，以去除残留的钾或铯盐。 4iit地，iL^酸，例如含7JC5克酸、硝酸，或者M盐酸，可以在渗滤^^前^b^ Ai^中以调整pH到# pH6到8之间，M约pH7。钠离子，合适的是以钠盐的7jc溶液的形式，优选NaCl，可以被加AJiJ溶液 中，从而置换出与GM1连接的钾或铯离子，并获得生理钠盐形式的GM1。船溶经历第二次渗滤以消除残留盐(例如NaCl)。有利地，可以^^]过滤盒，例如 SART0C0N (Sartorius )聚m^:型，伏it具有50000道尔顿的分离点(cut-off) 的it^虑盒。船il^^可以被干燥以回收粉末形式的GM1。干燥可以以員方法进行。 有利地，干燥可以通过喷雾干g真空干燥进行，^ 、本发明获得的GM1具有98 %或更高^1的级别,通常为约99. 0到99. 9 % 。 ^M本发明的方法获得的GM1包含岩藻糖酰-GMl杂质少于0.1 %。本发明的方法方^^能够从^^唾 _神经节苷脂类中有效分离GM1。 特别是，本发明的方法允许^藻糖酰"^M1杂质中将GM1分离出来。有利地，本发明的方法允许^^产率和高7jC平^l的单唾'^^神经节苷脂 GM1的制备。才財居本发明方法纯化的GM1可以用于人类和动物受治疗者的处理，特别是， 才娥本发明的纯化GM1被设想用于人类或哺乳动物的治疗，特别是中才沐夕卜围 神经系统病症和疾病，包括脑中风，帕金森病、脊髄损伤、阿耳茨海默氏病、 m链动障碍、M缩侧索硬化、周围神经病变和自主神经性病变。本发明可进一步通过下述实施例进行阐it实施例实施例1含有单唾^^神经节苷脂GM1作为主要神经节苷脂类的脂质〉V給物的制备以约25g/1的浓度#^有具有70 % M的神经节苷脂濕^的脂质提, 溶解于纯化水中。1^溶液通过具有50 000道尔顿分离点(cut~off )的 SART0C0胸聚^Mtifl盒渗滤'船通ii^加50mM的醋酸緩沖液和4mM的氯化钩将200 1的溶液平衡到 pH5.5。加入30000 U的霍《U^菌唾'^SI，并将il^口热到37"C保持12小时 以完成^i要神经节苷脂类(GTlb、 GDla、 GDlb)到GM1的转化。所得的溶 液具有14-15g/l的GMl狄。在酶7]<#^， i^bit过具有50 000道尔顿的分离点(cut-off)的it^虑 盒渗滤。随后将1M NaCl加入滞留物中，使M经历第4渗滤。在第4渗 滤之后，通过不经伶阿水置换的渗透物流动，滞留物被浓缩到GM1浓度为 100g/l。然后，^Mt真空下千燥，获得大约3200g的，具有通过HPLC测量浓 >^7 85 %的粉末。得自含有单唾'^M神经节苷脂GM1作为主要神经节苷脂类的脂质^^物的 GM1的纯化^^1前述步^^得的粉末制备^JL^ 10g/l的甲醇溶液，溶液5f顿过0. 22 jam的Sartopore滤芯(由Sartorius AG制造)，船，对每个循环，在含有20 1在曱醇中平l^1 Fractogel EMD TAME (S)树脂的FPLC柱子Ji^填7升经过滤的溶l歸柱子用具有1200-1300 HiS/cm的传导率的甲醇醋酸钾的曱醇驗，以1201/h的-腿'舰。重复循环 J^GM1溶液的终点。洗出液(大约60-70 l)通过蒸馏不断浓缩，然后被干燥以获^#末，并 回收甲醇。所获得的粉末是纯GM1和醋酸钾的混*。由此获得的粉^解于纯化水中至25g/l的M，并添加18 %的HC1将pH 中和到7。通过具有50 000道尔顿的分离点(cut-off)的it)虑盒，外溶^^滤。 而后加入lMNaCl,絲过具有50 000道尔顿的分离点(cut-off)的it 虑盒， 对溶液再次渗滤。在第二次渗滤^，通过不经^^T水置换的'^t物流动，将滞留物棘到100-120 g/1 。浓缩的溶液随后通过0.22ym过滤器过滤并通过喷雾千燥，以提供大约 2700g白色-浅褐色的GMl粉末，由TLC鉴别，此GMl粉末具有由HPLC测量的 99. 8 %的^。所得的GMl粉末具有通过HPLC测量的小于0.1 %的岩藻糖酰"GMl棘雄实施例制备和纯化GM1的方法以与上述实施例1中相同方式进行，除了柱色镨中 甲醇醋酸钾的曱醇溶液由曱醇醋酸钠的甲醇溶液代替"卜。获得3100g由HPLC测量含有91 %GM1和8 Q/Q岩藻糖酰-GM1的GMl粉末。 M述实施例可以看出假如用醋酸Wt GMl '^ym,获得的GMl的 _很 低。这可^i由于与相反的完全将两者的峰分离开的钾或^^荷离子相比，钠 反荷离子无法区分GM1和岩藻糖酰-GMl的事实。
权利要求
1.单唾液酸神经节苷脂GM1的分离和纯化的方法，包括步骤(a)使用含有钾或铯离子的洗脱液通过离子交换柱色谱从含有单唾液酸神经节苷脂GM1作为主要神经节苷脂组分的脂质混合物中分离出GM1，(b)从洗脱溶液中回收溶质，(c)对步骤(b)回收的溶质的水相溶液进行渗滤，(d)加入钠盐，并对所得的水相溶液进行渗滤，(e)以钠盐的形式回收GM1。
2. 才^^5Uf'J^"求1的方法，其中，3fe^包，酸钾或醋酸铯。
3. 才娘权利要求2的方法，其中洗Wbl醋酸钾或醋酸铯的甲醇M。
4. 才娘;M'j要求1的方法，其中离子交换柱含有具有季^^团的树脂。
5， 4娥权利要求1的方法，其中离子交换柱首先用甲醇平衡。
6. #^权利要求1的方法，其中NaCl是在步骤(d)加入的。
7. 才n^m'j^求i的方法，其中渗滤是^^具有^tnx寸为ioooo-iooooo道尔顿的膜进行的。
8. #^权利要求1的方法，其中GM1在步骤(e)中的回收包减过喷雾 干;^真空干燥才^^^iifrt燥从而生产出粉末。
9. 才M^MyNU的方法，^t过离子交换色傳对GMl进行分离之前，包 括一顿纯化的步骤，所舰化步骤包括(a) 通过具有微孑U^HH^ 10000-100000道尔顿的膜，对含有单唾、;^ 神经节苷脂GM1作为主要神经节苦脂组^脂质^^物的7K4目溶^ii行渗滤，(b) ，渗透物并回收包含GM1的溶质脂质〉V^物。
10. wj^求1所述的方法，其中包含单唾'^^神经节苷脂GM1作为主要 的神经节苷脂组分的脂质^^是通it7jC^^有具有^y^少50%的神经节苷 脂^^的脂质^^而获得的。
11. 拟，J^求10的方法，其中水解是通过用产脲节杆菌唾自酶系S或霍 舌li瓜菌唾、mi^t鄉旨质提,而进行的。
12. 纯4傳唾^_神经节苷脂GM1的方法，包才錄过^^J含有钾或铯离子 的洗脱液藉由离子交换柱色镨，从含有包含单唾液酸神经节苷脂GM1作为主要的神经节苷脂组分的脂质混合物中分离单唾^^神经节苷脂GM1。
13. ^t^U'j^求12所述的方法生产的单唾^m神经节苷脂GM1 ，具有99. 0 %或更高的^1.
14. 才M^U'j^求13所述的单唾:^^神经节苷脂GM1,包含少于0.1%的 岩藻糖酰-GMl.
15. 才娥权矛JJMU3所述的单唾'^^神经节苷脂GM1，用作药剂'
16. 才M^WJ要求13所述的单唾^^f申经节苷脂GM1用于生产治疗中才咏 外围神经系统病症和疾病的药物组合物的用途。
全文摘要
一种制备纯的钠盐形式的单唾液酸神经节苷脂GM1的方法。提供了一种分离和纯化单唾液酸神经节苷脂GM1的方法，包括(a)使用含有钾或铯离子的洗脱液通过离子交换柱色谱从含有单唾液酸神经节苷脂GM1作为主要神经节苷脂组分的脂质混合物中分离出GM1，(b)从洗脱溶液中回收溶质，(c)回收溶质的水相溶液进行渗滤，以及(d)在加入1M NaCl之后进行第二次渗滤，并回收GM1。获得的GM1的纯度水平高于99.0％。
文档编号A61P25/02GK101328196SQ200710199780
公开日2008年12月24日 申请日期2007年9月29日 优先权日2007年6月18日
发明者R-P·邦特, S·卡里诺 申请人:梅迪多姆实验室股份有限公司