专利名称：：一种抗癌前药及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种抗癌前药及其制备方法和用途，属于抗癌制药领域。技术背景传统的抗癌药物是通过口服、静脉注射等途径给药后，达到一定的血药浓度分布于全身而产生治疗作用。这种治疗方法最大的缺陷是缺乏选择性，大多数常用抗癌药物分子量低，在体内容易扩散，导致相对平均的组织分布，产生较大的毒副作用，严重影响这些药物的抗癌治疗价值。通过改变药物的结构，使药物能够在靶组织聚集，而在机体其它部分分布降低，可以起到提高疗效，降低毒副作用的效果。将抗癌药物与大分子偶联，形成大分子抗癌药物偶联物，可以改变抗癌药物在体内的分布，在特定组织器官聚集，达到靶向治疗作用。研究其靶向机理，既可以有被动靶向，例如大分子抗癌药物偶联物在癌组织中容易集聚，不容易排出，即癌组织对大分子抗癌药物偶联物的集聚潴留效应(EPR效应)，也可以有主动耙向，例如偶联物中的半乳糖结构可以与肝细胞表面的半乳糖受体主动结合。这样，就可以将大分子抗癌药物偶联物开发成针对特定靶组织器官的靶向抗癌药物。另外，大分子抗癌药物偶联物具有淋巴系统靶向性。转移是实体癌最重要的生物学特性之一，淋巴转移在实体癌的转移中很常见，而且严重影响治疗效果。实体癌淋巴转移的治疗方法主要是手术切除，但是由于淋巴转移的复杂性，例如当转移的淋巴结对大血管等正常重要结构有侵袭粘连时，手术不能进行或导致术后残留，并且有可能造成程度不等的后遗症和功能障碍。微小淋巴结转移灶以及淋巴管转移的存在，也易使清除不彻底。全身化疗和放射治疗虽然有效，但淋巴结转移灶疗效低于原发灶，并因程度不同的不良反应，患者不能耐受而使治疗失败。因此，研究淋巴系统靶向给药十分重要。近年来，大分子靶向抗癌药物成为对淋巴转移的化疗药物研究的重点，这类偶联物具有较大的分子体积，在局部注射后，不能透过毛细血管非常狭窄的内皮间隙进入血液，而比较容易通过毛细淋巴管较宽的内皮间隙进入局部的引流淋巴结。另外，这类偶联物还可以通过被巨噬细胞吞噬的方式，带到局部淋巴结，在淋巴结内酶的作用下，被水解释放出活性物质(抗癌药物)，起到杀死淋巴结内转移癌细胞的作用。因而这类大分子载体靶向药物最适于淋巴癌转移的治疗。果胶常用作片剂、微球、微囊和脂质体等的衣层，制备滴丸与颗粒剂，包埋液体或固体药物，起到缓释作用和掩蔽药物的不适臭味，是天然的大分子多糖聚合物，广泛存在于植物的细胞壁中，是由a-(1—4)-D-吡喃半乳糖醛酸单位组成的酸性大分子多糖(HyunjoKim，etal.InternationalJournalofPharmaceutics,1998，161:149-159)，其分子由3个单位构成一螺旋状结构，其螺旋的节距为1.34nm。其中，半乳糖醛酸上的羧基有许多是甲酯化形式，未甲酯化的残留羧基则为游离酸形式或钾、钠、铵、钙盐形式(孙元琳等.食品与机械，2004，20(6):60-63)。此外，其结构中还带有乙酰基和其他中性(多)糖支链，如鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖木糖等存在；果胶可通过增强单核巨噬细胞系统，激活巨噬细胞、T细胞和B细胞、NK细胞和补体系统，促进细胞因子分泌，增强红细胞免疫等提高宿主免疫功能；通过改变实体癌细胞膜的生长特性、影响实体癌细胞内信号传递途径、抗自由基作用、诱导分化与凋亡、抑制实体癌细胞的核酸与蛋白质合成、影响实体癌细胞超微结构、影响癌基因、抗突变作用、抑制实体癌血管形成而发挥直接的抗癌作用(中国中医药信息杂志，1999，5:64)。目前未见果胶用于制备淋巴靶向药物、肝靶向药物或肺靶向药物的报道，也未见果胶与抗癌药物偶联，用于制备治疗实体癌或其引流淋巴结转移的药物、或治疗肝癌或肺癌的药物中的用途的报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种新型的抗癌前药，为临床提供一种新的选择。本发明提供的抗癌前药是由具有良好的生物相容性的果胶与抗癌药物偶联形成的大分子偶联物，其中，通常将高酯果胶经过脱脂得到低酯果胶，含有氨基或羟基的抗癌药物与低酯果胶以酰胺键的方式偶联。国内外学者研究表明，分子量小于7万的果胶可以用作代血浆，而分子量大于7万的果胶则会在肾脏蓄积。由于果胶在体内不容易降解，只能通过肾脏排泄，因此，本发明选择分子量为100070000的果胶与抗癌药物偶联，制备得到新型抗癌前药。优选的方案是果胶的分子量为300035000，更优选果胶的分子量为500025000。其中果胶与抗癌药物偶联的重量比为果胶1份、抗癌药0.050.8份。所述抗癌药物为阿霉素、表阿霉素、佐柔比星、阿柔比星、柔红霉素、比生群、丝裂霉素、米托蒽醌、博莱霉素、甲氨蝶呤、喜树碱、紫杉醇或吉西他滨。上述抗癌前药加上药学上接受的辅助原料可以制备成局部注射给药制剂或静脉注射制剂。也可以是本发明抗癌前药l份、卵磷脂130份，优选抗癌前药与卵磷脂的比为l:58。加上药学上可接受的辅助原料制备成腹腔或胸腔局部注射给药制剂或静脉注射制剂。所述制剂为大输液、冻干粉针、脂质体、纳米粒或微球。上述局部注射给药制剂主要是指腹腔或胸腔局部注射给药制剂。本发明还提供了制备上述抗癌前药的方法，包括以下步骤a、低酯果胶溶解于水，然后将抗癌药物溶于水与有机溶剂的混合物中；b、将上述二溶液混合混匀，加入N-乙氧甲酰-2-乙氧基二氢喹啉(EEDQ)为脱水剂，控温2080。C，搅拌324h，加入乙醇，离心分离；c、将沉淀溶解于水，转移到透析袋中透析至检测不到小分子药物，在透析袋内液中加入乙醇，离心，沉淀真空干燥，得水溶性偶联物；上述有机溶剂可以为吡啶、三乙胺，四氢呋喃或N，N-二甲基甲酰胺，优选N，N-二甲基甲酰胺，并优选水N，N-二甲基甲酰胺二1:1;或a、将低酯果胶溶解于一定量的水，然后将抗癌药物溶于水并加到果胶溶液中，搅拌混匀后加入脱水剂，控温208(TC，搅拌324h;所述脱水剂为N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-环己基-N'-二甲胺丙基碳二亚胺(CDC)或EDCHC1，b、加入乙醇，离心分离，用水洗涤沉淀至无小分子药物，沉淀真空干燥，得难溶性偶联物。所述低酯果胶是高酯果胶经过脱脂反应得到，并过葡聚糖凝胶柱收集所需分子量的果胶使用。具体可以采用以下方法脱酯将高酯果胶溶解于水，用氢氧化钠溶液调节溶液pH到1013，158(TC搅拌反应0.5h5h。反应完成，用盐酸调节pH到2.83.5，加入有机溶剂沉淀，过滤，用有机溶剂水溶液洗涤产品到无氯离子，干燥，得低酯果胶；优选的方案是制备水溶性偶联物使用的脱水剂为EEDQ，反应温度5(TC，反应时间为8h;制备的难溶性偶联物使用的脱水剂为EDC*HC1，反应温度为5(TC，反应时间为8h。本发明还提供了上述抗癌前药在制备治疗实体癌或其引流淋巴结转移的药物、治疗肝癌或肺癌的药物中的用途。尤其是所述的抗癌前药是用于实体癌及其引流淋巴结局部注射给药的药物、用于实体癌导致腹水或胸水的腹腔或胸腔注射给药的药物，或用于治疗肝癌或肺癌的静脉注射药物中的用途。果胶在制备淋巴靶向、肝靶向或肺靶向药物中的用途也是本发明首次提出。由于果胶链上含有半乳糖残基，而肝脏上有大量的半乳糖受体，用果胶作为抗癌药物载体，可以将抗癌药物主动导向到肝脏，为肝癌的靶向治疗提供了一种新方法。试验表明，果胶与阿霉素偶联以后，根据合成反应的不同，水溶性不同，与辅料制备成不同的制剂后，分别对淋巴、肝或肺具有明确的靶向性。本发明与现有技术比较有如下优点果胶为天然大分子，具有良好的生物相容性，其中分子量低于35000的果胶，及其与阿霉素形成的偶联物，静脉注射到体内后，可以通过肾脏排泄。本发明公开的果胶-阿霉素偶联物是一种大分子前药，根据合成工艺的不同，水溶性有不同，分别与辅料制备成不同的制剂后，其结构特点使它们分别具有肺靶向性或肝靶向性。它们的结构特点还使它们都具备淋巴靶向特性，在局部注射以后，可以特异性地进入到注射部位周围的引流淋巴结，可以作为设计淋巴靶向性新药的载体使用。本发明的抗癌前药可以通过局部注射给药，可以注射到在实体癌癌灶中，也可以注射到实体癌周围的引流淋巴结中，偶联物进入淋巴结后被巨嗜细胞吞噬，在淋巴结中酶的作用下水解释放出抗癌药物，用于治疗实体癌(例如乳腺癌、胃癌、食道癌、头颈部癌、宫颈癌、宫内膜癌、大肠癌等)及其引流淋巴结转移。果胶抗癌前药有望成为设计和开发新药的一条重要途径，对于抗癌前药治疗肿瘤方面的应用，具有重要的科学意义。本发明以果胶为载体，将其与抗癌药物通过共价键偶联，有望开发成为淋巴靶向抗癌前药、肝靶向抗癌前药或肺靶向抗癌前药，该合成路线经济有效。图l水溶性果胶-阿霉素紫外图图2难溶性果胶-阿霉素紫外图其中，图中曲线表示a、阿霉素；b、难溶性果胶-阿霉素偶联物；C、果胶与阿霉素混合物；d果胶。图3难溶性果胶-阿霉素红外图其中，图中曲线表示a、阿霉素；b、难溶性果胶-阿霉素偶联物；C、果胶图4不同药物对肝癌荷瘤小鼠生存时间的影响图5不同药物对肺癌荷瘤小鼠生存时间的影响具体实施方式以下通过具体实施方式对本发明进一步描述，但不应理解为是对本发明的限定。本领域普通技术人员根据上述技术方案，还可以做出多种形式的修改、替换、变更。凡基于上述技术思想所作的修改、替换、变更均属于本发明的范围。下面通过实施例对本发明作进一步描述。实施例一、高酯果胶碱法降酯称取10g高酯果胶，溶于1000mL二次水中，然后用氢氧化钠溶液调节pH4013，保持1060°C，分别搅拌反应30、60、90、120、150和180min，反应结束后，浓盐酸调节pH=2.83.5，加入300ml乙醇，4500r/min离心15min，沉淀用60%乙醇溶液洗净氯离子，10(TC干燥，得低酯果胶。实施例二、分子量分段将处理好的的葡聚糖凝胶G-75边搅拌边倒入色谱柱中，自然沉降20min，最后放入略小于层析柱内径的圆形滤纸片，取制备好的果胶溶液小心加到凝胶柱上，用恒流泵调节二次水流速为4ml/管/6分，GPC测定果胶的分子量分布，然后合并一定分子量范围的果胶，得到分子量范围为100070000的低酯果胶。实施例三、果胶-阿霉素偶联物的制备一称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中，将50mg盐酸阿霉素溶解于10ml二甲基甲酰胺/水(V/V=l:1)的混合溶液中，控温在3(TC，搅拌30分钟。然后加入300mgEEDQ，控制温度在3(TC，搅拌反应24小时。到达所需时间时，将反应混合物转移到截留分子量为5000的透析袋，用二次水透析24小时。在透析袋内液中加入无水乙醇150ml，产生沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得水溶性偶联物。果胶和阿霉素水溶性偶联物的紫外图见图l，果胶、阿霉素、果胶和阿霉素的混合物紫外吸收见图2，果胶无紫外吸收，阿霉素在479.5nm有吸收，果胶和阿霉素混合物在488.5nm处有吸收，水溶性果胶一阿霉素偶联物在496nm处有最大吸收，紫外吸收发生红移，证明阿霉素与果胶发生了共价偶联。实施例四、果胶-阿霉素偶联物的制备二称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中，将50mg盐酸阿霉素溶解于10ml二甲基甲酰胺/水(V/V=l:1)的混合溶液中，控温在5(TC，搅拌30分钟。然后加入300mgEEDQ，控制温度在5(TC，搅拌反应8小时。到达所需时间时，将反应混合物转移到截留分子量为5000的透析袋，用二次水透析24小时。在透析袋内液中加入无水乙醇150ml，产生沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得水溶性偶联物。实施例五、果胶-阿霉素偶联物的制备三称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中，将50mg盐酸阿霉素溶解于10ml二甲基甲酰胺/水(V/V=l:1)的混合溶液中，控温在7(TC，搅拌30分钟。然后加入300mgEEDQ，控制温度在7(TC，搅拌反应6小时。到达所需时间时，将反应混合物转移到截留分子量为5000的透析袋，用二次水透析24小时。在透析袋内液中加入无水乙醇150ml，产生沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得水溶性偶联物。实施例六、果胶-阿霉素偶联物的制备四称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中，然后用O.lmol/LNaOH溶液调节pH至6.9。将50mg盐酸阿霉素溶解于10ml二甲基甲酰胺/水(V/V=l:1)的混合溶液中，控温在50。C，搅拌30分钟。然后加入220mgEEDQ，控制温度在50。C，搅拌反应4小时。将反应混合物转移到截留分子量为5000的透析袋，用二次水透析24小时。在透析袋内液中加入无水乙醇150ml，产生沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得水溶性偶联物。实施例七、果胶-阿霉素偶联物的制备五称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中，然后用O.lmol/LNaOH溶液调节pH至7。将50mg盐酸阿霉素溶解于10ml二甲基甲酰胺/水(V/V=l:1)的混合溶液中，控温在5(TC，搅拌30分钟。然后加入200mgEEDQ，控制温度在50。C，搅拌反应6小时。到达所需时间时，将反应混合物转移到截留分子量为5000的透析袋，用二次水透析24小时。在透析袋内液中加入无水乙醇150ml，产生沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得水溶性偶联物。实施例八、果胶-阿霉素偶联物的制备六称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中，然后用O.lmol/LNaOH溶液调节pH至7.1。将50mg盐酸阿霉素溶解于10ml二甲基甲酰胺/水(V/V=l:1)的混合溶液中，控温在5(TC，搅拌30分钟。然后加入240mgEEDQ，控制温度在5(TC，搅拌反应8小时。到达所需时间时，将反应混合物转移到截留分子量为5000的透析袋，用二次水透析24小时。在透析袋内液中加入无水乙醇150ml，产生沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得水溶性偶联物。实施例九、果胶-阿霉素偶联物的制备七称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中，然后用O.lmol/LNaOH溶液调节pH至6.8。将50mg盐酸阿霉素溶解于10ml二甲基甲酰胺/水(V/V=l:1)的混合溶液中，控温在50。C，搅拌30分钟。然后加入200mgEEDQ，控制温度在50。C，搅拌反应10小时。到达所需时间时，将反应混合物转移到截留分子量为5000的透析袋，用二次水透析24小时。在透析袋内液中加入无水乙醇150ml，产生沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得水溶性偶联物。实施例十、果胶-阿霉素偶联物的制备八称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中，然后用O.lmol/LNaOH溶液调节pH至7.2。将50mg盐酸阿霉素溶解于10ml二甲基甲酰胺/水(V/V=l:1)的混合溶液中，控温在5(TC，搅拌30分钟。然后加入240mgEEDQ，控制温度在50。C，搅拌反应12小时。到达所需时间时，将反应混合物转移到截留分子量为5000的透析袋，用二次水透析24小时。在透析袋内液中加入无水乙醇150ml，产生沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得水溶性偶联物。实施例十一、果胶-阿霉素偶联物的制备九称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中，然后用O.lmol/LNaOH溶液调节pH至7。将50mg盐酸阿霉素溶解于10ml二甲基甲酰胺/水(V/V=l:1)的混合溶液中，控温在5(TC，搅拌30分钟。然后加入200mgEEDQ，控制温度在50。C，搅拌反应16小时。到达所需时间时，将反应混合物转移到截留分子量为5000的透析袋，用二次水透析24小时。在透析袋内液中加入无水乙醇150ml，产生沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得水溶性偶联物。实施例十二、果胶-阿霉素偶联物的制备十称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中，然后用O.lmol/LNaOH溶液调节pH至7.2。将50mg盐酸阿霉素溶解于10ml二甲基甲酰胺/水(V/V=l:1)的混合溶液中，控温在5(TC，搅拌30分钟。然后加入300mgEEDQ，控制温度在50。C，搅拌反应20小时。到达所需时间时，将反应混合物转移到截留分子量为5000的透析袋，用二次水透析24小时。在透析袋内液中加入无水乙醇150ml，产生沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得水溶性偶联物。实施例十三、果胶-阿霉素偶联物的制备十一称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中，然后用O.lmol/LNaOH溶液调节pH至7.0。将50mg盐酸阿霉素溶解于10ml二甲基甲酰胺/水(V/V=l:1)的混合溶液中，控温在50。C，搅拌30分钟。然后加入300mgEEDQ，控制温度在50。C，搅拌反应24小时。到达所需时间时，将反应混合物转移到截留分子量为5000的透析袋，用二次水透析24小时。在透析袋内液中加入无水乙醇150ml，产生沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得水溶性偶联物。实施例十四、果胶-阿霉素偶联物的制备十二称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中，然后用O.lmol/LNaOH溶液调节pH至6.9。将100mg盐酸阿霉素溶解于20ml二甲基甲酰胺/水(V/V=l:1)的混合溶液中，控温在5(TC，搅拌30分钟。然后加入300mgEEDQ，控制温度在50。C，搅拌反应8小时。到达所需时间时，将反应混合物转移到截留分子量为5000的透析袋，用二次水透析24小时。在透析袋内液中加入无水乙醇150ml，产生沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得水溶性偶联物。实施例十五、果胶-阿霉素偶联物的制备十三称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中。将50mg盐酸阿霉素溶解于10ml二次水中，25。C搅拌60分钟。然后加入100mgEDOHCl，25。C搅拌反应12小时。到达所需时间时，加入有机溶剂，离心分离，用水洗涤沉淀至无小分子药物，沉淀真空干燥，得难溶性偶联物。其紫外图见图2，阿霉素在479.5nm处有最大吸收峰，果胶与阿霉素混合物在488.5nm处有最大吸收峰，果胶-阿霉素在498nm处有最大吸收峰，果胶无吸收。吸收发生红移，这说明阿霉素与果胶发生化学键偶联，红外谱图见图3，图3显示，与果胶相比，果胶一阿霉素在1620cm—1处出现酰胺I带和酰胺II带的混合吸收峰与1750cm—1的酯键峰相比峰面积比值显著增加，且在IIOOcm—1和1017cm—1处出现明显的阿霉素的蒽环特征吸收峰，1411.23cm—1处出现伯酰胺的吸收峰，说明果胶与阿霉素是以酰胺键的形式结合的。实施例十六、果胶-阿霉素偶联物的制备十四称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中。将50mg盐酸阿霉素溶解于10ml二次水中，25。C搅拌60分钟。然后加入110mgEDOHCl，25。C搅拌反应24小时。到达所需时间时，加入有机溶剂，离心分离，用水洗涤沉淀至无小分子药物，沉淀真空干燥，得难溶性偶联物。实施例十七、果胶-阿霉素偶联物的制备十五称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中。将50mg盐酸阿霉素溶解于10ml二次水中，7(TC搅拌60分钟。然后加入105mgEDOHCl，7(TC搅拌反应8小时。到达所需时间时，加入有机溶剂，离心分离，用水洗涤沉淀至无小分子药物，沉淀真空干燥，得难溶性偶联物。实施例十八、果胶-阿霉素偶联物的制备十六称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中。将50mg盐酸阿霉素溶解于10ml二次水中，控温在5(TC，搅拌60分钟。然后加入120mgEDOHCl，控制温度在50。C，搅拌反应5小时。到达所需时间时，加入有机溶剂，离心分离，用水洗涤沉淀至无小分子药物，沉淀真空干燥，得难溶性偶联物。实施例十九、果胶-阿霉素偶联物的制备十七称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中。将50mg盐酸阿霉素溶解于10ml二次水中，控温在50。C，搅拌60分钟。然后加入140mgEDOHCl，控制温度在50。C，搅拌反应8小时。到达所需时间时，加入有机溶剂，离心分离，用水洗涤沉淀至无小分子药物，沉淀真空干燥，得难溶性偶联物。实施例二十、果胶-阿霉素偶联物的制备十八称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中。将50mg盐酸阿霉素溶解于10ml二次水中，控温在5(TC，搅拌60分钟。然后加入110mgEDOHCl，控制温度在50。C，搅拌反应12小时。到达所需时间时，加入有机溶剂，离心分离，用水洗涤沉淀至无小分子药物，沉淀真空干燥，得难溶性偶联物。实施例二十一、果胶-阿霉素偶联物的制备十九称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中。将50mg盐酸阿霉素溶解于10ml二次水中，控温在5(TC，搅拌60分钟。然后加入130mgEDOHCl，控制温度在50。C，搅拌反应18小时。到达所需时间时，加入有机溶剂，离心分离，用水洗涤沉淀至无小分子药物，沉淀真空干燥，得难溶性偶联物。实施例二十二、果胶-阿霉素偶联物的制备二十称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中。将50mg盐酸阿霉素溶解于10ml二次水中，控温在5(TC，搅拌60分钟。然后加入120mgEDOHCl，控制温度在50。C，搅拌反应24小时。到达所需时间时，加入有机溶剂，离心分离，用水洗涤沉淀至无小分子药物，沉淀真空干燥，得难溶性偶联物。实施例二十三、果胶-阿霉素偶联物的制备二十一称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中。将19mg盐酸阿霉素溶解于10ml二次水中，控温在50。C，搅拌30分钟。然后加入200mgEDOHCl，控制温度在50。C，搅拌反应8小时。到达所需时间时，加入有机溶剂，离心分离，用水洗涤沉淀至无小分子药物，沉淀真空干燥，得难溶性偶联物。实施例二十四、果胶-阿霉素偶联物的制备二十二称取300mg低酯果胶，用30ml二次水溶解。将36mg盐酸阿霉素溶解于10ml二次水中，控温在50。C，搅拌30分钟。然后加入40mgEDOHCl，控制温度在50。C，搅拌反应8小时。到达所需时间时，加入有机溶剂，离心分离，用水洗涤沉淀至无小分子药物，沉淀真空干燥，得难溶性偶联物。实施例二十五、果胶-阿霉素偶联物的制备二十三称取300mg低酯果胶，用30ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中。将57mg盐酸阿霉素溶解于10ml二次水中，控温在5(TC，搅拌30分钟。然后加入60mgEDOHCl，控制温度在5(TC，搅拌反应8小时。到达所需时间时，加入有机溶剂，离心分离，用水洗涤沉淀至无小分子药物，沉淀真空干燥，得难溶性偶联物。实施例二十六、果胶-阿霉素偶联物的制备二十四称取300mg低酯果胶，用30ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中。将80mg盐酸阿霉素溶解于10ml二次水中，控温在50。C，搅拌30分钟。然后加入65mgEDOHCl，控制温度在50。C，搅拌反应8小时。到达所需时间时，加入有机溶剂，离心分离，用水洗涤沉淀至无小分子药物，沉淀真空干燥，得难溶性偶联物。实施例二十七、果胶-阿霉素偶联物的制备二十五称取300mg低酯果胶，用30ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中。将50mg盐酸阿霉素溶解于10ml二次水中，控温在5(TC，搅拌30分钟。然后加入50mgEDCHC1，控制温度在5(TC，搅拌反应8小时。到达所需时间时，加入有机溶剂，离心分离，用水洗涤沉淀至无小分子药物，沉淀真空干燥，得难溶性偶联物。实施例二十八、果胶-表阿霉素偶联物的制备一称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中，然后用O.lmol/LNaOH溶液调节pH至7.1。将50mg盐酸表阿霉素溶解于10ml二甲基甲酰胺/水(V/V=l:1)的混合溶液中，控温在5(TC，搅拌30分钟。然后加入250mgEEDQ，控制温度在50。C，搅拌反应8小时。到达所需时间时，将反应混合物转移到截留分子量为5000的透析袋，用二次水透析24小时。在透析袋内液中加入无水乙醇150ml，产生沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得水溶性偶联物。实施例二十九、果胶-表阿霉素偶联物的制备二称取100mg低酯果胶，用30ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中。将50mg盐酸表阿霉素溶解于10ml二次水中，室温搅拌30分钟。然后加入20mgEDOHCl，控制温度在5(TC，搅拌反应8小时。到达所需时间时，加入有机溶剂，离心分离，用水洗涤沉淀至无小分子药物，沉淀真空干燥，得难溶性偶联物。实施例三十、果胶-柔红霉素偶联物的制备一称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中，然后用O.lmol/LNaOH溶液调节pH至7。将50mg盐酸柔红霉素溶解于10ml二甲基甲酰胺/水(V/V=l:1)的混合溶液中，控温在5(TC，搅拌30分钟。然后加入200mgEEDQ，控制温度在50。C，搅拌反应8小时。到达所需时间时，将反应混合物转移到截留分子量为5000的透析袋，用二次水透析24小时。在透析袋内液中加入无水乙醇150ml，产生沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得水溶性偶联物。实施例三十一、果胶-柔红霉素偶联物的制备二称取100mg低酯果胶，用30ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中。将50mg盐酸柔红霉素溶解于10ml二次水中，室温搅拌30分钟。然后加入50mgEDC.HCl，控制温度在5(TC，搅拌反应8小时。到达所需时间时，加入有机溶剂，离心分离，用水洗涤沉淀至无小分子药物，沉淀真空干燥，得难溶性偶联物。实施例三十二、果胶-米托蒽醌偶联物的制备一称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中，然后用O.lmol/LNaOH溶液调节pH至7.1。将30mg盐酸米托蒽醌溶解于10ml二甲基甲酰胺/水(V/V=l:1)的混合溶液中，控温在5(TC，搅拌30分钟。然后加入210mgEEDQ，控制温度在50。C，搅拌反应8小时。到达所需时间时，将反应混合物转移到截留分子量为5000的透析袋，用二次水透析24小时。在透析袋内液中加入无水乙醇150ml，产生沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得水溶性偶联物。实施例三十三、果胶-米托蒽醌偶联物的制备二称取100mg低酯果胶，用30ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中。将50mg盐酸米托蒽醌溶解于10ml二次水中，室温搅拌30分钟。然后加入50mgEDC.HCl，控制温度在5(TC，搅拌反应8小时。到达所需时间时，加入有机溶剂，离心分离，用水洗涤沉淀至无小分子药物，沉淀真空干燥，得难溶性偶联物。实施例三十四、果胶-吉西他滨偶联物的制备一称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中，然后用O.lmol/LNaOH溶液调节pH至7。将50mg盐酸吉西他滨溶解于10ml二甲基甲酰胺/水(V/V=l:1)的混合溶液中，控温在50。C，搅拌30分钟。然后加入220mgEEDQ，控制温度在50。C，搅拌反应8小时。到达所需时间时，将反应混合物转移到截留分子量为5000的透析袋，用二次水透析24小时。在透析袋内液中加入无水乙醇150ml，产生沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得水溶性偶联物。实施例三十五、果胶-吉西他滨偶联物的制备二称取100mg低酯果胶，用30ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中。将50mg盐酸吉西他滨溶解于10ml二次水中，室温搅拌30分钟。然后加入50mgEDC.HCl，控制温度在5(TC，搅拌反应8小时。到达所需时间时，加入有机溶剂，离心分离，用水洗涤沉淀至无小分子药物，沉淀真空干燥，得难溶性偶联物。实施例三十六、果胶-紫杉醇偶联物的制备称取100mg低酯果胶，用30ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中。将50mg紫杉醇溶解于10mlDMF中，室温搅拌30分钟。然后加入50mgEDOHCl，控制温度在5(TC，搅拌反应8小时。至U达所需时间时，加入有机溶剂，离心分离，用水洗涤沉淀至无小分子药物，沉淀真空干燥，得难溶性偶联物。实施例三十七、果胶-佐柔比星偶联物的制备称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中。将50mg盐酸佐柔比星溶解于10mlDMF与水的混合物(DMF/水二1/1)中，室温搅拌30分钟。然后加入60mgEEDQ，控制温度在5(TC，搅拌反应8小时。到达所需时间时，将反应混合物转移到截留分子量为5000的透析袋，用二次水透析24小时。在透析袋内液中加入无水乙醇150ml，产生沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得水溶性偶联物。实施例三十八、果胶-阿柔比星偶联物的制备称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中。将50mg盐酸阿柔比星溶解于10mlDMF与水的混合物(DMF/水二1/1)中，室温搅拌30分钟。然后加入40mgEEDQ，控制温度在5(TC，搅拌反应8小时。到达所需时间时，将反应混合物转移到截留分子量为5000的透析袋，用二次水透析24小时。在透析袋内液中加入无水乙醇150ml，产生沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得水溶性偶联物。实施例三十九、果胶-比生群偶联物的制备称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中。将50mg盐酸比生群溶解于10mlDMF与水的混合物(DMF/水二1/1)中，室温搅拌30分钟。然后加入45mgEEDQ，控制温度在5(TC，搅拌反应8小时。到达所需时间时，将反应混合物转移到截留分子量为5000的透析袋，用二次水透析24小时。在透析袋内液中加入无水乙醇150ml，产生沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得水溶性偶联物。实施例四十、果胶-丝裂霉素偶联物的制备称取50mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中。将20mg丝裂霉溶解于10mlDMF与水的混合物(DMF/水二1/1)中，室温搅拌30分钟。然后加入20mgEEDQ，控制温度在5CTC，搅拌反应8小时。到达所需时间时，将反应混合物转移到截留分子量为5000的透析袋，用二次水透析24小时。在透析袋内液中加入无水乙醇150ml，产生沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得水溶性偶联物。实施例四十一、果胶-博莱霉素偶联物的制备称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中。将50mg盐酸博莱霉素溶解于10mlDMF与水的混合物(DMF/水二1/1)中，室温搅拌30分钟。然后加入50mgEEDQ，控制温度在5(TC，搅拌反应8小时。到达所需时间时，将反应混合物转移到截留分子量为5000的透析袋，用二次水透析24小时。在透析袋内液中加入无水乙醇150ml，产生沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得水溶性偶联物。实施例四十二、果胶-甲氨蝶呤偶联物的制备称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中。将50mg甲氨蝶呤溶解于10mlDMF与水的混合物(DMF/水二1/1)中，室温搅拌30分钟。然后加入55mgEEDQ，控制温度在5(TC，搅拌反应8小时。到达所需时间时，将反应混合物转移到截留分子量为5000的透析袋，用二次水透析24小时。在透析袋内液中加入无水乙醇150ml，产生沉淀，离心，沉淀用无水乙醇洗涤，干燥，得水溶性偶联物。实施例四十三、果胶-喜树碱偶联物的制备称取100mg低酯果胶，用10ml二次水溶解于100ml圆底烧瓶中。将50mg喜树碱溶解于10mlDMF与水的混合物(DMF/水二1/1)中，室温搅拌30分钟。然后加入50mgEDOHCl，控制温度在5(TC，搅拌反应8小时。到达所需时间时，加入有机溶剂，离心分离，用水洗涤沉淀至无小分子药物，沉淀真空干燥，得难溶性偶联物。实施例四十四、偶联物载药量的测定将10mg盐酸阿霉素溶解于二次水，定容成100mL溶液。准确移取lmL于10mL的容量瓶中，用二次水稀释致刻度，得到IOUg/mL的阿霉素溶液。以二次水为空白对照，在200—600nm波长范围内进行紫外扫描，确定阿霉素的最大紫外吸收波长为480nm。准确配制浓度为10.00、20.00、30.00、40.00、50.00yg/mL的盐酸阿霉素标准溶液，于最大吸收波长处测定吸光度，将标准溶液浓度C对其吸光度A进行线性回归，得回归方程为A=0.0182C+0.0288(R=0.9985)由此可知，在10-50yg/mL范围内，阿霉素浓度与吸光度间线性关系良好。样品载药量的测定准确称取一定量水溶性果胶-阿霉素，溶于二次水中配成待测溶液，测定吸光度。将测定的样品吸光度代入回归方程，求得浓度C(yg/ml)。偶联物载药量根据下式计算载药量《V/1000MX100%;V为样品体积，单位ml;M为称样量，单位mg。难溶性果胶-阿霉素滴加盐酸使其溶解后，然后用二次水稀释，配制成一定浓度测定载其他前药载药量测定过程与果胶-阿霉素步骤相同。偶联物载药量测定结果见表l:表l偶联物载药量测定结果实施例载药量〔％)实施例三21.3实施例四16.8实施例五14.0实施例六17.2实施例七18.5实施例八20.9实施例九21.2实施例十21.5实施例十一21.8实施例十二22.0实施例十三23.1实施例十四38.0实施例十五19.2实施例十六20.1实施例十七19.8实施例十八17.4实施例十九22.3实施例二十22.5实施例二十一23.8实施例二十二11.4实施例二十三8.2实施例二十四7.5实施例二十五14.6实施例二十六15.2实施例二十七10.1实施例二十八21.3实施例二十九20.8实施例三十19.5<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>实施例四十五、注射剂的制备1、药物盐酸阿霉素，购自浙江海正药业股份有限公司；水溶性果胶-阿霉素偶联物和难溶性果胶一阿霉素偶联物由成都市药友科技发展有限公司合成室提供。2、注射剂的制备2.1水溶性果胶-阿霉素偶联物注射剂的制备称取载药量为20.9。/。水溶性果胶-阿霉素偶联物100mg，加入生理盐水，搅拌溶解，然后用生理盐水稀释成10ml，得水溶性果胶一阿霉素偶联物注射液(相当于阿霉素2mg/ml)。2.2难溶性果胶-阿霉素偶联物注射剂的制备称取载药量为20.P/。的难溶性果胶-阿霉素100mg置于10ml生理盐水，室温下搅拌2小时，使药物充分混匀，得难溶性果胶-阿霉素偶联物注射液(相当于阿霉素2mg/ml)。2.3盐酸阿霉素用生理盐水溶解，配制成含阿霉素2mg/ml。实施例四十六、难溶性果胶-阿霉素偶联物卵磷脂注射剂的制备将一定量大豆卵磷脂用双蒸水溶解，室温下搅拌2-4个小时，形成大豆卵磷脂胶体溶液;称取载药量为20.1%的难溶性果胶-阿霉素，加入大豆卵磷脂溶液，室温下搅拌至药物完全混匀，得难溶性果胶-阿霉素偶联物卵磷脂注射(相当于阿霉素2mg/ml)。各种配比制备的卵磷脂注射剂的制备见表2:表2难溶性果胶-阿霉素卵磷脂注射剂的制备处方<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>实施例四十七、水溶性果胶-阿霉素偶联物淋巴靶向性实验1、动物SD大鼠，全雌，体重230250g，由成都百康医药工业药理毒理研究院提供，生产设施许可证川实动管质第06号。2、方法2.l色谱条件流动相甲醇乙腈磷酸缓冲液(25mMNH4H2P04-30mMH3P04，pH=5)=5:2:3，流速1.0ml/min，进样量20yl，波长480nm。2.2给药方法及样本采集选取大鼠112只，随机分为阿霉素组和果胶-阿霉素组，实验前禁食12h。两组动物左、右脚垫皮下注射实施例四十五中的注射剂(0.02ml/只)，分别于O、10、30、60、90、120、180、240、300min处死动物，摘取左右胭窝部淋巴结，剥离脂肪组织，称重。2.3样品处理按重量比例加50。/。ACN匀浆，3000转/分钟离心10分钟，取上清液，0.45ym滤膜过滤，取滤液进样。2.4标准曲线的制备取空白淋巴结匀浆液，加入阿霉素使浓度为O.04、0.08、0.12yg/ml，按3.3处理进样，记录色谱图、峰面积A，以A对浓度进行线性回归。3、结果不同时间点大鼠胭窝部淋巴结中阿霉素浓度见表3。表3不同时间点淋巴结中阿霉素浓度(11=7)时间(min)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>4、结论果胶-阿霉素和阿霉素在注射给药后30分钟内阿霉素组的药物浓度高于果胶-阿霉素组；60、90、120、180、240、300分钟浓度比阿霉素组高，300分钟以后阿霉素组的药物浓度已检测不到。以上结果表明，果胶-阿霉素具有淋巴靶向性，并且在淋巴结中具有缓释作用，能长时间维持较高浓度，起到持久的治疗作用。实施例四十八、果胶-阿霉素偶联物全身给药后在小鼠体内的分布试验1、动物昆明种小鼠，雌雄各半，体重1825g，购自四川大学华西医学院动物中心。2、方法2.1给药方法选取50只小鼠，随机分为5组，每组10只。分别给予尾静脉注射实施例四十五制备的含阿霉素2mg/ml的阿霉素注射液、水溶性果胶-阿霉素注射液、难溶性果胶-阿霉素注射液、实施例四十六制备的难溶性果胶-阿霉素卵磷脂注射液(抗癌前药/大豆卵磷脂=1:2)和生理盐水O.lml/只。2.2样品采集及处理给药后2小时摘除眼球取血，处死小鼠。取适量的心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏组织用匀浆液(含O.3mol/L盐酸的60。/。乙醇)按重量体积比l:9配成组织匀浆液。匀浆后3000rpm离心10min。取O.lml上清液进行荧光检测。血样3000rpm离心10min。取O.lml上清液进行荧光检测。3、结果不同组织样品中阿霉素的荧光光度值见表4。表4给药后2小时不同组织样品中阿霉素的荧光光度值(ii=10)项目心脏肝脏脾脏肺肾脏血液A1M.63土22.1617T.S2土34.1171.03±12.0451.45±18.20132.19±14.247.79±1.635B353.07±65.27303.48±27.83248.9±4f.51480.78±25.89273.42±30.1410.42±2.519e291.86±30.845S9.88±75.63224.67±35.87523.58±42.35283.4±59.8713.504±2.634D39T.41土35.26483.15±69.38277.13±20.14570.81±42.1343±63.5214.301±0.213E343.5±16.69887.99±103.62248.15±2S.93288.89±25.71411.89±15.6914.297±0.5S8注A.生理盐水组；B.阿霉素生理盐水组；C.水溶性果胶-阿霉素组；D.难溶性果胶-阿霉素生理盐水组；E.难溶性果胶-阿霉素卵磷脂组4、结论不同阿霉素制剂在小鼠体内的分布不尽相同。水溶性果胶-阿霉素和难溶性果胶-阿霉素都有在肝脏中富集的趋势，随制剂不同有所区别，但都明显高于血液中的浓度。说明果胶-阿霉素具有一定的趋肝性。实施例四十九、果胶-阿霉素抗小鼠肝癌的实验研究1.动物和细胞株C57BL/6J小鼠，雌性，1822g，46周龄，购自四川大学实验动物中心。小鼠肝癌细胞系(H印a)，购于ATCC(AmericanTypeCultureCollection)，本实验室保种。2.方法2.1肝癌模型制备用水合氯醛麻醉小鼠，固定于解剖板上，无菌条件下，于剑突下右侧开一O.5cm长的横切口，暴露腹腔，挤出肝左叶并固定好，用注射器(7号针)刺入肝包膜下23mm，注射H印a细胞悬液50yl(含细胞106个)，关腹，消毒皮肤以预防感染。2.2给药方法30只小鼠随机分为3组，每组10只，对照组(生理盐水)、阿霉素组(剂量10mg/kg)、实施例四十六制备的难溶性果胶-阿霉素卵磷脂注射液(抗癌前药/大豆卵磷脂=1:2)(相当于阿霉素剂量10mg/kg)。于接种肿瘤后3天开始治疗，尾静脉注射，注射体积100yl，每5天1次，共34次。3.结果不同药物对荷瘤小鼠生存时间的影响见图4。4.结论与对照组相比，盐酸阿霉素组和果胶-阿霉素组可见荷瘤小鼠生存时间明显延长，差异具有统计学意义。而果胶-阿霉素组效果最好，优于盐酸阿霉素组，可延长肝癌荷瘤小鼠的生存时间。实施例五十果胶-阿霉素抗小鼠肺转移瘤和肺癌的实验研究1.动物和细胞株C57BL/6J小鼠，雌性，1822g，46周龄，购自四川大学实验动物中心。小鼠Lewis肺癌细胞系(LL/2)，购于ATCC(AmericanTypeCultureCollection)，本实验室保种。2.肺癌模型制备与治疗肺癌模型制备收集对数生长期的LL/2细胞，1500rpm离心3min，细胞沉淀用无血清、无抗生素的培养基洗涤l次，计数细胞数量后用无血清、无抗生素培养基调整细胞浓度为lX107/ml。每只小鼠于尾静脉注射lX106个(0.1ml)肿瘤细胞，种瘤后3天开始治疗。治疗分三组，对照组(生理盐水)、阿霉素组(剂量10mg/kg)、水溶性果胶-阿霉素组(相当于阿霉素剂量10mg/kg)，尾静脉注射，注射体积1001，每5天1次，共34次。3.结果不同药物对肺癌荷瘤小鼠生存时间的影响见图5;各组药物对肺癌荷瘤小鼠肺部转移节结数多少的影响见表5。表5不同药物对肺癌荷瘤小鼠肺部转移节个结数多少的影响(10)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>*与对照组相比，P〈0.01。4.结论果胶-阿霉素和盐酸阿霉素组与对照组相比均可延长肺癌荷瘤小鼠的生存时间，抑制癌节结在肺部的生长。果胶-阿霉素效果更为明显。恶性肿瘤细胞的恶性行为，如血相转移，细胞表面糖复合物的合成，聚糖结构以及细胞表面和基质中的粘附分子及其受体均与糖有十分密切的关系。细胞恶变过程中表面膜的聚糖结构有明显变化，肿瘤细胞合成和分泌的糖蛋白及糖链结构也有类似的变化，从肿瘤细胞进入体内中的糖脂组成也和正常有显著差别。因此研究和开发直接作用与膜水平靶点上的药物，势必有助于发现高效特异性抗肿瘤药物。果胶表面存在半乳糖残基，而肝脏存在大量的半乳糖受体，基于上述两方面的因素，应用拼合原理，将抗癌药物与果胶偶联，制备果胶抗癌前药，通过两者相加互补，目的是提高化合物的靶向性及其生物利用度，寻找疗效高、毒副作用低的新型抗癌药物，以期为临床提供新型抗癌药物。本领域技术人员根据本发明的技术思想可以合理预测其它抗癌药物，采用本发明方法，与果胶偶联成前药，为设计和开发新药提供一条新途径，对于抗癌前药治疗肿瘤方面的应用，具有重要的科学意义和很好的应用前景。权利要求1.抗癌前药，其特征在于是由低酯果胶与抗癌药物以酰胺键的方式偶联形成的大分子偶联物；其中，所述抗癌药物含有氨基或羟基，所述低酯果胶的数均分子量为1000～70000。全文摘要本发明涉及一种抗癌前药及其制备方法及其用途，属于医药化工领域。本发明抗癌前药是由低酯果胶与含有氨基或羟基的抗癌药以酰胺键或酯键的方式偶联形成的大分子偶联物。本发明为抗癌新药的设计和开发提供了一条新的途径，对于抗癌前药治疗肿瘤方面的应用，具有重要的科学意义。本发明的大分子偶联物有望开发成为淋巴靶向抗癌前药、肝靶向抗癌前药或肺靶向抗癌前药。文档编号A61K47/48GK101134109SQ20071020172公开日2008年3月5日申请日期2007年9月17日优先权日2007年9月17日发明者唐小海,鑫宋,谢永美,宇邱申请人:成都市药友科技发展有限公司