热可逆水包油乳液的制作方法

专利名称：：热可逆水包油乳液的制作方法热可逆水包油乳液本发明涉及一；它包含TLR4兴奋剂，一皮称作TLA4。TLR4((toll-like受体型4)是由免疫系统的抗原-呈递细胞表达的受体；它涉及对gram(革兰氏)-细菌感染的早期防卫机制。细菌的脂多糖(LPS)是TLR4的天然配体；它激活受体，从而触发一连串生化事件，特别是Nf-KappaB转录因子的激活，以及助炎症细胞因子的产生。单膦酰基脂类A,后者来自LPS的水解，也是TLR4的配体，优点是其毒性比LPS小。WO2004/060396描述O/W(水包油)乳液形式的制剂，它包含磷脂佐剂。具有亚微米粒度的该乳液是借助高压均化器(微流化器)获得的。其生产方法使用高机械能以便获得足够大的剪切力来减少油滴的粒度。按照该公开内容，获得的乳液含有粒度近似于500nm的液滴。可心的是，能有一种该专利申请中建议的制剂的替代制剂，尤其是可利用较简单方法(不要求专门剪切技术)，涉及低能量，同时又可重复、可靠和可用于大规模生产；另外，该佐剂制剂必须能通过增加对抗原的免疫应答改进疫苗的有效性，同时却不表现出将有损其完全安全给药的任何毒性迹象。为此，本发明的目的是一种水包油(0/W)乳液，包含i)TLR4兴奋剂，称作TLA4，其化学结构不包含糖环，ii)角鲨烯，ill)含水溶剂，iv)非离子亲水表面活性剂，其是聚氧乙烯烷基醚，v)非离子疏水表面活性剂，并且它是热可逆的。本发明乳液中包含的TLR4兴奋剂不是脂类A或脂类A的衍生物或其结构像脂类A的分子。典型地，TLA4是通式I，II,III或IV的化学化合物通式I的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>通式m的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>通式IV的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>其中，就通式I,II,III或IV每一个而言，R^选自a)C(0);b)C(O)-(C广d4烷基)-C(O),其中所述d-C14烷基任选地取代上羟基，d-C5烷氧基，CrC5亚烷基二氧基，(C广C5烷基)氨基或(CrC5烷基)芳基，其中所述(crc5烷基)芳基的芳基部分任选地取代上crc5烷氧基，(CVC5烷基)氨基，(d-C5烷氧基)氨基，(d-C5烷基)氨基(C广C5烷氧基)，-0-(CrC5烷基)氨基(CrC5烷氧基)，-O-(d-C5烷基)氨基-C(O)陽(d-C5烷基)-C(O)OH,或-O-(C!-C5烷基)氨基-C(O)-(CrCs烷基)-C(O)-(CrC5)烷基；c)含有C2-d5线型或支化链的烷基，任选地取代上羟基或烷氧基;以及d)-C(O)-(CVd2亚芳基)-C(O)-，其中所述亚芳基任选地取代上羟基，卣素，硝基或氨基；a和b独立地是O,1,2,3或4;d，d，，d",e,e，和e，，独立地是O,1,2,3或4;X1,X2,Y工和Y2独立地选自空位，氧，NH和N(C(O)(CrC4烷基))，和N(d-C4烷基);W4口\￥2独立地选自羰基，亚曱基，石风和亚石风；112和115独立地选自a)C2toC2。直链或支化链烷基，其任选地取代上氧代，羟基或烷氧基；b)C2t0C2。直链或支化链烯基或二烯基，其任选地取代上氧代，羟基或烷氧基；c)C2t0C2。直链或支化链烷氧基，其任选地取代上氧代，羟基或烷氧基；d)NH-(C2toC2o直链或支化链烷基)，其中所述烷基基团任选地取代上氧代，羟基或烷氧基；和e)其中Z选自O和NH,而M和N独立地选自烷基，烯基，烷氧基，酰氧基，烷基氨基和酰基氨基，其包含C2-C2。线型或支化链；113和116独立地选自C2tOC2Q直链或支化链烷基或烯基，其任选地取代上氧代或氟；R4和R7独立地选自C(O)-(C2toC加直链或支化链烷基或烯基)，C2toC20直链或支化《连烷基，C2toC20直链或支化链烷氧基，和C2toC20直链或支化链烯基；其中所述烷基，烯基或烷氧基基团可独立地并任选地取代上羟基，氟或d-C5烷氧基；G2,G3和G4独立地选自氧，亚曱基，氨基，硫醇，-C(O)NH画，-NHC(O)-，和-N(C(O)(C广Q烷基))-;或。2!14或G"R7可合在一起是氢原子或羟基；且其中就通式III而言a，和b，独立地是2，3,4,5,6,7或8,优选2;Z1选自-OP(O)(OH)2,-P(O)(OH)2，-OP(O)(OR8)(OH),其中R8是d-Q烷基链，-OS(0)2OH,-S(0)2OH，-C02H,-OB(OH)2，-OH,-CH3,画NH2和画NR93,其中119是d画C4烷基链；z2选自-OP(0)(OH)2,-P(O)(OH)2,-OP(O)(OR10)(OH)，其中R"是d画C4烷基链，-OS(O)2OH,腸S(O)2OH,-C02H,國OB(OH)2,-OH,-CH3,誦NH2和画NR11，其中R"是d画C4烷基链；且其中就通式IV而言R12isH或d-Q烷基链；或通式I,II,III或IV的化合物的药学可接受盐。本发明的乳液是热可逆的，就是说，当加热至至少等于"所述相变温度"的温度时，它从o/w乳液状态转变为w/o乳液状态。在微观尺度上，相变温度反映从指向油相的曲率到指向水相的曲率的改变，该转变必然涉及经过零平均曲率相的穿越(于是，该系统涉及层状相或者涉及微乳液)。本发明乳液可通过变温相变方法获得，该方法从工业的观点看是非常有利的，因为它能方便地控制和适应大规模生产。这样的方法保证安全和成本效益，而这二者都是制药工业所必须的。另外，借助该方法，可获得油滴粒度小的单分散乳液，从而使乳液可借助截止粒度等于200nm的灭菌过滤器轻易地滤过。有利的是，本发明乳液油滴总体的至少90%(体积)具有《200nm的粒度。一般地，该乳液油滴总体的至少50%(体积))具有《110nm的粒度。按照一个特定特征，油滴总体的至少90。/。(体积)具有《180nm的粒度，并且油滴总体的至少50%(体积))具有《110nm的粒度。一般地，本发明热可逆乳液是均质的。术语"均质乳液"是指这样一种乳液，其油滴粒度分布的图形表达("granulogram")为单峰的。就典型而言，该图形表达属"高斯型"。油滴的粒度可利用各种不同手段测定，特别是采用激光衍射粒度分析仪，例如，LS系列(特别是LS230)BeckmanCoulter装置，或Mastersizer系歹'j(特别是，Mastersizer2000)的Malvern装置。这些装置的测定原理基于分析当样品受到激光束照射时粒子散射的光强度随角度而变化(大、中和小角度检测器)。该分析是借助根据所用材料的粒度和性质选择的数学模型实施的。在亚微米粒度测定的情况下，需要应用专门光学模型(Mie理论)，考虑油相的折光指数(在本工况中，对角鲨烯来说是1.495)以及水相的折光指数(例如，对水，是1.332);还必须能检测由非常细的粒子发射的弱光强度，这要求借助以下措施优化该分析方法-用于大角偏振强度差示散射测定的附加检测元件(large-anglepolarizedintensitydifferentialscatteringmeasurement)(PIDS系纟克，由Coulter生产，它能从40nm测起)，-组合2种波长，蓝和红光的检测系统，由Malvern制造。较短-波长蓝光光源，与宽角散射和后散射检测器相连，能增强亚微米范围分析的性能等级。视所使用的装置而定，测定值可随装置的元件以及使用数据处理软件而略有不同。本发明热可逆乳液的相变温度是每种乳液特有的特征，随着其组分的本性及其相对浓度而变化。有利的是，本发明乳液的组成应选择得使相变出现在45°C~8(TC之间，优选5065。C之间的温度。该温度范围的优势在于没有乳液改变状态的危险，如果它在相对高温(-37°C)之下贮存的话。另外，正如在制备热可逆乳液的方法中，诸组分的加热不超过80。C,这有利于维持诸组分的结构完整性，特别是TLA4的。当乳液的相变温度高时，特别是当它大于或接近80。C时，可有用的是，通过向乳液的组合物中加入糖醇来降低它，糖醇通常选自山梨醇、甘露醇、甘油、木糖醇或赤藓醇。当糖醇以0.1~10wt。/。的浓度范围，优选以1~10wt"X)的浓度范围，特别是2~7wt。/。的浓度范围使用时，乳液的相变温度可下降约l(TC。乳液的相变温度也可通过以緩冲盐水的水相替代仅由水组成的水相来降低。通常使用TRIS緩冲液、磷酸盐緩冲液如PBS，不含Ca"和Mg"的DulbeccoPBS或拧檬酸盐緩冲液。或US2005/0164988中描述的方法合成的。具体地说，本发明TLA4是一种通式I的化学化合物，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>或该化合物的药学可接受盐。优选的是，Rl是C(O)或C(O)-(CH2)n-C(O),n是l,2,3或4，a，b,d,d,,d",e,e，和e，，独立地是1或2,XI,X2,Yl和Y2是NH，Wl和W2是C(O),R2和R5独立地选自C1(rC15直链烷基，其任选地取代上氧代,NH-(C1Q-C15直链烷基)，和<formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>其中M和N独立地是C2toC20直链烷基或烯基，R3和R6是C5-C1C)直链烷基，R4和R7选自氬，C(O)-(C8-C12直链烷基)或C(O)-(C8-C12直链烯基)，Gl和G3是氧或-NH(CO)隱，G2和G4是氧。TLA4表现出体外和/或体内的免疫刺激活性。体外免疫刺激活性采用特别是以下方法评估1)测定全人血细力包生产TNFa的增加，或2)测定在TNFa启动子控制下以碱性磷酸酶基因由线转染(linetransfected)的THP-1生产石咸性石寿酸酶的增加，或3)测定鼠科脾细胞生产细胞因子如IL-10和干扰素Y的增加，或4)测定鼠科巨噬细胞线RAW264生产TNFa的增加，或5)测定U373人体星形细^>瘤生产IL-6的增加，或6)由流动细胞计量术测定由人单核细胞衍生的树突细胞活化/成熟的增加，根据活化标记物如CD25,CD80/CD83的表达。所有这些测定方法都是本领域技术人员熟知的，特别是，描述在US2003/0153532的实施例7中，或在JournalofBiologicalChemistry,(2001),vol276/3,page1873-1880中。体内免疫刺激活性反映在体液响应和/或在特异细胞应答上。为评估体液响应，测定抵御抗原的特异抗体的生产。例如，有关此种响应的评估，可参见US2003/0153532的实施例8中描述的化-睑方法。当注射TLA4-相关抗原后观察到特异抗体(在总免疫球蛋白的或特异同种型的形式内)的产生大于仅给予同样数量抗原本身后观察到的时，就认为TLA4发挥了体内免疫刺激活性。TLA4的免疫刺激活性也可利用测定特异细胞应答的化验方法评估，该方法乃是本领域技术人员熟知的，例如，通过测定细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或淋巴增生来评估。优选的是，TLA4选自US2003/0153532中以下列名称提到并描述的化学化合物ER803022,ER803058,ER803732,ER803789,ER804053,ER804057,ER804058,ER804059,ER804442,ER804764,ER111232,ER112022,ER112048,ER112065,ER112066,ER113651,ER118989,ER119327和ER119328。该化合物可呈非对映异构体形式或呈外消旋(非对映异构体的混合物)形式，这是指当化合物结构包含几个不对称碳时。例如，ER804057和ER804053具有4个不对称碳，是ER112066的非对映异构体，后者是外消旋形式。ER804057呈(R,R,R,R)-型异构体构型，而ER804053则处于(R,S,S,R)-型构型。类似地，ER804058,其处于(R,R,R,R)-型异构体构型，和ER804059,其处于(R,S,S,R)-型异构体构型，二者是ER113651的非对映异构体，呈外消旋形式。ER803022，其处于(R,R,R,R)-型构型,ER803732,其处于(R,S,S,R)构型，和ER803789,其处于(R,R,S,R)构型，它们也是同一化学分子的非对映异构体。优选使用具有R,R,R,R-型构型、通常比其他形式更具活性的非对映异构体。在这些当中，ER804057是特别优选的。它是十二烷酸(1R,6R,22R，27R)-1,27-二庚基-9,19-二羟基-9,19-二氧代-14-氧代-6,22-双[(1,3-二氧代十四烷基)氨基]-4,8,10,18,20,24-六氧杂-13,15-二氮杂-9,19-二膦杂二十七烷-1,27-二基酯；它呈游离酸或呈盐的形式。游离酸的分子量是1579,钠盐的是1624。钠盐的经验式是C83l^58N4Na20wP2。从结构的角度，本发明TLR4兴奋剂是两亲分子。两亲分子具有既是亲水又是疏水的性质，并具有随时间沉淀的倾向。它们常常不完全地溶解于有机或含水溶剂并且常常是溶液不稳定或难以复制的原因。目前，需要改进这些分子的配方。如在本发明中描述乳液通过提供随时间稳定的乳液满足了这种需要。本发明中的乳液在+4°C经过6个月贮存仍保持其最初具有的特性油滴粒度分布基本上不变；本发明的乳状、流体和均质方面得以保持；并且，显然，TLA4的结构完整性不受损害，正如在实施例II中所示。甚至还注意到，本发明乳液能在-2。C的温度贮存至少48h,而就液滴粒度分布而论看不到任何明显改变。另外，本发明乳液降低某些TLR4兴奋剂的致热能力。TLA4的数量与乳液的亲水和疏水表面活性剂总量之比一般介于0.01x10—2和5x10-2之间，优选介于0.1x1(T2~2xl(T2。在这一比值范围，TLA4的数量足够小，以致不对表面活性剂的乳化能力产生任何影响，但它以足以发挥体外和/或体内免疫刺激活性的数量存在。本发明亲水表面活性剂具有>10的HLB(亲水/亲油平衡值)并属于聚氧乙烯烷基醚(PAE)化学类别，亦称作聚氧乙烯脂肪醇醚。这些非离子表面活性剂是通过脂肪醇与环氧乙烷之间的化学缩合获得的。它们具有类型R-(0-CH2-CH2)n-OH的化学通式，其中残基R—般代表饱和或不饱和烷基残基并且n代表环氧乙烷单元的数目。按照本发明，R含有1~50个碳原子，优选4~20个石友原子，特别优选10~20个石友原子。n》2,—般介于4~50。本发明乳液一般含有单一亲水PAE。几种PAE的混合物也适合，只要总HLB>10。适合本发明主题的聚氧乙烯脂肪醇醚可呈常温下为液体或固体的形式。在固体化合物当中，优选那些能直接溶解在水相中或者不要求很大加热的化合物。只要环氧乙烷单元数目足够，月桂醇、肉豆蔻醇、鲸蜡醇、油醇和/或硬脂醇的聚氧乙烯醚特别适合本发明主题。它们特别可见诸于以商品名Brij,Eumulgm或Simulsol而著称的产品系列中。作为非离子亲水表面活性剂，本发明特别优选的乳液含有聚氧乙烯烷基醚，其选自聚氧乙烯(12)鲸蜡硬脂醇醚(ceteareth-12)(商品名EumulginBl),聚氧乙烯(20)鯨蜡硬脂醇醚(ceteareth-20)(商品名EumulgmB2),聚氧乙烯(21)硬脂醇醚(steareth-21)(EumulginS21),聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚(ceteth-20)(Simulsol58或Brij58),聚氧乙烯(10)鲸蜡醇醚(ceteth-10)(Brij56),聚氧乙烯(IO)硬脂醇醚(steareth-10)(Brij76)，聚氧乙烯(20)硬脂醇醚(steareth-20)(Brij78),聚氧乙烯(10)油醇醚(oleth-10)(Bry96或Brij97)和聚氧乙烯(20)油醇醚(oleth-20)(Brij98或Brij99)。跟在每一种化学名称后面的数字对应于化学式中的环氧乙烷单元数目。特别合适和由于其半合成源而优选的化合物是Cogms公司提供的EumulgmBl(ceteareth-12)。本发明乳液还包含非离子疏水表面活性剂，其HLB<6。乳液通常含有单一非离子疏水表面活性剂。几种非离子疏水表面活性剂的混合物23也适合，只要总HLB《6。就典型而言，它涉及疏水脱水山梨醇酯或疏水二缩甘露醇酯。脱水山梨醇酯通常是通过脂肪酸与山梨醇、山梨醇一酐或山梨醇二酐之间的酯化反应获得的。二缩甘露醇酯通常是通过脂肪酸与甘露醇一酐或二酐之间的酯化反应获得的。优选的是，它涉及二缩甘露醇一油酸酯(由公司Sigma销售或由公司Seppic以商品名Montanide8()TM供应)或脱水山梨醇一油酸酯(以商品名Span80,DehymulsSMOTM(Cognis)或Montane80TM(Seppic)供应)。通过从现有技术建议的所有表面活性剂当中选择这些特殊表面活性剂来制备乳液，现已发现，一种佐剂O/W乳液可非常有利地采用一种非常容易实施的相变方法制备。当亲水和疏水表面活性剂的相应浓度满足混合物的HLB(HLBm)介于8.5-10,特别是8.69.6时，乳液通常将是均质的，并且常常油滴总体的至少90%(体积)的粒度<0.2|um。而且，这样的乳液特别稳定。优选地调节角鲨烯乳液中亲水和疏水表面活性剂的数量，以便使HLBm为8.510,特别是使HLBm介于8.6-9.6。为确定亲水和疏水表面活性剂各自在乳液组合物中的浓度，采用以下公式HLBm=HLBexM+HLBpaex(1画M),其中，HLBm对应于混合物的HLB,优选介于8.5-10,特别是8.6~9.6。HLBe对应于疏水表面活性剂的HLB。M对应于由疏水表面活性剂和PAE组成的混合物中疏水表面活性剂的重量百分数。HLBpae对应于PAE的HLB。角鲨烯，代表乳液的油相，具有经-验化学式C3。H50并包含6个双4定。该油为可代谢的并且具有用于可注射药物产品所要求的品质。它来自鲨鱼肝(动物源)但也可从橄榄油(植物源)提取。好的结果已由，特别是采用公司Fluka提供的角鲨烯获得，后者是动物源的。一般而言，角鲨烯的数量代表乳液总重量的5~45%。本发明乳液中的角鲨烯数量与表面活性剂总量的质量比一般介于2.0-4.0，优选2.5-3.5。特别优选的本发明乳液的组成包含24-角鲨烯，-磷酸盐緩冲液或柠檬酸盐緩冲液，作为含水溶剂，-化合物ER804057，作为TLR4兴奋剂，-ceteareth-12(EumulginBl),作为亲水表面活性剂，-脱水山梨醇一油酸酯，作为疏水表面活性剂。角鲨烯的数量代表乳液总重量的5~45wt%。化合物ER804057的数量通常代表2种表面活性剂重量的0.05%~2wt%。优选的是，ceteareth-12的和脱水山梨醇一油酸酯的凄t量应满足，2种表面活性剂的混合物的HLB介于8.5-10，更优选8.6~9.6。角鲨烯的数量与ceteareth-12的和脱水山梨醇的一油酸酯的总量之比介于2.0~4.0,优选2.5-3.5。另外，该组合物可包含甘露醇，其数量一般代表乳液总重量的0.1%~10wt%。本发明乳液的水相还可包含含有1或多种防冻剂的冷冻干燥底物。防冻剂通常选自糖如蔗糖，多元醇(如甘露醇或山梨醇)，或糖的衍生物(如烷基聚普，例如，硅基-D-半乳糖苷糖醛酸钠或十二烷基P-麦芽苷)。通常使用作为混合物的包含蔗糖、甘露醇和十二烷基P-麦芽苷的冷冻干燥底物。于是，本发明乳液可进行冷冻干燥并以冷冻干燥物的形式保存。然而，它将保存其全部特性，因为，一旦将它分散到水相中，它将重新变成乳状、稳定和流态、热可逆O/W乳液，其中油滴粒度分布近似于冷冻干燥前预先存在的。本发明乳液还起到对抗原的免疫应答佐剂的作用。就本发明目的而言，术语"抗原"是指可用于疫苗的任何抗原，不论它是活的、减毒的抑或灭活的整个微生物、微生物的提取物或者亚基形式。当它是亚基形式时，抗原的本质无关紧要它可以是肽、蛋白、糖蛋白、多糖、糖脂、脂酰肽或核酸。在适合本发明主题的抗原当中，可举出源于下列的细菌抗原破伤风梭菌、Clostridiumdiphtheriae(白喉梭菌)、百日咳梭菌、血内生流感b-型、月申炎链J求菌、Neisseriameningitidis、Shigellasp.(志贺菌种)、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌、结核杆菌、Chlamydiatrachomatis(沙眼衣原体)或者链球菌种；源于下列病毒的病毒抗原肝炎种A、B或C病毒，流感病毒、呼吸合胞体病毒、西尼罗河病毒、狂犬病毒、脊髓灰质炎病毒、HIV(艾滋病)病毒、登革病毒、日本脑炎病毒、黄热病病毒、巨红月包病毒或疱渗病毒；源于特别是下列来源的抗原疟原虫种或肿瘤抗原。这些抗原可采用本领域技术人员熟知的基因重组方法或采用提取方法获得。本发明乳液通过增加特异抗体的生产作用于体液免疫，和/或通过促进特別是T淋巴细胞增生、特异细胞溶解响应(CTL响应)和/或由活化的胸腺依赖性细胞生产的细胞因子、化学因子和生长因子的生产作用于特异细胞免疫。应用。获得的该疫苗组合物已证明例如致免疫能力更强，因为该组合物能诱导更大的特异免疫应答，不论它是体液型和/或细胞型的，或者由于为获得同样强度和可比持续时间，需要较少数量的抗原。由本发明乳液获得的疫苗组合物可通过任何一种通常使用或推荐用于疫苗的途径给药非经肠道、皮内、皮下、肌肉内或黏膜；并且可采取各种不同形式给药，特别是液体或冷冻干燥的。它可利用针筒或者无针注射器进行肌肉内、皮下或皮内注射，或者利用鼻子吸入喷雾给药。该疫苗组合物一般呈抗原与本发明乳液的混合物形式。它也可呈临时制剂的形式。在此种工况中，抗原与乳液只是到了临给予疫苗组合物之前或者在给予的时刻才彼此接触。例如，抗原可进行冷冻干燥并在给药之前以乳液分散，或者反过来，乳液可呈冷冻干燥形式，然后再以抗原溶液分散。疫苗组合物也可置于专门注射装置中，例如，"旁路"针筒，这是指当要求抗原不与乳液混合时。当疫苗组合物采取通过以抗原溶液稀释本发明乳液获得的混合物形式时，它通常呈O/W乳液形式，其中角鲨烯的数量一般代表组合物总重量的0.5~5wt%。它也可呈热可逆O/W乳液的形式，这是当角鲨烯在疫苗组合物中的数量达到或超过5wt。/。时。当疫苗组合物是一种热可逆O/W乳液时，它特别呈油滴总体的至少90%(体积)并可具有《0.2ium粒度的形式。令人惊奇的是，本发明乳液诱导中和抗体的能力大于通过微流化获得的现有技术0/W乳液，后一种组合物含有角鲨烯、聚氧乙烯脱水山梨醇一油酸酯((Tween80)和脱水山梨醇三油酸酯(Span85)(现有技术o/w乳液)。中和抗体是抗传染性微生物的功能抗体，由已经对与该微生物有关或由它衍生的抗原免疫的或曾接触过该微生物的个体产生，并且能预防细胞^^皮此种微生物感染。它们在预防和治疗由细胞内微生物，特别是病毒或单细胞寄生物，特别是痴原虫种引起的感染中起非常重要的作用。痴原虫falciparum的"生殖胞芽"形式的的抗原(例如，子孢子的主要表面蛋白(circumsporozoiteprotein),LSA3,或thePfs16#元原、),以及源于疟原虫falciparum的"裂殖子"形式的抗原(例如，MSP1,MSP2,MSP3,EBA國175，Rhop-1,Rhop-2,Rhop-3,RAP-1,RAP-2,RAP-3,Pfl55/RESA或AMA-1抗原)，能i秀导产生中和抗体。本发明乳液用于制备含有l或多种由痴原虫falciparum生殖胞芽或裂殖子衍生的抗原的疫苗组合物的应用已表明，能放大中和免疫应答。本发明乳液特别可用于制备包含，作为疫苗抗原、疟原虫falcipammLSA3蛋白的疫苗组合物。记录此种蛋白编码的基因已被Gardner等人，(Science(1998)，282,1126-1132)找到并且存在于Plasmodiumfalciparum的染色体2(抹3D7)上。该基因的完整序列是12240个碱基对长并记录了1558种氨基酸蛋白。该核苷酸和蛋白序列描述在EMBL数据库中，片企索号AE001424,以及uniprot号096275-PLAF7。所描述的整个蛋白，肽，或该蛋白的片段，例如在WO02/38176中描述的那些，可用作疫苗抗原。通常采用这样的整个蛋白(它包含1或多个点突变以便考虑到存在于痴原虫falciparum各种林之间的变化)或该蛋白的片段其氨基酸序列具有与uniprot号096275-PLAF7中描述的整个序列至少80%的同一性。某些抗病毒疫苗的有效性，在某些情况下，根据它们诱导的中和抗体的滴定度来评估。流感疫苗就是此种情况，其有效性涉及血凝-抑制(HAI)抗体的滴定度。本发明乳液#皮用于制备治疗或预防与流感病毒相关的人或动物(鸟类、马)的传染病。依流感疫苗的性质而定，疫苗组合物可呈各种不同形式-当流感疫苗含有1或多种灭活整个或"断裂的"病毒株，或呈含有来自1或多种病毒抹的提纯的凝血素的亚基疫苗形式，或呈病毒体(Berna疫苗)时，疫苗组合物一^:呈O/W乳液的或热可逆O/W乳液的混合物形式。-当流感疫苗含有1或多种活减毒病毒抹时，疫苗组合物优选一皮预先置于旁路针筒型的装置中，以便使活病毒不直接接触该乳液。病毒悬浮体与本发明乳液被置于针筒的2个不同间隔内。该流感疫苗可按照本领域:技术人员熟知的方法由在卵或在细胞内27培养的流感病毒来制造，并全都包含作为主要成分的l或多种病毒株的凝血素。因此，本发明的主题还在于本发明乳液用于制备包含作为疫苗抗原的1或多种流感病毒凝血素的疫苗组合物的应用。该疫苗组合物可用于对以下情况的免疫1)对流感病毒呈血清反应阴性的个体的群体这些是从未接触或-故流感病毒或其免疫原成分壽丈化过的个体，或者/人未4姿触过导致大流4亍的新4朱流感病毒的个体；2)对流感病毒呈血清反应阴性的个体的群体这些是已接触过或-故流感病毒或其免疫原成分敏化的个体；3)通常表现出对细胞和/或体液免疫的缺损，正如特别是对流感病毒表现的老年个体的群体。本发明乳液也可用于制备治疗或预防由疱渗病毒(HSV1，HSV2,巨核细胞病毒(CMV))引起的传染病。通常在该疫苗组合物中使用病毒包膜抗原。在CMV感染中，抗病毒包膜蛋白，主要是糖蛋白B(gB)和糖蛋白H(gH)的并能中和病毒感染的抗体，在保护性免疫的发展中起到非常重要的作用。本发明乳液在含CMV包膜蛋白疫苗组合物制备中的应用具有增加中和抗体的生产的^t应。因此，本发明的一个主题是本发明乳液用于制备含有作为疫苗抗原的CMV包膜抗原的疫苗组合物的应用。就典型而言，该抗原是gB糖蛋白和/或gH糖蛋白。它也可以是一种由gB和/或gH书f生的肽或多肽，其包含1或多种中和抗原表位。处于其天然形式的gB(gpl30),由CMV的UL55基因来编码，是一种906或907种氨基酸的糖蛋白，具体取决于所涉及的是AD169林或Towne林。这两株的蛋白序列描述在US2002/0102562(图2)中。gB的天然形式含有信号序列，接着是含有介于残余精氨酸460与丝氨酸461之间的内切蛋白水解部位的细胞外的域，接着是跨膜结构域，然后接细胞内的域。曾描述过几种包括中和抗体的抗原域。这涉及特别是位于gp130的氨基酸残基461与680之间的域，该域;故细分为2个不连续域，即在残基461与619之间的域，和残基620与680之间的域(US5,547,834)。它还包括位于氨基酸残基552和635之间的AD-1域，或位于50~77氨基酸残基之间的AD-2域(JournalofGeneralVirology(1999),80,2183-2191;JournalofVirology(2005)，79,4066-4079)。因此，在其氨基酸序列中包含与上面提到的域之一同源的序列的多肽适合本发明的目的。就典型而言，该多肽在其氨基酸序列中含有与位于gp130的残基461与680之间的那个同源的序列，或者更具体地说，与位于残基552与635之间的那个同源的序列。术语"同源序列"是指任何这样的氨基酸序列，只要它具有至少80%与位于Towne或AD169抹(描述在US2002/0102562)的gpl30上、所考虑的抗原域的氨基酸序列的同一性。就典型而言，此种序列同源基于至少90%的同一性，更具体地说，该序列同源基于100%的序列同一性。在适合本发明目的的gB-衍生的肽或多肽当中，可举出，特别是，gp55,正如在US5,547,834中描述的。它由gB在内切蛋白水解部位处的裂解衍生而来；其氨基酸序列对应于介于丝氨酸残基461与C-链端之间的序列。gp55的剪取形式也可使用，例如，从跨膜序列的全部或部分以及细胞内C-末端域的全部或部分剪取的gp55(例如，具有与残基461与646之间的gp130氨基酸序列同源序列的肽)，或者从细胞内C-末端域全部或部分剪取的gp55(例如，具有与残基461与680之间的gp130氨基酸序列同源的序列的肽)，后者描述在US5,547,834中。也可以使用带有在内切蛋白水解切割位点的1或多个突变从而使后者变得无效的gB的突变形式。突变位于gp130序列的残基457与460之间，更具体地说，位于精氨酸460和/或赖氨酸459和/或精氨酸457处。特别适合本发明目的的CMV包膜抗原是一种gB的剪裁形式，它是从C-末端域的全部或部分剪取和/或从跨膜序列的全部或部分剪取的，并且其中切割位点无效。特别优选的gB剪裁形式对应于US6,100,064中描述的那种，被称作gBdTM;它带有在切割位点的3个突变，以及在氨基酸残基缬氨酸677与精氨酸752之间的消除，从而使细胞外域直接连接在细胞质域上。gB蛋白或由它衍生的肽或多肽是利用基因重组方法制取并按照本领域技术人员熟知的方法提纯的。特别可使用US6,100,064和US2002/0102562(在此收作参考)中描述的方法。为提高其免疫原性，可将它们二次接合到载体蛋白上或融合到其他蛋白上，特别是到颗粒-形成蛋白如肝炎B包膜抗原(HbS)上。gB蛋白或由它^f汙生的肽或多肽也可由重组病毒表达，特别是由重组&泉病毒或重组poxviruses(腺病毒)表达。为制备此类重组载体gB或衍生的肽，可采用特别是US6,162,620,US5,866,383,US5,552,143,US6,183,750,US5,338,683或WO9215672或WO9639491中描述的方法。gB也可由通过连续送过细月包培养物而减毒的CMV的林，特别是已经就疫苗目的试验过的Towne株提供。gH蛋白由CMV的UL75基因编码。它是一种742或743种氨基酸的糖蛋白，这取决于该林是Towne株或AD169抹。其序列描述在US5,474,914(图1)和US6,610,295(图5(a))。由其核苷酸序列推断的gH的蛋白序列包含信号肽，接着是不具有内切蛋白水解切割位点的细胞外域，接着是跨膜结构域，再接C-末端细胞质域。该中和肽存在于细胞外域中，主要在该域的N-末端部分，更具体地说在天然gH蛋白序列的氨基酸残基15与142之间，进一步具体地说，介于氨基酸残基33与142之间。AD169抹的主要中和表位已被找到，介于gH的序列的残基33与43之间，并具有序列LDPHAFHLLL(UrbM等人J.Virol(1992,vol66/3,pl303-1311))。因此，在其氨基酸序列中包含与LDPHAFHLLL同源的序列，或与介于适合本发明目的gH蛋白序列残基15与142之间或残基33与142之间的序列同源的序列。术语"同源序列"是指任何氨基酸序列，只要它具有至少80%与位于AD1694朱的gH蛋白序列的残基15与142或残基33与142之间的氨基酸序列的同一性，或者与序列LDPHAFHLLL的同一性。更具体地说，序列同源基于至少90%的同一性，更具体地说，序列同源基于100%的序列同一性。作为适合本发明目的的gH-衍生肽或多肽，可举出从其跨膜区域的全部或部分剪取和/或从其细胞质区域的全部或部分剪取的gH。就典型而言，这对应于这样的gH蛋白，从中，有至少5个C-末端残基，优选至少10个C-末端残基，更优选20~34个氨基酸序列的C-末端残基已;故消除。gH蛋白和由它衍生的多肽或肽是采用本领域技术人员熟知的基因重组方法制取和提纯的，特别是，US5,474,914或US5，314,800(在此收作参考)中描述的那些。为提高其免疫原性，可将它们二次接合到载体蛋白上，它们也制成融合蛋白的形式，正如在J.Virol(1992,vol66/3，1303-1311页)中描述的。该gH蛋白和由它衍生的多肽或肽也可由重组病毒表达，特别是由重组l^病毒或重组poxviruses(腺病毒)表达。为制备表达gH或衍生形式的此类重组载体，可采用特别是US6,162,620，30US5,866,383,US5,552,143或WO9639491中描述的方法。gH蛋白也可由通过连续送过细胞培养物而减毒的CMV的抹，特别是已经就疫苗目的试验过的Towne株提供。作为疫苗抗原，也可以使用一种由gB糖蛋白或gH糖蛋白(或从所述糖蛋白剪取的形式)与HSV1或HSV2(或从其剪取的形式)之间的融合生成的蛋白。例如，可举出EP0759995中描述的融合蛋白，特別是gB685s和由部分CMVgB糖蛋白与部分HSVgD糖蛋白之间的融合生成的gB685**。视CMV抗原本质而定，疫苗组合物可采取各种不同的形式-当抗原是蛋白或肽时，疫苗组合物可呈O/W乳液的或热可逆OAV乳液的混合物的形式。它也可呈临服用前配制的临时制剂的形式。疫苗组合物也可被置于装置内，如置于将抗原与乳液物理地分开的"旁路"针筒内。-当CMV抗原呈表达gB、gH或由gB或gH衍生的肽的重组病毒形式时，或者当它呈CMV的减毒抹时，则抗原和本发明乳液通常不在疫苗组合物中直接接触。该抗原和乳液可置于将它们物理地分开的装置中，例如，"旁路"针筒，但它们将在给药的同一现场同时地给药。本发明乳液还通过促进Thl型细胞因子(IL2,IFN-y等)的生产和/或通过减少Th2型细胞因子(IL4,IL5,IL10等)的生产以应答在MHC类别II前后序列中呈递的抗原，而使特异CD4+细胞应答倾向于Thl的特质(profile)。此种岁文应是通过测定以与用于体内免疫的相关的抗原重复体外刺激后产生的IFN-y和IL5数量，或通过确定IFN-y/IL5比值来评估。该比值越高，CD4+应答越倾向于Thl型。CD4+T细胞应答特质也可通过测定老鼠以本发明疫苗组合物免疫后获得的特异Ig2a/特异IgGl之间的比值来间接评估。因此，本发明乳液被用于纠正在某些表现出免疫缺损或免疫系统障碍个体的群体中观察到的CD4+T细胞应答失衡。这些人特别是那些在以源于细胞内微生物的抗原，特别是以流感抗原(Ouyang等人(Mechanismsofageing和development),2000,vol.121,131-137)进行体外刺激后表现出IFN-y和/或IL2产生量不足的老年个体。细胞应答失衡的个体的人群。31本发明的主题也是一种制备本发明O/W乳液的方法，包括通过提高温度获得W/0反相乳液的步骤，以及通过降低温度使w/o反相乳液转变为o/w乳液的步骤。该转变是在当获得的w/o乳液被降低到低于该乳液的相变温度的温度时发生的。按照该方法的一种实施方案，w/o乳液是通过实施将含有含水溶剂、聚氧乙烯烷基醚和TLR4兴奋剂的水相与含有角鲨烯和非离子疏水表面活性剂的油相混合从而获得0/W乳液的第一步骤，以及将O/W乳液加热至至少是乳液相变温度的温度的第二步骤获得的。将含有水溶液(一般是緩沖液)、TLR4兴奋剂(如果它不在油相中)和非离子亲水表面活性剂的水相加入到包含角鲨烯和非离子疏水表面活性剂的油相中，或者反过来将油相加入到水相中。此种加入是在机^械搅拌下进行的。获得一种未标定、不稳定的粗o/w乳液(预乳液)。该预乳液在机械搅拌下加热，直至达到相变，即，获得一种w/o乳液。相变可以由电导分析法跟踪。出现反映从一种类型乳液向另一种乳液转变的曲率改变的温度就是相变温度。实际上，该温度是一个温度范围，而不是非常具体的点值；事实上，可以认为，为了4吏整个乳液都发生相变，该温度能变动1或2度。当乳液处于W/0乳液时，观察到电导率的突然下降。停止加热并冷却该混合物。冷却可,皮动i也进行，即通过简单地让温度自发地返回到环境温度，或者较积极地，通过，例如，将乳液浸没在水浴中。在温度下降期间，W/0乳液将在相变温度再次反转爿夂人而重又获得O/W乳液。该乳液在等待以含疫苗抗原的溶液稀释期间可原封不动地放置。它是热可逆的，就是说，如果它一皮再次提高到至少等于相变温度的温度，它将重新变成W/0乳液。相变温度通常介于45-80°C,典型温度介于50~65°C。于是，乳液的诸成分，特别是TLR4兴奋剂，将经受防止水相蒸发或成分的化学降解的适度加热。按照另一种实施方案，这样制取W/O乳液，即分别加热含有含水溶剂、聚氧乙烯烷基醚和TLR4兴奋剂的水相，以及含有角鲨烯和非离子疏水表面活性剂的油相，至至少等于乳液相变温度的温度，随后混合该水相与油相，与此同时保持混合物的温度处于至少等于相变温度的温度。在此种情况中，水相和油相分别加热至略微高于相变温度的温度，然后混合它们以得到W/O反相乳液，后者接着将进行冷却，直至获得3亚微米o/w乳液。这些操作可在分开的容器中进^f亍，以便间歇制备。也可以使用"在线，，制造方法。该方法包括在热条件下通过恒温调节的静态混合器混合分别制备的水相和油相，随后通过连接静态混合器出口的、制冷的热交换器进行在线冷却，然后在适当接收器(烧瓶或反应器)中最终回收本发明乳液。一种静态混合器已^皮成功地应用，它由一系列混合元件组成，该元件由相对于装有它们的管子的轴线倾斜布置的十字形桨叶组成。混合所需要的能量由输送流体的泵提供，混合是在没有运动零件的情况下，通过混合元件，依靠混合物诸成分的相继分离、排代和汇合实现的。在线制造方法按如下方式实施水相和油相分别制备，如上所述，在2个烧瓶或反应器中。这两相在搅拌下加热至略微高于相变温度的温度。随后，这两相由2台泵引入到恒温调节的静态混合器中，其间调节泵的流率以便获得符合本发明的乳液组成。在这两相通过静态混合器期间便获得W/O反相乳液。然后，反相乳液借助在线流过连接静态混合器出口的制冷的热交换器^:冷却。继而，该w/O乳液将通过制冷的热交换器而发生反转，从而生成O/W乳液，被收集在烧瓶或反应器中，其特性与利用间歇方法获得的乳液相同。仍然存在作为上面已经描述的本发明的实施方案的替代方案；当TLR4兴奋剂的性质，与亲水相比，更偏于疏水时，它将^^皮引入到油相，而不是水相。TLR4兴奋剂也可在油相与水相已经实施混合之后，或者当乳液已加热并且它处于W/O乳液形式时，-波引入。水相也可含有3f唐醇。最后，制备本发明乳液的方法还可包含几个前后连接的热转变循环。本发明的目的是还在于一种制备疫苗组合物的方法，其中至少一种疫苗抗原与含有化学结构中不含糖环的TLR4兴奋剂进行混合，特征在于，含有该TLR4兴奋剂的0/W乳液按照相变方法制备，它包括通过提高温度得到W/O反相乳液形式的乳液的步骤，以及通过降低温度将W/O乳液转变为0/W乳液的步骤。一种简单实施方案包括将疫苗抗原水溶液混入到按照刚才描述的实施方案之一获得的热可逆OAV乳液中。获得的疫苗组合物呈OAV乳液的形式，或呈热可逆O/W乳液的形式，这是指当角鲨烯的数量代表疫苗组合物总重量的至少5wt。/。时。替代地，抗原可在制备乳液之前与水相或油相进行混合。当然，这样实施该程序意味着，这些抗原是与热转变方法相容的抗原。抗原溶液还可包含无机盐和1或多种緩冲剂，还有任何其他通常用于疫苗的化合物，例如，稳定剂、防腐剂或任选地，其他佐剂。仅作为说明，水溶液中的抗原浓度一般介于1|ug/ml~1mg/ml之间。本发明方法还可包括冷冻干燥步骤。首先，制备浓缩液态乳液，正如上面描述的那样，但优选的是选择水而不是緩冲液作为水溶液。该乳液随后被稀释在含有糖醇、糖和烷基聚苷的冷冻干燥底物中。通常使用的冷冻干燥底物包含甘露醇、蔗糖和十二烷基麦芽苷。随后，将稀释的乳液分成一份份样品(例如，0.5mL)并可接受^fe照以下方式实施的冷冻干燥循环-在+4。C加载样品,-在-45。C的i殳定温度冷冻约2h,-在0。C的设定温度一次干燥14-19h,-在+25。C的设定温度二次干燥3h又30min。获得的冷冻干燥物通常保存在+4。C左右的温度，直至与l或多种疫苗抗原混合。本发明疫苗组合物总重量于是可通过以抗原水溶液分散冷冻干燥的乳液来制备，并原封地保存(即，以液态)，或者可进行进一步冷冻干燥循环的处理以便以冷冻干燥物的形式保存，如果抗原的本性允许这样。替代地，可以直接以包含疫苗抗原和糖醇、糖和烷基聚苷的水溶液稀释该浓缩的乳液，随后对获得的组合物实施冷冻干燥。此种实施该程序的方式，当然，隐含，抗原与冷冻干燥加工相容。下面的例子以非限制性方式解释本发明各种不同的实施方案。实施例I:含有32.4wt。/。角鲨烯的浓缩热可逆O/W乳液的制备一种18wt。/。甘露醇在磷酸盐緩冲液中的溶液在40°C、机械搅拌下制成。0.093gEumulginTMBl一皮加入到0.454g该溶液中，后者在40°C、机械搅拌下均化5min。制备包含1000jag/ml化学化合物ER804057在50mMTris緩沖液中的储备悬浮体。390filER804057的储备悬浮体被加入到该EumulginTMBl/甘露醇混合物中。在另一个接收器中，0.073gDehymulsSMO与0.484g角鲨烯进行混合，然后，该混合物在30。C、机械搅拌下均化5mm。34随后，含ER804057的水相物料在30°C、4觉拌下^皮加入到含有DehymulsSMO/角罝烯混合物的油相中。获得的粗乳液在机械搅拌下加热，直至达到60。C的温度。该温度对应于该组合物的相变温度。之后，乳液处于反相乳液的形式(W/0乳液)。然后，停止加热但维持搅拌直至温度达到实验室环境温度(《20°C)。乳液变回到0/W乳液的形式。于是获得均质热可逆0/W乳液，其中油滴总体的大于90%(体积)的粒度《200nm，且其中重量组成如下32.4%角鲨烯，6.2%ceteareth隱12(EmulginBl),4.9%脱水山梨醇一油酸酯(dehymulsSMO),5.5%甘露醇0.026%ER804057.角鲨烯在该佐剂乳液中的数量因此代表乳液总重量的32.4wt%。在另一种实施方案中，在烧杯中制备含有50.5g磷酸盐緩冲液，6g甘露醇，6.18gEumulginTMBl和0.026gER804057的混合物。该混合物在约4(TC维持搅拌。在另一个容器中制备油相混合32.5g角鲨烯与4.8gDehymulsSMO,利用》兹性搅拌，直至DehymulsSMO完全溶解。当获得均质相时，将水相加入到油相中，并按如上所述先实施升温步骤，随后实施降温步骤。获得一种均质热可逆0/W乳液，其中大于油滴总体的90%(体积)的粒度S200nm且其中重量组成如下32.5%角鲨烯，6.2%ceteareth隱12(EmulginBl),4.8%脱水山梨醇一油酸酯(DehymulsSMO),6%甘露醇，0.026%ER804057,50.5%PBS。在方法的另一种实施方案中，使用一种通过混合0.83mM拧檬酸一水化物与9.14mM柠檬酸钠制备的柠檬酸盐緩冲液，pH6.04,以替代PBS緩冲液。该浓缩角鲨烯乳液被用作"储备"乳液，由它，通过稀释在磷酸盐緩沖液、Tns缓冲液或柠檬酸盐緩冲液中衍生出热可逆0/W乳液，随后令其通过过滤灭菌(见实施例II)。这些0/W乳液随后与1或多种疫苗抗原进行混合(参见实施例in、iv和v)。实施例II:含有5wt。/。角鲨烯的稀热可逆0/W乳液的稳定性研究实施例1的浓缩乳液祐:稀释在9.6mM磷酸盐緩冲液(pH=7.4)中从而获得稀乳液，其中角鲨烯的数量代表乳液总重量的5wt%。稀乳液-故称作5%PIT-ER804057，其组成如下角豊埽50mg/mlceteareth-12(EmulginBl):9.5mg/ml脱水山梨醇一油酸酯(dehymulsSMO):7.4mg/ml甘露醇9mg/mlER804057:40|ug/ml在+4。C|&存6个月后，对该热可逆乳液的稳定性通过确认ER804057在乳液中的含量以及乳液液滴分布进行评估。为测定ER804057,实施ER804057从乳液中的选择性萃取，随后进行偶联到二极管阵列检测器(紫外检测)上的高性能液相色谱法(HPLC)的分析。待确认乳液的ER804057的含量是采用含有5~25pg/mlER804057的标准范围测定的。为补偿萃取收率的波动，在每个待测样品中引入化学结构非常接近ER804057的恒定数量内标(加入到标准范围的样品中)，该内标是叫做ER803022的化学分子。"标准范围"是这样制备的取组成和制备方法与5%的PIT-ER804057乳液(参见实施例II)相同的热可逆乳液，只是它不含4壬何ER804057(乳液PIT,5%)，向其中加入不同数量取自ER804057储备溶液的ER804057,按0.1mg/ml含2体积氯仿/1体积甲醇的混合物(混合物CM2:1),以及固定数量内标(10|ug)，后者按O.lmg/ml混合物CM2:1取自内标储备溶液，将它酌情稀释在水中以便配成可注射制剂(EPPI)。该5%的PIT-ER804057待测样品是通过取5%乳液PIT-ER804057等分试样，向其中加入10|Llg内标并在水中稀释成可注射制剂而制成的。ER804057从标准范围样品或从5%PIT-ER804057样品中的萃取按如下方式实施样品用CM2:1增溶。获得的两相体系由主要含有ER804057的氯仿相和含有乳液其他成分的水相组成。氯仿相在热条件和氮气流下被回收并蒸发。获得的干萃取物重新被增溶在CM2:1混合36物中。将混合物加载到预先在CM2:1中平衡过的阴离子交换元件上去。它选才奪地截留带负电的ER804057和内标，而乳液的其4也成分，由于不带电，一皮排出。ER804057和内标利用含2体积氯仿和3体积甲醇，每体积1M氯化钠的混合物洗脱。随后，洗脱液在热条件、氮气流下进4亍干燥。最后，用水和CM2:1进行最终萃取以便除掉残余盐并在氯仿相中回收到ER804057和内标，它们最后在热条件、氮气流下进4亍蒸发。由每种样品衍生的干萃取物被保存在-20。C,直至用HPLC进行分析。每个样品的干萃取物以50jLilCM4:1增溶，随后在甲醇中稀释至1/2,随后在30%乙腈-水的混合物中稀释至1/10,用于可注射制剂。20|Lil该稀液4皮注入到液相色谱法4义器(MerckHitachiHPLC,Lachromseries7000)中，其中装有WatersXTerraTMRP8柱，后者预先在由80。/。相A(50/50用于可注射制剂的水/含2%H3P04的乙醇)和20%相B(乙醇，含2%H3P04)组成的移动相中平衡过。ER804057和内标-故利用某种含2%H3P04的乙醇的梯度洗脱。在HPLC的出口，洗脱液到达二极管阵列检测器，其分子在215nm波长净皮;险出。在获得的色镨图上，就2个峰值(分析物和参照物)的表面面积进行积分并校正。为校正与样品制备有关的波动，在对应于ER804057(一皮定量的分子)和ER803022(内标)成对的峰值的表面面积之比，与对应于ER804057和ER803022(内标)的浓度比之间，制定出标准曲线。一旦曲线制定出来，存在于5%乳液PIT-ER804057中的ER804057的数量便可通过测定ER804057/内标峰值的表面面积之比并与标准曲线比4交来确定。1个月，+4°C3个月，+4°C6个月，+4°C38|ug/ml37|ug/ml42|ug/ml上表所载数据显示，ER804057保持了其结构完整性，而且其在乳液5%PIT-ER804057中的浓度，在乳液于+4。C保存6个月后未发生实质性改变。采用Mastersizer2000,在将乳液稀释至1/100之后实施粒度分布分析，采用以下参数IR粒子4.495;IR介质4.332;吸收值=0;朦胧下卩艮(limited，obscurationbass)=4%;月蒙胧上P艮(limited'obscurationhaute)ER804057(理论浓度40jag/ml)=7%;"通用"分析4莫型。就每一种粒度分布分析而言，评估了以下参数dlO,d50和d90,它们分别代表这样的数值，即，在这些数值以下分别存在着占油滴总体的10%,50%和90%的油滴。d10d50d卯T=071nm103nm155nmT=3个月70nm100nm152nmT-6个月70nm101nm153nm这些结果显示，乳液的粒度分布在+4。C经至少6个月的时间是稳定的。实施例III:由本发明O/W乳液制备的抗细胞肥大病毒感染的疫苗组合物制备了包含作为疫苗抗原的一种由CMV的gB糖蛋白衍生的重组蛋白的疫苗组合物。该重组蛋白是由以叫做pPRgB27clv4的质粒转染的重组CHO系制备的，它包含改性gB基因。为促进CHO系生产该重组蛋白的能力，对其序列描述在US5,834,307中的gB基因预先做了改性，即，消除了记录着对应于位于缬氨酸677与精氨酸752之间的氨基酸序列的gB蛋白跨膜区域编码的那部分基因，并在切割位点引入3个点突变。由CHO系生产的蛋白，-故称作BdTM,对应于去掉切割位点和^争膜区域的修剪过的gB蛋白。质粒pPRgB27clv4的建造和利用重组CHO系实现修剪gB蛋白(gBdTM)的制备描述在US6,100,064中。随后，在该培养介质中生产的gBdTM蛋白采用RasmussenL等人(J.Virol.(1985)55:274-280)描述的亲和色谱法，用单克隆抗体15D8来提纯。提纯的蛋白以含有0.975mg/mlgBdTM在-舞酸盐緩沖液中的储备溶液形式贮存。制备了用gBdTM并加上各种不同OAV乳液或氳氧化铝悬浮体配制的免疫刺激组合物。组合物编号1含有在柠檬酸盐緩沖液中的2gBdTM,pH6,50|ul(组gB)。组合物编号2含有2|uggBdTM,1.075mgof角豊烯，0.133mg脱水山梨醇三油酸酯(MontaneVG85)和0.125mgofTween80,在柠檬酸盐纟爰冲液中，pH6,50|al(组gB+0/W乳液)。该组合物是通过体积对体积混合gB的溶液与通过微流化获得的现有技术O/W乳液而获得的。组合物编号3包含2|uggBdTM和60|ug氢氧化铝，在磷酸盐緩冲液中，50|ul(组gB+AL)。组合物编号4包含2|uggB，1.25mg角篁烯，0.187mgDehymulsSMO，0.237mgEumulginBl和0.225mg甘露醇，在PBS緩冲液中，pH7.4,50^1。该组合物是通过体积对体积混合gB的溶液与含有5%角鲨烯的热可逆0/W乳液获得的(组gB+PIT)。用于制备该组合物的热可逆O/W乳液是通过稀释含有32.4wt。/。角鲨烯的浓缩热可逆O/W乳液获得的，后者是采用与实施例1中描述的方法相同的方法制备的，不同的是，水相不含任何ER804057。组合物编号5包含2吗gBdTM和1吗ER804057，在柠檬酸盐緩沖液中，pH6,50|ul(组gB+ER804057)。组合物编号6包含2|iiggBdTM，1.25mg角畫烯，0.145mgMontaneVG85,0.147mgTween80和1|ugER804057,在柠檬酸盐緩冲液中，pH6,50|ul(组gB+0/W乳液+ER804057)。该组合物是通过体积对体积混合gB的溶液与其中加入了ER804057的用孩i流化方法获得的现有技术O/W乳液而获得的。组合物编号7含有2gBdTM,1|ugER804057和60|ug氢氧化铝，在磷酸盐緩冲液中，50|ul(组gB+Al+ER804057)。组合物编号8含有2iiiggB,1.25mg角鲨烯，0.189mgDehymulsTMSMO,0.240mgEumulginTMBl,0.211mg甘露醇和1昭ER804057,在PBS乡爰冲液中，pH7.4,50|ul。该组合物是通过体积对体积混合gB的溶液与5%角鲨烯的PIT-ER804057热可逆O/W乳液PIT-ER804057获得的，后者是通过稀释实施例1的储备乳液获得的(组gB+PIT+ER804057)。8组10个8周大雌性远系繁殖OF1老鼠在日DO和D21接受以上面给出的组合物的皮下免疫注射(每组老鼠接受2次同样组合物的注射)。在D20和D34从后眶窦(retro-orbitalsinus)抽取的血样被用于测定gBdTM-特异IgGl和lgG2a抗体的浓度。这些检测是按照ELISA,通过在Dynex96-孔微量培养斧反的孔上涂布100ng(100|al)gBdTM在0.05M石友酸盐i爰冲液中，pH9.6,并在+4。C过夜实施的。为确定中和抗体，采用GonczolE.等人在J.VirologicalMethods,14:37-41(1986)中描述的程序。采用在含有10%胎儿牛犊血清的MEM介质中培养的MRC5,在通道28至38之间用以进行微量中和试验。在MRC5细胞上提纯并繁殖的TowneCMV抹(WistarInstitute,Philadelphia,US),具有约2x106PFU/ml的滴定度，被用作感染菌抹。也使用一种由VirionLtdInstitute(瑞士)获得的老鼠血清获得的补体源。一种滴定度为1:128的人体血清的混合物被用作阳性参照物并将其包括在每个微量中和化^r中。待测血清在56。C加热30min以灭活。在平底96-孔樣t量培养板中，在每份15jal等分试样中加入105iul培养介质(MEM+10。/o胎儿牛犊血清)(l/8稀释)。然后制备一系列2倍稀释液。按同样方式试验对照血清。在每一个孔中加入60|Lil包含3000PFU的病毒悬浮体和5|Lil老鼠补体。在37°C、。02下培养1h后，每个孔中加入150iul培养介质中的3-4xl()4MRC5个细胞。将微量培养物培养4日。在不含任何血清的孔中的病毒，其细胞致病活性是100%。另一方面，在含有中和血清的孔中，观察到病毒的细胞致病活性受到抑制。血清的中和抗体滴定度对应于其稀释度的倒数，其抑制病毒的细胞致病活性大于90%。从每一组老鼠获得的结果载于下表<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>*:血清稀释液的平均滴定度(表示为log10)这些结果表明，PIT/ER804057乳液表现出比其他佐剂更大的免疫刺激能力，因为在老鼠的"gB+PIT/ER804057"组中获得的特异IgGl和IgG2a滴定度显著高于在老鼠"gB+AL"或"gB+0/W乳液"组中获得的那些。本发明乳液的免疫刺激能力不仅是由于热可逆乳液(PIT乳液)或TLA4兴奋剂造成的，而且由于这两种产物的组合所致。事实上，在"gB+PIT，，和"gB+ER804057"组中观察到的特异IgGl和IgG2a滴定度显著低于在"gB+PIT/ER804057"组中观察到的那些。中和抗体生产的汇总表<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>**:抑制病毒的细胞致病效应超过90%的血清稀释度平均值的倒数。这些结果显示，由CMV包膜抗原与含本发明中描述的TLR4兴奋剂的热可逆O/W乳液的混合产生的免疫刺激组合物是能在老鼠体内诱导最高中和抗体滴定度的组合物。PIT/ER804057乳液刺激中和抗体生产的能力大于其他试-验过的佐剂组合物。PIT/ER804057乳液，据发现，比含有与MF59乳液相同成分的、迄今^皮认为是辅佐CMV蛋白的标准佐剂的基于角鲨烯的OAV乳液更有效(就其刺激中和抗体的生产而论)。还应当指出，TLR4兴奋剂在现有技术0/W乳液中的加入不增加该乳液的有效性(中和抗体滴定度依然不变)，然而热可逆乳液(PIT)的有效性，当它包含TLR4兴奋剂时，却增加了(中和抗体滴定度增加)。实施例IV:由本发明Q/W乳液制备的抗流感免疫组合物免疫刺激组合物由包含3种2004campaign(战役)疫苗抹(theA/NewCaledonia(H1N1)抹，theA/Wyoming(H3N2)林，和theB/Jiangsu林)的抗流感疫苗组合物制备，它是用各种不同OAV乳液组合物或用氬氧组合物编号1含有每种病毒株0.3iug凝血素(HA),在PBS緩冲液中，30|iil(0.3iugHA组)。组合物编号2含有每种病毒抹6.3)iig凝血素(HA),在PBS中，30(il(6.3]LigHA组)。组合物编号3含有每种病毒林0.3ng凝血素(HA),0.65mg角鲨烯，0.075mg脱水山梨醇三油酸酯(Span85)和0.075mgTweenTM80,在PBS緩冲液中，30)al(0.3|ugHA+O/W乳液组)。该组合物是通过混合抗流感疫苗组合物与通过微流化获得的现有技术0/W乳液获得的。组合物编号4含有每种病毒抹0.3iig凝血素(HA),0.75mg角鲨燁，0.11mgDehymulsSMO，0.143mgEumulginTMBl和0,138mg甘露醇和0.6figER804057,在PBS緩冲液中，pH7.4,30)ul(0.3jugHA+PIT/ER804057组)。该组合物是通过混合抗流感疫苗组合物与实施例1中描述并预先用PBS緩冲液稀释过的热可逆乳液而获得的。4组8个8周大雌性BALB/c老鼠通过皮内给药(耳朵内表面)在DO,以30jil剂量上面给出的免疫刺激组合物之一接受免疫。在D20从后眶窦抽取的血样一皮用于测定在每组免疫过的老鼠中得到的对每种病毒株特异的中和抗体的滴定度(凝血素-抑制(HAI)抗体)。该检测的原理基于病毒使红血细胞凝集的能力，而包含专门抗该病毒的HA的中和抗体的血清则能抑制病毒的"凝血，，活性。首先，将血清中包含的非特异抑制因子通过以Sigma提供的RDE酶(消灭酶的受体)处理血清，随后令它们与10%鸡血红细胞溶液进行接触而将它们(非特异因子)消除。获得一种不含非特异抑制因子并且对应于稀释至1/10的上层清液。随后，制备一系列上层清液在磷酸盐緩沖液中的2倍稀释液，随后将50iul每种稀释液沉积到V形底樣i量板的孔中。在每个孔中加入50|ul来源于滴定度为4凝血单位(4HAU)的澄清尿嚢酸流体的病毒悬浮体。该板在实验室温度下孵化1h,随后在每个孔中加入50pl鸡或火鸡血红细胞。让板在+4。C静置1h,然后读取化^r读数。凝血抑制因子的存在反映在微量孔底部红斑的存在上，而凝血作用的存在则反映在在孔中发粉红色的光圈的存在上。HAI抗体滴定度由在微量板孔中不再看到凝血现象的最终稀释的逆转代表。获得的结果载于下表42老鼠组HAI,抗A/NewCaledonia(H1N1)HAI，抗A/Wyoming(H3N2)HAI,抗B/Jiangsu0.3jugHA26w17486.3iugHA247907730.3)ugHA+0/W乳液135987570.3|ugHA+PIT+E謂4057290152298从每组老鼠8个血清样获得的HAI滴定度的平均值。这些结果显示，通过混合流感疫苗与含有TLR4兴奋剂的热可逆0/W乳液而获得的疫苗组合物是，与其他疫苗组合物相比，在老鼠体内诱导最高中和抗体滴定度的组合物，不论测试何种疫苗抹。PIT/ER804057乳液，据发现，甚至比组成类似于MF59的现有技术O/W乳液还稍微更有效(就其刺激中和抗体生产而论)。该组合物的优点还在于，抗原的数量可以大大减少，因为用0.3fig血凝素的剂量与PIT/ER804057乳液混合所获得的结果好于用等于或大于20倍凝血素剂量获得的那些。在另一种试验中，针对以由同样来自2004campaign的疫苗制备的各种不同免疫刺激组合物所免疫的老鼠组，跟踪了凝血素-抑制抗体滴定度随时间的演变。组合物编号1含有每种病毒抹0.3]ug凝血素(HA),在PBS緩冲液中，30(al(0.3)ugHA组)。组合物编号2含有每种病毒一朱6.3iug凝血素(HA),在PBS緩冲液中，30jal(6.3pgHA组)。组合物编号3含有每种病毒抹0.3|ug凝血素(HA),和0.6|ugER804057,在緩冲水溶液中，30(0.3pigHA+ER804057组)。组合物编号4含有每种病毒4朱0.3iug凝血素(HA)，0.30mg角鲨烯，0.044mgDehymulsTMSMO,0.057mgEumulginTMBl和0.055mg甘露醇，在PBS緩冲液中，pH7.4,30|il(0.3|ugHA+PIT,1%组)。组合物编号5含有每种病毒抹0.3iug凝血素(HA),0.30mg角鲨烯，0.044mgDehymulsSMO,0.057mgEumulginBl，0.055mg甘43露醇和0.6lugER804057,在PBS緩冲液中，pH7.4,30)ul(0.3|ugHA+PITatP/。+ER804057组)。5组5个8周大雌性BALB/c老鼠通过皮内给药(耳朵内表面)在D0，以30iul剂量上面给出的免疫刺激组合物之一接受免疫。在D23、D51和D79从后眶窦抽取的血样被用于测定在每组被免疫老鼠中得到的对HIN1抹特异的中和抗体的滴定度(凝血素-抑制(HAI)抗体)。获得的结果载于下表。老鼠组D23D51D790.3|ugHA组53806.3|ugHA组2352432790.3(igHA+ER804057组652112430.3|LigHA+PIT,1%组2265577350.3|ugHA+PIT,P/o+E謂4057组226970844***:从每组老鼠5个血清样品获得的HAI滴定度平均值。PIT-ER804057乳液就其生产流感病毒凝血-抑制抗体(保护性抗体)的能力而论的有效性是乳液与TLR4兴奋剂共同作用的结果，单单PIT乳液或者单单ER804057效力都4支小。实施例V:在已经对流感病毒敏化的年幼或年老老鼠群体中试验的由本发明乳液制备的抗流感疫苗组合物本发明乳液的抗流感疫苗有效性在已经对流感病毒敏化的个体给药的病例中进行了试验，敏化或者是因为个体曾经接触过抗流感病毒或者因为它们已经接种了抗流感疫苗。为实施此种评估，可使用已用三价疫苗做了肌肉注射(IM)预先免疫的老鼠，按照Potter等人(Vaccine,2003,21:940-945),作为相对于流感而言不是首次经历的动物模型。5组10个C57Bl/6老鼠8-10周大，接受IM注射三4介疫苗的剂量包含1.5|LigA/NewCaledoma/20/99(H1N1),A/NewYork/55/04(H3N2)和B/Malaysia/2506/04抹每种的HA。在D28,除接受PBS緩沖液注射的l组(PBS组)之外，所有其他老鼠组一律接受皮下注射30nl体积各种不同疫苗组合物，包含不同于一次免疫试'睑的三<介疫苗(A/NewCaledonia/20/99(H1N1),A/Wellington/01/04(H3N2)和B/Jiangsu/10/03)。一组接受含有0.3iiigHA每种菌林在PBS緩冲液中的组合物(0.3|LigHA组)。另一组接受含6.3ngHA每种菌株在PBS緩冲液中的组合物(6.3pgHA组)。另一组接受含每种菌株0.3pigHA,在PBS緩冲液中，在1%角鲨烯0/W乳液中的组合物，乳液包含0.3mg角鲨烯，0.044mgDehymulsTMSMO,0.057mgEumulginTMBl和0.055mg甘露醇，在PBS緩冲液中。含有1%角鲨烯的该组合物是通过混合抗流感疫苗与0/W乳液制备的，该乳液是通过稀释浓缩的热可逆储备溶液获得的，后者是按照与实施例1中描述的相同方法制备的，所不同的是，水相不含任何ER804057(0.3lugHA+PIT1%组)。最后，最后一组接受以下组合物的接种它含每种菌抹0.3iugHA,在PBS緩冲液中，在1。/。角鲨烯0/W乳液中，乳液包含0.3mg角鲨烯，0.44mgDehymulsTMSMO，0.057mgEumulginTMB1和0.055mg甘露醇，在PBS緩冲液中和0.6|ugER804057。包含1%角鲨烯和0.6|ugER804057的该组合物是通过混合流感疫苗与0/W乳液制备的，乳液是通过稀释浓缩的热可逆储备溶液获得的，储备溶液是按照实施例1所述相同方法制备的(0.3|ugHA+PIT1%/ER804057组)。在D50,老鼠借助安乐死被处死，以便收集血样和采集脾脏样品。对每种血样以A/NewCaldedoma/20/99(H1N1),A/Wellmgton/01/04(H3N2)和B/Jmngsu/10/03林实施了HAI试验。获得的结果载于下表老鼠组HAI,抗HAI,抗HAI,抗A/NewA/WellingtonB/JiangsuCaledonia(H3N2)(H1N1)PBS组52*48130.3|ugHA组95226576.3|ugHA组190640226HA+PIT1%组431640290450.3|ugHA+PIT1%舰804057组6982348640*代表从每组老鼠的10个血清样品获得的HAI滴定度平均值。这些结果显示，以含低剂量角鲨烯(1%)和TLR4兴奋剂(它包0.6|LigER804057)的"HA+PIT1%/ER804057，，疫苗组合物免疫的老鼠组中平均HAI滴定度明显高于老鼠以不含佐剂的流感疫苗在等价剂量HA(0.3pgHA组)或20倍高的剂量(6.3ingHA组)之下免疫后获得的滴定度。这些结果显示，PIT1%/ER804057乳液的优越性，即便在已经对流感病毒敏化的群体中，因为每种菌株的抗原数量可减少为20分之一，同时却获得，就3种病毒抹而言，更高保护性抗体滴定度。对每种脾脏样品分析了特异细胞免疫应答，采用ELISPOT技术和CBA(CytometricBeadArray)技术检验特异刺激后脾细胞产生的干扰素-y和IL5。关于ELISPOT技术，2x105脾细胞在200fil培养介质(RPMI1640,10%胎儿牛犊血清，2mM谷氨酰胺，50mMp-巯基乙醇)中，被沉积在以(Pharmingenref:551216)或以大鼠抗鼠抗体IL5抗体(Pharmingenref:554393)预敏化的硝基纤维素微量板孔上。脾细胞在37。C在鼠科IL-2(Bohringer)(10U/ml)和各种不同抗原以1|ug/ml的浓度的存在下进行孵化。为对CD8+细胞应答进行分析，采用一种在H-2kd前后序列中公认的流感NP肽(TYQRTRALV)。为分析CD4+细胞应答，流感抗原由以含有A/NewCaledonia/20/99(H1N1),A/Wellington/01/04(H3N2)和B/Jiangsu/10/03病毒抹的三价灭活裂解疫苗代表。然后，洗净微量板，并用分泌IFNy或IL5的脾细胞利用生物素酰化的大鼠抗鼠INFr抗体(Pharmingenref:554410或生物素酰化)的大鼠抗鼠IL5抗体(Pharmingenref:554393)和利用过氧化物酶-共轭的链霉亲和素(SouthernBiotechnology-ref7100-05)进行检测。在采用3-氨基-9-乙基。卡唑揭露后，利用自动ELISPOT读入器累加对应于分泌IFNy或IL5的脾细胞的斑点。结果表示为每10S个脾细胞分泌IFN丫或IL5的细胞数目。阳性检测门限值是20个斑点/106脾细胞。关于CBA技术，4x105脾细胞在200iul培养介质(RPMI1640，10%胎儿牛犊血清，2mM谷氨酰胺，50mMp巯基乙醇)中，一皮沉积在培养微量板的孔中。脾细胞在三价疫苗(1ng/ml)的存在下或在没有刺激剂的存在下在37。C孵化5日，以便评估细胞因子(介质对照样)的非特异生产。随后利用流动细胞计量术采用鼠Thl/Th2CBA套件(BectonDickinson-ref:551287)化-验培养物上层清液的IFNy序列或IL5序列内容。阳性检测门限值是就IFNY而言2.5pg/ml，和对IL5而言5pg/ml。就每个大鼠样品而言，通过从结果中扣除非特异性产生的IFNy或IL5的数量计算出IFNy或IL5的特异浓度。细胞应答分析的结果载于下表<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>*代表以三价疫苗刺激后，分泌IL5或IFNy每106脾细胞的平均脾细胞数目。该平均值是根据从10个大鼠样品/老鼠组获得的ELISPOT结果算出的。**代表根据10个大鼠样品/老鼠组采用CBA技术获得的结构算出的IL5或IFNy平均数量(pg/ml)。***该比值代表每组中IFNy/IL5比值的算术平均值。IFNy/IL5比值是根据按照CBA方法在脾细胞经过培养后获得的IFNy和IL5特异浓度值就每个样品确定的，随后算出每个老鼠组的IO个比值的算术平均值。这些结果显示，PITP/。/ER804057乳液在以流感疫苗特异再刺激细胞后强烈促使CD4+细胞应答倾向于产生IFNy。最显著的Thl应答(最高IFNy/IL5比值)据发现存在于接受了该乳液的老鼠组中。Thl应答事实上强于接受了含20倍高剂量(6.3pg组)的流感疫苗的老鼠组中的。因此，该乳液应推荐给在流感疫苗接种后Thl应答不良的个体，特别是老年个体的群体使用。同样的试验程序采用17个月大雄性C57B16老鼠进行重复试验，随后测定抗A/Wellington(H3N2)的HAI的滴定度。获得的结果载于下表。老鼠组HAIs，抗A/Wdlington(H3N2)6.3iugHA组104*0.3)ugHA+PIT1%组2470.3|ugHA+PIT1%/ER804057组476*代表从每个老鼠组的IO个血清样品获得的HAI滴定度平均值。这些结果显示通过将抗流感疫苗混合在含有低剂量角鲨烯(1%)和TLR4兴奋剂(ER804057,0.6jag)中获得的疫苗组合物中用于给已经对流感病毒敏化的老年个体的群体免疫接种的优点，因为每抹流感抗原的数量可减少为1/20,同时具有对3种病毒株较高的保护性抗体滴定度。权利要求1.一种水包油(O/W)乳液，包含i)TLR4兴奋剂，称作TLA4，其化学结构不包含糖环，ii)角鲨烯，iii)含水溶剂，iv)非离子亲水表面活性剂其是聚氧乙烯烷基醚，v)非离子疏水表面活性剂，并且它是热可逆的。2.权利要求1的乳液，其中TLA4是通式I，II,III或IV的化学化合物通式I的化合物X1R1>~Y1、<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中，就通式i,n,m或iv每一个而言，R^选自a)C(O);b)C(O)-(C广Cm烷基)-C(O),其中所述d-C14烷基任选地取代上羟基，CrC5烷氧基，d-C5亚烷基二氧基，(d-C5烷基)氨基或(crc5烷基)芳基，其中所述(crc5烷基)芳基的芳基部分任选地取代上d-C5烷氧基，(crc5烷基)氨基，(crc5烷氧基)氨基,(C广C5烷基)氨基(CrC5烷氧基)，-O-(CrC5烷基)氨基(CrC5烷氧基)，-O-(CrC5烷基)氨基陽C(O)-(C广C5烷基)-C(O)OH，或匿O-(CrC5烷基)氨基陽C(O)-(CrC5烷基)-C(O)-(C广C5)烷基5c)含有Crd5线型或支化链的烷基，任选地取代上羟基或烷氧基;以及d)-C(O)-(Q-d2亚芳基)-C(O)-，其中所述亚芳基任选地取代上羟基，卣素，硝基或氨基；a和b独立地是O,1，2,3或4;d,d，，d，，，e,e，和e，，独立地是O,1,2,3或4;X1，X2,Y工和Y2独立地选自空位，氧，NH和N(C(0)(d-C4烷基))，和N(d-C4烷基)；W4口W2独立地选自羰基，亚曱基，石风和亚石风；R2和R5独立地选自a)C2toC2。直链或支化链烷基，其任选地取代上氧代，羟基或烷氧基；b)C2toC20直链或支化链烯基或二烯基，其任选地取代上氧代，羟C)C2t0C2。直链或支化链烷氧基，其任选地取代上氧代，羟基或烷氧基；d)NH-(C2toC加直链或支化链烷基)，其中所述烷基基团任选地取代上氧代，羟基或烷氧基；和e)其中Z选自O和NH，而M和N独立地选自烷基，歸基，烷氧基，酰氧基，烷基氨基和酰基氨基，其包含C2-C加线型或支化链；R3和116独立地选自C2toC加直链或支化链烷基或烯基，其任选地取代上氧代或氟；R4和R7独立地选自C(O)-(C2toC2Q直链或支化链烷基或烯基)，C2toC20直链或支化链烷基，C2toC20直链或支化链烷氧基，和C2toC20直链或支化链烯基；其中所述烷基，烯基或烷氧基基团可独立地并任选地取代上羟基，氟或CrC5烷氧基；Gl5G2,G3和G4独立地选自氧，亚曱基，氨基，硫醇，-C(O)NH-,-NHC(O)國，和-N(C(O)(d-C4烷基))隱；或。2!14或。4!17可合在一起是氢原子或羟基；且其中就通式III而言a，和b，独立地是2，3，4,5,6,7或8,优选2;Z1选自-OP(0)(OH)2,-P(0)(OH)2，-OP(O)(OR8)(OH),其中R8是d-C4烷基链，-OS(0)2OH,-S(0)2〇H，-C02H,-OB(OH)2,-OH,-CH3,-^2和^1193,其中R9是C广C4烷基链；Z2选自-0P(0)(OH)2，-P(O)(OH)2,-OP(O)(OR10)(OH),其中R"是d-Ct烷基链，-OS(O)2OH,-S()2OH,-C02H,-OB(OH)2,-OH,-CH3,画NH2和國NR11,其中R11是d-C4烷基链；且其中就通式IV而言R12isH或C广C4烷基链；或通式I，II,m或iv的化合物的药学可接受盐。3.权利要求1或2的乳液，其中油滴总体的至少90体积％的粒度<200亂4.;k利要求1~3之一的乳液，其中油滴总体的至少50体积％的粒度<110亂5.权利要求1-4之一的乳液，其中相变发生在45°C~80。C之间的温度，优选在50°C65。C之间。6.4又利要求15之一的乳液，还包含至少一种糖醇。7.权利要求6的乳液，其中糖醇是山梨醇、甘露醇、甘油、木糖醇或赤藓醇。8.权利要求17之一的乳液，其中水相是緩冲盐溶液。9.权利要求1~8之一的乳液，其中TLR4兴奋剂是通式I的化学化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>或该化合物的药学可接受盐。10.权利要求9的乳液，其中Rl是C(O)或C(O)-(CH2)n-C(O),n是l,2,3或4,a,b,d,d，，d，，，e，e，和e，，独立地是1或2,XI,X2,Yl和Y2是丽，Wl和W2是C(O),R2和R5独立地选自C1(rC15直链烷基，其任选地取代上氧代，NH-(C1G-C15直链烷基)，和其中M和N独立地是C2-C20直链烷基或烯基，R3和R6是C5-C1Q直链烷基，R4—R7it自Il,c(0)画(c8—c12jl^》AI)，口c(o)陽(c8—c12直链烯基)，Gl和G3是氧或-NH(CO)誦，G2和G4是氧。11.权利要求9或10的乳液，其中化学化合物选自ER803022，ER803058,ER803732,ER803789,ER804053,ER804057,ER804058,ER804059,ER804442,ER804764,ER111232,ER112022,ER112048，ER112065,ER112066,ER113651,ER118989,ER119327和ER119328。12.权利要求1~11之一的乳液，其中TLR4兴奋剂的数量与非离子亲水和疏水表面活性剂的总量之比介于0.01x1(T2~5xl(T2，优选0.05x1CT2-2x10-2(wt/wt)。13.权利要求1~12之一的乳液，其中聚氧乙烯烷基醚选自聚氧乙烯(12)鲸蜡硬脂醇醚(ceteareth-12),聚氧乙烯(20)鲸蜡硬脂醇醚(ceteareth-20),聚氧乙烯(21)硬脂醇醚(steareth-21),聚氧乙烯(20)鲸蜡醇醚(ceteth-20),聚氧乙烯(10)鲸蜡醇醚(ceteth-10),聚氧乙烯(10)硬脂醇醚(steareth-10),聚氧乙烯(20)硬脂醇醚(steareth-20),聚氧乙烯(10)油醇醚(oleth-10)和聚氧乙烯(20)油醇醚(oleth-20)。14.权利要求1~13之一的乳液，其中疏水表面活性剂是脱水山梨醇酯或二缩甘露醇酯。15.权利要求14的乳液，其中疏水表面活性剂是二缩甘露醇一油酸酯。16.权利要求14的乳液，其中疏水表面活性剂是脱水山梨醇一油酸酯。17.权利要求1~16之一的乳液，其中亲水和疏水表面活性剂的数量应满足表面活性剂的总HLB介于8.5~10。18.权利要求1-17之一的乳液，其中角鲨烯代表乳液总重量的5%~45wt%。19.权利要求118之一的乳液，其中角鲨烯的数量与表面活性剂的数量之比介于2.0-4.0,优选2.5~3.5。20.^又利要求1~19之一的乳液，其中TLR4兴奋剂是化学^f匕合物ER804057，非离子亲水表面活性剂是聚氧乙烯(12)鲸蜡硬脂醇醚(ceteareth-12),非离子疏水表面活性剂是脱水山梨醇一油酸酯，而含水溶剂是磷酸盐緩冲液或柠檬酸盐緩冲液。21.权利要求20的乳液，其中a.角鲨烯的数量代表乳液总重量的的5%~45wt%(重量/重量)，b.角鲨烯的数量与聚氧乙烯(12)鯨蜡硬脂醇醚(ceteareth-12)和脱水山梨醇一油酸酯总量之比介于2.0-4.0,c.ceteareth-12和脱水山梨醇一油酸酯的数量应满足HLB介于8.5-10,以及d.ER804057与聚氧乙烯(12)鲸蜡硬脂醇醚(ceteareth-12)和脱水山梨醇一油酸酯总量之比介于0.01xl(T2~2xl(T2。22.权利要求21的乳液，还包含甘露醇，其数量代表乳液总重量的0.1~10wt%。23.权利要求1-22之一的乳液，还包含冷冻干燥底物。24.权利要求23的乳液，其中冷冻干燥底物是蔗糖、甘露醇和十二烷基麦芽苷的水溶液。25.权利要求124之一的乳液用于制备疫苗组合物的应用。26.权利要求1~24之一的乳液用于制备作为疫苗抗原包含至少一种流感病毒凝血素的疫苗组合物的应用。27.权利要求1~24之一的乳液用于制备作为疫苗抗原包含巨细胞病毒(CMV)包膜抗原的疫苗组合物的应用。28.权利要求27的乳液的应用，其中CMV包膜抗原是CMV的gB蛋白或其包含至少一种中和表位的衍生物。29.权利要求28的乳液的应用，其中CMV包膜抗原是已从中去除跨膜结构域且其中切割位点为无效的gB蛋白。30.制备权利要求1~24之一的0/W乳液的方法，包括通过提高温度获得W/0反相乳液的步骤，以及通过降低温度使W/0反相乳液转变为0/W乳液的步骤。31.权利要求30的方法，其中W/O乳液是通过实施将含有含水溶剂、聚氧乙烯烷基醚和TLR4兴奋剂的水相与含有角鲨烯和非离子疏水表面活性剂的油相混合从而获得O/W乳液的第一步骤，以及将0/W乳液加热至至少是乳液相变温度的温度的第二步骤获得的。32.权利要求30的方法，其中W/0乳液是通过分别加热含有含水溶剂、聚氧乙烯烷基醚和TLR4兴奋剂的水相以及含有角鲨烯和非离子疏水表面活性剂的油相至至少等于乳液相变温度的温度，随后混合该水相与油相，与此同时保持混合物的温度处于至少等于相变温度的温度而获得的。33.权利要求31或32的方法，其中TLR4兴奋剂在油相中，而不是在水相中。34.权利要求31-33之一的方法，其中水相还包含糖醇。35.权利要求31~34之一的方法，其中相转变温度介于45°C~80。C,优选50°C~65°C。36.—种制备疫苗组合物的方法，其中至少一种疫苗抗原与含有化学结构中不含糖环的TLR4兴奋剂进行混合，特征在于，含有该TLR4兴奋剂的0/W乳液按照相变方法制备，它包括通过提高温度得到W/0反相乳液形式的乳液的步骤，以及通过降低温度将W/0乳液转变为O/W乳液的步骤。37.权利要求36的方法，其中0/W乳液包含a)TLR4兴奋剂，如权利要求2所定义，b)角鲨烯，c)含水溶剂，d)非离子亲水表面活性剂，即聚氧乙烯烷基醚，以及e)非离子疏水表面活性剂。38.权利要求30-37之一的方法，还包括冷冻干燥步骤。全文摘要本发明涉及一种热可逆水包油(O/W)乳液形式的免疫刺激组合物，它包含化学结构不含糖环的TLR4兴奋剂，属于聚氧乙烯烷基醚化学类别的非离子表面活性剂、亲水表面活性剂和含水溶剂，它表现出免疫刺激性质。文档编号A61K39/39GK101636178SQ200780003005公开日2010年1月27日申请日期2007年1月9日优先权日2006年1月13日发明者J·海恩斯勒,M·-F·克卢克,P·乔克斯,P·普罗贝克-奎莱申请人:赛诺菲巴斯德有限公司