专利名称：：一种人中期因子蛋白封闭肽在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物技术的分子生物学和生物化学领域，具体涉及一种人中期因子蛋白封闭肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
：恶性肿瘤是一种严重危害人类健康的重要疾病，肿瘤的防治是一个全球性问题，引起世界各国的广泛重视。开发切实有效的抗肿瘤药物，是当前亟待解决的重大课题。目前的传统肿瘤化疗药物有垸化剂、抗代谢药物、抗肿瘤抗生素、铂类抗肿瘤药物等，作用机制多为抑制细胞的DNA、RNA及蛋白质合成，对肿瘤细胞作用的特异性较差，故常具有较大的副作用，例如骨髓抑制、肝肾功能损害。随着分子生物学在肿瘤防治研究的多层次全方位渗透，临床上也越来越多地将肿瘤生物治疗与传统的化学治疗相结合，从而达到最佳的治疗效果。以现代分子生物学、细胞生物学和分子免疫学等前沿科学为基础，强调肿瘤发生发展及转归的分子基础，针对CD分子、膜受体信号传导、基因转导、血管形成等靶位，设计相应药物(单抗或小分子等)，用于肿瘤的防治，治疗具有针对性、特异性(靶向性)和有效性，对正常造血、免疫和主要器官功能大都没有负面影响和明显毒性报道。这种肿瘤治疗新思维和新模式，将成为现代肿瘤综合治疗新模式的里程碑。尤其是分子靶向治疗，已有多个药物在肿瘤治疗上成功应用。中期因子Midkine(MK)是一种受视黄酸诱导的肝素结合生长因子，人MK基因位于染色体llqll.2，由5个外显子和4个内含子组成。成熟的人MK蛋白由121个氨基酸残基组成，相对分子量为13.4KD,是一个分泌性的碱性肝素结合蛋白。研究表明，MK可促进多种细胞的生长、存活和迁移，在神经发生和器官发生过程中的上皮一间充质相互作用中发挥作用。MK在很多方面显示与肿瘤发生有关的活性，包括促细胞增殖、抗细胞凋亡、促纤维蛋白溶解和血管新生等，而且在许多恶性肿瘤及其衍生肿瘤细胞株中表达增加，可能成为肿瘤诊断和治疗的一个耙点。传统的分子靶向抗肿瘤药物多为单抗类药物(例如贺赛汀、美罗华等)，随着生物技术的发展，多肽作为药物在临床上的应用越来越广泛，相应的研究也日益受到重视。多肽类药物具有分子量小、无免疫原性、可控缓释、可口服给药、生产方便等优点。由于新给药技术的发展、新生产技术和极具活力的研发活动的开展，许多制药公司、生物技术公司都步入了这一领域。在基因组学和蛋白组学领域的进步都为多肽类药物的研究提供了新的动力。多肽与靶蛋白的结合力，类似抗原抗体反应的分子间作用力。亲合力高的多肽有可能达到抑制靶蛋白活性这种效果。噬菌体展示技术于1985年首先由Smkh发明，在1988年由Parmley和Smith提出构建噬菌体随机肽库的设想，而在1990年则由三个研究小组构建并成功筛选噬菌体肽库，从而标志着噬菌体肽库技术的诞生。噬菌体肽库的基本原理是将随机肽段的DNA序列插入到噬菌体衣壳蛋白的基因组，插入的DNA经噬菌体表达以后，以肽展示在噬菌体衣壳蛋白上，肽段与噬菌体衣壳蛋白形成融合蛋白而呈现于噬菌体表面，并利用噬菌体能大量复制的特点，得到不同重组噬菌体的多个拷贝，而不影响噬菌体的浸染与扩增能力。这一技术使基因型和表型得以巧妙地结合，从而为不同的研究提供了有利工具。生物大分子之间的相互作用，实质上是功能位点间的相互作用，并不一定需要整个分子的完全接触，MK与其受体间的相互作用以及MK与抗-MK抗体间的相互作用也不例外。因此，只要能找到受体分子或封闭性抗体分子上与MK结合的肽序列(或模拟肽)来竞争性或封闭性抑制MK与其受体相结合，进而就能达到抑制MK促肿瘤生长的作用。在噬菌体随机肽库中恰恰包含了极大量的，在氨基酸组成序列上相互有差异的小肽，这些小肽呈现于噬菌体表面，他们可以在序列上充当或模拟生物大分子间相互作用的功能位点。噬菌体随机肽库技术的优势在于其筛选通量大，操作简便。目前已经商品化的噬菌体随机肽库最常用的是由美国NewEnglandBiolabs公司(简称NEB)在M13噬菌体基础上开发的噬菌体文库，M13噬菌体是一种溶源性噬菌体，它只感染而不裂解宿主菌，最终以分泌蛋白的形式排出，宿主菌保持其原有的活性，并不断分泌扩增的噬菌体。NEB公司的产品包括7肽库，12肽库，环7肽库三种文库，其中前面两种属于非构象型肽库，第三种是一个构象型肽库。两类肽库的区别主要在于，构象型肽库是将两个半胱氨酸的核苷酸序列加于随机肽DNA序列的两端，二硫键能够相结合成环从而使呈现的肽段形成具有功能活性的空间结构，进而模拟天然分子的相互作用；而非构象约束型肽库所呈现的肽段则为线形，则不使所呈现的随机肽形成二硫键。
发明内容本发明的目的是提供一种与人中期因子蛋白特异性结合的封闭肽，在抗肿瘤药物中的应用。本发明采用的技术方案是一种人中期因子蛋白封闭肽(下文中用MK-P3表示)，具有如下氨基酸序列CTSTAMDNC。所述MK-P3通过以下方法筛选得到(1)选择靶蛋白选择人中期因子蛋白作为随机肽库筛选的耙蛋白。采用原核表达系统高效表达并纯化得到人中期因子重组蛋白。(2)生物淘洗筛选以人中期因子蛋白为靶蛋白，对噬菌体表面的随机7肽库和环7肽库进行生物淘洗3轮。(3)测定特异性随机肽序列生物淘洗后，选取pfu值约为100的平板上的蓝色噬斑，感染宿主菌，37。C培养，离心后，上清中加入PEG/NaCl，于0。C沉淀M13噬菌体单链DNA，离心后沉淀溶于TBS/NaN3，得样品ssDNA用于测序。(4)序列分析对测序结果进行分析，确定筛选得到的中期因子特异结合多确定MK-P3的氨基酸序列后，其合成可采用Fmoc-氨基酸树脂固相合成法进行，经过HPLC纯化，质谱(MS)鉴定，纯度>90%。采用MTT法，检测MK-P3对HepG2和HUVEC细胞增殖的影响；制备BALB/c小鼠移植瘤模型，检测MK-P3对肿瘤生长及微血管密度的影响。经实验验证MK-P3具有抗肿瘤作用，可用于制备抗肿瘤药物。进一步，所述MK-P3可应用于制备抑制恶性肿瘤细胞生长的药物。再进一步，所述MK-P3可应用于制备抑制恶性肿瘤新生血管生成的药物。本发明提供了一种人中期因子蛋白封闭肽在制备抗肿瘤药物中的应用，该多肽可抑制恶性肿瘤细胞生长、尤其是抑制恶性肿瘤新生血管生成，为新药筛选提供了基础，具有重大临床意义。图1为MK封闭肽对HepG2细胞(A)和HUVEC(B)增殖的抑制作用；图2为BALB/c小鼠移植瘤HE染色(X200);A为模型对照；B为MK-P3;图3为BALB/c小鼠移植瘤MVD(X200);A为模型对照；B为MK-P3。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例l:人中期因子蛋白封闭肽的筛选(一)人中期因子蛋白的表达纯化根据人中期因子的mRNA序列，可溶性表达并纯化人中期因子蛋白。(二)噬菌体多肽库的筛选及阳性克隆的鉴定和序列分析噬菌体7肽库和环7肽库筛选(固体包被法)MK重组蛋白包被平皿，包被量为15pg/孔，经封闭液封闭后，洗涤平皿。加入10iul原库/L(100fil0.r/^TBST稀释)，室温轻摇10-60min后洗涤平皿，酸性洗脱液100pl洗脱结合噬菌体，洗脱液离心后，以150jillMTris-HCl(PH9.1)中和后。收集洗脱物，取少量用于测定洗脱物滴度，其余用于扩增。噬菌体滴度的测定挑选生长良好的ER2537单菌落，接种于LB/Tet中，孵育至对数生长中期(OD6oo=0.5)。LB培养基IO倍比稀释噬菌体，以l:10加入ER2537中，混均后涂板(LB/IPTG/Xgal)培养。噬斑计数以噬斑数为100左右的平皿为准。回收率(％)二洗脱噬菌体数/加入噬菌体数x100。/^。噬菌体的扩增ER2537单菌落接种于LB/Tet中过夜培养，以1:100接种至LB中，加入待扩增的噬菌体，37°C，270r/m培养4.55h。收集培养物离心，上清中加入1/6体积的PEG/NaCl，4。C沉淀过夜。离心，用1mlTBS悬浮沉淀(并至少溶解1h)，离心后用1/6体积的PEG/NaCl再次沉淀，冰上孵育60min;4°C，12000xg，离心10min，弃上清，再次离心30sec，用枪头吸弃残留上清。TBS(0.02。/。NaN3)重悬沉淀(至少溶解1h)，离心去除不溶杂质。上清4'C保存。扩增后的洗脱物进行滴度测定，准备进行下一轮筛选。第二、三轮筛选程序与第一轮筛选相仿，仅有以下几点不同1、投入筛选的肽库为上一轮筛选的洗脱扩增物，控制噬菌体数量在l2xl0"pfu。2、结合后的洗涤过程中，使用的洗涤液PBST中Tween-20的浓度提高至0.5%,洗涤次数增至10次。3、第三轮筛选的洗脱物取lOpl铺板测滴度，余者4t:保存，不再扩增。随机挑选第三轮分隔良好的蓝色噬斑，培养后进行ELISA分析和DNA序ELISA方法比较阳性噬菌体克隆对靶蛋白的结合能力-在噬菌体洗脱液滴度测定时，在<100个蓝斑的平板上，挑选轮蓝色克隆，2mlER2537菌液，37。C震荡培养5h。2次离心，稀释用于ELISA检测。MK蛋白100pg/孔包被酶标板过液，封闭，洗涤后加阳性噬菌体克隆，以各轮未结合噬菌体做阴性对照。室温孵育2h，TBST洗涤后加入HRP标记抗M13抗体(1:5000)，室温震荡lh，TBST洗板，显色后于酶标板测4卯nm处A值。测序模板的快速纯化扩增噬斑，在第一次离心后，吸取500)ul含有噬菌体的上清，转入新的离心管中。加入200ialPEG/NaCl，室温静置10min。离心，用100|^1碘化物缓冲液重悬沉淀物，加入250fal乙醇。室温孵育10min，室温短暂孵育将选择性沉淀单链噬菌体DNA，而大部分噬菌体蛋白保留在溶液中。离心10min，用70%乙醇洗涤沉淀物，真空吸干后，用30piTE缓冲液重悬沉淀物。取5|_il作为测序模板，送出测序。实验结果经过3轮筛选，7肽库中与MK特异性结合的噬菌体已从原始肽库中筛选并富集出来(见表l)。各阳性克隆与目标蛋白均具有一定结合力(见表2)，将筛选出的阳性克隆送上海中科新生命生物技术有限公司测序，根据DNA序列推导相应的氨基酸序列，共测出14组不同序列(见表3)。选择与靶蛋白结合力高及序列测定重复次数多的阳性克隆序列，合成了3条线性肽和3条环肽(见表4)，序列分别为CVIHWDFIC;CTWLHWWAC;CTSTAMDNC;LLWYDEI;HAIYPRH;PVPRSRP，委托杭州中肽公司合成。表1:以MK为靶分子筛选噬菌体7肽库及环7肽库的回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>名称多肽序列MK陽P1CVIHWDFICMK-P2CTWLHWWACMK-P3CTSTAMDNCMK陽P4LLWYDEIMK-P5HAIYPRHMK-P6PVPRSRP实施例2:MTT法检测封闭肽对人HepG2肝癌细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)生长的抑制作用实验分组实验由筛选出的多肽MK-P3作用于HepG2和HUVEC两种细胞，其中每种细胞又分为15|imol/L、50pmol/L和150pmol/L3个浓度梯度组。MTT检测细胞增殖人肝癌细胞系(HepG2)及人脐静脉内皮细胞(HUVEC)由浙江大学传染病研究所提供，用含10%小牛血清及100U/ml青霉素，100ng/ml链霉素的DMEM培养基(Gibco公司)，置37°C,5%0)2培养箱中培养。取对数生长期细胞接种至96孔板，200^1/孔，3Xl()3个细胞/每孔，每组设3孔，重复3次，37°C，5%(302培养箱中培养，待细胞出现60-80%融合后，换无血清培养基培养24h后，加入不同浓度MK封闭肽，设不加封闭肽孔为空白对照。继续培养48h后，每孔加20^MTT，37°C，5%002培养箱孵育卯min,测定4卯nm光吸度值"49Q)，通过细胞生长倍增数量评价封闭肽对H叩G2和HUVEC生长的影响，计算细胞增殖抑制率。抑制率(％)=["柳对照一Am用药)/^柳对照]X100%。实验结果-MK封闭肽抑制HepG2和HUVEC增殖MK-P3在15Mg/ml时即能显著抑制HepG2和HUVEC增殖作用，当浓度进一步升高至50)Lig/m和150pg/ml，其抑制作用也随之增强，具有剂量依赖性(图1)。实施例3:制备BALB/c小鼠移植瘤模型，分析MK封闭肽在小鼠体内的抗血管生成及抗肿瘤活性作用动物模型建立H22细胞由浙江大学传染病研究所提供；BALB/c小鼠，18-20g，雌雄各半，由上海必凯实验中心提供，。将H22细胞注射入BALB/c小鼠腹腔，10-14d左右取腹水，收集肿瘤细胞。用1640培养基调细胞悬液浓度至5X10"ml，每只BALB/c小鼠背部皮下取一点种植细胞悬液0.1ml，观察小鼠背部肿瘤形成情况及其表面有无红肿及破溃。实验分组及处理取BALB/c小鼠96只，随机分为8组，每组12只(1)MK-P3组腹腔注射MK-P30.5mg'kg";(2)模型对照组腹腔注射PBS;(3)阳性对照组腹腔注射5-FU10mg'kg—、以上各组动物于注射H22细胞当日开始给药，1-7组每日腹腔注射给药2次，5-FU每日一次，连续注射给药21天。开始给药后第28天BALB/c小鼠处死，切取肿瘤称重，计算抑瘤率抑瘤率(％)=(模型对照组平均瘤重量-治疗组平均瘤重量)/模型对照组平均瘤重量X100。/。。肿瘤组织液氮冻存备用。免疫组织化学(ABC法)检测肿瘤组织中微血管密度肿瘤组织用10%福尔马林固定，石蜡包埋，4pm厚连续切片，常规HE染色观察肿瘤细胞形态。免疫组织化学法检测肿瘤组织中微血管密度(MVD):用VIII抗体标记微血管，了解肿瘤组织新生血管情况并检测肿瘤组织中微血管密度(MVD)。ABC免疫组织化学法按照说明书的步骤进行。MVD判断方法先在40倍显微镜下观察整张切片的血管分布情况，选择癌灶内微血管最密集的5个区域，即"热点"，然后在200倍镜下计数每个区域中的血管数，取5个区域的平均值作为该只小鼠肿瘤MVD，取同一组内小鼠肿瘤的平均MVD作为该组肿瘤的平均MVD。计数由2位不知临床资料的病理科高年资医生完成。染成棕色的血管内皮细胞或血管内皮细胞族，只要他们和邻近的微血管、肿瘤细胞或其他结缔组织分幵，就视为一个微血管；同一个血管的"头"与"尾"正巧在同一切面上，也作为2个微血管计算。血管腔和红细胞不作为判断微血管的标准。实验结果-MK封闭肽抑制BALB/c小鼠肿瘤生长细胞接种后第七天，BALB/c小鼠背部皮下开始出现肿块，到第14天，各小鼠背部皮下均出现肿瘤块，小鼠移植瘤率高达100%。MK封闭肽对移植瘤均有不同程度抑制作用，MK-P3的抑瘤率为56.4%。(见表5)。表5:MK封闭肽抗BALB/c小鼠移植瘤试验瘤重与抑瘤率分组瘤重(g)抑瘤率(％)MK-P10.5mg.kg-1组2.42±0.56*22.0MK-P20.5mg.kg-1组2.31±0.645*25.4MK-P30.5mg.kg-'组1.35±0.88**56.4MK-P40.5mg-kg-'组2.31±0.49*25.5MK-P50.5mg'kg-1组2.26±0.34**27.0MK-P60.5mg'kg-1组2.50±0,16*19.313阳性对照(5-FU10mg'kg-')组1.692±0.563*45.4模型对照(PBS0.1ml/只)组3.099±0.452—x±s，n=12，*尸<0.05，**尸<0.01，丄j投M对照绍比抑瘤率(％)=(投M对照组平均瘤巫呈-治疗组平均瘤重ifO/投艰对照组平均瘤2呈X100。/。免疫组织化学结果肿瘤组织苏木素-伊红(HE)染色肿瘤细胞生长良好，呈多边形，核大，深染而不规则，可见核分裂现象。MK-P3处理组出现不同程度的肿瘤细胞坏死现象。(图2)微血管密度(MVD):MK封闭肽处理组MVD明显低于模型对照组(图3)。因此，MK封闭肽可能通过抑制肿瘤血管新生来抑制肿瘤生长。序列表.ST25.txtSEQUENCELISTING〈110>湖州市中心医院<120>—种人中期因子蛋白封闭肽在制备抗肿瘤药物中的应用<130〉〈160>6<170>Patentlnversicm3.2<210>1<211>9〈212〉PRT<213〉Unknown<220〉<223>人工序列〈400〉1CysVallieHisTrpAspPhelieCvs15<210>2<211>9<212〉PRT<213〉Unknown〈220><223>人工序列<400〉2CysThrTrpLeuHisTrp丁rpAlaCys1.5<210〉3〈211〉9〈212〉PRT<213>Unknown〈220><223>人工序列<400〉3CysThrSerThi'AlaMetAspAsnCvs1'5〈210〉4<211>7<212>PRT〈213〉Unknown《220〉〈223〉人工序列<400〉4LeuLeuTrpTyrAspGlulie15<210>5<211〉7〈212〉PRT<213>Unk訓n<220><223〉人工序列序列表.ST25.txt<400>5HisAlalieTyrProArgHis15<210〉6〈211>7〈212>PRT<213>Unknown<220><223>人工序列〈400〉6ProValProArgSerArgPro1权利要求1、一种人中期因子蛋白封闭肽在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的人中期因子蛋白封闭肽具有如下氨基酸序列CTSTAMDNC。2、如权利要求l所述的应用，其特征在于所述的人中期因子蛋白封闭肽应用于制备抑制恶性肿瘤细胞生长的药物。3、如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的人中期因子封闭肽应用于制备抑制恶性肿瘤新生血管生成的药物。全文摘要本发明涉及一种人中期因子蛋白封闭肽在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的人中期因子蛋白封闭肽具有如下氨基酸序列CTSTAMDNC。本发明提供了一种人中期因子蛋白封闭肽在制备抗肿瘤药物中的应用，该多肽可抑制恶性肿瘤细胞生长、尤其是抑制恶性肿瘤新生血管生成，为新药筛选提供了基础，具有重大临床意义。文档编号A61P35/00GK101255190SQ20071030130公开日2008年9月3日申请日期2007年12月26日优先权日2007年12月26日发明者戴利成,沈建芬申请人:湖州市中心医院