一种复方斑蝥口服制剂的质量控制方法

专利名称：一种复方斑蝥口服制剂的质量控制方法
技术领域：
本发明涉及一种复方斑蝥口服制剂的质量控制方法，属于对药品进行质量控制的技术领域。
背景技术：
恶性肿瘤是一种严重危害人类健康的疾病，几十年来人类一直在不断的研究和开发新的药物以有效的抑制恶性肿瘤的生长。在研究过程中，有效的筛选出具有抗肿瘤作用的药物就显得尤为重要。复方斑蝥口服制剂由斑蝥、人参、黄芪、刺五加、三棱、半枝莲、莪术、山茱萸、女贞子、熊胆粉、甘草共十一味药物制备而成，具有破血消瘀，攻毒蚀疮的作用，主要用于原发性肝癌、肺癌、直肠癌、恶性淋巴瘤、妇科恶性肿瘤等疾病。其中“复方斑蝥胶囊”在国家卫生部药品标准中药成方制剂第十七册有记载。但是经过研究发现，现有复方斑蝥制剂存在着质量控制标准简单，产品质量不易控制等缺点。半枝莲、山茱萸、女贞子等为复方斑蝥制剂中有效成分，而现有制剂质量标准没有将其薄层鉴别方法收入其中；对人参和黄芪两味药材的薄层鉴别中，展开剂的选择不够理想，造成放置时间较长，操作不便，并且由于操作环境等因素影响，导致在鉴别过程中分离度不好，斑点显色不够清晰；氯仿毒性较大，为国家列出的二类溶剂，现有制剂提取工艺是用氯仿进行浸提，而在质量标准中没有严格要求控制其限度。另外，现有制剂质量标准对复方斑蝥制剂中有效成分黄芪和斑蝥素的含量没有建立准确有效的测定方法。故现有质量控制方法不能有效控制复方斑蝥口服制剂的质量，从而将影响该制剂的临床疗效。但是如何制定科学合理的质量控制方法，有效控制这种口服制剂的质量，从而确保其临床疗效，是本领域技术人员必须考虑的问题。

发明内容
本发明的目的在于提供一种复方斑蝥口服制剂的质量控制方法，该口服制剂包括胶囊剂、片剂、颗粒剂。本发明针对现有技术的不足，对复方斑蝥口服制剂的质量控制方法进行了研究，增加了黄芪和斑蝥素的含量测定以及半枝莲、山茱萸、女贞子的薄层鉴别项目，增加了氯仿残留量的检查，并对人参和黄芪两味药材的薄层鉴别方法进行了改进，对展开剂以及薄层板的厚度进行选择，优化了鉴别方法，提高了这种复方斑蝥口服制剂的质量控制标准，从而保证了该制剂的临床疗效。
本发明所述复方斑蝥口服制剂是这样构成的按照重量组份计算它主要由斑蝥4-12、人参10-30、黄芪50-150、刺五加50-150、三棱16-48、半枝莲60-180、莪术16-48、山茱萸20-60、女贞子20-60、熊胆粉0.4-1.2和甘草10-30制备而成。其制备方法为以上十一味，除熊胆粉外，人参、山茱萸、女贞子、半枝莲粉碎成细粉，过筛，备用；斑蝥用氯仿浸泡提取1-5次，每次16-48ml，浸泡48-96小时，合并提取液，回收氯仿，浓缩至稠膏状；其余黄芪等五味加水煎煮1-5次，每次0.5-5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度约为1.00-1.40(60-100℃)；熊胆粉加80℃水溶解后，加入上述稠膏、浓缩液及人参等细粉，搅匀，在100℃以下烘干，粉碎成细粉，加入辅料，用常规方法制成胶囊剂、片剂或颗粒剂。本制剂中可加入辅料，也可不加入辅料。
本发明所述质量控制方法主要包括性状、鉴别、检查以及含量测定项目中的部分或全部；其中鉴别包括对制剂中人参、黄芪、半枝莲、山茱萸和女贞子的薄层色谱鉴别；检查包括水分、氯仿残留量以及其他常规项目；含量测定是对制剂中黄芪和斑蝥中所含斑蝥素的含量测定。
人参和黄芪的鉴别方法是以人参皂苷Rg1对照品及黄芪甲苷对照品为对照，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝5-50∶2-20∶0.5-10的下层溶液为展开剂的薄层色谱法；半枝莲的鉴别方法是以半枝莲对照药材为对照，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝2-20∶1-9∶1-9为展开剂的薄层色谱法；山茱萸的鉴别方法是以马钱苷对照品为对照，以甲苯∶丙酮∶无水乙醇∶甲酸＝1-9∶5-50∶0.5-10∶0.1-0.9为展开剂的薄层色谱法；女贞子的鉴别方法是以女贞子对照药材为对照，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝10-50∶1-9∶0.1-0.9为展开剂的薄层色谱法；氯仿残留量的检查方法是以氯仿对照品为对照的气相色谱法；黄芪的含量测定方法是以黄芪甲苷对照品为对照，以乙腈∶水＝10-90∶90-10为流动相的高效液相色谱法；斑蝥中所含斑蝥素的含量测定方法是以斑蝥素对照品为对照的气相色谱法。
所述鉴别方法包括以下项目的部分或全部(1)取胶囊剂、片剂或颗粒剂，研细，置索氏提取器中，加适量氯仿，置水浴中回流提取，弃去氯仿液，取出滤筒，晾干，待氯仿挥尽，再置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴中回流提取，回收甲醇至干，残渣加氢氧化钠溶液使溶解，转至分液漏斗中，再用水洗涤容器，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取，提取液用水洗涤，分取正丁醇液，蒸干，残渣用水溶解，转移至中性氧化铝柱上，先用氯仿洗脱，弃去氯仿洗脱液，再用甲醇洗脱，洗脱液于水浴上蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg1对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇溶解，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝5-50∶2-20∶0.5-10的下层溶液为展开剂(必要时控制湿度)，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置200-500nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；(2)取胶囊剂、片剂或颗粒剂，研细，加乙醚加热回流，放冷，滤过，弃去滤液，药渣加甲醇加热回流，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，作为供试品溶液；另取半支莲对照药材，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照药材溶液，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝2-20∶1-9∶1-9为展开剂，展开，取出，晾干；置200-500nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；(3)取胶囊剂、片剂或颗粒剂，研细，加甲醇，加热回流，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇适量溶解，加于中性氧化铝柱上，用甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取马钱苷对照品，加甲醇溶解，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照品溶液，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上(点成带状)，以甲苯∶丙酮∶无水乙醇∶甲酸＝1-9∶5-50∶0.5-10∶0.1-0.9为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；(4)取胶囊剂、片剂或颗粒剂，研细，加乙酸乙酯，超声，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇溶解，作为供试品溶液；另取女贞子对照药材，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照药材溶液，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝10-50∶1-9∶0.1-0.9为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
更具体的鉴别方法包括以下项目的部分或全部(1)取胶囊剂、片剂或颗粒剂各2-5g，研细，置索氏提取器中，加适量氯仿，置水浴中回流提取1-3小时，弃去氯仿液，取出滤筒，晾干，待氯仿挥尽，再置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴中回流提取2-6小时，回收甲醇至干，残渣加5％氢氧化钠溶液1-10ml使溶解，转至分液漏斗中，再用1-10ml水分1-3次洗涤容器，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取2-6次，每次2-20ml，合并正丁醇液，用水洗涤1-3次，每次1-10ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣用0.4-1.2ml水分1-5次溶解，转移至2g、干法装柱、直径1cm、长25cm、100～200目的中性氧化铝柱上，先用10-50ml氯仿洗脱，弃去氯仿洗脱液，再用70％甲醇10-40ml洗脱，洗脱液于水浴上蒸干，残渣加甲醇0.5-2ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg1对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5-2mg的混合溶液，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5-20μl，对照品溶液2-10μl，分别点于450-550μm厚的同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝5-50∶2-20∶0.5-10的下层溶液为展开剂(必要时控制湿度)，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置200-500nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；(2)取胶囊剂、片剂或颗粒剂1-4g，研细，加乙醚10-40ml，加热回流10-50分钟，放冷，滤过，弃去滤液，药渣加甲醇10-40ml，加热回流10-50分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5-2ml溶解，作为供试品溶液；另取半支莲对照药材0.5-2g，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各2-20μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝2-20∶1-9∶1-9为展开剂，展开，取出，晾干；置200-500nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；(3)取胶囊剂、片剂或颗粒剂1-5g，研细，加50％甲醇10-50ml，加热回流0.5-2小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加50％甲醇适量溶解，加于4g、100～200目的中性氧化铝柱上，用40％甲醇20-80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0.5-2ml使溶解，作为供试品溶液；另取马钱苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5-2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照品溶液各5-20μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上(点成带状)，以甲苯∶丙酮∶无水乙醇∶甲酸＝1-9∶5-50∶0.5-10∶0.1-0.9为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；(4)取胶囊剂、片剂或颗粒剂1-5g，研细，加乙酸乙酯10-40ml，超声10-30min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇0.5-2ml溶解，作为供试品溶液；另取女贞子对照药材0.2-2g，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各2-20μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝10-50∶1-9∶0.1-0.9为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
氯仿残留量的检查方法为照气相色谱法测定柱长30m、内径0.25mm、膜厚0.25μm的弹性石英毛细管柱Rtx-5，以5％苯基-甲基硅氧烷为固定相；程序升温初始温度60℃，保持5min，以每分钟30℃的速率升温至180℃，保持5min；FID检测器；进样口温度200℃；检测器温度250℃；分流比10∶1；线速度30cm/sec；氢气流量40mL/min；空气流量400mL/min；采用顶空进样气化室温度为100-120℃，加热25-40min，进样针温度110-120℃，传输管温度110-130℃；理论板数以氯仿峰计算应不低于5000；精密称取氯仿对照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂，精密称定，置具塞试管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，密塞，振摇，离心，取上清液，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液于顶空瓶中，轧盖，于顶空炉中高温平衡一段时间后，分别取顶空瓶中饱和气体注入气相色谱仪测定；本口服制剂中，氯仿残留量不得过0.006％。
更具体的氯仿残留量的检查方法为照气相色谱法测定柱长30m、内径0.25mm、膜厚0.25μm的弹性石英毛细管柱Rtx-5，以5％苯基-甲基硅氧烷为固定相；程序升温初始温度60℃，保持5min，以每分钟30℃的速率升温至180℃，保持5min；FID检测器；进样口温度200℃；检测器温度250℃；分流比10∶1；线速度30cm/sec；氢气流量40mL/min；空气流量400mL/min；采用顶空进样气化室温度为100-120℃，加热25-40min，进样针温度110-120℃，传输管温度110-130℃；理论板数以氯仿峰计算应不低于5000；精密称取氯仿对照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，制成每1mL含10-30μg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂，取内容物约0.5-2.0g，精密称定，置具塞试管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)5-20ml，密塞，振摇1-5min，离心，取上清液，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1-4ml于20ml顶空瓶中，轧盖，于顶空炉中110℃平衡20-50min后，分别取顶空瓶中饱和气体0.5-2.0ml注入气相色谱仪测定；本口服制剂中，氯仿残留量不得过0.006％。
所述含量测定方法包括以下项目的部分或全部(1)黄芪 照高效液相色谱法测定色谱柱为C18或C4或C8柱，以乙腈∶水＝10-90∶90-10为流动相；流速0.5-1.0ml/min；柱温30-60℃；蒸发光散射检测器漂移管温度为80-100℃；雾化气体为空气，流速为1.5-3.0L/min；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于3000；精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇溶解，摇匀，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂，精密称定，置索氏提取器中，加2％氢氧化钾甲醇溶液，加热回流，提取液蒸干，残渣加水使溶解后转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取；加水洗涤，弃去乙酸乙酯液，合并水液，用水饱和的正丁醇提取；提取后用氨试液洗涤，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水适量使溶解，转移至D101型大孔吸附树脂柱上，用水洗脱，弃去水液，再用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液1-10μl和2-20μl、供试品溶液2-20μl注入液相色谱仪测定含量；本口服制剂中，胶囊剂中含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计，不得少于0.08mg/g；片剂中含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计，不得少于0.08mg/g；颗粒剂中含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计，不得少于0.01mg/g；(2)斑蝥素 照气相色谱法测定玻璃色谱柱1-2m×3mm id，OV-17固定液的涂渍量为1.5％，担体Shimalite W(AW-DMCS)80-100目；FID检测器，进样口温度230-250℃；检测器温度230-250℃；柱温为150-160℃；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于1000；取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿溶解，摇匀，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂，精密称定，置烧杯中，加入氯化钠氢氧化钠溶液，再加入丙酮，超声，放冷，加入浓盐酸，搅拌，静置，放冷，抽滤，用少量水洗涤残渣，合并滤液，滤液用氯仿萃取，氯仿液置50℃水浴上挥至少量(整个操作过程中不得将氯仿挥干)，再加氯仿定容，摇匀，即得供试品溶液；分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各0.5-5μl，注入气相色谱仪测定含量；本口服制剂中，胶囊剂中含斑蝥素C10H12O4为0.025-0.180mg/g；片剂中含斑蝥素C10H12O4为0.025-0.180mg/g；颗粒剂中含斑蝥素C10H12O4为0.003-0.018mg/g。
更具体的含量测定方法包括以下项目的部分或全部(1)黄芪 照高效液相色谱法测定色谱柱为C18或C4或C8柱，以乙腈∶水＝10-90∶90-10为流动相；流速0.5-1.0ml/min；柱温30-60℃；蒸发光散射检测器漂移管温度为80-100℃；雾化气体为空气，流速为1.5-3.0L/min；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于3000；精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂，研细，取约0.5-2g，精密称定，置索氏提取器中，加2％氢氧化钾甲醇溶液50-100ml，加热回流4-6小时，提取液蒸干，残渣加水10-40ml使溶解后转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取1-3次，每次10-40ml；合并乙酸乙酯液，加水10-20ml洗涤；弃去乙酸乙酯液，合并水液，用水饱和的正丁醇提取3-5次，每次20-60ml；合并正丁醇提取液，用氨试液20-60ml洗涤1-2次，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水适量使溶解，转移至内径1.5cm、长12cm的D101型大孔吸附树脂柱上，用水30-70ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇60-100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液1-10μl和2-20μl、供试品溶液2-20μl注入液相色谱仪测定含量；本口服制剂中，胶囊剂中含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计，不得少于0.08mg/g；片剂中含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计，不得少于0.08mg/g；颗粒剂中含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计，不得少于0.01mg/g；
(2)斑蝥素 照气相色谱法测定玻璃色谱柱1-2m×3mm id，OV-17 50％甲基-50％苯基聚硅氧烷固定液的涂渍量为1.5％，担体Shimalite W(AW-DMCS)80-100目；FID检测器，进样口温度230-250℃；检测器温度230-250℃；柱温为150-160℃；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于1000；取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿制成每1ml含30-50μg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂内容物，研细，取约1-3g，精密称定，置100ml烧杯中，加入氯化钠-氢氧化钠溶液30-50ml，再加入0.5-2ml丙酮，功率250w、频率20kHz下超声20-50分钟，放冷，加入2-8ml浓盐酸，搅拌，静置，放冷，抽滤，用少量水洗涤残渣，合并滤液，滤液用氯仿萃取2-4次，每次30-40ml，合并氯仿液，置50℃水浴上挥至1～2ml(整个操作过程中不得将氯仿挥干)，再加氯仿定容至3ml，摇匀，即得供试品溶液；分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各0.5-5μl，注入气相色谱仪测定含量；本口服制剂中，胶囊剂中含斑蝥素C10H12O4为0.025-0.180mg/g；片剂中含斑蝥素C10H12O4为0.025-0.180mg/g；颗粒剂中含斑蝥素C10H12O4为0.003-0.018mg/g。
本发明所述质量控制方法包括性状对于胶囊剂，内容物为黄绿色至棕褐色的粉末，味微苦回甜；对于片剂，产品为薄膜衣片，除去薄膜衣后显黄绿色至棕褐色，味微苦回甜；对于颗粒剂，产品为棕黄色至深褐色的颗粒；味甜；鉴别(1)取胶囊剂、片剂或颗粒剂，研细，置索氏提取器中，加适量氯仿，置水浴中回流提取，弃去氯仿液，取出滤筒，晾干，待氯仿挥尽，再置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴中回流提取，回收甲醇至干，残渣加氢氧化钠溶液使溶解，转至分液漏斗中，再用水洗涤容器，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取，提取液用水洗涤，分取正丁醇液，蒸干，残渣用水溶解，转移至中性氧化铝柱上，先用氯仿洗脱，弃去氯仿洗脱液，再用甲醇洗脱，洗脱液于水浴上蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg1对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇溶解，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝5-50∶2-20∶0.5-10的下层溶液为展开剂(必要时控制湿度)，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置200-500nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；(2)取胶囊剂、片剂或颗粒剂，研细，加乙醚加热回流，放冷，滤过，弃去滤液，药渣加甲醇加热回流，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，作为供试品溶液；另取半支莲对照药材，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照药材溶液，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝2-20∶1-9∶1-9为展开剂，展开，取出，晾干；置200-500nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；(3)取胶囊剂、片剂或颗粒剂，研细，加甲醇，加热回流，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇适量溶解，加于中性氧化铝柱上，用甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取马钱苷对照品，加甲醇溶解，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照品溶液，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上(点成带状)，以甲苯∶丙酮∶无水乙醇∶甲酸＝1-9∶5-50∶0.5-10∶0.1-0.9为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；(4)取胶囊剂、片剂或颗粒剂，研细，加乙酸乙酯，超声，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇溶解，作为供试品溶液；另取女贞子对照药材，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照药材溶液，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝10-50∶1-9∶0.1-0.9为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；检查水分 不得过15.0％；氯仿残留量 照气相色谱法测定柱长30m、内径0.25mm、膜厚0.25μm的弹性石英毛细管柱Rtx-5，以5％苯基-甲基硅氧烷为固定相；程序升温初始温度60℃，保持5min，以每分钟30℃的速率升温至180℃，保持5min；FID检测器；进样口温度200℃；检测器温度250℃；分流比10∶1；线速度30cm/sec；氢气流量40mL/min；空气流量400mL/min；采用顶空进样气化室温度为100-120℃，加热25-40min，进样针温度110-120℃，传输管温度110-130℃；理论板数以氯仿峰计算应不低于5000；精密称取氯仿对照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂，精密称定，置具塞试管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，密塞，振摇，离心，取上清液，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液于顶空瓶中，轧盖，于顶空炉中高温平衡一段时间后，分别取顶空瓶中饱和气体注入气相色谱仪测定；本口服制剂中，氯仿残留量不得过0.006％；其他 本发明的胶囊剂、片剂或颗粒剂应符合中国药典关于胶囊剂、片剂或颗粒剂项下的有关规定；
含量测定(1)黄芪 照高效液相色谱法测定色谱柱为C18或C4或C8柱，以乙腈∶水＝10-90∶90-10为流动相；流速0.5-1.0ml/min；柱温30-60℃；蒸发光散射检测器漂移管温度为80-100℃；雾化气体为空气，流速为1.5-3.0L/min；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于3000；精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇溶解，摇匀，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂，精密称定，置索氏提取器中，加2％氢氧化钾甲醇溶液，加热回流，提取液蒸干，残渣加水使溶解后转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取；加水洗涤，弃去乙酸乙酯液，合并水液，用水饱和的正丁醇提取；提取后用氨试液洗涤，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水适量使溶解，转移至D101型大孔吸附树脂柱上，用水洗脱，弃去水液，再用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液1-10μl和2-20μl、供试品溶液2-20μl注入液相色谱仪测定含量；本口服制剂中，胶囊剂中含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计，不得少于0.08mg/g；片剂中含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计，不得少于0.08mg/g；颗粒剂中含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计，不得少于0.01mg/g；(2)斑蝥素 照气相色谱法测定玻璃色谱柱1-2m×3mm id，OV-17固定液的涂渍量为1.5％，担体Shimalite W(AW-DMCS)80-100目；FID检测器，进样口温度230-250℃；检测器温度230-250℃；柱温为150-160℃；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于1000；取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿溶解，摇匀，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂，精密称定，置烧杯中，加入氯化钠氢氧化钠溶液，再加入丙酮，超声，放冷，加入浓盐酸，搅拌，静置，放冷，抽滤，用少量水洗涤残渣，合并滤液，滤液用氯仿萃取，氯仿液置50℃水浴上挥至少量(整个操作过程中不得将氯仿挥干)，再加氯仿定容，摇匀，即得供试品溶液；分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各0.5-5μl，注入气相色谱仪测定含量；本口服制剂中，胶囊剂中含斑蝥素C10H12O4为0.025-0.180mg/g；片剂中含斑蝥素C10H12O4为0.025-0.180mg/g；颗粒剂中含斑蝥素C10H12O4为0.003-0.018mg/g。
申请人经研究发现，采用以下质量控制方法将更容易控制复方斑蝥口服制剂的质量，更利于保证该制剂的临床疗效。故所述质量控制方法还可包括性状对于胶囊剂，内容物为黄绿色至棕褐色的粉末，味微苦回甜；对于片剂，产品为薄膜衣片，除去薄膜衣后显黄绿色至棕褐色，味微苦回甜；对于颗粒剂，产品为棕黄色至深褐色的颗粒；味甜；鉴别(1)取胶囊剂、片剂或颗粒剂各2-5g，研细，置索氏提取器中，加适量氯仿，置水浴中回流提取1-3小时，弃去氯仿液，取出滤筒，晾干，待氯仿挥尽，再置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴中回流提取2-6小时，回收甲醇至干，残渣加5％氢氧化钠溶液1-10ml使溶解，转至分液漏斗中，再用1-10ml水分1-3次洗涤容器，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取2-6次，每次2-20ml，合并正丁醇液，用水洗涤1-3次，每次1-10ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣用0.4-1.2ml水分1-5次溶解，转移至2g、干法装柱、直径1cm、长25cm、100～200目的中性氧化铝柱上，先用10-50ml氯仿洗脱，弃去氯仿洗脱液，再用70％甲醇10-40ml洗脱，洗脱液于水浴上蒸干，残渣加甲醇0.5-2ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg1对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5-2mg的混合溶液，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5-20μl，对照品溶液2-10μl，分别点于450-550μm厚的同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝5-50∶2-20∶0.5-10的下层溶液为展开剂(必要时控制湿度)，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置200-500nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；(2)取胶囊剂、片剂或颗粒剂1-4g，研细，加乙醚10-40ml，加热回流10-50分钟，放冷，滤过，弃去滤液，药渣加甲醇10-40ml，加热回流10-50分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5-2ml溶解，作为供试品溶液；另取半支莲对照药材0.5-2g，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各2-20μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶酸＝2-20∶1-9∶1-9为展开剂，展开，取出，晾干；置200-500nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；(3)取胶囊剂、片剂或颗粒剂1-5g，研细，加50％甲醇10-50ml，加热回流0.5-2小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加50％甲醇适量溶解，加于4g、100～200目的中性氧化铝柱上，用40％甲醇20-80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0.5-2ml使溶解，作为供试品溶液；另取马钱苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5-2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照品溶液各5-20μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上(点成带状)，以甲苯∶丙酮∶无水乙醇∶甲酸＝1-9∶5-50∶0.5-10∶0.1-0.9为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；(4)取胶囊剂、片剂或颗粒剂1-5g，研细，加乙酸乙酯10-40ml，超声10-30min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇0.5-2ml溶解，作为供试品溶液；另取女贞子对照药材0.2-2g，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各2-20μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝10-50∶1-9∶0.1-0.9为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；检查水分 不得过15.0％；氯仿残留量 照气相色谱法测定柱长30m、内径0.25mm、膜厚0.25μm的弹性石英毛细管柱Rtx-5，以5％苯基-甲基硅氧烷为固定相；程序升温初始温度60℃，保持5min，以每分钟30℃的速率升温至180℃，保持5min；FID检测器；进样口温度200℃；检测器温度250℃；分流比10∶1；线速度30cm/sec；氢气流量40mL/min；空气流量400mL/min；采用顶空进样气化室温度为100-120℃，加热25-40min，进样针温度110-120℃，传输管温度110-130℃；理论板数以氯仿峰计算应不低于5000；精密称取氯仿对照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，制成每1mL含10-30μg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂，取内容物约0.5-2.0g，精密称定，置具塞试管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)5-20ml，密塞，振摇1-5min，离心，取上清液，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1-4ml于20ml顶空瓶中，轧盖，于顶空炉中110℃平衡20-50min后，分别取顶空瓶中饱和气体0.5-2.0ml注入气相色谱仪测定；本口服制剂中，氯仿残留量不得过0.006％；其他 本发明的胶囊剂、片剂或颗粒剂应符合中国药典关于胶囊剂、片剂或颗粒剂项下的有关规定；含量测定(1)黄芪 照高效液相色谱法测定色谱柱为C18或C4或C8柱，以乙腈∶水＝10-90∶90-10为流动相；流速0.5-1.0ml/min；柱温30-60℃；蒸发光散射检测器漂移管温度为80-100℃；雾化气体为空气，流速为1.5-3.0L/min；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于3000；精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂，研细，取约0.5-2g，精密称定，置索氏提取器中，加2％氢氧化钾甲醇溶液50-100ml，加热回流4-6小时，提取液蒸干，残渣加水10-40ml使溶解后转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取1-3次，每次10-40ml；合并乙酸乙酯液，加水10-20ml洗涤；弃去乙酸乙酯液，合并水液，用水饱和的正丁醇提取3-5次，每次20-60ml；合并正丁醇提取液，用氨试液20-60ml洗涤1-2次，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水适量使溶解，转移至内径1.5cm、长12cm的D101型大孔吸附树脂柱上，用水30-70ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇60-100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液1-10μl和2-20μl、供试品溶液2-20μl注入液相色谱仪测定含量；本口服制剂中，胶囊剂中含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计，不得少于0.08mg/g；片剂中含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计，不得少于0.08mg/g；颗粒剂中含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计，不得少于0.01mg/g；(2)斑蝥素 照气相色谱法测定玻璃色谱柱1-2m×3mm id，OV-17 50％甲基-50％苯基聚硅氧烷固定液的涂渍量为1.5％，担体Shimalite W(AW-DMCS)80-100目；FID检测器，进样口温度230-250℃；检测器温度230-250℃；柱温为150-160℃；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于1000；取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿制成每1ml含30-50μg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂内容物，研细，取约1-3g，精密称定，置100ml烧杯中，加入氯化钠氢氧化钠溶液30-50ml，再加入0.5-2ml丙酮，功率250w、频率20kHz下超声20-50分钟，放冷，加入2-8ml浓盐酸，搅拌，静置，放冷，抽滤，用少量水洗涤残渣，合并滤液，滤液用氯仿萃取2-4次，每次30-40ml，合并氯仿液，置50℃水浴上挥至1～2ml(整个操作过程中不得将氯仿挥干)，再加氯仿定容至3ml，摇匀，即得供试品溶液；分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各0.5-5μl，注入气相色谱仪测定含量；本口服制剂中，胶囊剂中含斑蝥素C10H12O4为0.025-0.180mg/g；片剂中含斑蝥素C10H12O4为0.025-0.180mg/g；颗粒剂中含斑蝥素C10H12O4为0.003-0.018mg/g。
以上所用的氯化钠氢氧化钠溶液是在1mol/L氢氧化钠溶液100mL中加入氯化钠2g，搅拌、溶解而成的。
本发明质量控制方法是经过大量的筛选试验得到的最佳方案，以下实验研究为本发明的优选过程一、黄芪含量测定方法的研究因黄芪甲苷紫外吸收较差，属末端吸收，若用紫外检测器检测，则其灵敏度低，干扰大，重现性较差，尤其对于复方制剂，测定其含量更加困难。近几年来，有使用HPLC-ELSD法测定黄芪甲苷含量的文献报道，其灵敏度、稳定性及重现性均能符合含量测定的要求。本试验参考了文献资料中的实验条件，并结合《中国药典》关于黄芪药材中黄芪甲苷的含量测定方法对色谱条件作了适当的调整，理论塔板数(N)按黄芪甲苷峰计算在3000以上。
(一)供试品溶液制备方法研究1、提取方法的确定方法1取药品，研细，置索氏提取器中，加1％的氢氧化钠乙醇溶液，于水浴加热提取，水浴蒸干提取液，加水，微热使溶解，置分液漏斗中加二氯甲烷提取，弃二氯甲烷液，水溶液用乙醚提取，弃乙醚液，水溶液用水饱和的正丁醇提取，正丁醇溶液用水洗涤，弃水层，再以1％磷酸二氢钾溶液洗涤，弃水层，将正丁醇提取液置水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，并定量转移至量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。
方法2取药品，研细，取细粉置索氏提取器中，加甲醇加热回流提取，甲醇液蒸干，残渣加水，微热使溶解，水液用水饱和正丁醇提取，正丁醇液用2％的氢氧化钾溶液洗涤，弃去碱液，再用正丁醇饱和水洗涤，弃去水液，正丁醇层蒸干，残渣加甲醇使溶解，并定量转移至量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。
方法3取药品，研细，取细粉加甲醇，超声，倒出上清液过滤，残渣加甲醇超声，过滤，合并过滤液，蒸干，残渣加水溶解，用二氯甲烷提取，水液用水饱和正丁醇提取，正丁醇液用氨试液洗涤，弃去氨试液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。
方法4取药品，研细，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇，放置过夜，再加甲醇适量，加热回流，提取液回收溶剂并蒸干，残渣加水，微热使溶解，水液用水饱和正丁醇提取；正丁醇液用氨试液洗涤，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水，微热使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长12cm)，用水洗脱，弃去水液，再用30％乙醇洗脱，弃去洗脱液，继用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，并定量转移至量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。
方法5取药品，研细，精密称定，置索氏提取器中，加2％的氢氧化钾甲醇溶液，加热回流，提取液蒸干，残渣加水使溶解后转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取；乙酸乙酯液加水洗涤；合并水液，用水饱和正丁醇提取；正丁醇提取液用氨试液洗涤，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长12cm)，用水洗脱，弃去水液，再用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，即得。

根据试验结果可知，采用方法5制备供试品溶液，黄芪甲苷提取完全，操作简便，而方法一、方法二和方法三的提取率较低，残渣较多，在转移定容时不好操作，同时样品的杂质干扰较大，方法四在用30％乙醇洗涤时含量有损失，通过比较选择方法五进行方法学考察后，证实了该方法的可靠性，故选择此种方法。
2、提取时间的考察取样品6份，分别称取约1g，精密称定，置索氏提取器中，加2％的氢氧化钾甲醇溶液70ml，索氏提取时间每两份分别为3小时，4小时，6小时，照本发明质量控制方法中黄芪含量测定项下供试品溶液的制备方法制备，通过测定，结果表明提取4小时与6小时的结果很接近，而3小时的结果相差很大，因此选择提取时间为4-6小时，即可把黄芪甲苷提取完全。见下表。
提取时间的考察

3、正丁醇提取次数的考察取样品6份，分别称取约1g，精密称定，照本发明质量控制方法中黄芪含量测定项下供试品溶液的制备方法制备(用水饱和的正丁醇分别提取2次、3次、4次、5次)，通过测定，结果表明第二次提取不完全，差别很大，第4次的正丁醇提取液中还有少量的黄芪甲苷，而第5次的正丁醇液中黄芪甲苷已少于0.01％。因此将正丁醇的提取次数定为3-5次，最优提取次数为4次。见下表。
提取次数的考察

(二)流动相的选择流动相1以甲醇、乙酸乙酯溶液不同比例的混合溶液为流动相。
流动相2以甲醇和水不同比例的混合溶液为流动相。
流动相3以乙腈和水不同比例的混合溶液为流动相。
结果以乙腈∶水＝10-90∶90-10为流动相；阴性样品色谱图在黄芪甲苷位置处无假阳性峰，黄芪甲苷和相近的杂质峰分离完全(分离度＞1.5)，即在该条件下黄芪甲苷与其他组分峰达到基线分离。最佳流动相为乙腈∶水＝36∶64。
(三)线性关系的考察精密吸取对照品储备液1ml至10ml、1ml至5ml、10ml至25ml、3ml至5ml的量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，摇匀，即可。然后分别精密吸取上述对照品溶液及贮备液各10μl注入液相色谱仪，测定其峰面积，并以峰面积值A的自然对数(LNA)为纵坐标，进样量C的自然对数(LNC)为横坐标，得回归方程为LNA＝1.5525LNC+16.324，r＝0.9994。以峰面积A的自然对数(LNA)对进样量C的自然对数(LNC)作图，得一直线，其结果表明在0.4064～4.064μg范围内，黄芪甲苷的线性关系良好。见下表。
黄芪甲苷线性关系考察

(四)重复性试验取同一样品6份，每份约1g，精密称定，照本发明质量控制方法中黄芪含量测定项下供试品溶液的制备方法制备，分别精密吸取对照品溶液5μl和10μl、供试品溶液10μl进样，记录色谱图，计算含量，6份样品的黄芪甲苷含量测定平均值为0.4118mg/g，RSD为0.5％，说明重复性良好。见下表。
重复性试验

(五)回收率试验取已知含量的样品(平均含量0.4118mg/g)6份，每份约0.5g，精密称定，置索氏提取器中，分别精密加入黄芪甲苷对照品溶液(0.2392mg/ml)1ml，照本发明质量控制方法中黄芪含量测定项下供试品溶液的制备方法制备，制作加样回收供试品溶液。测定黄芪甲苷含量，测得平均加样回收率为97.86％，RSD为1.1％，结果表明，本方法具有良好的加样回收率。见下表。
回收率试验

(六)重现性试验取药品，分别由小组不同的人取样照本发明质量控制方法中黄芪含量测定项下供试品溶液的制备方法制备，分别精密吸取对照品溶液5μl和10μl、供试品溶液10μl进样，记录色谱图，计算含量，三份药品的黄芪甲苷含量平均值分别为0.4203mg/g、0.4127mg/g、0.3946mg/g，RSD％分别为0.3％、0.3％、0.2％，说明重现性良好。见下表。
重现性试验

(七)范围考察根据药物中黄芪甲苷的含量限度，其含量小于1％，考察的范围为±50％。供试品的制备照本发明质量控制方法中黄芪含量测定项下供试品溶液的制备方法制备，分别精密吸取10μl注入液相色谱仪，记录峰面积，计算含量。见下表。
范围考察

测定结果表明，在范围的两个极端其测试结果能够达到要求。
(八)耐用性试验1.稳定性实验 取药品，按本发明所述质量控制方法中黄芪含量测定项下供试液的制备方法制备供试液，分别于0，2，4，6，8，12h分别测定样品中黄芪甲苷的峰面积值。RSD％为0.2％，结果表明样品溶液在12h内稳定。
稳定性实验


2.不同色谱柱比较 将同一样品在不同色谱柱下测定其含量进行比较。见下表。
不同色谱柱

3.流动相组成比例变化比较 将同一样品在不同流动相组成比例下测定其含量进行比较。见下表。
不同流动相组成比例

4.不同柱温比较 将同一样品在不同柱温下测定其含量进行比较。见下表。
不同柱温

(九)样品测定 用本发明所述质量控制方法中黄芪含量测定项下供试品溶液的制备方法制备10批共20份样品，测其黄芪甲苷含量。见下表。
样品中黄芪甲苷测定试验

二、斑蝥素含量测定方法的研究因斑蝥素为本发明制剂中抗癌的有效成份，而本发明制剂中很多药味是以药材细粉直接入药，在用一般的回流、超声提取时，杂质较多，为将制剂中斑蝥素提取完全且除去过多的杂质，对其进行了方法学研究。
(一)供试品溶液制备方法研究1、提取方法的确定方法一取药物研细，精密称定，置圆底烧瓶中，加入三氯甲烷，置水浴上回流，放冷，滤过，残渣加三氯甲烷继续回流，放冷，滤过，合并滤液，置水浴上挥干，残渣用三氯甲烷溶解，转移定容至容量瓶中，摇匀，即得。
方法二取药物研细，精密称定，置圆底烧瓶中，加入三氯甲烷，置水浴上回流，放冷，滤过，残渣加少量三氯甲烷洗涤，合并滤液，自然挥干，用氯化钠-氢氧化钠溶液洗涤残渣，再用盐酸调pH至1～2，滤过，滤液用三氯甲烷萃取，氯仿液自然挥干，残渣加三氯甲烷溶解，并转移定量至量瓶中，摇匀，即得。
方法三取药物研细，精密称定，置烧杯中，加入氯化钠-氢氧化钠溶液，超声处理，放冷，用盐酸调pH至1～2，抽滤，用少量水洗涤残渣，合并滤液，用三氯甲烷萃取，氯仿液自然挥干，残渣加三氯甲烷溶解，并转移定量至量瓶中，摇匀，即得。
方法四取药物研细，精密称定，置烧杯中，加入氯化钠-氢氧化钠溶液，超声，放冷，加入浓盐酸，搅拌，静置，放冷，抽滤，用少量水洗涤残渣，合并滤液，用三氯甲烷萃取(若在提取过程中出现乳化现象时，为了不损失斑蝥素含量，须在提取完后将乳化层离心，分取氯仿液)，合并氯仿液，置50℃水浴挥至约1～2ml，再用氯仿定容至3ml，摇匀，即得。
结果通过上述四种方法的多次试验比较，方法一提取的杂质较多；方法二重现性差，同时提取率也较低；方法三与方法四样品经处理后杂质少，提取率高，但方法三在氯仿提取液自然挥干后存在两个问题第一，氯仿自然挥干后，会析出少量水，导致定容不准，影响测定结果；第二，氯仿自然挥干后，同时会造成斑蝥素含量损失，导致重现性差。而在方法四中，样品是用50℃水浴上挥至约1～2ml便可克服以上两个问题，经多次试验，重现性好。故将供试品提取方案选定为方法四。
2、提取溶剂体积的确定取药物，照本发明质量控制方法中斑蝥素含量测定项下供试品溶液的制备方法制备，比较提取溶剂氯化钠氢氧化钠溶液(取1mol/L氢氧化钠溶液100mL与氯化钠2g，搅拌，溶解)为20ml、30ml、50ml的三种方法。见下表。
提取溶剂体积的比较

通过试验结果的比较，溶剂体积在30ml、50ml时能够将斑蝥素提取完全，故采用体积为30-50ml的提取溶剂，优选30ml。
3、提取时间的确定取药物，照本发明质量控制方法中斑蝥素含量测定项下供试品溶液的制备方法制备，比较超声20min，30min，40min，60min四种方法。见下表。
提取时间的比较

通过试验结果的比较，超声时间在30-40分钟时可将斑蝥素完全提取出来，故采用超声30-40min，优选30min。
4、蒸发水浴温度的确定取药物，照本发明质量控制方法中斑蝥素含量测定项下供试品溶液的制备方法制备，比较用40℃，50℃，55℃，60℃来挥发氯仿液至1～2ml的四种方法。见下表。
蒸发水浴温度的比较

通过试验结果的比较，证明用50℃水浴来挥发氯仿既不损失斑蝥素含量，又能将水份挥去，故本发明采用50℃水浴来挥发氯仿。
5、提取溶剂的确定取药物，照本发明质量控制方法中斑蝥素含量测定项下供试品溶液的制备方法制备，比较提取溶剂为氯仿和二氯甲烷两种方法。见下表。
提取溶剂体积的比较

通过比较试验结果，证明氯仿能够将斑蝥素提取完全，而二氯甲烷提取率较低。故本发明采用氯仿为提取溶剂。
(二)专属性试验供试品溶液的制备照本发明质量控制方法中斑蝥素含量测定项下供试品溶液的制备方法制备。
阴性样品溶液的制备取不含斑蝥的阴性样品，同供试品溶液制备方法制备。
在选定的色谱条件下，分别吸取斑蝥素对照品溶液、供试品溶液和缺斑蝥阴性样品溶液2μl注入气相色谱仪。斑蝥素的保留时间约为12min，阴性样品在对照品位置无干扰峰，样品中斑蝥素峰与其它杂质峰分离度均大于1.5，理论塔板数按斑蝥素峰计算大于1000。
(三)线性关系的考察精密称取斑蝥素对照品12.10mg，置50ml容量瓶中，加氯仿溶解并稀释定容至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。再分别精密吸取对照品贮备液适量，加氯仿制成0.121mg/ml、0.0605mg/ml、0.0484mg/ml、0.0242mg/ml、0.0121mg/ml的对照品溶液。然后分别精密吸取上述对照品溶液各2μl注入气相色谱仪，测定其峰面积，并以峰面积值(A)对进样量(C)进行回归，得标准曲线方程为A＝6127836.8097C+4767.9444，r＝0.9998；拟合至原点方程为A＝6142992.3864C，r＝0.9998。结果表明在0.0242μg～0.484μg范围内，斑蝥素线性关系良好。见下表。
斑蝥素线性关系考察

将同一样品峰面积(577921)分别代入上两方程计算，所得值的RSD％为0.3％，因此可以用外标一点法计算。
(四)重复性试验取样品，分别精密称取6份，每份约2g，照本发明质量控制方法中斑蝥素含量测定项下供试品溶液的制备方法制备，分别精密吸取2μl进样，记录色谱图，计算含量，6份样品斑蝥素含量测定平均值为55.03μg/g，RSD％为1.63％，说明重复性良好。见下表。
重复性试验

(五)准确度试验采用加样回收率试验。取已知含量的样品6份，每份约1g，精密称定，置100ml烧杯中，分别加入氯化钠-氢氧化钠溶液(取1mol/L氢氧化钠溶液100mL与氯化钠2g，搅拌，溶解)30ml，再分别精密加入斑蝥素对照品溶液(48.4μg/ml)1ml，照本发明质量控制方法中斑蝥素含量测定项下供试品溶液的制备方法制备回收率供试品溶液。由于斑蝥素对照品溶液是使用氯仿作为溶剂，因氯仿与氯化钠氢氧化钠混合溶液不互溶，导致提取及抽滤步骤中存在不易操作性，因此在加样回收率试验中将斑蝥素对照品溶液的配制改用丙酮作为溶剂。经比较，以氯仿或丙酮为溶剂配制的斑蝥素对照品峰面积基本一致。
对照品溶液的配制精密称取斑蝥素对照品0.01210g于50ml量瓶中，加丙酮溶解并稀释至刻度，摇匀。再精密量取10ml于50ml量瓶中，加丙酮稀释至刻度，摇匀，即得(C＝48.4μg/ml)。
试验方法取已知含量的样品6份，每份约1g，精密称定，置100ml烧杯中，分别加入氯化钠-氢氧化钠溶液(取1mol/L氢氧化钠溶液100mL与氯化钠2g，搅拌，溶解)30ml，再分别精密添加斑蝥素对照品溶液(C＝48.4μg/ml，丙酮为溶剂)1ml，照本发明质量控制方法中斑蝥素含量测定项下供试品溶液的制备方法制备回收率供试品溶液，分别精密吸取2μl进样，记录色谱图，计算含量，测得平均加样回收率为100.45％，RSD％为2.37％。结果表明，本方法具有良好的加样回收率。见下表。
回收率试验

(六)重现性试验取样品，分别在实验室由不同的人照本发明质量控制方法中斑蝥素含量测定项下供试品溶液的制备方法制备，分别精密吸取2μL进样，记录色谱，计算含量，三份样品的含量平均值分别为77.74μg/g、52.92μg/g、55.80μg/g，RSD％分别为1.81％、2.03％、0.22％，说明重现性良好。见下表。
重现性试验

(七)范围考察根据本发明中斑蝥素的含量限度，其含量小于1％，考察的范围为±50％。取样品，分别精密称取4份，两份约1g、两份约3g，照本发明质量控制方法中斑蝥素含量测定项下供试品溶液的制备方法制备，分别精密吸取2μl进样，记录色谱图，计算含量，4份样品斑蝥素含量测定平均值为54.09μg/g，RSD为1.91％，与重复性样品含量(55.03μg/g)相对标准偏差为1.22％，说明范围试验良好。见下表。
范围考察

(八)耐用性试验1.稳定性实验取复方斑蝥口服制剂，照本发明质量控制方法中斑蝥素含量测定项下供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，分别于0，2，4，8，12h精密吸取2μL注入气相色谱仪，测定样品中斑蝥素峰面积值。RSD％为0.3％，结果表明样品溶液在12h内稳定。见下表。
稳定性实验


2.不同气相色谱仪、不同色谱柱比较 将同一样品在不同色谱柱下测定其含量进行比较。两种不同条件测得含量平均值为55.80mg/g，RSD％为0.22％。见下表。
不同色谱柱

注“A”为色谱柱以聚乙二醇20M及甲基硅橡胶(SE-30)为固定液，涂布浓度分别为10％和5％，1∶1混合装柱；超纯氮气(55KPa)，氢气(50ml/min)，空气(500ml/min)；柱温155℃；进样口温度240℃；FID检测器，检测器温度240℃；威玛珑工作站；“B”为色谱柱用聚苯基甲基硅氧烷(5％苯基)毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；N2为载气，线速度24mL/min；分流比10∶1；氢气流量40.0ml/min；空气流量400.0ml/min；柱温135℃；气化室温度240℃；FID检测器，检测器温度240℃；GCSolution工作站。
(九)样品测定用本发明质量控制方法中斑蝥素含量测定项下供试品溶液的制备方法制备12批，共24份样品，测其斑蝥素含量。见下表。
样品测定试验

三、人参、黄芪薄层鉴别研究以人参皂苷Rg1对照品及黄芪甲苷对照品鉴别制剂中人参、黄芪药材供试品溶液制备方法一取药品，研细，置索氏提取器中，加适量氯仿，置水浴中回流提取，弃去氯仿液，取出滤筒，晾干，待氯仿挥尽，再置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴中回流提取，回收甲醇至干，残渣加氢氧化钠溶液使溶解，转至分液漏斗中，再用水洗涤容器，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取，提取液用水洗涤，分取正丁醇液，蒸干，残渣用水溶解，转移至氧化铝柱上(中性氧化铝100～200目，2g，干法装柱，直径1cm，长25cm)，先用氯仿洗脱，弃去氯仿洗脱液，再用甲醇洗脱，洗脱液于水浴上蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；同法制备缺人参及黄芪的阴性供试液。
供试品溶液制备方法二取药品，研细，加适量氯仿，超声提取，弃去氯仿液，待氯仿挥尽，加适量甲醇，超声提取，回收甲醇至干，残渣加氢氧化钠溶液使溶解，转至分液漏斗中，再用水洗涤容器，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取，提取液用水洗涤，分取正丁醇液，蒸干，残渣用水溶解，转移至氧化铝柱上用氯仿洗脱，洗脱液于水浴上蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；同法制备缺人参及黄芪的阴性供试液。
展开剂选择分别以氯仿、乙酸乙酯、甲醇、水不同比例的混合溶液；三氯甲烷、甲醇、水不同比例的混合溶液；氯仿、乙酸乙酯、水不同比例的混合溶液为展开剂。
薄层板的厚度选择厚度500μm以上；厚度500μm以下。
点样量选择分别以点样量为供试品8μl，对照品4μl；点样量为供试品10μl，对照品5μl进行选择。
结果采用方法一制备供试品溶液，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝5-50∶2-20∶0.5-10为展开剂，其分离度好，斑点显色清晰，阴性对照无干扰，方法重现性好。以氯仿∶乙酸乙酯∶甲醇∶水为展开剂，放置时间较长，操作不便；而且若操作环境的湿度较大也会造成斑点分离效果不好，重现性较差，通过多次试验，认为可将点样后的薄层板置于65℃左右的烘箱中加热10～15min或用5ml硫酸置于展开缸另一侧中来控制湿度；同时薄层板的厚度也是一个重要因素，经多次试验，该鉴别需要用厚板(500μm以上)才能达到好的展开效果；人参中是用人参Re和Rg1的总量大于0.30％来控制药材含量，采用点样量为供试品8μl，对照品4μl会出现二者中含量较低者的斑点模糊；另外，供试品处理步骤较多，也易造成损失。故最佳展开剂为三氯甲烷∶甲醇∶水＝13∶7∶2，薄层板的厚度500μm以上，点样量为供试品10μl，对照品5μl时，鉴别效果最佳。
四、半枝莲薄层鉴别研究以半枝莲对照品鉴别制剂中半枝莲药材供试品溶液制备方法一取药品，研细，加乙醚，加热回流，放冷，滤过，弃去滤液，药渣加甲醇，加热回流，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；同法制备缺半枝莲的阴性供试液。
供试品溶液制备方法二取药品，研细，加三氯甲烷，超声提取，滤过，弃去滤液，药渣加甲醇，超声提取，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；同法制备缺半枝莲的阴性供试液。
展开剂选择分别以甲苯、甲酸乙酯、甲酸不同比例的混合溶液；环己烷、乙酸乙酯不同比例的混合溶液；苯和甲酸乙酯不同比例的混合溶液；环己烷、甲酸不同比例的混合溶液为展开剂。
结果采用方法一制备供试品溶液，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝2-20∶1-9∶1-9为展开剂，其分离度好，斑点显色清晰，阴性对照无干扰，方法重现性好，专属性强。最佳展开剂为甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝9∶5∶3。
五、山茱萸薄层鉴别研究方法一取药物，研细，加乙酸乙酯，超声处理，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇使溶解，作为供试品溶液；同法制备缺山茱萸的阴性供试液。另取熊果酸对照品加无水乙醇配制成1mg/ml的溶液作为对照品溶液。以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝20∶4∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，以10％的硫酸乙醇溶液为显色剂。
结果阴性样品有干扰。
方法二取药物，研细，加甲醇，加热回流，滤过，弃去滤液。残渣加乙酸乙酯，超声处理，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇使溶解，作为供试品溶液；同法制备缺山茱萸的阴性供试液。取山茱萸对照药材，同法制备对照药材溶液。以环己烷∶氯仿∶乙酸乙酯＝20∶5∶8为展开剂，展开，取出，晾干，以10％的硫酸乙醇溶液为显色剂。
结果阴性样品有干扰。
方法三取药物，研细，加甲醇，超声处理，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇∶氯仿＝3∶2的混合溶液使溶解，作为供试品溶液；同法制备缺山茱萸的阴性供试液。另取山茱萸对照药材，同法制备对照药材溶液。以环己烷∶丙酮∶乙酸乙酯＝10∶4∶2为展开剂，展开，取出，晾干，以10％的硫酸乙醇溶液为显色剂。
结果阴性样品有干扰。
由于山茱萸与女贞子中均含有熊果酸和齐墩果酸，会造成阴性干扰，因此考虑选用山茱萸中特有的马钱苷进行鉴别。
以马钱苷对照品鉴别制剂中山茱萸药材供试品溶液制备方法一取药物，研匀，加50％甲醇，加热回流，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加50％甲醇适量溶解，加于中性氧化铝柱(100～200目，4g)上，用40％甲醇洗脱。收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；同法制备缺山茱萸的阴性供试液。
供试品溶液制备方法二取药物，研匀，加50％甲醇，超声处理，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加50％甲醇适量溶解，加于中性氧化铝柱(100～200目，4g)上，用40％甲醇洗脱。收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；同法制备缺山茱萸的阴性样品溶液。
展开剂选择分别以甲苯、乙酸乙酯、甲酸不同比例的混合溶液；
甲苯、丙酮、无水乙醇、浓氨不同比例的混合溶液；甲苯、丙酮、无水乙醇、甲酸不同比例的混合溶液；环己烷、丙酮、乙酸乙酯不同比例的混合溶液；环己烷、氯仿、乙酸乙酯不同比例的混合溶液为展开剂。
结果采用方法一制备供试品溶液，以甲苯∶丙酮∶无水乙醇∶甲酸＝1-9∶5-50∶0.5-10∶0.1-0.9为展开剂，其分离度好，斑点显色清晰，阴性对照无干扰，方法重现性好。另外，点样状为带状比点样状为圆点的效果好。最佳展开剂为甲苯∶丙酮∶无水乙醇∶甲酸＝4∶16∶2∶0.5。采用前三种方法对山茱萸进行薄层鉴别，其鉴别结果分离度不好，斑点显色不清晰，阴性有干扰。
六、女贞子薄层鉴别研究以女贞子对照药材鉴别制剂中女贞子药材供试品溶液制备方法一取药物，研匀，加甲醇，加热回流，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇∶三氯甲烷＝3∶2的混合溶液使溶解，作为供试品溶液；同法制备缺女贞子的阴性供试液。
供试品溶液制备方法二取药物，研细，加水煎煮，滤过，滤液浓缩，用稀盐酸调pH至2～3，以乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯使溶解，作为供试品溶液；同法制备缺女贞子的阴性供试液。
供试品溶液制备方法三取药物，研细，加水煎煮，滤过，滤液蒸干。残渣加无水乙醇∶三氯甲烷＝3∶2的混合溶液使溶解，作为供试品溶液；同法制备缺女贞子的阴性供试液。
供试品溶液制备方法四取药物，研细，加甲醇加热回流，滤过，弃去滤液，残渣加乙酸乙酯，超声，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇使溶解，作为供试品溶液；同法制备缺女贞子的阴性供试液。
供试品溶液制备方法五取药物，研细，加乙酸乙酯，超声，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇使溶解，作为供试品溶液；同法制备缺女贞子阴性供试液。
展开剂选择分别以环己烷、丙酮、乙酸乙酯不同比例的混合溶液；甲苯、乙酸乙酯、甲酸不同比例的混合溶液；石油醚、乙酸乙酯、甲酸不同比例的混合溶液为展开剂。
结果前四种方法的阴性样品有干扰。方法五处理的样品效果较好，阴性无干扰。故最终采用方法五制备供试品溶液，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝10-50∶1-9∶0.1-0.9为展开剂，其分离度好，斑点显色清晰，阴性对照无干扰，方法重现性好，鉴别专属性强。最佳展开剂为甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝20∶4∶0.5。
七、熊胆粉的薄层鉴别研究熊胆粉为处方中的贵重药材，理应进行控制，特对其作如下薄层鉴别研究方法一取药物，加10％的氢氧化钠溶液，加盖微沸。放冷，过滤，滤液滴加稀盐酸至pH 2～3，转至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取，合并提取液，蒸干，残渣加乙醇使溶解，作为供试品溶液；同法制备缺熊胆粉的阴性供试液。
方法二取药物，加10％的氢氧化钠溶液，置电炉上微沸。放冷，过滤，滤液滴加稀盐酸至pH 2～3，转至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取，合并提取液，蒸干，残渣加乙醇使溶解，作为供试品溶液；同法制备缺熊胆粉的阴性供试液。
方法三取药物，加10％的氢氧化钠，超声使溶解，120℃加热水解。放冷，过滤，滤液滴加稀盐酸至pH 2～3，转至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取两次，合并提取液，蒸干，残渣加乙醇使溶解，作为供试品溶液；同法制备缺熊胆粉的阴性供试液。
方法四取药物，加水加热搅拌使其充分溶解，静置，放冷，滤过。滤液用乙醚振摇提取，弃去乙醚层，水层加20％的氢氧化钠于水浴加热水解(随时补充蒸发的水)。放冷，滴加稀盐酸至pH 2～3，转至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取，合并提取液，蒸干，残渣加乙醇使溶解，作为供试品溶液；同法制备缺熊胆粉的阴性供试液。
方法五取药物，加乙醇振摇提取，合并乙醇提取液，滤过，滤液置水浴上蒸干。残渣加20％的氢氧化钠转移至适当容器中，至水浴中水解。放冷，滴加盐酸至PH 2～3，转至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；同法制备缺熊胆粉的阴性供试液。
展开剂选择分别以异辛烷、乙醚、冰醋酸、正丁醇、水不同比例的混合溶液；异辛烷、乙酸乙酯、冰醋酸不同比例的混合溶液为展开剂。
结果分别用10％的硫酸乙醇溶液、10％的磷钼酸乙醇溶液显色，在与对照品(熊去氧胆酸、鹅去氧胆酸、猪去氧胆酸和胆酸的混合对照品)相应的位置上，斑点不清晰，其他杂质颜色很深，干扰较大。在荧光下观察，杂质也对主要斑点影响很大。
参照万应胶囊中熊胆粉的鉴别方法。其供试品的取样量为1.8g，通过对本制剂中熊胆粉的量进行换算，得出本发明口服制剂的取样量约为20-25g，取样量过大，而且样品处理过程复杂，易造成损失；另外，本发明口服制剂中药味较多，共有11味，会造成较大干扰，因此具不可操作性，无法对熊胆粉制定鉴别方法。
八、氯仿残留量的检查方法研究本发明中斑蝥药材在提取工艺中是用氯仿浸提的，而氯仿毒性较大，为国家列出的二类溶剂，在药品中是严格要求控制其限度的，2005版药典二部附录中规定药品中的氯仿残留量应控制在0.006％。为此申请人对本发明制剂中氯仿残留量的检查进行了方法学验证，该方法专属性强，灵敏度高，能有效控制制剂中的氯仿残留量。
(1)仪器与试药仪器 岛津GC-2010气相色谱仪；FID检测器；RESTEC Rtx-5石英毛细管气相色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；GC-Solution工作站；GCH-300氢气发生器；GCB-2000全自动空气源；DANI HSS 86.50顶空进样装置；AE200分析天平。
试剂和试药 氯仿为色谱纯，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)为分析纯。
(2)专属性试验A.色谱条件色谱柱弹性石英毛细管柱(柱长30m，内径0.25mm，膜厚度0.25μm)Rtx-5(5％苯基-甲基硅氧烷为固定相)；程序升温初始温度60℃，保持5min，以每分钟30℃的速率升温至180℃，保持5min；FID检测器；进样口温度200℃；检测器温度250℃；载气高纯氮；分流比10∶1；线速度30cm/sec；氢气流量40mL/min；空气流量400mL/min。采用顶空进样气化室温度为110℃，加热30min，进样针温度115℃，传输管温度120℃。
B.顶空条件选择以75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂时，较低的温度不能使氯仿达到充分饱和，检出灵敏度较低，分别将炉温设定为90℃、100℃、110℃和120℃，平衡30min，结果显示，110℃时相同对照品检出峰面积最高，而90℃检出峰面积最低，故选110℃作为最佳炉温。同时也比较了相同炉温下平衡20min、30min、45min、60min之间的差异，结果表明平衡20min不能达到充分饱和，而45min和60min则可能因为平衡时间较长而发生气体泄露，因为30min峰面积最大，故最终选择平衡最佳时间为30min。
C.专属性试验精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品各2ml于20ml顶空瓶中，轧盖，于顶空炉中110℃平衡30min后进样，记录色谱图。从色谱图可以看出，氯仿峰的保留时间为3.121min，与溶剂及阴性样品中的其它峰都达到完全分离，分离度大于2.0，氯仿峰的理论塔板数为112150，故确定理论板数以氯仿峰计算应不低于5000。
(3)对照品溶液的制备取氯仿对照品适量，加75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)制成每1ml含15μg的溶液，即得。
(4)供试品溶液的制备方法一取样品于20ml顶空瓶中，精密称定，精密加入水，轧盖，振摇均匀，即得。
方法二取样品于具塞试管中，精密称定，精密加入水，密塞，振摇，离心，精密量取上清液于20ml顶空瓶中，轧盖，即得。
方法三取样品于具塞试管中，精密称定，精密加入50％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，密塞，振摇，离心，精密量取上清液于20ml顶空瓶中，轧盖，即得。
方法四取样品于具塞试管中，精密称定，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，密塞，振摇，离心，精密量取上清液于20ml顶空瓶中，轧盖，即得。
方法五取样品于具塞试管中，精密称定，精密加入N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，密塞，振摇，离心，精密量取上清液于20ml顶空瓶中，轧盖，即得。
在按以上五种方法处理样品的同时，对照品也用相对应的溶剂进行配制，并进行了回收率试验。通过比较以上五种方法，回收率试验只有以75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂时能达到要求，但以纯N，N-二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂的氯仿对照品峰面积很小，检测灵敏度低。故确定供试品处理方法为取样品于具塞试管中，精密称定，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，密塞，振摇，离心，精密量取上清液于20ml顶空瓶中，轧盖，即得。
(5)线性关系考察精密称取氯仿对照品0.1089g，加75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解稀释至25ml，即得对照品贮备液。分别精密吸取3ml、5ml、1ml、3ml、1ml、2ml，加75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)分别稀释2500倍、2500倍、250倍、250倍、25倍、25倍，得浓度分别为0.0052272mg/ml，0.008712mg/ml，0.017424mg/ml，0.052272mg/ml，0.17424mg/ml，0.34848mg/ml的对照品溶液，再分别精密量取2ml放入顶空瓶中，轧盖，于顶空炉中110℃平衡30min后进样，记录色谱图。以对照品溶液(mg/ml)为横坐标，以峰面积为纵坐标进行线性回归。回归方程为y＝51031.5714x-0.8098，r＝0.9999。结果表明氯仿在5.2272μg～348.48μg范围内具有良好的线性关系。见下表氯仿残留量线性关系考察


将同一对照品峰面积(871.6)分别代入以上两方程计算，所得值的RSD％为0.1％，因此可以用外标一点法计算。
(6)精密度考察分别精密量取对照品溶液(C＝17.424μg/ml)2ml放入顶空瓶中，轧盖，于顶空炉中110℃平衡30min后进样，记录色谱图。6份对照品平均峰面积为889.3，RSD％为2.2％，说明精密度良好。见下表精密度试验

(7)稳定性考察分别于0、2、4、8、12时精密量取氯仿对照品溶液(C＝14.25μg/ml)2ml放入顶空瓶中，轧盖，于顶空炉中110℃平衡30min后进样，记录色谱图。测得氯仿平均峰面积为725.3，RSD％为5.4％，根据药典规定，该偏差在规定范围内。结果表明稳定性良好。见下表稳定性考察

(8)重复性考察分别取通过本发明所述复方斑蝥口服制剂的制备方法制备的复方斑蝥胶囊1.0g于10ml具塞试管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)10ml，振摇3min，离心，精密量取上清液2ml放入顶空瓶中，轧盖，于顶空炉中110℃平衡30min后进样，记录色谱图。结果样品中都未检出氯仿。结果见下表重复性考察

(9)准确度考察用回收率来验证。分别取通过本发明所述复方斑蝥口服制剂的制备方法制备的复方斑蝥胶囊1.0g于10ml具塞试管中，精密加入氯仿对照品溶液(C＝17.424μg/ml)10ml，振摇3min，离心，精密量取上清液2ml放入顶空瓶中，加盖，于顶空炉中110℃平衡30min后进样，记录色谱图。测得平均加样回收率为98.3％，RSD％为3.0％，结果表明，本方法具有良好的加样回收率。结果见下表(A对＝859.4)准确度考察

(10)重现性考察分别取3个批次样品，按本发明所述质量控制方法测定其中的氯仿残留量，结果三批样品中有两批未检出氯仿，检出氯仿的一批样品平均值为0.001066％，RSD％为6.43％，该偏差在允许范围内，说明该方法重现性良好。见下表(C检对＝13.12μg/ml A检对＝962.2 C质对＝14.91μg/ml A质对＝1160.8)
表6重现性考察 (11)范围考察根据本发明制剂中氯仿残留量的限度要求(不得高于0.006％)，考察的范围为±50％。分别取药品0.5g和1.5g，照本发明所述质量控制方法中氯仿残留量检查方法测定氯仿残留量，结果在范围的两个极端都未检出，并能够达到所述要求。见下表范围考察 (12)样品测定精密称取样品1.0g，置10ml具塞试管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)10ml，振摇3min，离心，精密量取上清液2ml于顶空瓶中，轧盖，放入顶空炉中110℃平衡30min，进样。按下式计算样品中氯仿残留量。
按以上方法测定10份复方斑蝥口服制剂中氯仿残留量，结果见下表(氯仿对照品浓度C＝14.91μg/ml，峰面积A平均＝1160.8)氯仿残留量测定
以上结果可以看出，10份复方斑蝥口服制剂中有5份未检出氯仿，有5份检出，其含量也在国家规定的范围内。该方法专属性强，灵敏度高，能有效控制制剂中的氯仿残留量。
故将本发明质量控制方法中检查项下氯仿残留限度定为氯仿残留量不得过0.006％。
与现有技术相比，本发明质量控制方法补充建立了黄芪和斑蝥中斑蝥素的含量测定项目以及半枝莲、山茱萸、女贞子的薄层鉴别项目，增加了氯仿残留量的检查，并对人参和黄芪两味药材的薄层鉴别方法进行了改进，对展开剂以及薄层板的厚度进行了选择，优化了鉴别方法，其精密度高，重现性好，稳定性好，回收率高，测量结果准确，提高了复方斑蝥口服制制剂的质量控制标准，可有效地控制产品质量，从而确保其临床疗效。
具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
本发明的实施例1复方斑蝥胶囊剂的质量控制方法包括性状其内容物为黄绿色至棕褐色的粉末，味微苦回甜。
鉴别(1)取胶囊剂内容物3.5g，置索氏提取器中，加适量氯仿，置水浴中回流提取2小时，弃去氯仿液，取出滤筒，晾干，待氯仿挥尽，再置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴中回流提取4小时，回收甲醇至干，残渣加5％氢氧化钠溶液5ml使溶解，转至分液漏斗中，再用5ml水分2次洗涤容器，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取4次(10ml、5ml、5ml、5ml)，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次5ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣用0.8ml水分3次溶解，转移至中性氧化铝柱(100～200目，2g，干法装柱，直径1cm，长25cm)上，先用30ml氯仿洗脱，弃去氯仿洗脱液，再用70％甲醇25ml洗脱，洗脱液于水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg1对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含1mg的混合溶液，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10μl，对照品溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板(厚500μm)上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝13∶7∶2的下层溶液为展开剂(必要时控制湿度)，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(2)取胶囊剂内容物2g，加乙醚20ml，加热回流30分钟，放冷，滤过，弃去滤液，药渣加甲醇20ml，加热回流30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为供试品溶液；另取半支莲对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝9∶5∶3为展开剂，展开，取出，晾干；置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(3)取胶囊剂内容物3g，加50％甲醇30ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加50％甲醇适量溶解，加于中性氧化铝柱(100～200目，4g)上，用40％甲醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取马钱苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照品溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上(点成带状)，以甲苯∶丙酮∶无水乙醇∶甲酸＝4∶16∶2∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(4)取胶囊剂内容物3g，加乙酸乙酯20ml，超声15min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1ml溶解，作为供试品溶液；另取女贞子对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝20∶4∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
检查水分 不得过15.0％。
氯仿残留量 照气相色谱法测定色谱条件与系统适用性试验 弹性石英毛细管柱(柱长30m，内径0.25mm，膜厚度0.25μm)Rtx-5(5％苯基-甲基硅氧烷为固定相)；程序升温初始温度60℃，保持5min，以每分钟30℃的速率升温至180℃，保持5min；FID检测器；进样口温度200℃；检测器温度250℃；分流比10∶1；线速度30cm/sec；氢气流量40mL/min；空气流量400mL/min；采用顶空进样气化室温度为110℃，加热30min，进样针温度115℃，传输管温度120℃；理论板数以氯仿峰计算应不低于5000。
对照品溶液的制备精密称取氯仿对照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，制成每1mL含15μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取装量差异项下的胶囊剂内容物约1.0g，精密称定，置具塞试管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)10ml，密塞，振摇3min，离心，取上清液，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2ml于20ml顶空瓶中，轧盖，于顶空炉中110℃平衡30min后，分别取顶空瓶中饱和气体1ml注入气相色谱仪测定，即得。
本胶囊剂中，氯仿残留量不得过0.006％。
其他 本发明胶囊剂应符合中国药典关于胶囊剂项下的有关规定。
含量测定(1)黄芪 照高效液相色谱法测定以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈∶水＝36∶64为流动相；流速0.7ml/min；柱温40℃；蒸发光散射检测器漂移管温度为90℃；雾化气体为空气，流速为2.2L/min；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于3000；精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂，研细，取约1g，精密称定，置索氏提取器中，加2％氢氧化钾甲醇溶液70ml，加热回流4小时，提取液蒸干，残渣加水20ml使溶解后转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取2次，每次20ml；合并乙酸乙酯液，加水15ml洗涤；弃去乙酸乙酯液，合并水液，用水饱和的正丁醇提取4次，每次40ml；合并正丁醇提取液，用氨试液40ml洗涤1次，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水适量使溶解，转移至D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长12cm)上，用水50ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液5μl和10μl、供试品溶液10μl注入液相色谱仪测定含量；本胶囊剂中含黄芪以黄芪甲苷(C41H68O14)计，不得少于0.12mg/g。
(2)斑蝥素 照气相色谱法测定玻璃色谱柱1-2m×3mm id，OV-17(50％甲基-50％苯基聚硅氧烷)固定液的涂渍量为1.5％，担体Shimalite W(AW-DMCS)80-100目；FID检测器，进样口温度240℃；检测器温度240℃；柱温为155℃；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于1000；取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿制成每1ml含40μg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂内容物，研细，取约2g，精密称定，置100ml烧杯中，加入氯化钠氢氧化钠溶液(取1mol/L氢氧化钠溶液100mL与氯化钠2g，搅拌，溶解)30ml，再加入1ml丙酮，超声(功率250w，频率20kHz)30分钟，放冷，加入5ml浓盐酸，搅拌，静置，放冷，抽滤，用少量水洗涤残渣，合并滤液，滤液用氯仿萃取3次，每次30ml，合并氯仿液，置50℃水浴上挥至1～2ml(整个操作过程中不得将氯仿挥干)，再加氯仿定容至3ml，摇匀，即得供试品溶液；分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各2μl，注入气相色谱仪测定含量；本胶囊剂中含斑蝥素(C10H12O4)为0.028-0.160mg/g。
本发明的实施例2复方斑蝥片剂的质量控制方法包括性状产品为薄膜衣片，除去薄膜衣后显黄绿色至棕褐色，味微苦回甜。
鉴别(1)取片剂3g，研细，置索氏提取器中，加适量氯仿，置水浴中回流提取2小时，弃去氯仿液，取出滤筒，晾干，待氯仿挥尽，再置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴中回流提取3小时，回收甲醇至干，残渣加5％氢氧化钠溶液3ml使溶解，转至分液漏斗中，再用3ml水分2次洗涤容器，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取3次，每次10ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次3ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣用0.6ml水分2次溶解，转移至中性氧化铝柱(100～200目，2g，干法装柱，直径1cm，长25cm)上，先用20ml氯仿洗脱，弃去氯仿洗脱液，再用70％甲醇20ml洗脱，洗脱液于水浴上蒸干，残渣加甲醇0.8ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg1对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含0.8mg的混合溶液，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液15μl，对照品溶液8μl，分别点于同一硅胶G薄层板(厚450μm)上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝20∶10∶5的下层溶液为展开剂(必要时控制湿度)，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置300nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(2)取片剂2.5g，研细，加乙醚25ml，加热回流20分钟，放冷，滤过，弃去滤液，药渣加甲醇25ml，加热回流20分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.8ml溶解，作为供试品溶液；另取半支莲对照药材0.8g，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝10∶5∶5为展开剂，展开，取出，晾干；置300nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(3)取片剂2g，研细，加50％甲醇20ml，加热回流1.2小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加50％甲醇适量溶解，加于中性氧化铝柱(100～200目，4g)上，用40％甲醇35ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0.8ml使溶解，作为供试品溶液；另取马钱苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.8mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照品溶液各12μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上(点成带状)，以甲苯∶丙酮∶无水乙醇∶甲酸＝5∶25∶5∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(4)取片剂2g，研细，加乙酸乙酯25ml，超声20min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇0.8ml溶解，作为供试品溶液；另取女贞子对照药材1g，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝30∶5∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
检查水分 不得过15.0％。
氯仿残留量 照气相色谱法测定弹性石英毛细管柱(柱长30m，内径0.25mm，膜厚度0.25μm)Rtx-5(5％苯基甲基硅氧烷为固定相)；程序升温初始温度60℃，保持5min，以每分钟30℃的速率升温至180℃，保持5min；FID检测器；进样口温度200℃；检测器温度250℃；分流比10∶1；线速度30cm/sec；氢气流量40mL/min；空气流量400mL/min；采用顶空进样气化室温度为105℃，加热35min，进样针温度110℃，传输管温度115℃；理论板数以氯仿峰计算应不低于5000；精密称取氯仿对照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，制成每1mL含20μg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的片剂约1.2g，精密称定，置具塞试管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)12ml，密塞，振摇2min，离心，取上清液，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2.5ml于20ml顶空瓶中，轧盖，于顶空炉中110℃平衡35min后，分别取顶空瓶中饱和气体1.2ml注入气相色谱仪测定；本片剂中，氯仿残留量不得过0.006％。
其他 本发明片剂应符合中国药典关于片剂项下的有关规定。
含量测定(1)黄芪 照高效液相色谱法测定以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈∶水＝50∶50为流动相；流速0.6ml/min；柱温45℃；蒸发光散射检测器漂移管温度为85℃；雾化气体为空气，流速为2.0L/min；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于3000；精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的片剂，研细，取约1.2g，精密称定，置索氏提取器中，加2％氢氧化钾甲醇溶液75ml，加热回流5小时，提取液蒸干，残渣加水25ml使溶解后转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取2次，每次25ml；合并乙酸乙酯液，加水12ml洗涤；弃去乙酸乙酯液，合并水液，用水饱和的正丁醇提取4次，每次30ml；合并正丁醇提取液，用氨试液30ml洗涤2次，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水适量使溶解，转移至D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长12cm)上，用水40ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇70ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液3μl和8μl、供试品溶液8μl注入液相色谱仪测定含量；本片剂中含黄芪以黄芪甲苷(C41H68O14)计，不得少于0.08mg/g。
(2)斑蝥素 照气相色谱法测定玻璃色谱柱1-2m×3mm id，OV-17(50％甲基-50％苯基聚硅氧烷)固定液的涂渍量为1.5％，担体Shimalite W(AW-DMCS)80-100目；FID检测器，进样口温度235℃；检测器温度235℃；柱温为150℃；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于1000；取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿制成每1ml含35μg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的片剂，研细，取约1.5g，精密称定，置100ml烧杯中，加入氯化钠-氢氧化钠溶液(取1mol/L氢氧化钠溶液100mL与氯化钠2g，搅拌，溶解)40ml，再加入1.2ml丙酮，超声(功率250w，频率20kHz)35分钟，放冷，加入4ml浓盐酸，搅拌，静置，放冷，抽滤，用少量水洗涤残渣，合并滤液，滤液用氯仿萃取3次，每次35ml，合并氯仿液，置50℃水浴上挥至1～2ml(整个操作过程中不得将氯仿挥干)，再加氯仿定容至3ml，摇匀，即得供试品溶液；分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入气相色谱仪测定含量；本片剂中含斑蝥素(C10H12O4)为0.025-0.180mg/g。
本发明的实施例3复方斑蝥颗粒剂的质量控制方法包括性状产品为棕黄色至深褐色的颗粒；味甜。
鉴别(1)取颗粒剂4g，研细，置索氏提取器中，加适量氯仿，置水浴中回流提取2小时，弃去氯仿液，取出滤筒，晾干，待氯仿挥尽，再置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴中回流提取5小时，回收甲醇至干，残渣加5％氢氧化钠溶液7ml使溶解，转至分液漏斗中，再用7ml水分2次洗涤容器，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取5次，每次15ml，合并正丁醇液，用水洗涤2次，每次7ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣用1.0ml水分4次溶解，转移至中性氧化铝柱(100～200目，2g，干法装柱，直径1cm，长25cm)上，先用40ml氯仿洗脱，弃去氯仿洗脱液，再用70％甲醇30ml洗脱，洗脱液于水浴上蒸干，残渣加甲醇1.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg1对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含1.5mg的混合溶液，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液12μl，对照品溶液6μl，分别点于同一硅胶G薄层板(厚550μm)上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝40∶15∶8的下层溶液为展开剂(必要时控制湿度)，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置400nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(2)取颗粒剂3g，研细，加乙醚30ml，加热回流40分钟，放冷，滤过，弃去滤液，药渣加甲醇30ml，加热回流40分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1.5ml溶解，作为供试品溶液；另取半支莲对照药材1.5g，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各15μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝15∶7∶4为展开剂，展开，取出，晾干；置400nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(3)取颗粒剂4g，研细，加50％甲醇40ml，加热回流1.5小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加50％甲醇适量溶解，加于中性氧化铝柱(100～200目，4g)上，用40％甲醇65ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇1.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取马钱苷对照品，加甲醇制成每1ml含1.5mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照品溶液各15μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上(点成带状)，以甲苯∶丙酮∶无水乙醇∶甲酸＝7∶40∶8∶0.7为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(4)取颗粒剂4g，研细，加乙酸乙酯30ml，超声25min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇1.5ml溶解，作为供试品溶液；另取女贞子对照药材1.5g，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各15μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝40∶7∶0.8为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
检查水分 不得过15.0％。
氯仿残留量 照气相色谱法测定弹性石英毛细管柱(柱长30m，内径0.25mm，膜厚度0.25μm)Rtx-5(5％苯基甲基硅氧烷为固定相)；程序升温初始温度60℃，保持5min，以每分钟30℃的速率升温至180℃，保持5min；FID检测器；进样口温度200℃；检测器温度250℃；分流比10∶1；线速度30cm/sec；氢气流量40mL/min；空气流量400mL/min；采用顶空进样气化室温度为115℃，加热30min，进样针温度120℃，传输管温度125℃；理论板数以氯仿峰计算应不低于5000；精密称取氯仿对照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，制成每1mL含25μg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的颗粒剂约1.5g，精密称定，置具塞试管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)15ml，密塞，振摇4min，离心，取上清液，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各3ml于20ml顶空瓶中，轧盖，于顶空炉中110℃平衡40min后，分别取顶空瓶中饱和气体1.5ml注入气相色谱仪测定；本颗粒剂中，氯仿残留量不得过0.006％。
其他 本发明颗粒剂应符合中国药典关于颗粒剂项下的有关规定。
含量测定(1)黄芪 照高效液相色谱法测定以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈∶水＝60∶40为流动相；流速0.8ml/min；柱温50℃；蒸发光散射检测器漂移管温度为95℃；雾化气体为空气，流速为2.5L/min；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于3000；精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.3mg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的颗粒剂，研细，取约1.5g，精密称定，置索氏提取器中，加2％氢氧化钾甲醇溶液80ml，加热回流5小时，提取液蒸干，残渣加水30ml使溶解后转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取2次，每次30ml；合并乙酸乙酯液，加水17ml洗涤；弃去乙酸乙酯液，合并水液，用水饱和的正丁醇提取4次，每次50ml；合并正丁醇提取液，用氨试液50ml洗涤2次，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水适量使溶解，转移至D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长12cm)上，用水60ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇90ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液8μl和15μl、供试品溶液15μl注入液相色谱仪测定含量；本颗粒剂中含黄芪以黄芪甲苷(C41H68O14)计，不得少于0.01mg/g。
(2)斑蝥素 照气相色谱法测定玻璃色谱柱1-2m×3mm id，OV-17(50％甲基-50％苯基聚硅氧烷)固定液的涂渍量为1.5％，担体Shimalite W(AW-DMCS)80-100目；FID检测器，进样口温度245℃；检测器温度245℃；柱温为160℃；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于1000；取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿制成每1ml含45μg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的颗粒剂，研细，取约2.5g，精密称定，置100ml烧杯中，加入氯化钠-氢氧化钠溶液(取1mol/L氢氧化钠溶液100mL与氯化钠2g，搅拌，溶解)45ml，再加入1.5ml丙酮，超声(功率250w，频率20kHz)40分钟，放冷，加入6ml浓盐酸，搅拌，静置，放冷，抽滤，用少量水洗涤残渣，合并滤液，滤液用氯仿萃取3次，每次35ml，合并氯仿液，置50℃水浴上挥至1～2ml(整个操作过程中不得将氯仿挥干)，再加氯仿定容至3ml，摇匀，即得供试品溶液；分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各3μl，注入气相色谱仪测定含量；本颗粒剂中含斑蝥素(C10H1204)为0.003-0.018mg/g。
本发明的实施例4复方斑蝥制剂的质量控制方法可以包括性状对于胶囊剂，内容物为黄绿色至棕褐色的粉末，味微苦回甜；对于片剂，产品为薄膜衣片，除去薄膜衣后显黄绿色至棕褐色，味微苦回甜；对于颗粒剂，产品为棕黄色至深褐色的颗粒；味甜。
鉴别(1)取胶囊剂、片剂或颗粒剂各2g，研细，置索氏提取器中，加适量氯仿，置水浴中回流提取1小时，弃去氯仿液，取出滤筒，晾干，待氯仿挥尽，再置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴中回流提取2小时，回收甲醇至干，残渣加5％氢氧化钠溶液lml使溶解，转至分液漏斗中，再用1ml水洗涤容器，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取2次，每次2ml，合并正丁醇液，用水洗涤1次，每次1ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣用0.4ml水1次溶解，转移至2g、干法装柱、直径1cm、长25cm、100～200目的中性氧化铝柱上，先用10ml氯仿洗脱，弃去氯仿洗脱液，再用70％甲醇10ml洗脱，洗脱液于水浴上蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg1对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5mg的混合溶液，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5-20μl，对照品溶液2-10μl，分别点于同一硅胶G薄层板(厚450μm)上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝5∶20∶0.5的下层溶液为展开剂(必要时控制湿度)，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置200nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(2)取胶囊剂、片剂或颗粒剂1g，研细，加乙醚10ml，加热回流10分钟，放冷，滤过，弃去滤液，药渣加甲醇10ml，加热回流10分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5ml溶解，作为供试品溶液；另取半支莲对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各2μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝2∶9∶1为展开剂，展开，取出，晾干；置200nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
检查水分 不得过15.0％。
其他 本发明的胶囊剂、片剂或颗粒剂应符合中国药典关于胶囊剂、片剂或颗粒剂项下的有关规定。
含量测定斑蝥素 照气相色谱法测定玻璃色谱柱1-2m×3mm id，0V-17(50％甲基-50％苯基聚硅氧烷)固定液的涂渍量为1.5％，担体Shimalite W(AW-DMCS)80-100目；FID检测器，进样口温度230℃；检测器温度230℃；柱温为150℃；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于1000；取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿制成每1ml含30μg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂内容物，研细，取约1g，精密称定，置100ml烧杯中，加入氯化钠氢氧化钠溶液(取1mol/L氢氧化钠溶液100mL与氯化钠2g，搅拌，溶解)30ml，再加入0.5ml丙酮，超声(功率250w，频率20kHz)20分钟，放冷，加入2ml浓盐酸，搅拌，静置，放冷，抽滤，用少量水洗涤残渣，合并滤液，滤液用氯仿萃取2次，每次30ml，合并氯仿液，置50℃水浴上挥至1～2ml(整个操作过程中不得将氯仿挥干)，再加氯仿定容至3ml，摇匀，即得供试品溶液；分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各0.5μl，注入气相色谱仪测定含量；本口服制剂中，胶囊剂中含斑蝥素(C10H12O4)为0.025-0.180mg/g；片剂中含斑蝥素(C10H12O4)为0.025-0.180mg/g；颗粒剂中含斑蝥素(C10H12O4)为0.003-0.018mg/g。
本发明的实施例5复方斑蝥制剂的质量控制方法可以包括性状对于胶囊剂，内容物为黄绿色至棕褐色的粉末，味微苦回甜；对于片剂，产品为薄膜衣片，除去薄膜衣后显黄绿色至棕褐色，味微苦回甜；对于颗粒剂，产品为棕黄色至深褐色的颗粒；味甜。
鉴别(1)取胶囊剂、片剂或颗粒剂5g，研细，加50％甲醇10ml，加热回流0.5小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加50％甲醇适量溶解，加于中性氧化铝柱上，用40％甲醇20ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0.5ml使溶解，作为供试品溶液；另取马钱苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照品溶液各5μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上(点成带状)，以甲苯∶丙酮∶无水乙醇∶甲酸＝1∶50∶0.5∶0.9为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(2)取胶囊剂、片剂或颗粒剂1g，研细，加乙酸乙酯10ml，超声10min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇0.5ml溶解，作为供试品溶液；另取女贞子对照药材0.2g，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各2μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝10∶9∶0.1为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
检查水分 不得过15.0％。
其他 本发明的胶囊剂、片剂或颗粒剂应符合中国药典关于胶囊剂、片剂或颗粒剂项下的有关规定。
含量测定黄芪 照高效液相色谱法测定色谱柱为C4柱，以乙腈∶水＝10∶90为流动相；流速0.5ml/min；柱温30℃；蒸发光散射检测器漂移管温度为80℃；雾化气体为空气，流速为1.5L/min；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于3000；精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.05mg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂，研细，取约0.5g，精密称定，置索氏提取器中，加2％氢氧化钾甲醇溶液50ml，加热回流4小时，提取液蒸干，残渣加水10ml使溶解后转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯40ml提取1次，乙酸乙酯液加水10ml洗涤；弃去乙酸乙酯液，合并水液，用水饱和的正丁醇提取3次，每次20ml；合并正丁醇提取液，用氨试液20ml洗涤1次，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水适量使溶解，转移至D101型大孔吸附树脂柱上，用水30ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇60ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液1μl和2μl、供试品溶液2μl注入液相色谱仪测定含量；本口服制剂中，胶囊剂中含黄芪以黄芪甲苷(C41H68O14)计，不得少于0.08mg/g；片剂中含黄芪以黄芪甲苷(C41H68O14)计，不得少于0.08mg/g；颗粒剂中含黄芪以黄芪甲苷(C41H68O14)计，不得少于0.01mg/g。
本发明的实施例6复方斑蝥制剂的质量控制方法可以包括性状对于胶囊剂，内容物为黄绿色至棕褐色的粉末，味微苦回甜；对于片剂，产品为薄膜衣片，除去薄膜衣后显黄绿色至棕褐色，味微苦回甜；对于颗粒剂，产品为棕黄色至深褐色的颗粒；味甜。
鉴别取胶囊剂、片剂或颗粒剂5g，研细，加乙酸乙酯40ml，超声30min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇2ml溶解，作为供试品溶液；另取女贞子对照药材2g，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各20μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝50∶1∶0.9为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
检查水分 不得过15.0％。
氯仿残留量 照气相色谱法测定弹性石英毛细管柱(柱长30m，内径0.25mm，膜厚度0.25μm)Rtx-5(5％苯基-甲基硅氧烷为固定相)；程序升温初始温度60℃，保持5min，以每分钟30℃的速率升温至180℃，保持5min；FID检测器；进样口温度200℃；检测器温度250℃；分流比10∶1；线速度30cm/sec；氢气流量40mL/min；空气流量400mL/min；采用顶空进样气化室温度为100℃，加热25min，进样针温度110℃，传输管温度110℃；理论板数以氯仿峰计算应不低于5000；精密称取氯仿对照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，制成每1mL含10μg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂，取内容物约0.5g，精密称定，置具塞试管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)5ml，密塞，振摇1min，离心，取上清液，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1ml于20ml顶空瓶中，轧盖，于顶空炉中110℃平衡20min后，分别取顶空瓶中饱和气体0.5ml注入气相色谱仪测定；本口服制剂中，氯仿残留量不得过0.006％。
其他 本发明的胶囊剂、片剂或颗粒剂应符合中国药典关于胶囊剂、片剂或颗粒剂项下的有关规定。
含量测定(1)黄芪 照高效液相色谱法测定色谱柱为C8柱，以乙腈∶水＝90∶10为流动相；流速1.0ml/min；柱温60℃；蒸发光散射检测器漂移管温度为100℃；雾化气体为空气，流速为3.0L/min；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于3000；精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂，研细，取约2g，精密称定，置索氏提取器中，加2％氢氧化钾甲醇溶液100ml，加热回流6小时，提取液蒸干，残渣加水40ml使溶解后转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取3次，每次10ml；合并乙酸乙酯液，加水20ml洗涤；弃去乙酸乙酯液，合并水液，用水饱和的正丁醇提取5次，每次60ml；合并正丁醇提取液，用氨试液60ml洗涤2次，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水适量使溶解，转移至D101型大孔吸附树脂柱(内径1.5cm，长12cm)上，用水70ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液10μl和20μl、供试品溶液20μl注入液相色谱仪测定含量；本口服制剂中，胶囊剂中含黄芪以黄芪甲苷(C41H68O14)计，不得少于0.08mg/g；片剂中含黄芪以黄芪甲苷(C41H68O14)计，不得少于0.08mg/g；颗粒剂中含黄芪以黄芪甲苷(C41H68O14)计，不得少于0.01mg/g。
(2)斑蝥素 照气相色谱法测定玻璃色谱柱1-2m×3mm id，OV-17(50％甲基-50％苯基聚硅氧烷)固定液的涂渍量为1.5％，担体Shimalite W(AW-DMCS)80-100目；FID检测器，进样口温度250℃；检测器温度250℃；柱温为160℃；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于1000；取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿制成每1ml含50μg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂内容物，研细，取约3g，精密称定，置100ml烧杯中，加入氯化钠氢氧化钠溶液(取1mol/L氢氧化钠溶液100mL与氯化钠2g，搅拌，溶解)50ml，再加入2ml丙酮，超声(功率250w，频率20kHz)50分钟，放冷，加入8ml浓盐酸，搅拌，静置，放冷，抽滤，用少量水洗涤残渣，合并滤液，滤液用氯仿萃取4次，每次40ml，合并氯仿液，置50℃水浴上挥至1～2ml(整个操作过程中不得将氯仿挥干)，再加氯仿定容至3ml，摇匀，即得供试品溶液；分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入气相色谱仪测定含量；本口服制剂中，胶囊剂中含斑蝥素(C10H12O4)为0.025-0.180mg/g；片剂中含斑蝥素(C10H12O4)为0.025-0.180mg/g；颗粒剂中含斑蝥素(C10H12O4)为0.003-0.018mg/g。
本发明的实施例7复方斑蝥制剂的质量控制方法可以包括性状对于胶囊剂，内容物为黄绿色至棕褐色的粉末，味微苦回甜；对于片剂，产品为薄膜衣片，除去薄膜衣后显黄绿色至棕褐色，味微苦回甜；对于颗粒剂，产品为棕黄色至深褐色的颗粒；味甜。
鉴别(1)取胶囊剂、片剂或颗粒剂各5g，研细，置索氏提取器中，加适量氯仿，置水浴中回流提取3小时，弃去氯仿液，取出滤筒，晾干，待氯仿挥尽，再置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴中回流提取6小时，回收甲醇至干，残渣加5％氢氧化钠溶液10ml使溶解，转至分液漏斗中，再用10ml水分3次洗涤容器，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取6次，每次20ml，合并正丁醇液，用水洗涤3次，每次10ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣用1.2ml水分5次溶解，转移至2g、干法装柱、直径1cm、长25cm、100～200目的中性氧化铝柱上，先用50ml氯仿洗脱，弃去氯仿洗脱液，再用70％甲醇40ml洗脱，洗脱液于水浴上蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg1对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含2mg的混合溶液，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液20μl，对照品溶液10μl，分别点于同一硅胶G薄层板(厚550μm)上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝50∶2∶10的下层溶液为展开剂(必要时控制湿度)，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置500nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
(2)取胶囊剂、片剂或颗粒剂4g，研细，加乙醚40ml，加热回流50分钟，放冷，滤过，弃去滤液，药渣加甲醇40ml，加热回流50分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml溶解，作为供试品溶液；另取半支莲对照药材2g，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各20μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝20∶1∶9为展开剂，展开，取出，晾干；置500nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
(3)取胶囊剂、片剂或颗粒剂5g，研细，加50％甲醇50ml，加热回流2小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加50％甲醇适量溶解，加于中性氧化铝柱上，用40％甲醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取马钱苷对照品，加甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照品溶液各20μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上(点成带状)，以甲苯∶丙酮∶无水乙醇∶甲酸＝9∶5∶10∶0.1为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
检查水分 不得过15.0％。
氯仿残留量 照气相色谱法测定弹性石英毛细管柱(柱长30m，内径0.25mm，膜厚度0.25μm)Rtx-5(5％苯基-甲基硅氧烷为固定相)；程序升温初始温度60℃，保持5min，以每分钟30℃的速率升温至180℃，保持5min；FID检测器；进样口温度200℃；检测器温度250℃；分流比10∶1；线速度30cm/sec；氢气流量40mL/min；空气流量400mL/min；采用顶空进样气化室温度为120℃，加热40min，进样针温度120℃，传输管温度130℃；理论板数以氯仿峰计算应不低于5000；精密称取氯仿对照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，制成每1mL含30μg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂，取内容物约2.0g，精密称定，置具塞试管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺(DMF)20ml，密塞，振摇5min，离心，取上清液，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各4ml于20ml顶空瓶中，轧盖，于顶空炉中110℃平衡50min后，分别取顶空瓶中饱和气体2.0ml注入气相色谱仪测定；本口服制剂中，氯仿残留量不得过0.006％。
其他 本发明的胶囊剂、片剂或颗粒剂应符合中国药典关于胶囊剂、片剂或颗粒剂项下的有关规定。
权利要求
1.一种复方斑蝥口服制剂的质量控制方法，所述口服制剂为胶囊剂、片剂或颗粒剂，其特征在于所述质量控制方法主要包括性状、鉴别、检查以及含量测定项目中的部分或全部；其中鉴别包括对制剂中人参、黄芪、半枝莲、山茱萸和女贞子的薄层色谱鉴别；检查包括水分、氯仿残留量以及其他常规项目；含量测定是对制剂中黄芪和斑蝥中所含斑蝥素的含量测定。
2.按照权利要求1所述复方斑蝥口服制剂的质量控制方法，其特征在于人参和黄芪的鉴别方法是以人参皂苷Rg1对照品及黄芪甲苷对照品为对照，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝5-50∶2-20∶0.5-10的下层溶液为展开剂的薄层色谱法；半枝莲的鉴别方法是以半枝莲对照药材为对照，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝2-20∶1-9∶1-9为展开剂的薄层色谱法；山茱萸的鉴别方法是以马钱苷对照品为对照，以甲苯∶丙酮∶无水乙醇∶甲酸＝1-9∶5-50∶0.5-10∶0.1-0.9为展开剂的薄层色谱法；女贞子的鉴别方法是以女贞子对照药材为对照，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝10-50∶1-9∶0.1-0.9为展开剂的薄层色谱法；氯仿残留量的检查方法是以氯仿对照品为对照的气相色谱法；黄芪的含量测定方法是以黄芪甲苷对照品为对照，以乙腈∶水＝10-90∶90-10为流动相的高效液相色谱法；斑蝥中所含斑蝥素的含量测定方法是以斑蝥素对照品为对照的气相色谱法。
3.按照权利要求1或2所述复方斑蝥口服制剂的质量控制方法，其特征在于所述鉴别方法包括以下项目的部分或全部(1)取胶囊剂、片剂或颗粒剂，研细，置索氏提取器中，加适量氯仿，置水浴中回流提取，弃去氯仿液，取出滤筒，晾干，待氯仿挥尽，再置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴中回流提取，回收甲醇至干，残渣加氢氧化钠溶液使溶解，转至分液漏斗中，再用水洗涤容器，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取，提取液用水洗涤，分取正丁醇液，蒸干，残渣用水溶解，转移至中性氧化铝柱上，先用氯仿洗脱，弃去氯仿洗脱液，再用甲醇洗脱，洗脱液于水浴上蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg1对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇溶解，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝5-50∶2-20∶0.5-10的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置200-500nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；(2)取胶囊剂、片剂或颗粒剂，研细，加乙醚加热回流，放冷，滤过，弃去滤液，药渣加甲醇加热回流，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，作为供试品溶液；另取半支莲对照药材，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照药材溶液，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝2-20∶1-9∶1-9为展开剂，展开，取出，晾干；置200-500nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；(3)取胶囊剂、片剂或颗粒剂，研细，加甲醇，加热回流，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇适量溶解，加于中性氧化铝柱上，用甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取马钱苷对照品，加甲醇溶解，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照品溶液，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶丙酮∶无水乙醇∶甲酸＝1-9∶5-50∶0.5-10∶0.1-0.9为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；(4)取胶囊剂、片剂或颗粒剂，研细，加乙酸乙酯，超声，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇溶解，作为供试品溶液；另取女贞子对照药材，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照药材溶液，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝10-50∶1-9∶0.1-0.9为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
4.按照权利要求3所述复方斑蝥口服制剂的质量控制方法，其特征在于更具体的鉴别方法包括以下项目的部分或全部(1)取胶囊剂、片剂或颗粒剂各2-5g，研细，置索氏提取器中，加适量氯仿，置水浴中回流提取1-3小时，弃去氯仿液，取出滤筒，晾干，待氯仿挥尽，再置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴中回流提取2-6小时，回收甲醇至干，残渣加5％氢氧化钠溶液1-10ml使溶解，转至分液漏斗中，再用1-10ml水分1-3次洗涤容器，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取2-6次，每次2-20ml，合并正丁醇液，用水洗涤1-3次，每次1-10ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣用0.4-1.2ml水分1-5次溶解，转移至2g、干法装柱、直径1cm、长25cm、100～200目的中性氧化铝柱上，先用10-50ml氯仿洗脱，弃去氯仿洗脱液，再用70％甲醇10-40ml洗脱，洗脱液于水浴上蒸干，残渣加甲醇0.5-2ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg1对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5-2mg的混合溶液，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5-20μl，对照品溶液2-10μl，分别点于450-550μm厚的同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝5-50∶2-20∶0.5-10的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置200-500nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；(2)取胶囊剂、片剂或颗粒剂1-4g，研细，加乙醚10-40ml，加热回流10-50分钟，放冷，滤过，弃去滤液，药渣加甲醇10-40ml，加热回流10-50分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5-2ml溶解，作为供试品溶液；另取半支莲对照药材0.5-2g，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各2-20μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝2-20∶1-9∶1-9为展开剂，展开，取出，晾干；置200-500nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；(3)取胶囊剂、片剂或颗粒剂1-5g，研细，加50％甲醇10-50ml，加热回流0.5-2小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加50％甲醇适量溶解，加于4g、100～200目的中性氧化铝柱上，用40％甲醇20-80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0.5-2ml使溶解，作为供试品溶液；另取马钱苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5-2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照品溶液各5-20μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶丙酮∶无水乙醇∶甲酸＝1-9∶5-50∶0.5-10∶0.1-0.9为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；(4)取胶囊剂、片剂或颗粒剂1-5g，研细，加乙酸乙酯10-40ml，超声10-30min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇0.5-2ml溶解，作为供试品溶液；另取女贞子对照药材0.2-2g，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各2-20μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝10-50∶1-9∶0.1-0.9为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
5.按照权利要求1或2所述复方斑蝥口服制剂的质量控制方法，其特征在于氯仿残留量的检查方法为照气相色谱法测定柱长30m、内径0.25mm、膜厚0.25μm的弹性石英毛细管柱Rtx-5，以5％苯基-甲基硅氧烷为固定相；程序升温初始温度60℃，保持5min，以每分钟30℃的速率升温至180℃，保持5min；FID检测器；进样口温度200℃；检测器温度250℃；分流比10∶1；线速度30cm/sec；氢气流量40mL/min；空气流量400mL/min；采用顶空进样气化室温度为100-120℃，加热25-40min，进样针温度110-120℃，传输管温度110-130℃；理论板数以氯仿峰计算应不低于5000；精密称取氯仿对照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺溶解，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂，精密称定，置具塞试管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺，密塞，振摇，离心，取上清液，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液于顶空瓶中，轧盖，于顶空炉中高温平衡一段时间后，分别取顶空瓶中饱和气体注入气相色谱仪测定；本口服制剂中，氯仿残留量不得过0.006％。
6.按照权利要求5所述复方斑蝥口服制剂的质量控制方法，其特征在于更具体的氯仿残留量的检查方法为照气相色谱法测定柱长30m、内径0.25mm、膜厚0.25μm的弹性石英毛细管柱Rtx-5，以5％苯基-甲基硅氧烷为固定相；程序升温初始温度60℃，保持5min，以每分钟30℃的速率升温至180℃，保持5min；FID检测器；进样口温度200℃；检测器温度250℃；分流比10∶1；线速度30cm/sec；氢气流量40mL/min；空气流量400mL/min；采用顶空进样气化室温度为100-120℃，加热25-40min，进样针温度110-120℃，传输管温度110-130℃；理论板数以氯仿峰计算应不低于5000；精密称取氯仿对照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺溶解，制成每1mL含10-30μg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂，取内容物约0.5-2.0g，精密称定，置具塞试管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺5-20ml，密塞，振摇1-5min，离心，取上清液，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1-4ml于20ml顶空瓶中，轧盖，于顶空炉中110℃平衡20-50min后，分别取顶空瓶中饱和气体0.5-2.0ml注入气相色谱仪测定；本口服制剂中，氯仿残留量不得过0.006％。
7.按照权利要求1或2所述复方斑蝥口服制剂的质量控制方法，其特征在于所述含量测定方法包括以下项目的部分或全部(1)黄芪照高效液相色谱法测定色谱柱为C18或C4或C8柱，以乙腈∶水＝10-90∶90-10为流动相；流速0.5-1.0ml/min；柱温30-60℃；蒸发光散射检测器漂移管温度为80-100℃；雾化气体为空气，流速为1.5-3.0L/min；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于3000；精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇溶解，摇匀，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂，精密称定，置索氏提取器中，加2％氢氧化钾甲醇溶液，加热回流，提取液蒸干，残渣加水使溶解后转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取；加水洗涤，弃去乙酸乙酯液，合并水液，用水饱和的正丁醇提取；提取后用氨试液洗涤，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水适量使溶解，转移至D101型大孔吸附树脂柱上，用水洗脱，弃去水液，再用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液1-10μl和2-20μl、供试品溶液2-20μl注入液相色谱仪测定含量；本口服制剂中，胶囊剂中含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计，不得少于0.08mg/g；片剂中含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计，不得少于0.08mg/g；颗粒剂中含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计，不得少于0.01mg/g；(2)斑蝥素照气相色谱法测定玻璃色谱柱1-2m×3mm i d，OV-17固定液的涂渍量为1.5％，担体Shimalite W 80-100目；FID检测器，进样口温度230-250℃；检测器温度230-250℃；柱温为150-160℃；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于1000；取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿溶解，摇匀，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂，精密称定，置烧杯中，加入氯化钠-氢氧化钠溶液，再加入丙酮，超声，放冷，加入浓盐酸，搅拌，静置，放冷，抽滤，用少量水洗涤残渣，合并滤液，滤液用氯仿萃取，氯仿液置50℃水浴上挥至少量，再加氯仿定容，摇匀，即得供试品溶液；分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各0.5-5μl，注入气相色谱仪测定含量；本口服制剂中，胶囊剂中含斑蝥素C10H12O4为0.025-0.180mg/g；片剂中含斑蝥素C10H12O4为0.025-0.180mg/g；颗粒剂中含斑蝥素C10H12O4为0.003-0.018mg/g。
8.按照权利要求7所述复方斑蝥口服制剂的质量控制方法，其特征在于更具体的含量测定方法包括以下项目的部分或全部(1)黄芪照高效液相色谱法测定色谱柱为C18或C4或C8柱，以乙腈∶水＝10-90∶90-10为流动相；流速0.5-1.0ml/min；柱温30-60℃；蒸发光散射检测器漂移管温度为80-100℃；雾化气体为空气，流速为1.5-3.0L/min；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于3000；精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂，研细，取约0.5-2g，精密称定，置索氏提取器中，加2％氢氧化钾甲醇溶液50-100ml，加热回流4-6小时，提取液蒸干，残渣加水10-40ml使溶解后转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取1-3次，每次10-40ml；合并乙酸乙酯液，加水10-20ml洗涤；弃去乙酸乙酯液，合并水液，用水饱和的正丁醇提取3-5次，每次20-60ml；合并正丁醇提取液，用氨试液20-60ml洗涤1-2次，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水适量使溶解，转移至内径1.5cm、长12cm的D101型大孔吸附树脂柱上，用水30-70ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇60-100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液1-10μl和2-20μl、供试品溶液2-20μl注入液相色谱仪测定含量；本口服制剂中，胶囊剂中含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计，不得少于0.08mg/g；片剂中含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计，不得少于0.08mg/g；颗粒剂中含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计，不得少于0.01mg/g；(2)斑蝥素照气相色谱法测定玻璃色谱柱1-2m×3mm i d，OV-17 50％甲基-50％苯基聚硅氧烷固定液的涂渍量为1.5％，担体Shimalite W 80-100目；FID检测器，进样口温度230-250℃；检测器温度230-250℃；柱温为150-160℃；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于1000；取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿制成每1ml含30-50μg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂内容物，研细，取约1-3g，精密称定，置100ml烧杯中，加入氯化钠-氢氧化钠溶液30-50ml，再加入0.5-2ml丙酮，功率250w、频率20kHz下超声20-50分钟，放冷，加入2-8ml浓盐酸，搅拌，静置，放冷，抽滤，用少量水洗涤残渣，合并滤液，滤液用氯仿萃取2-4次，每次30-40ml，合并氯仿液，置50℃水浴上挥至1～2ml，再加氯仿定容至3ml，摇匀，即得供试品溶液；分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各0.5-5μl，注入气相色谱仪测定含量；本口服制剂中，胶囊剂中含斑蝥素C10H12O4为0.025-0.180mg/g；片剂中含斑蝥素C10H12O4为0.025-0.180mg/g；颗粒剂中含斑蝥素C10H12O4为0.003-0.018mg/g。
9.按照权利要求1所述复方斑蝥口服制剂的质量控制方法，其特征在于所述质量控制方法包括性状对于胶囊剂，内容物为黄绿色至棕褐色的粉末，味微苦回甜；对于片剂，产品为薄膜衣片，除去薄膜衣后显黄绿色至棕褐色，味微苦回甜；对于颗粒剂，产品为棕黄色至深褐色的颗粒；味甜；鉴别(1)取胶囊剂、片剂或颗粒剂，研细，置索氏提取器中，加适量氯仿，置水浴中回流提取，弃去氯仿液，取出滤筒，晾干，待氯仿挥尽，再置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴中回流提取，回收甲醇至干，残渣加氢氧化钠溶液使溶解，转至分液漏斗中，再用水洗涤容器，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取，提取液用水洗涤，分取正丁醇液，蒸干，残渣用水溶解，转移至中性氧化铝柱上，先用氯仿洗脱，弃去氯仿洗脱液，再用甲醇洗脱，洗脱液于水浴上蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg1对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇溶解，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照品溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝5-50∶2-20∶0.5-10的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置200-500nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；(2)取胶囊剂、片剂或颗粒剂，研细，加乙醚加热回流，放冷，滤过，弃去滤液，药渣加甲醇加热回流，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，作为供试品溶液；另取半支莲对照药材，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照药材溶液，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝2-20∶1-9∶1-9为展开剂，展开，取出，晾干；置200-500nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；(3)取胶囊剂、片剂或颗粒剂，研细，加甲醇，加热回流，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇适量溶解，加于中性氧化铝柱上，用甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇使溶解，作为供试品溶液；另取马钱苷对照品，加甲醇溶解，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照品溶液，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶丙酮∶无水乙醇∶甲酸＝1-9∶5-50∶0.5-10∶0.1-0.9为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；(4)取胶囊剂、片剂或颗粒剂，研细，加乙酸乙酯，超声，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇溶解，作为供试品溶液；另取女贞子对照药材，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液及对照药材溶液，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝10-50∶1-9∶0.1-0.9为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；检查水分不得过15.0％；氯仿残留量照气相色谱法测定柱长30m、内径0.25mm、膜厚0.25μm的弹性石英毛细管柱Rtx-5，以5％苯基-甲基硅氧烷为固定相；程序升温初始温度60℃，保持5min，以每分钟30℃的速率升温至180℃，保持5min；FID检测器；进样口温度200℃；检测器温度250℃；分流比10∶1；线速度30cm/sec；氢气流量40mL/min；空气流量400mL/min；采用顶空进样气化室温度为100-120℃，加热25-40min，进样针温度110-120℃，传输管温度110-130℃；理论板数以氯仿峰计算应不低于5000；精密称取氯仿对照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺溶解，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂，精密称定，置具塞试管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺，密塞，振摇，离心，取上清液，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液于顶空瓶中，轧盖，于顶空炉中高温平衡一段时间后，分别取顶空瓶中饱和气体注入气相色谱仪测定；本口服制剂中，氯仿残留量不得过0.006％；其他本发明的胶囊剂、片剂或颗粒剂应符合中国药典关于胶囊剂、片剂或颗粒剂项下的有关规定；含量测定(1)黄芪照高效液相色谱法测定色谱柱为C18或C4或C8柱，以乙腈∶水＝10-90∶90-10为流动相；流速0.5-1.0ml/min；柱温30-60℃；蒸发光散射检测器漂移管温度为80-100℃；雾化气体为空气，流速为1.5-3.0L/min；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于3000；精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇溶解，摇匀，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂，精密称定，置索氏提取器中，加2％氢氧化钾甲醇溶液，加热回流，提取液蒸干，残渣加水使溶解后转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取；加水洗涤，弃去乙酸乙酯液，合并水液，用水饱和的正丁醇提取；提取后用氨试液洗涤，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水适量使溶解，转移至D101型大孔吸附树脂柱上，用水洗脱，弃去水液，再用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液1-10μl和2-20μl、供试品溶液2-20μl注入液相色谱仪测定含量；本口服制剂中，胶囊剂中含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计，不得少于0.08mg/g；片剂中含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计，不得少于0.08mg/g；颗粒剂中含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计，不得少于0.01mg/g；(2)斑蝥素照气相色谱法测定玻璃色谱柱1-2m×3mm i d，OV-17固定液的涂渍量为1.5％，担体Shimalite W 80-100目；FID检测器，进样口温度230-250℃；检测器温度230-250℃；柱温为150-160℃；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于1000；取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿溶解，摇匀，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂，精密称定，置烧杯中，加入氯化钠-氢氧化钠溶液，再加入丙酮，超声，放冷，加入浓盐酸，搅拌，静置，放冷，抽滤，用少量水洗涤残渣，合并滤液，滤液用氯仿萃取，氯仿液置50℃水浴上挥至少量，再加氯仿定容，摇匀，即得供试品溶液；分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各0.5-5μl，注入气相色谱仪测定含量；本口服制剂中，胶囊剂中含斑蝥素C10H12O4为0.025-0.180mg/g；片剂中含斑蝥素C10H12O4为0.025-0.180mg/g；颗粒剂中含斑蝥素C10H12O4为0.003-0.018mg/g。
10.按照权利要求9所述复方斑蝥口服制剂的质量控制方法，其特征在于所述质量控制方法包括性状对于胶囊剂，内容物为黄绿色至棕褐色的粉末，味微苦回甜；对于片剂，产品为薄膜衣片，除去薄膜衣后显黄绿色至棕褐色，味微苦回甜；对于颗粒剂，产品为棕黄色至深褐色的颗粒；味甜；鉴别(1)取胶囊剂、片剂或颗粒剂各2-5g，研细，置索氏提取器中，加适量氯仿，置水浴中回流提取1-3小时，弃去氯仿液，取出滤筒，晾干，待氯仿挥尽，再置索氏提取器中，加适量甲醇，置水浴中回流提取2-6小时，回收甲醇至干，残渣加5％氢氧化钠溶液1-10ml使溶解，转至分液漏斗中，再用1-10ml水分1-3次洗涤容器，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇提取2-6次，每次2-20ml，合并正丁醇液，用水洗涤1-3次，每次1-10ml，分取正丁醇液，蒸干，残渣用0.4-1.2ml水分1-5次溶解，转移至2g、干法装柱、直径1cm、长25cm、100～200目的中性氧化铝柱上，先用10-50ml氯仿洗脱，弃去氯仿洗脱液，再用70％甲醇10-40ml洗脱，洗脱液于水浴上蒸干，残渣加甲醇0.5-2ml使溶解，作为供试品溶液；另取人参皂苷Rg1对照品及黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml各含0.5-2mg的混合溶液，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5-20μl，对照品溶液2-10μl，分别点于450-550μm厚的同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷∶甲醇∶水＝5-50∶2-20∶0.5-10的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置200-500nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；(2)取胶囊剂、片剂或颗粒剂1-4g，研细，加乙醚10-40ml，加热回流10-50分钟，放冷，滤过，弃去滤液，药渣加甲醇10-40ml，加热回流10-50分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5-2ml溶解，作为供试品溶液；另取半支莲对照药材0.5-2g，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各2-20μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶甲酸乙酯∶甲酸＝2-20∶1-9∶1-9为展开剂，展开，取出，晾干；置200-500nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；(3)取胶囊剂、片剂或颗粒剂1-5g，研细，加50％甲醇10-50ml，加热回流0.5-2小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加50％甲醇适量溶解，加于4g、100～200目的中性氧化铝柱上，用40％甲醇20-80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇0.5-2ml使溶解，作为供试品溶液；另取马钱苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5-2mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照品溶液各5-20μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶丙酮∶无水乙醇∶甲酸＝1-9∶5-50∶0.5-10∶0.1-0.9为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％的硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点清晰；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；(4)取胶囊剂、片剂或颗粒剂1-5g，研细，加乙酸乙酯10-40ml，超声10-30min，滤过，滤液蒸干，残渣加无水乙醇0.5-2ml溶解，作为供试品溶液；另取女贞子对照药材0.2-2g，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各2-20μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝10-50∶1-9∶0.1-0.9为展开剂，展开，取出，晾干；喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；检查水分不得过15.0％；氯仿残留量照气相色谱法测定柱长30m、内径0.25mm、膜厚0.25μm的弹性石英毛细管柱Rtx-5，以5％苯基-甲基硅氧烷为固定相；程序升温初始温度60℃，保持5min，以每分钟30℃的速率升温至180℃，保持5min；FID检测器；进样口温度200℃；检测器温度250℃；分流比10∶1；线速度30cm/sec；氢气流量40mL/min；空气流量400mL/min；采用顶空进样气化室温度为100-120℃，加热25-40min，进样针温度110-120℃，传输管温度110-130℃；理论板数以氯仿峰计算应不低于5000；精密称取氯仿对照品，加75％N，N-二甲基甲酰胺溶解，制成每1mL含10-30μg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂，取内容物约0.5-2.0g，精密称定，置具塞试管中，精密加入75％N，N-二甲基甲酰胺5-20ml，密塞，振摇1-5min，离心，取上清液，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1-4ml于20ml顶空瓶中，轧盖，于顶空炉中110℃平衡20-50min后，分别取顶空瓶中饱和气体0.5-2.0ml注入气相色谱仪测定；本口服制剂中，氯仿残留量不得过0.006％；其他本发明的胶囊剂、片剂或颗粒剂应符合中国药典关于胶囊剂、片剂或颗粒剂项下的有关规定；含量测定(1)黄芪照高效液相色谱法测定色谱柱为C18或C4或C8柱，以乙腈∶水＝10-90∶90-10为流动相；流速0.5-1.0ml/min；柱温30-60℃；蒸发光散射检测器漂移管温度为80-100℃；雾化气体为空气，流速为1.5-3.0L/min；理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于3000；精密称取黄芪甲苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂，研细，取约0.5-2g，精密称定，置索氏提取器中，加2％氢氧化钾甲醇溶液50-100ml，加热回流4-6小时，提取液蒸干，残渣加水10-40ml使溶解后转移至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取1-3次，每次10-40ml；合并乙酸乙酯液，加水10-20ml洗涤；弃去乙酸乙酯液，合并水液，用水饱和的正丁醇提取3-5次，每次20-60ml；合并正丁醇提取液，用氨试液20-60ml洗涤1-2次，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水适量使溶解，转移至内径1.5cm、长12cm的D101型大孔吸附树脂柱上，用水30-70ml洗脱，弃去水液，再用70％乙醇60-100ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，用甲醇溶解并转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液；分别精密吸取对照品溶液1-10μl和2-20μl、供试品溶液2-20μl注入液相色谱仪测定含量；本口服制剂中，胶囊剂中含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计，不得少于0.08mg/g；片剂中含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计，不得少于0.08mg/g；颗粒剂中含黄芪以黄芪甲苷C41H68O14计，不得少于0.01mg/g；(2)斑蝥素照气相色谱法测定玻璃色谱柱1-2m×3mm i d，OV-1750％甲基-50％苯基聚硅氧烷固定液的涂渍量为1.5％，担体Shimalite W 80-100目；FID检测器，进样口温度230-250℃；检测器温度230-250℃；柱温为150-160℃；理论板数按斑蝥素峰计算应不低于1000；取斑蝥素对照品，精密称定，加氯仿制成每1ml含30-50μg的溶液，即得对照品溶液；取装量差异项下的胶囊剂、片剂或颗粒剂内容物，研细，取约1-3g，精密称定，置100ml烧杯中，加入氯化钠-氢氧化钠溶液30-50ml，再加入0.5-2ml丙酮，功率250w、频率20kHz下超声20-50分钟，放冷，加入2-8ml浓盐酸，搅拌，静置，放冷，抽滤，用少量水洗涤残渣，合并滤液，滤液用氯仿萃取2-4次，每次30-40ml，合并氯仿液，置50℃水浴上挥至1～2ml，再加氯仿定容至3ml，摇匀，即得供试品溶液；分别精密量取对照品溶液与供试品溶液各0.5-5μl，注入气相色谱仪测定含量；本口服制剂中，胶囊剂中含斑蝥素C10H12O4为0.025-0.180mg/g；片剂中含斑蝥素C10H12O4为0.025-0.180mg/g；颗粒剂中含斑蝥素C10H12O4为0.003-0.018mg/g。
11.按照权利要求8、9或10所述复方斑蝥口服制剂的质量控制方法，其特征在于所用的氯化钠-氢氧化钠溶液是在1mol/L氢氧化钠溶液100mL中加入氯化钠2g，搅拌、溶解而成的。
全文摘要
本发明公开了一种复方斑蝥口服制剂的质量控制方法，所述质量控制方法主要包括性状、鉴别、检查以及含量测定项目中的部分或全部；其中鉴别包括对制剂中人参、黄芪、半枝莲、山茱萸和女贞子的薄层色谱鉴别；检查包括水分、氯仿残留量以及其他常规项目；含量测定是对制剂中黄芪和斑蝥中所含斑蝥素的含量测定。与现有技术相比，本发明质量控制方法补充建立了黄芪和斑蝥素的含量测定以及半枝莲、山茱萸、女贞子的薄层鉴别项目，增加了氯仿残留量的检查，并对人参和黄芪两味药材的薄层鉴别方法进行了改进，提高了复方斑蝥口服制制剂的质量控制标准，可有效地控制产品质量，从而确保其临床疗效。
文档编号A61K35/413GK101036774SQ20071020046
公开日2007年9月19日 申请日期2007年4月17日 优先权日2007年4月17日
发明者叶湘武, 汤琼, 李磊 申请人:贵州益佰制药股份有限公司