专利名称：：Na/K-ATP酶配体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及在药学或化妆品可接受载体中的将会刺激Na/K-ATPHff号的Na-K-ATP酶配体的药物组合物。在一个实式中，所i^且合物可以用于预防皮肤疾病的发展或治疗皮肤疾病。在另一个实施方式中，所述组合物可以用于抑制组织纤维化。我们同时也发现本发明对高血压的治疗和伤口闭合的治疗有
背景技术：
：化合物可以通过局部或全身施用来用作药剂。用于这一目的的制齐阿以包括载体、保护剂、抗氧化剂(例如维生素C或E)以及其它药学和药理学试剂。同时也希望这些化合物可以在包括将化合物传递至耙区的分子识别的递药系统中使用(口服、局部应用、注射或植入)。在其它方法中，这些递药系统可以包括脂质体技术或免疫方法。天然的或合成的那些可以调节受体和大分子的产生或细胞作用的化学药物在例如皮S夫病的反常的治疗中有用。在过去的几十多年中，为了鉴别和证实那些可以参与Na.sup.+、K.sup.+-AIP酶酶系统调节的因子的存在，众多研究者己经投入很大的精力去研究哺乳动物组织和体液的提取物。现在，己经提出大量的证据来支持这些内源性因子或因子家族的存在，它被认为可以抑制Na.sup.+,K.sup.+-A^P酶系统。此外，这些抑制特性暗示着所述因子参与数种生理学作用。然而，虽然这些早期石开究者提出了多方面的数据，但是存在关于它们作用机理的很多争论，因此所述因子在生理学上很重要。发明简述本发明一般涉及利用某些化合物对一定疾病的控制。劍门4顿了药物组合物，其包括药理有效量的在药学可接受载体中的至少一种^^剌激Na/K-ATP,号的Na-K-AIP酶配体。这一组合物诱导传导信号的Na-K-ATP酶与脂质、蛋白激酶、磷酸酶、离子通道、运载体以及其它可溶性蛋白和膜蛋白的相互作用以形成各种被称为Na/K-ATP酶信号体的信号复合物。该方法维持了正常的结构和功能。因此，向患者纟好有效齐糧的本发明的药物组合物来预防和治疗需要所述预防和治疗的患者的皮肤疾病及其发展。该方飽括通过局部纟舒或注射纟好药物组合物来增强皮肤成纤维细胞胶原的生成以与预防或逆转老化相关的肤色损耗的步骤。该方法同样也可以包括将药物组合物用作对伤口闭合的局部或全身增强作用的步骤。我们已经证明了Na/K-ATP酶与不同脂质和蛋白质的相互作用。这些相互作用导致构成Na/K-ATP謝言号体的多功能复合物的形成。Na/K-ATP酶可以不于其泵功能来调节许多重要的细胞功能和传导CTS信号的认识已经促使我们确定Na/K-ATP謝言号体的分子组成和该信号体行使功能的^机制。这些研究已经给我们提供了几个新的对分子功能进行分子介入的靶点，从而有新的治疗方法和诊断方法。在一个实施方式中，我们公开了那些与预防或逆转老化相关的肤色损耗以及加速伤口愈合的应用的其中之一。謝门发现了强心类固醇、海蟾麟素(MBG)的高循环水平和由肾部分切除术(PNx)诱导的实验性肾衰竭中的心肌纤维化之间的关系。简而言之，我们观察到PNx动物有实质性的心肌纤维化。同时也可以3151纟好MBG来诱导这一纤维化而达到相类似的血中浓度。可以通过在PNx手术前对进行动物针对MBG的免疫来减弱这一纤维化。典型的免疫组织化学影象被显示如下，用以举例说明。本发明的其它目的和优点对于本领域技术人员来说，在回顾下面优选实施方式的详述和相应附图后将会变得显而易见。附图简述图1表示Na/K-ATP酶信号体的作用途径；图2te^海蟾蜍毒素(MBG)对收縮压的作用；图3表示MBG在心脏、肾脏和肝纤维化中的作用；图4表示MBG力口速伤口愈合的作用；图5(a)和图5(b)^MBG在溶胶原蛋白泰逸中的作用；图6(a)标dP/dt繊；图6(b)表示dP/dtf[^;图6(c)标LVEDP娜；图6(d)表示MSEC数据；图7(a)表示丽/BW娜；图7(b)表示用蛋白质梦斑&(Westemblot)所展示的溶胶原蛋白表达；图7(c)表示用蛋白质印迹所展示的溶胶原蛋白彭i;图7(d)表示用蛋白质印迹所展示的溶胶原蛋白表达；图7(e)表示用蛋白质印迹所展示的溶胶原蛋白表达；图7(f)表示用蛋白质印迹所展示的Na/K-ATP職达；图7(g)表示用蛋白质印迹所展示的SERCA表达；图7(h)表示用蛋白质印迹所展示的SERCA表达；图8(a)表示纤维化积分繊图8(b)表示纤维化娄M;图8(c)表示纤连蛋白表达的。发明详述在一个实施方式中，所述组合物诱导各种被称为Na/K-ATP酶信号体的信号复合物的形成。在另一个实施方式中，所述药物组合物是在药学可接受载体中的药学有效量的至少一种Na/K-ATP酶信号的抑制剂。该组合物作为通过Na/K-ATP酶信号转导的抑制剂来行使功能。,地，对需要所述治疗的患者的皮肤病的治疗包括向患者给予治疗有效量的所述药物组合物的步骤。更特别地，所述治疗包括将该药物组合物用作局部或注射给药工具以逆转或预防过度的皮肤疤痕形成。在另一个实施方式中，所述治疗是抑制需要所述治疗的患者的心肌纤维化，该治疗包括向所述患者给予治疗有效量的药物组合物的步骤。该药物组合物可以是选自片剂、丸剂、混悬液片剂、粉剂、锭剂、囊剂、扁胶囊、酏剂、悬浮剂、乳液、溶液、糖浆、气雾剂、油膏、软胶囊、禾口石到交囊、栓剂、霜剂、洗剂、溶液、；赚和糊齐啲齐趣。Na/K-ATP酶配体包括但不限于一般被称为强A类固醇的一组化合物(例如卡烯内酯和蟾二烯羟酸内酯)，它们来自植物或动物或是半合成的。抑制剂包括但不限于那些中断Na/K-ATP酶同它的信号偶配体如EGF受体、Src激酶和小窝蛋白-1的相互作用的物质。需要治疗的受试者可以包括(但不限于)那些有系统性纤维化病症例如硬皮病以及那些有局部性纤维化病症例如肝硬化的患者，其是由于病毒或酒精性肝炎、同肾脏疾病和/或动脉粥样硬化有关的进行性心力衰竭以及来自于肾小球肾炎(glomerlonephritis)、糖尿病和高血压的进行性肾脏疾病所引起的。Na/K-AIP酶属于P-型ATP酶家族，它对于生物将ATP转化为横跨细HM的电和化学梯度是必要的。Na/K-ATP酶在几乎所有的哺乳动物细胞中都有表达并且用通ilzK解ATP产生的能量来，Na+和K+穿M^胞膜。在最近的几年内，我们的实验室已经获得Na/K-ATP酶也可以作为重要的细胞信号传导蛋白来行使功能的证据。我们现在提出至少有两个分离的Na/K-ATP酶的库，其中一库作为离子泵行使功能而另外一库参与同脂质、蛋白激酶、磷酸酶、离子通道、运载体以及其它可溶性蛋白和膜蛋白的相互作用以形成各种被称为Na/K-ATP酶信号体的信号复合物。图1是描述钠泵在心IW胞中信号传导的示意图。在强A嘆固醇的存在条件下，Na/K-ATPStt为信号转导蛋白，该蛋白同Src和表皮生长因子受体相络合。开始一个信号级联，它M^于Ras并导致活性氧物质(ROS)的产生和ERK的活化。这随后导致改变的基因表达，包括SERCA表达的减少以及转循环的变化。图2显示MBG产生了与心脏肥大相一致的功能和解剖学的变化。(a)在假手术(l叚的，n=8)、肾部分切除术(PNx，n=8)、MBG车傲主(MBG，n=10)或肾部分切除术前针对MBG进行免疫(PNx-IM，n=8)4周后的收縮压。(b)4组大鼠典型的超声心电图，(c)后壁厚度，(d)左心室舒絲期的直径，(e)收縮末期左室内径，禾n(f)假的(n=8)、PNx(n=10)、MBG(n=9)、或PNx-腦(n=16)4周后的FS值。氺P〈0.05对PNx;##P<0.01对PNx。图3显示MBG在心脏、肾脏和肝脏纤维化中的作用。图4显示MBG加速伤口愈合的作用；图5(a)和图5(b)显示MBG在溶胶原蛋白表达中的作用；图6(a)、(b)、(c)和(d)MBG引起与舒张期功能障碍相一致的血液动力学变化。(a)最大的血压变化率(+dP/dt)，(b)+dP/dt与最小的血压变化率(也就是最大的负血压变化率，-dP/dt)的比，(c)左心室舒张末期的血压(LVEDP)，禾tl(d)假手术(f叚的，n=14)，肾部分切除术(PNx，n=15)，固G输注(MBG，n=12)，或肾部分切除术前对MBG进行免疫(PNx-IM，n=14)4周后等容弛缓的时间常数。*P<0.05对假的；**P<0.01对假的;#P<0.05对PNx;辦PO.Ol对PNx。图7(a)到(h)MBG弓I起的与实验性尿毒症相一致的心脏开絲和蛋白表达变化。(a)假手术(假的，n=18)、肾部分切除术(PNx，n=20)、MBG输注(MBG，n二20)或肾部分切除术前针对MBG进行免疫(PNx-IM，n=18)4周后心脏重ay身体重量(HW/BW)比。(b)假的(n=15)、PNx(n=14)、MBG(n=7)或PNx-IM(n=7)4周后在左心室组织匀浆中的胞夕卜信号相关激酶(ERK-l,p44)活化。将50卞g左心室组织匀浆蛋白加载于灌跟中。公开了典型的活性和所有ERK印迹。(c)假的(n=15)、PNx(n=13)、MBG(n=10)或PNx-IM(n=6)4周后在左心室组织匀浆中的Src(SrcpY"s)活化。将75卞g左心室组织匀浆蛋白加载于^疑j狡中。公开了典型的活性和所有Src印迹。(d)骨骼月/Wl动蛋白(skACT)，(e)Na/K-ATP酶al，(f)Na/K國ATP酶a2，禾卩(g)假的(n二15),PNx(n=13)，MBG(n二10)，或PNx-M(n二6)4周后的SERCA2a表达。将20吗左心室组织匀浆蛋白加载于用于d到g的凝胶中。(h)假的(n=8)，PNx(n=6)，MBG(n=8)，或PNx-M(n=8)4周后的左心室组织匀浆中的SERCA2a酶活性。关于蛋白质印迹的条形图概述了该印迹的密度测定。衬PO.01对假的；承PO.05对假的；存PO.05对PNx;##P<0.01对PNx。图8(a)和(b)表示MBG引赵lL、肌纤维化。(a)假手术(假的)，肾部分切除术(PNx)，MBG车傲主(MBG)，或肾部分切除术前对MBG进行免疫(PNx-M)4周后左心室组织典型的Masson三色法染色切片。(b)半定量等级和(c)假的(n=8)，PNx(n=10),MBG(n=10)，或PNx-IM(n=10)4周后关于三色染色的左心室切片载片的定量形态测定的纤维化积分。(d)来自假的(n=9)，PNx(n=9)的纤连蛋白表达和定量数据。将50叱左心室匀浆组织蛋白加载于;嫩中。*P<0.05，**P<0.01对假的，#P<0.05，##P<0.01对PNx。强A类固醇(CTS)包括来自于植物的洋地黄药物如地高辛和G毒毛旋花，以及来自于脊椎动物的苷原如柳可林和海蟾麟素。虽然CTS自它们被发现以^M仅仅被认为是药品，但是:TO的研究已经将Gg旋花和海蟾^素鉴定为内源性类固醇，它们的产生和分泌被包括促肾上腺^i^激素(ACTH)和血管紧张素n在内的多种病理学或生理学剌激物所调节。G#^旋花和海蟾^#素对于血压的作用现在已经被证明。此外，我们和其他人也已经证明了低剂量的这些类固醇不但引起大鼠的高血压，而且引起不于心血管对高血压作用的显著心血管重塑。此外，这些类固醇调节细胞生长和包括胶原的细胞外基质蛋白的细胞生产。己经确定CTS是Na/K-ATP酶的特异性配体和抑制剂。早先的研究己经表明CTS调节基因表达和细胞生长。来自我们实验室的最近工作已经在Na/K-ATP酶介导的信号传导和CTS-诱发的细胞功能变化之间建立了联系，这表明Na/K-ATP酶可以通过不依赖于胞内Na+和K+浓度变化的机制来传导胞夕卜CTS信号。该传递信号的Na/K-ATP酶存在于细胞膜穴样凹陷中并且与酪氨酸激酶Src形成受体复合物。CTS如G毒毛旋花表现为激动剂并朋微受体，导致与传导信号的Na/K-ATP,Src复合物有关或相近似的蛋白酪氨酸磷酸化。随后，反式作用于受体酪氨酸激酶比如EGFR并开始蛋白、激酶级径。该己鉴定的途径包括P13K、Ras/Ra^ERKs和PLC/PKC同工酶的活化。它也增加了活性氧物质(ROS)的线粒体生产。与其它复合物类似，CTS弓虚的该复合物活化诱发该活性复合物的细胞内吞作用，因此终止了该活性复合物或将其耙向于特定的胞内层。与一些受体酪氨酸激酶(RTKs)不同，传导信号的Na/K-ATP酶也能作为支架行使功能，育滩与其它膜运载体和通道(图1)相互作用。例如，我们已经证明了传导信号的Na/K-ATP酶的骨架和、激酶调控能力使得G毒毛旋花在培养的LLC-PK1细胞系中诱导(^2+瞬为可能。对大鼠进行假手术(假的)，实验性肾衰竭(PNx)，ilil微泵的MBG补充给药(MBG)，并且在PNx外利手术前针对MBG对大鼠进行免疫，再对获得自这些大鼠的心脏组织逆行免疫组织化学研究。我们注意到了蛋白的存在(前胶原在板左侧，平滑肌肌动蛋白在板右侧)(未给出)。获得波形蛋白或纤连蛋白的类似图片。蛋白质印迹数据证实了Jd翻勺视觉趋向(数据未给出)。基于这些繊，我们然后选择去检查MBG对细胞i咅养系统中的成纤维细胞(fribroblasts)是否有直接作用。下列数据说明了我们迄今为止的发现。前胶原表达作为MBG,物的一个功能。顶部为蛋白质印迹，底部为10个实验的均值+"舰。**p<0.01相对于对照组，经由成。、肌纤维细胞将脯氨酸掺AiSK原，该过程以剂量臓的方法^MBG戶;n秀导。繊表示为6个实验的均值+ASEM，**p<0.01相对于对照组(1中的水平条)。我们然后检查皮鹏纤维细胞系是否有同样的反应。该实验是用BasharKahaleh博士友瞎提供的皮肤成纤维细胞完成的。如下所示，j細这些在培养物中培育的人类细胞，激门注意到i5^成纤维细MMBG有显著的反应。通过与最大齐糧的作为纤维化"经典的"刺激做GF財目比来说明该反应的强度(见下文)。此外，我们观察到7乂生成纤维细胞系对固G、G毒毛旋花和地高辛有相类似的反应。皮肤成纤维细MMBG的反应与附GF卩的反应相比较。注意到用5或10nM的MBG时赵4BG中胶原表达增加了大约10倍。使用蛋白质印迹证明了G毒毛旋花、MBG和地高辛对成纤维细胞系中前胶原表达相当的影响。概括这些薩，我们观察到例如MBG的强心类固醇极大地增加了前胶原表达。在另外一些没有在此展示的研究中，我们观察到这些通^Na/K-ATP酶的信号传导对于促纤维化作用显得必不可少。而且，劍门观察到iMROS清除、Src抑制自GFR转录激活的预防的级联途径引起的信号传导的拮抗作用预防了对胶原合成的诱导作用。由MBG所诱导的前胶原表达可以被Src抑制作用(PP2)、非特异酪氨酸激酶抑制作用(除莠霉素)自GFR转录激活预防作用(AG178)所减弱。顶部为典型的蛋白质印迹，底部为6个实验的平均值+ASEM。**p<0.01相对于对照组。MBG增加了舰脯氨酸掺入法所测定的胶原合成。然而，N-乙酰半胱氨酸(NAC)禾0PP2预防了该作用。然后，我们检查伤口愈合是否可以被强心类固酉辩利地影响。我们培育了大鼠成纤维细胞系，让该SYF+Src细胞系进行融合并用吸管職咄一条横行无细胞刮除带的划痕。我们在该体外划痕模型中观察到用MBG的12小时预处理极大地加速了该实验性损伤的闭合(参见下蹄。划痕实验3、7和12小时后来自成纤维细胞的代表性影象。来自成纤维细胞培养的定量伤口闭合。M^^N二6的3拉实验，它们各自包括在*时间点的3次测定。M表示平均值+ASEM，**<0.01。我们提出通过局部^^主射给予强A类固醇来增强皮肤成纤维细胞胶原的生成，并预防或逆转与老化相关的肤色损耗。劍门同时也提出开发局部或全身的对舰闭合的增强作用。最后，我们提出发展局部離射工具Sii^抗这一过禾M^转或预防鹏的皮M痕形成(例如挖瘩)。在另一个实船式中，劍门最近已纷见察到大鼠体内的实验性肾衰与强心类固醇、海蟾麟素(MBG)循环浓度增加和实质性心肌纤维化相关联。劍门完成如下研究去检SMBG是否可直接棘激心成纤维细胞的胶原生成。通过{顿实验性肾衰竭(PNx)、MBG输注(MBG)、对MBG进行免疫后的PNx和并发的PNx和肾上腺切除术的5/6肾切除的模型，iS《亍了体内试-验。完成了使用Mllar导管和免疫组织化学方法的生理学测量。在体外逸验中随后^ffl培养隔离的成心月几纤维细胞。我们观察至lJPNx禾nMBG提高了MBG水平、血压、心脏尺寸，削弱舒展期功能，并引起心肌纤维化。对MBG进行免疫后的PNx和并发腔Nx以及肾上腺切除术如同PNx相类似的血压水平，但是较少存。、脏肥大、舒张期功能障碍和心肌纤维化。MBG于lnM的浓度诱导培养的成心肌纤维细胞的前胶原-l表达增加。这些前胶原的增加与胶原翻译和前胶原-1的mRNA增加相关联，而没有任何前胶原-1蛋白稳定性的可证明的增力口。用MBG对成纤维细胞的刺激可以31il给予酪氨酸磷酸化、Src活化、表皮生长因子受#$专录激刮勺抑制齐诉,-乙酰半胱氨*预防。基于这些发现，我们提出MBG直接诱导成纤维细胞中胶原表达的增加，并且我们提出从逸验性肾衰中可以看到该作用可能在心肌纤维化中十分重要。我们先前已经证明了通MNa/K-ATPl^专导信号的强心类固酉魏蟾麟素(MBG)对大鼠内的肾部分切除术(PNx)诱导的许多试验性尿毒症特征有直接的责任。具体地，我们注意到所有接^iPNx以及通过微泵补充给予MBG的大鼠在4周后发生显著的心脏肥厚和纤维化，然而对MBG进行免疫随后接受PNx的大鼠的这些变化减弱。从这些数据，我们形成了这样的假设MBG可旨喧接诱导成心肌纤维细胞生i^交原，因此从实验性肾衰中看到许多心肌纤维化的产生。为了检验该假说并观啶它所发生的^T基础，进行了如下i力验。实施例方法动物将雄性斯普拉-道来(一Sprague-Dawley)大鼠用于所述的所有研究。所有在本文中描述的动物i^验操作同国立卫生研究院有关照料和^ffii^动物的指南相一致，"f吏用MedicalUniversityofOhioInstitutionalAnimalUseandCareCommittee所认可的实验协i义。i離组简而言之，在手术时让称重《50g的Sprague-Dawley大鼠接受没WMBG输注的假手术(假的)、配置一个微泵以每天10^ig/kg剂量给予MBG的假手术(MBG)、PNx、和对MBG免疫后的PNx(PNx-M)中任一手术。非常高纯度的MBG(〉99%)1^Kennedy等A^人海蟾蜍的毒液中分离获得。除了这些操作以外，一^PNx动物也接受了肾上腺切除术(PNx-ADx)。在手术4周后评定体重规格化的心脏重量、左心室心脏血流动力学(如T值，下腔静脉闭塞产生的舒展末期血压同舒棘期容积拟合的回归线斜率，所有都是用Mllar导管测定)、血浆浓度[MBG](如前戶万述，使用DELPHIA的C-18柱提取后来测定)、醛甾酮(用CaymanChemical公司的ELISA试剂盒10004377进行观U量)和心脏的免疫组织化学(vidamfra)。分离的成心肌纤维细胞用Brilla等人先前所描述的并经过修改的方法完成成年大鼠的成心肌纤维细胞制备。蛋白质印迹分析如前所述，对分离自组织匀浆、细胞培养全细胞溶胞产物或核提取物的蛋白进行蛋白质印迹分析。胶原合成用经过修改的Nishida等人的方法测定胶原合成率。胶原-1的mRNA的定量测定如先辦艮道的方法，利用用作持M因的GAPDH转录物fOT标准化的逆转^PCR技术(RT-PCR)测量基因的表达。结果实验性肾衰禾tMBG对血压、心脏血流动力学和纤维化的作用在最近的体内试验中，我们观察至iJPNx-禾tMBG-处理的大鼠同假手术对照组大鼠相比，MBG水平得至lJ提高。我们也看至炉Nx禾nMBG大鼠比对照组大鼠有更高的收縮压，并且如同PNx中看到的，PNx-M大鼠具有统计学上相类似的收縮压值。^f顿Mllar压力/容积传感器导管而不是劍门先辦艮告中的超声心动图，我们观察到同假手术对照组大鼠相比，PNx诱导收縮期末容积和舒展期末容积减小，以及射血分数的增加。同PNx相比，PNx-M中的收縮期末容积和舒展末期容积扩大，并且射血因素值降低。同假手术对照组大鼠相比，发现测得的主动放松^PNx禾nMBG所削弱，并_@PNx-IMltPNx显示更低值。〗顿在腔静脉闭塞期间产生的压力-容量环，謝门注意到同对照组大鼠相比，PNx-禾PMBG-处理过的动物的舒駄期血压容积相关性(一种被动顿应性的逆观懂)增加，然而PNx大鼠同PNx组相比具有更低的舒展末期压容积相关性。同假手术对照组大鼠相比，所^PNx禾nMBG治疗增加了心脏重動体重比，然而PNx-IM动物t:kPNx有更低的值。检查三色染色法图象测定的心Sm细胞横断面积，我们注意至'JPNx和MBG输注都诱导了显著的增大，然而PNx-IM中的朋细胞横断面积比单独用PNx所看到的横断面积有相当大的縮小。PNx、MBG禾nPNx-M^血流动力学禾nMBG血浆浓度的影响。<table>complextableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>4周后对假手术(假的，n=20)、肾部分切除术(PNx，n=20)、MBGi^主(MBG，n=20)或在肾部分切除术前针对MBG的免疫作用(PNx-M，n=8)进行分析，结果以平均il士SEM报告。分析该免疫组织化学结果，来自接受了MBG禾nPNx的大鼠心脏组织的胶原-l和染色的平滑肌肌动蛋白表现出显著的增力[U对MBG的免疫削弱了这些增力口。蛋白质印迹分析确证了同假实验对照组的大鼠比较可以看至iJPNx禾nMBG有2到2.5倍的前胶原-1和平滑I/Wl动蛋白的表达，然而PNx-IM前胶原-l和平滑月;W1动蛋白的表达大体上少于对于PNx所看到的。为了确定纤维化作用所潜在的肝机制，劍门检查了几种在纤维形成活化作用中重要的蛋白的表达。具体地，劍门检查了转化生长因子(TGF)-|3、Smad2/3、禾口Smad4、以及pSmad2/3的组织zK平。我们并未发现这些实验组在心脏表iiS些蛋白方面有显著性差异。一个独立组的动物(N=11)也接受PNx-ADx，该实验中糖皮i^激素和醛固酮进纟亍生理学的ITf^与PNx相比，这些动物发展为相l^以的高血压水平，f旦是劍门注意到它们有非常低的MBG血浆浓度和醛固酮水平，以及同ip4虫使用PNx比駄体上更低的心脏重獻体重比(表格)。此外，基于对胶原-1或平滑肌肌动蛋白的三色法染色或免疫组织化学染色，这些接^PNx-ADx的动物几乎没有关于心肌纤维化的证据。强A类固醇对成纤维细胞胶原表达的作用为了进一步检查所述心M^千维化的好基础，让分离出来的成。、肌纤维细胞接受加大剂量的MBG(l(T10、10-9和l(rtVI)。使其接触10-9和1(^M的MBG24小时后，fflil蛋白质印迹检测到前胶原内含物增力口-2銜两者都为PO.Ol;图3a)。这种5嫁并不^MGB特有，其它强A类固醇也诱导相类似的前胶原内含物增加(图3b)。有意思的是，MBG作用的阈值似乎是在10^和1(^之间，然而对于在尿毒症大鼠中以相似浓度循环的G毒毛旋花，该阈值大约ltMBG高10倍(即，在10—9和10~之间)。对于MBG和G毒毛旋花，诱导胶原表达的阈值低于必须齐糧的对数单位，该剂量对这些细胞中^b摄取可检测作用是必需的。在检测方妇寸标记的脯氨酸掺入胶原中的平行逸验中，我们观察到10—9和1(^M的MBG诱导了脯氨酸掺入总蛋白的显著增加，在基质和上清液中都有。利用胶原酶消化作用，劍门观察到绝大多数的脯氨酸掺入胶原。使用标准化的逆转敦CR技术，我们观察到作为对10nM的MBG的响应，胶原-1的mRNA在24小时内倍土曾。然而，劍门并未发现任何前胶原稳定性的提高(在接触放线菌酮后经检查前胶原-1的表达来确定)来作为对MBG这一浓度的响应。Na/K-ATPHf言号的抑制对MBG-激发的胶原表达的作用为了检查强心类固醇是否经通aNa/K-ATP酶的信号传导来诱导胶原合成，劍门进行了下述研究。首先，謝门叙a/K-ATP酶级联途径的几个步骤中4顿药理性feif[作用。具体地，我们利用PP2对Srct^^乍用的药理性拮抗作用、除莠霉素的非特异性酪氨酸激酶抑制作用、AG1478对EGFR转录激舌的抑制作用和N-乙酰半胱氨酸糊一特异性抗氧化齐啲施用。这些操作各自预防了胶原合成的認G;微作用，为了确证这些数据，我们也检査了扭P2劍-乙酰半胱氨酸存在或不存在时方M标记的脯氨酸掺入对MBG的反应。作为前胶原表达的实例，PP2禾附-乙酰半胱氨酸都预防脯氨酸在成纤维细胞培^l/J期掺入胶原的增加。然后，劍门完成了SYF禾口SYF+细胞中的逸验(详清可以在在线补充内容中获得)。在成心肌纤维细胞培养初期关于前胶原的表肚调，SYF+细胞以十分类似的方式对MBG和G毒毛旋花进4于应答，然而SYF细胞对MBG或G毒毛旋花基本上没有反应。TGF-卩禾nMBG-激发的胶原生产之间的关系为了进一步检查强A类固S站成纤维细胞中诱导胶原产生的^^机制，我们检查了認G附GF-(3敲以及Smad2/3、Smad4禾口pSmad2/3親的作用。作为早先描述的体内i微实例，我们没有观察至盯GF-I3、Smad2/3、Smad4或pSmad2/3在体外敲的显著变化。然后，我们检查了TGF-I3是否诱导胶原生成以及TGF-卩禾隨G之间是否有协同作用。在原代培养的细胞中，劍门看至UTGF-P(5ng/mL)对前胶原毅的作用类似于在强A类固醇中观察至啲作用；然而，我们没有注意至W壬KTGF-)3(5ng/mL)禾nMBG(10nM)之间的协同作用。然而，需要重点指出的是，我们没有对原代培养物进行完全的血清饥饿，并且因为血清始终存在，一些TGF-(3始终存在。为了对其进行进一步的探寻，謝门也检査了TGF-卩受体拮抗剂SB431542对MBG激发的胶原生成的作用。有意思的是，SB431542在10(Himol/L浓度时没有弓l起在劍门的蛋白质印迹基线以下的前胶原表达，但>方謝标记的脯氨酸掺入低于用对照组细胞戶膽到盼瞎况。SB431542完全阻断了TGF-卩禾DMBG(10nM)激发的胶原表达和方M标记的脯氨酸掺入。心肌纤维化是许多心脏疾病的重要组成部分，并且它正是尿毒症的心肌病的特征部分。劍门团队以及其他人已纟劲见察至UMBG和其它强心类固醇M^存在于细胞膜穴样凹陷的质MNa/K-AIP酶诱导的信号转导级联，导致Src的激舌、EGFR的转录激活、活性氧物质的产生，并且最终引一42^有丝分裂素-活化的蛋白激酶的活化。有趣的是，许多同心肌纤维化相关的除肾衰竭之外的临床表现与随着提高的强心类固醇循环浓度相关联(例如，高血压、原发性醛固酮过多症、和充血性心力衰竭)。虽然初步讨论了謝门的发现同除肾衰竭之外的心肌疾病之间可能的关系，劍门需要指出的题errandi等人已经观察到内源性强心类固醇同PST2238的拮抗作用改善了Mlan高血压大鼠中的高血压以及心脏肥大。在最近的研究中，我们确证了PNx禾nMBG的治疗在血液动力学和心脏幵絲学方面诱导了相似但是并不相同的表型改变。很有可能的是除MBG之外的一些因子对^PNx中看到的表型改变有促成作用。也就是说，减少MBG循环的PNx-M禾nPNx-ADx大体上都M^了心脏功能和开絲学改变而对血压并没有显著影响。劍门需要指出的是，^PNx-ADx才题中进行该实验是因为我们判断由于在培养基中的肾上腺细胞生长产^MBG，很有可能该过程可以斷氐所述激素的循环水平。然而，謝门^PNx-ADx动物中的f^支持肾上腺;lMBG体内生成的主要(但不是唯一)位点的这一概念，在肾上腺中生成的其包敫素可能调节MBG在别处的生成。需要进一步的工作来准确阐明在正常和病理学的条件下認G于何处产生。因为这些涉JJVBG在心肌纤维化发病机理中作用的发现，謝门对纤维化所潜在的力子机理特别感兴趣。有意思的是，增力nTGF-P^3I31Smad蛋白的信号传导的证据并不明显。我们强调的是这a^并不排卩釘GF-p在这些过程中的作用，因为这些蛋白的初期增加、Smads易位和/^131该途径(Vidainfra)传导信号的允许作用肯定是存在的。基于这些体内试验的数据，謝门继续对分离出来的成心肌纤维细胞进行研究。謝门观察至fjMBG于生理学浓Jtl:接刺激成纤维细胞产生更多的胶原。尽管在欠^MBG比欠^G毒毛旋花苷更甚之前阈浓度似乎是-1对数单位，采用其它强心类固醇中似见察到了所繊原生成的增加。我们强调的是，m^K原表ii^必需的MBG和G毒毛旋花这两铺质的浓度比可感知地抑希ijRb摄取所需要的它们的浓度要低。关于f^于ffl3iNa/K-ATP酶传导信号的3Eim的进一步证据为活性氧物iH清除、拮抗作用、或Src的敲除以，GFR转录激活的预防作用防止了所述的增加，这些是我们先前已经证明过的aMNa/K-AIP^f言号体阻断信号转导的策略。劍门也观察到胶原生成的增加与脯氨酸掺入的增加以及胶原-1的mRNA的增加相关联。并没有证明在响iSMBG时前胶原-l稳定性得到提高。虽然TGF-P或Smad蛋白的增加也不存在于用MBG处理过的成纤维细胞中，但是需要特别注意的是，从未真正地劍门研究的成纤维细胞进行血清饥饿。甚至当在缺乏血清的(1%FBS)培养基中培养时，让所述成纤维细胞暴露于20.12ng/mL的TGF-P。这可以部分地解释为什么SB431542对预防MBG-激发的胶原生成有效。使用相似的药剂进行工作，Lijnen禾nPetrov注意到长时间培育(48小时)和高浓度的TGF-P(15ng/mL)对诱导胶原生成的最大增加(2倍)是必需的。当用蛋白质印迹测量时，劍门也需要注意到甚至^MBG合成的剝牛下，用SB431542阻断TGF-P实际上M4、脯氨酸掺入使其低于基线，虽然同样的药理学操作仅仅M^了前胶原表达使其至基线。劍门怀疑当TGF-I3途径被阻断时其它调节胶原合成的机制(例如，前胶原稳定性)可能会参与进来，虽然劍门在当前研究中没有进一步探究这一点。总而言之，我们的繊初步地反附GF-卩或Smad蛋白的上调在强心类固醇诱导的成纤维细胞生成增加中fei要作用这一观点。在劍门用于实验的啮齿动ttf莫型中，我们的,显示MBG与心肌纤维化的发病机理相牵连，并且在该环境下所发展出来的MBG以及其它强A类固醇的浓度具有体外作用，这同所3^见察结果相一致。随后马上考虑的一个问题是是否洋地黄的临床应用可以有相似的作用。对于这个问题，劍门^娥出以下几种可能。首先，在体内出现的地高辛游离浓度可能不足以诱导实质的心肌纤维化。在用地高辛治疗过的病人中，地高辛总的血液水平有f^性地保持在〈2ng/mL，所纟^i也高辛浓度同《.5-nM的浓度相对应。然而仅有70%到80%血浆中的地高辛是游离的，并且这些游离浓縮物可能落Ai也高辛麟人体ll、脏(或其它组织)纤维化所必需的阈值水平以下。可能更相关的，关于一旦到达作用阈值就有成纤维细胞胶原生成的刺、激作用，我们观察到很平坦的MBG和G毒毛旋花剂量响应曲线。劍门提出在心力衰竭(已知的与認G和其它强A类固醇增加相关的一种病症)的环境下，以治疗剂量加入地高辛可能不会有可发觉的作用。最后，劍门想指出的是，虽然已乡别这些试剂在治疗心力衰竭中的临床效育^t行了广泛的检查，但是对地高辛是否诱导或影响人的心肌纤维化的系统检查并未研究彻底。特别需要注意的是，人类形成心肌纤维化的速度看起来比啮齿类动物的要慢很多，这个可育腿一步使地高辛在受试者中是否具有促纤维化作用变得模糊。总之，我们观察到类似于在实验性肾衰中产生的MBG浓度弓l起在原代成心肌纤维细胞中的合成增加，所述原代成心肌纤维细胞是以依赖于通淑a/K-ATP酶-Src-EGFR-活性氧物质信号级联放大进行信号传导的方式在培养物中培育的。这些类娥将在人中进行确证，这一看法可以在临床的尿毒症L、肌病中提供一种有用的治疗耙点。结论在许多种疾病状况中看到，心肌纤维化是心脏疾病的重要组成部分。劍门在实验性肾衰模型中的繊标，在这一剝牛下可以看到强A类固醇，例如MBG，在心肌纤维化中可育跑着非常重要的作用。因为MBG的增加很可能伴随着各种容积扩张的瞎况，我们观察结果的含意可以扩展至并发于心肌纤维化的其它瞎形。其它包括在腔静脉闭塞期间获得的典型的压力-容量环，它来自于接受了假手术(作i的)、PNx、MBG输注(MBG)和针对MBG-白蛋白结合物进行免疫后进行的PNx(PNx-IM)的大鼠。回归线拟^P收縮期末压容积关系(ESPVR，虚线)以及舒展期末压容积关系(EDPVR，实线)。B，心室横断层面面积3!H色染色法染色的获得自假的、PNx、MBG、和PNx-M动物的组织来确定的(每一组:N=8个动物，对-100测量结果求平均{^^角定每个动物的平均值；数据以8个动物的平均值士SEM表示)。针对(c)胶原-l和(d)平滑肌肌动蛋白(aSMA)对有代表性的心脏组织的免疫组织化学影織行染色。用于c和d的复染齐嘟是苏木精。蛋白质印迹和相应的密度计被分析用于(e)前胶原-1和(f)aSMA的分析。我们注意到同假的相比，胶原-1和aSMA染色^PNx禾tMBG组中更浓密，然而PNx-M染色^i以于假的。相类似他，同假的相比，前胶原和aSMA表达^PNx禾tlMBG动物中大体上更高，然而对MBG的免疫(PNx-IM)削弱了用PNx所看到的变化。e和鹏数据来自于在每一组中N二6的实验并以平均值士SEM表示。假的指的是分离自对照组动物的心脏，PNx指的^PNx，MBG指的^MBG补给，以^PNx-IM指的是^PNx手术前针对MBG进行免疫的动物。*P<0.05，**P<0.01相对于假的，#P<0.01相对于PNx。典型的蛋白质印迹和定量的密度翻是关于(a)TGF-l31，(b)Smad2/3，(c)Smad4，和(d)pSmad2/3。娜来自于每组中N二6的实验并且以平均值士SEM表示。劍门注意至赃所有的4组实验组中有相类似的这些蛋白的表达。典型的关于前胶原的蛋白质印迹和定量的密度数据来自于响应不同剂量的(a)MBG(所郁=10)，(b)MBG10nM，与不同齐(J量的G毒毛旋花(0.1至lj100nM)和地高辛(10nM，所有N二8)相对照。c，G毒毛旋花敏感的Rb摄取f^MBG和G毒毛旋花浓度的函数(^MBG和G毒毛旋花的^浓度下N二4;数据表示为占对照组的分数)。d，在即将进行以及不进行胶原酶消化的基质和上清液中掺入相关脯氨酸(完整组)。每一组(对照组和不同齐懂的MBG)包括N=7份复制样品。总的组和胶原酶消化后的实验组之间的区别即为胶原。基质是除去上清液并且刮^i咅养皿后得到的样品。e，办ffiG-处理过(lOnM;N=8)自照组(N=8)的成纤维细胞中的胶原l的mRNA。f，在方文线菌酮处理后的前胶原的稳定性。时间0为用放线菌酮培育1小时后(2(^g/mL)。密度计的数据以对数尺度表示。最小二乘方回归线拟合于对照组(CTL)禾PMBGf^。条状f^图^^平均值士SEM。*P<0.05和WPO.OI相对于对照组。我们也已经发现了PP2(l拜oI/L)、除莠霉素(ljnmoI/L)、AG1478(250nM)禾nN-乙酰半胱氨酸(2.5醒ol/L)作用于MBG(10nM)对前胶原敏的、麟。在给予PP2、除莠霉素、AG1478(250nM)禾ON-乙酰半胱氨酸2小时后，加AMBG并继续进行24小时的MBG培育(总共26小时)。*条状图代^11=8的实验的平均值土SEM。b，PP2(l拜oI/L)禾nN-乙酰半胱氨酸(2.5匪o]/L)作用于MBG-、麟的脯氨酸掺入胶原。再一次，在暴露于MBG2个小时前，加APP2禾nN-乙酰半胱氨酸。*条状图^1=5的实验的平均值士SEM。c，MBG10nM^SYF禾口SYF+细胞中的前胶原含量的影响。典型的蛋白质印迹被显示在定量数据之上。SYF印迹加载了15昭蛋白禾nSYF+印迹加载了10呢蛋白。每个条形图代表在每一组中N-6次测定的平均值士SEM。**P<01.10相对于对照组。利用蛋白质印迹测^MBG(l和10nM)附GF-p、Smad2/3、Smad4和pSmad2/3表达的24小时作用。b和c，MBG(10nM)、TGF-ll(5ng/mL)禾口TGF-(3受体拮抗剂SB431542(100(l,o]ZL)对前胶原-l表达(蛋白质印迹)以及方效、t标记的脯氨酸掺入的24小时作用也各自被进行。在暴露于TGF-I3^MBG2小时前加入SB431542(总共暴露26小时)。每个条形图代表6到8次的测定值的平均值士SEM。*P<0.05，**P<0.01相对于对照组。，的本发明详述是为了解释本发明而给出的。对于本领域的技术人员来说显而易见地，在没有脱离本发明的范围内可以进fi1艮多变化和修改。相应地，，的整个说明书是为了分析说明而并没有限定的意思。本发明的范围仅仅由所附纟又利要求书确定。权利要求1.一种组合物，包含药理有效量的在药学或化妆品可接受载体中的至少一种将刺激Na/K-ATP酶信号的Na-K-ATP酶配体。2.根据^l利要求1的组合物，其中所述配体为至少一种与Na-K-AIP酶结合的强心类固醇或它的衍生物。3.根据丰又利要求2的组合物，其中所述类固醇为卡烯内酯或蟾蜍二烯羟酸内酯。4.根据权利要求2的组合物，其中所述类固醇来自任一植物、动物，是半合成的或合成的。5.根据权利要求l的组合物，其中所述组合物为选自片剂、丸剂、悬浮剂片剂、粉剂、锭剂、囊剂、扁胶囊、酏剂、悬浮剂、乳液、溶液、糖浆、气雾抓油膏、^!^囊、禾口石赚囊、栓剂、霜剂、洗剂、溶液、MK禾嗍剂的齐趣。6.根据权利要求1的组合物，其中所述组合物作为Na/K-ATP謝言号体的刺激物而发挥作用。7.根据权禾腰求l的组合物，其中所述组合物诱导Na/K-ATP酶与脂质、蛋白激酶、磷酸酶、离子通道、运载体以及其它可溶性蛋白和膜蛋白的相互作用以形成各种被称为Na/K-ATP酶信号体的信号复合物。8.在需要治疗皮肤病的患者中预防j^夫病的发展或治疗皮肤病的方法，包括向患者会t予治疗有效量的权利要求1的组合物的步骤。9.根据权利要求8的方法，包括通过局部会纤或注射^^所述药物组合物来增强皮肤成纤维细胞胶原生成以预防,转与老化相关的肤色损耗的步骤。10.根据权利要求8的方法，包括使用药物组合物作为对伤口闭合的局部或全身的增强作用的步骤。11.一种药物组合物，包括药理有效量的在药学可接受载体中的至少一种Na/K-ATP酶信号的抑制剂。12.根据权利要求11的组合物，其中所述抑制剂阻断配体-Na/K-ATP酶相互作用或Na/K-ATP酶与其信号偶配体的相互作用。13.根据权利要求12的组合物，其中所述信号偶配体为Src激酶、Src家族激酶和EGF受体、P13激酶或小窝蛋白-1o14.根据权利要求u的药物组合物，其中所^ia合物为选自片剂、丸剂、^L悬液片剂、粉剂、锭剂、囊剂、扁胶囊、酏剂、悬浮剂、乳液、溶液、糖浆、气雾剂、油膏、软胶囊和硬胶囊、栓剂、霜剂、洗剂、溶液、^赚和糊齐啲剂型。15.根据权利要求14的药物组合物，其中所fe^且合物通过Na/K-ATP酶而发挥作为信号转导的阻断齐啲作用。16.根据权利要求11的药物组合物，其中所i^且合物参与剛旨质、蛋白激酶、磷酸酶、离子通道、运载体以及其它可溶性蛋白和膜蛋白的相互作用以抑制ffiil被称为Na/K-ATP,号体的信号复合物的形成和/或信号传导。17.在需要治疗皮肤病的患者中治疗皮肤病的方法，包括向患者给予治疗有效量的权利要求16的组合物的步骤。18.根据禾又利要求11的方法，包括将所述药物组合物用作局部或注射给药工具以逆转或预防过度的皮肤瘢痕形成。19.抑制需要治疗的患者中组织纤维化的方法，包括向患者会合予治疗有效量的丰又利要求11的组合物的步骤。20.根据^R利要求19的方法，其中所述组织纤维化为心脏、肾脏或肝纤维化。21.根据权利要求19的方法，其中所述患者需要对系统性纤维化病症、局部性纤维化病症、进纟亍性心力衰竭或进纟亍性肾脏疾病进4亍治疗。22.根据权利要求21的方法，其中所述系统性纤维化病症为硬皮病。23.根据权利要求21的方法，其中所述局部性纤维化病症为由于病毒性或酒精性肝炎而引起柳干硬化。24.根据权利要求21的方法，其中所皿行性心力衰竭伴随有肾脏疾病或动脉粥样硬化。25.根据权利要求21的方法，其中所^ia行性肾脏疾病来自于肾小球肾炎、糖尿病或高血压。全文摘要本方法涉及在药学可接受载体中的将会刺激Na/K-ATP酶信号的Na-K-ATP酶配体的药物组合物。在一个实施方式中，这个组合物可以用于治疗皮肤病。在另一个实施方式中，这个组合物可以用于阻止心肌纤维化。文档编号A61P9/04GK101374571SQ200780003862公开日2009年2月25日申请日期2007年1月30日优先权日2006年1月31日发明者J·I·沙皮罗,谢子建申请人:托莱多大学