专利名称：新型疫苗载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用了具有膜融合性脂质膜的脂质体的新型疫苗载体。
背景技术：
动物的免疫系统具有识别本体和非本体，并将非本体从体内排除这样的功
能。这种对本体和非本体进行区别的生物体内的免疫反应，通过利用I类MHC (主要组织相容性复合体)分子的细胞免疫，以及利用II类MHC分子的体 液免疫来承担。例如在被作为传染性病原体的病毒或细菌感染时，生物体就使 用这些细胞免疫或体液性来排除这些传染性病原体。
作为对于这样的传染性病原体的预防手段，经常利用的是疫苗接种。无论 是在人类中，还是在家畜动物和宠物中， 一直在利用种类非常多的疫苗。
这些疫苗被大致分为两种类型，即灭活疫苗(也包括类毒素疫苗)和减毒 疫苗。灭活疫苗是用福尔马林或其他的化学处理使病原体或类毒素失去传染 性，以灭活的形接种的疫苗，或者只接种病原体的抗原部分的疫苗，例如， 人体的疫苗中，三联疫苗(白喉、破伤风类毒素、百日咳)、日本脑炎疫苗、 流感疫苗、破伤风类毒素疫苗等就是这种类型。另一方面，减毒疫苗是接种毒 性弱但还有传染性的病原体，即天然存在的弱毒林或人为制造的弱毒变异抹的 疫苗，例如人体的疫苗中，BCG疫苗、脊髓灰质炎疫苗、麻渗疫苗、风渗疫 苗、腮腺炎疫苗、水痘疫苗(水疱渗疫苗)等就是这种类型。
就灭活疫苗来说，作为疫苗接种的结果，真有由病原体引起感染的可能性 低、难以产生副作用的优点，另一方面，具有只能获得体液免疫的特征。另一 方面，减毒疫苗的情形中，由于使用活着的病原体，因此，存在可能因某些原 因恢复毒性而产生副作用的缺点。并且，除了一部分经口接种的减毒疫苗(例 如，脊髓灰质炎疫苗)的情况外，通常疫苗是通过肌肉注射来接种的，因此， 存在虽然IgG抗体的抗体效价上升，但是其他类的抗体(例如，IgA和IgM) 的抗体效价并不上升的问题，另外，也存在不能充分诱导对于防止感染非常重
要的细胞免疫应答的问题。
传染性病原体的感染是开始于病原体从鼻子、气管、肠道、眼睛等的粘膜 表面侵入体内，因此如果可以通过疫苗接种来诱导细胞免疫的话，则可以在边 界防御病原体向体内的侵入。但是，生物体的粘膜覆盖着口腔、鼻腔、消化管 和生殖器等的管腔表面和眼睛的粘膜表面，在其表面上，对于不断暴露的病毒、 细菌等病原微生物、食饼性抗原、异物，以分泌型IgA和粘膜附属淋巴组织为 主体的粘膜免疫发挥功能。该粘膜免疫发挥着抑制来自粘膜面的蛋白质抗原的 吸收，阻止细菌或病毒对粘膜上皮的吸附，中和感染上皮细胞的病毒等多种作 用，防止这些异物侵入体内。
但是，如上所述，以往多数的免疫接种存在的问题有IgG抗体以外的类 型的抗体(例如，IgA和IgM)的抗体效价不上升，而且也不能充分诱导细胞 免疫应答，因此，对于作为传染性病原体的感染部位的粘膜表面来说，不能有
的问题，进行了这样的研究，即考虑通过经口免疫或经鼻免疫等经由粘膜表面 来接种抗原，从而可以在全身性和全身的粘膜表面上诱导抗原特异性免疫应 答。
为了赋予这样的粘膜免疫，进行了使脂质体中含有抗原并将其作为疫苗接
种于粘膜的尝试。例如，就鸡而言，将肠炎沙门氏菌血清型(&/附0"6//"6"^^(3
S6rovar Enteritidis)抗原作为免疫原来包含于脂质体中，将该脂质体滴入鸡的 眼中，从而显示出可以诱导全身性的免疫应答，防止肠炎沙门氏菌血清型从肠 道内腔侵入(非专利文献1和非专利文献2)。
但是，在疫苗制造的领域中， 一直在要求开发出一种疫苗载体，该疫苗载 体能够进一步有效地提高各种类型抗体的抗体效价(体液免疫应答)和细胞免 疫应答。
3一专矛j文献 1: Fukutome, K., et al., Developmental and Comparative Immunology (发育与比较免疫学)，25， 2001, 475-484
非专利文献2: Li, W.， et al.， Developmental and Comparative Immunology (发育与比较免疫学),28， 2004, 29-38
发明内容
发明要解决的课题
本发明的课题是制造新型的疫苗载体，该新型的疫苗载体可以用于制造能 有效诱导体液性和细胞免疫应答的疫苗。本发明的课题还在于提供能有效地诱 导体液性和细胞免疫应答的疫苗。
解决课题的手段
本发明的发明人等发现，通过使用含有膜融合性脂质(琥珀酰化聚缩水甘 油)的脂质体，可以解决上述课题，从而完成本发明。即，本发明通过提供由 含有琥珀酰化聚缩水甘油的脂质体构成的疫苗载体，可以解决上述课题。
发明效果
通过使用上述的由含有琥珀酰化聚缩水甘油的脂质体构成的疫苗载体来 制作疫苗，与使用由以往的脂质体所构成的疫苗载体的情形相比，可以得到能 显著提高抗体效价的高效的疫苗。另外，通过使用上述的疫苗载体来制作的疫 苗，不仅可以有效地诱导体液免疫，还可有效地诱导细胞免疫。
图1是表示将由OVA-SucPG-脂质体所形成的疫苗、由OVA-脂质体所形 成的疫苗以及只由OVA所形成的疫苗对BALB/c小鼠的腹腔内进行免疫时， 血清中的OVA特异性的IgM抗体、IgG抗体以及IgE抗体的抗体效价的图。
图2是表示将由OVA-SucPG-脂质体所形成的疫苗、由OVA-脂质体所形 成的疫苗以及只由OVA所形成的疫苗对BALB/c小鼠的腹腔内进行免疫时， 血清中的OVA特异性的IgG抗体的亚型(IgGl、 IgG2和IgG3 )的抗体效价 的图。
图3是表示经鼻免疫时的肠液中的抗体类型诱导的结果的图。
图4是表示对由OVA-SucPG-脂质体所形成的疫苗进行腹腔内免疫的小鼠 的脾脏淋巴细胞中的IFN-y基因和IL-4基因的mRNA的表达，利用RT-PCR 法进行调查的结果的图。
图5是表示将由OVA-SucPG-脂质体所形成的疫苗进行腹腔内免疫的小鼠 的脾脏淋巴细胞培养基上清液中的IFN-y和IL-4的定量结果的图。
图6是表示将由OVA-SucPG-脂质体所形成的疫苗、由OVA-脂质体所形 成的疫苗以及只由OVA所形成的疫苗对BALB/c小鼠的腹腔内进行免疫时，
血清中的OVA特异性的IgM抗体、IgG抗体以及IgE抗体的抗体效价的图。
图7是表示将由OVA-SucPG-脂质体所形成的疫苗、由OVA-脂质体所形 成的疫苗以及只由OVA所形成的疫苗对BALB/c小鼠的腹腔内进行免疫时， 血清中的OVA特异性的IgG抗体的亚型(IgGl、 IgG2和IgG3 )的抗体效价 的图。
图8是表示对由OVA-SucPG-脂质体所形成的疫苗进行腹腔内免疫的小鼠 的脾脏淋巴细胞中的IFN-y基因和IL-4基因的mRNA的表达，利用RT-PCR 法进行调查的结果的图。
图9是表示将由OVA-SucPG-脂质体所形成的疫苗进行腹腔内免疫的小鼠 的脾脏淋巴细胞培养基上清液中的IFN-y和IL-4的定量结果的图。
图10是表示对将由肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗，通过滴眼接种来进行免疫的鸡的血中抗体的抗体效价的
结果的图。
图11是表示对将由锥虫(Trypanosoma brucei)的抗原-SucPG-脂质体所 形成的疫苗，通过经鼻接种来进行免疫的小鼠的血中抗体的抗体效价的结果的 图。
图12是表示对将由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )的抗原画 SucPG-脂质体所形成的疫苗，通过经鼻接种来进行免疫的牛的血中抗体的抗 体效价的结果的图。
图13是表示对将由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )的抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗，通过经鼻接种来进行免疫的牛的乳汁中抗体的 抗体效价的结果的图。
图14是表示对将由杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗，通过经口接种来进行免疫的鲤鱼的血中抗体的 抗体效价的结果的图。
图15是表示对将由杀鲑气单胞菌的抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗， 通过经口接种而免疫的鲤鱼的肠液中和胆汁中抗体的抗体效价的结果的图。
图16是表示将由杀鲑气单胞菌的抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗，通 过经口接种而免疫的鲤鱼的生存率的变化的图。
图17是表示对将由鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum )的抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗，通过经鼻接种而免疫的小鼠的血中抗体的抗体 效价的结果的图。
图18是表示对将由新城疫病毒的抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗，通 过经鼻接种而免疫的小鼠的血中抗体的抗体效价的结果的图。
具体实施例方式
如上所述，本发明的特征在于提供由含有琥珀酰化聚缩水甘油的脂质体构 成的疫苗载体。使用由该脂质体构成的疫苗载体时，不管脂质体中含有的免疫 原是灭活疫苗还是减毒疫苗，也不管什么样的接种途径，都不仅可以提高IgG 抗体的抗体效价，而且也可以提高其他类型抗体的抗体效价，并且，不仅可以 诱导体液免疫，还可"i"导细胞免疫。
使用本发明的由含有琥珀酰化聚缩水甘油(SucPG)的脂质体构成的疫苗
在化来实现的。即，通过使用本发明的疫苗载体，可以使脂质体的内腔含有免 疫原，因此，能够使免疫原在抗原提呈细胞内部进行内在化。其结果，组入抗 原提呈细胞中的免疫原作为本体成分与I类MHC分子结合，并作为抗原表达 在抗原提呈细胞表面上，结果诱导细胞免疫。
这里，所说的琥珀酰化聚缩水甘油(SucPG)是两亲化合物，其特征在于， 具有烷基。由于具有烷基，因此SucPG能够锚定在脂质体膜上。SucPG的烷 基的碳原子数可以是6 24,更优选碳原子数6 18的烷基。最优选烷基是碳原 子数10的正癸基。SucPG具有与两亲性的聚乙二醇类似的主链骨架，并在侧 链上具有羧基，因此具有的特征为，在中性环境下脂质体膜稳定，但在酸性环 境下侧链羧基被质子化而引起膜融合。通过将该SucPG组入脂质体膜，该脂 质体(SucPG-脂质体)在酸性环境下体现出膜融合能力。就是说，SucPG-脂 质体通过内吞作用被组入抗原提呈细胞时，溶酶体内的pH降低。此时，SucPG-脂质体发挥膜融合性，与溶酶体膜融合，可以将封入的抗原物质释放于细胞质 内(抗原的内在化)。
在本发明中使用的SucPG，可以通过将合成高分子聚缩水甘油与琥珀酸酐 在N,N-二曱基曱酰胺中，于80。C反应6个小时来制作。
本发明的特征为，对于构成在疫苗载体中使用的脂质体的脂质，添加琥珀 酰化聚缩水甘油。更具体地，本发明的疫苗载体中，相对于构成脂质体的脂质，
含有的琥珀酰化聚缩水甘油为10 40重量％,优选为20-35重量％,特别优选 为30重量％。
本发明的疫苗载体可以用于将脂质体内部所含有的免疫原经粘膜接种。在 本发明中，说到"粘膜"时，是指覆盖消化器、呼吸器、泌尿生殖器等的管腔 脏器的内腔面的部位的总称，其自由面经常被来自粘液腺和杯状细胞的分泌物 润湿。作为可以应用本发明的疫苗载体的粘膜，有口腔、咽喉、鼻腔、耳腔、 结膜嚢、阴道、胆门等。通过对这些粘膜面应用含有免疫原的脂质体，可以使 免疫原经由粘膜面进入体内。
本发明的疫苗载体也可以用于通过非经粘膜方式接种来传送疫苗载体的 脂质体内部所含有的免疫原。在本发明中，说到经粘膜以外的途径时，包括将 疫苗载体的脂质体的内部所含有的免疫原进行腹腔内接种等。例如，当腹腔内 接种免疫原时，可以从腹腔内的胃肠道、生殖器、肝脏、胰腺等脏器表面，将 免疫原取入体内。这样将免疫原投入体内，则可以使免疫原被组入到体内到处 存在的抗原提呈细胞。
作为构成本发明的脂质体的脂质，可以举出例如磷脂酰胆碱类、磷脂酰乙 醇胺类、磷脂酰丝氨酸类、磷脂酸类或长链烷基磷酸盐类、或者磷脂酰甘油类、 胆固醇(Chol)类等。本发明中制作脂质体时，可以单独使用这里列举的脂质， 或者将它们之中的两种以上进行组合来使用
磷脂酰胆碱类在作为构成本发明的脂质体的脂质来使用时，优选为二肉豆 蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、 二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、 二硬脂酰磷脂酰 胆碱(DSPC)、 二油基磷脂酰胆碱(DOPC)、蛋黄磷脂酰胆碱(eggPC)等。
磷脂酰乙醇胺类在作为构成本发明的脂质体的脂质来使用时，优选二油基 磷脂酰乙醇胺(DOPE)、 二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)等。
另夕卜，磷脂酰丝氨酸类在作为构成本发明的脂质体的脂质来使用时，优选 二油基磷脂酰丝氨酸(DOPS)、 二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)等。
磷脂酸类或长链烷基磷酸盐类作为构成本发明的脂质体的脂质来使用时，
优选二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、双十六烷基磷酸 等。
磷脂酰甘油类作为构成本发明的脂质体的脂质来使用时，优选二肉豆蔻酰 磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油等。
在上述列举的化合物中，优选使用DOPE、 DPPC、 DSPC、 DPPS、 DSPE、 Chol等。
混合上述脂质来使用时，各脂质的配合比例可以通过期望的脂质体尺寸， 期望的流动性等来适当地决定。在本发明中，优选以DOPE:DPPC为1:1的比 例进行混合来制作脂质体。
脂质体根据其结构或制作方法，被分类为MLV (multilamellar vesicles: 多层脂质体)、DRV ( dehydration-rehydration vesicles:脱水-再水化脂质体)、 LUV (large umilamellar vesicles: 大单层月旨质体)或SUV ( small unilamellar vesicles:小单层脂质体)等。本发明的含有琥珀酰化聚缩水甘油(SucPG)的 脂质体，也存在以多层膜构成的MLV、 DRV、 LUV或SUV等种类。
制作含有SucPG的脂质体时，只要是以往所知的脂质体的制造方法即可， 可以使用任何方法。作为脂质体的制造方法，在所属技术领域中，此前已知有 各种方法。
例如，作为通常的脂质体的制造方法，可以举出(l)使脂质溶解于适当 的有机溶剂(例如，氯仿、醚等)，在减压条件下蒸馏除去这些溶剂，暂时形 成脂质薄膜后，利用机械搅拌设备使该脂质薄膜在水中水合(或膨润)的方法；
(2)使脂质溶解于醚或乙醇等有机溶剂中，用注射器或喷嘴等，将该溶液在 加压下以 一定速度注入加热至高温的水中，在注入的同时有机溶剂被蒸馏除去 或者被稀释，脂质形成双层，从而制备脂质体的方法；(3)将脂质与胆酸或脱 氧胆酸等表面活性剂在水溶液中混合来形成胶束，对该胶束溶液通过透析或凝 胶过滤等操作除去胆酸或脱氧胆酸等表面活性剂，从而制备脂质体的方法；
(4)将溶解有脂质的有机溶剂加入水相中，通过超声波处理，暂时形成W/O 型乳液,接着通过除去有机溶剂使其凝胶化，对该凝胶通过机械搅拌进行转相， 从而制备脂质体的方法；(5 )向形成薄膜的脂质中加入水系溶剂使其水合.膨 润，通过机械振动从容器中剥离脂质薄膜后，通过超声波处理或釆用细胞破碎
仪、加压过滤器或淋膜机来通过一定大小的孔，从而制作脂质体的方法；(6)
将脂质体冷冻干燥后，用水系溶剂进行再水合，从而制作脂质体的方法等。 为了添加免疫增强活性，本发明的疫苗载体可以进一步含有佐剂。作为本
发明的疫苗载体中可含有的佐剂，可以举出单磷酸类脂A、细胞因子、凝集素等。
本发明的疫苗载体中含有的免疫原并无特别限制，可以含有人类或动物 (哺乳动物、鱼类等)希望疫苗接种的免疫原中的任一种。作为免疫原，含有 来自细菌的免疫原、来自病毒的免疫原、来自原虫的免疫原等。
例如，本发明的疫苗载体应用于人类的免疫原时，疫苗载体可以含有作为
来自病毒的免疫原的流感病毒抗原、SARS病毒抗原、AIDS病毒抗原等中的 任一种，作为来自细菌的免疫原的病原性大肠杆菌0-157抗原、沙门氏菌抗原、 金黄色葡萄球菌抗原、气单胞菌抗原、结核菌抗原等中的任一种，作为来自原 虫的免疫原的锥虫抗原、球虫抗原、疟疾抗原、泰勒虫(theileria)抗原等中 的任一种。
本发明的疫苗载体应用于动物的免疫原时，可以含有来自作为家畜的传染 症的重要的传染病原体的抗原中的任一种，例如应用于鸡的场合中，可以含有 作为来自细菌的免疫原的肠炎沙门氏菌血清型抗原、副鸡嗜血菌(Haemophilus pamgallinarum)抗原等、作为来自病毒的免疫原的禽流感病毒抗原、新城疫病 毒抗原、传染性支气管炎病毒抗原等、作为来自原虫的免疫原的住白细胞原虫
(leucocytoaoon)抗原、艾美耳球虫(eimeria)抗原等；应用于猪的场合中， 可以含有作为来自病毒的免疫原的传染性肠胃炎病毒抗原、作为来自细菌的免 疫原的支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)抗原、作为来自原虫 的免疫原的弓形虫(toxoplasma)抗原、艾美耳球虫抗原等；应用于牛的场合 中，可以含有作为来自病毒的免疫原的牛病毒性腹泻.粘膜病病毒抗原、作为 来自细菌的免疫原的金黄色葡萄球菌抗原、鸟分枝杆菌副结核亚种
(Mycobacterium avium via paratuberculosis) #元原、"f卡为来自原虫的免疫原的 泰勒虫抗原、焦虫(babesia)抗原等；应用于马的场合中，可以含有作为来自 病毒的免疫原的马鼻肺炎病毒抗原、马流感病毒抗原、作为来自原虫的免疫原 的锥虫抗原、焦虫抗原等；应用于鱼类的场合中，可以含有作为来自细菌的免
疫原的弧菌抗原、气单胞菌抗原等、作为来自病毒的免疫原的传染性胰脏坏死
症病毒抗原、虹彩病毒(iridovirus )抗原等、作为来自原虫的免疫原的鱼波豆 虫原虫抗原、六鞭毛虫原虫抗原等。 实施例
实施例1:琥珀酰化聚缩水甘油(SucPG)脂质体的制作
作为含有SucPG的脂质体，向二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC ) ( Sigma)和 二油基磷脂酰基乙醇胺(DOPE) (Sigma)的摩尔比1:1 (各l(H救摩尔)形成 的脂质组合中，添加脂质重量比为10%、 20%或30°/0的SucPG，制作出3种 SucPG浓度不同的含有SucPG的脂质体。在本实施例中使用的SucPG，具有 碳原子数10的正癸基作为烷基,根据文献中记载的方法进行合成得到的(Kono K.等人,J. Controlled Release, 68, 225-235(2000); Kono K.等人,Biochim. Biophys.Acta (生物化学与生物物理学报)，1325, 143-154(1997);或者Kono K. 等人,Biochim. Biophys. Acta (生物化学与生物物理学报)，1193,1-9(1994))。 具体来讲，通过使聚表氯醇在二曱基曱酰胺中，于醋酸钾存在下在175。C反应 6小时，来制作乙酸聚缩水甘油酯，使制成的乙酸聚缩水甘油酯进一步在曱基 卡必醇中，于醋酸钾存在下，在150。C反应一个小时，从而合成聚缩水甘油。 使这样合成的高分子聚缩水甘油与琥珀酸酑在N，N-二甲基甲酰胺中，在80°C 反应6个小时，从而制作出SucPG。
脂质体的制作按照例如专利文献l所述的方法来制造。具体来讲，首先， 将2微摩尔的DPPC、 2微摩尔的DOPE和SucPG溶解于有机溶剂中，在锥形 烧瓶中进行混合。使用旋转蒸发器来干燥该脂质，并且，在减压条件下于干燥 器中静置30分钟。添加4mg/ml的卵清蛋白(OVA)作为模型抗原，在35~40 。C下孵育3分钟后，进行激烈的振动搅拌，从而使脂质膜分散。这样，将模型 抗原OVA封入脂质体中。另一方面，通过反复在4。C下进行20分钟的14000g 的离心处理，来除去未封入脂质体中的OVA,精制出封入有模型抗原OVA的 脂质体。这样，制作出多层型的脂质体(OVA-SucPG-脂质体)(MLV)。
实施例2:将由琥珀酰化聚缩水甘油(SucPG)脂质体所形成的疫苗经粘 膜接种时的免疫应答的研究
本实施例的目的是对将在实施例1中制作的含有SucPG的脂质体所形 成的疫苗经粘膜接种时的免疫应答，与不含SucPG的脂质体所形成的疫苗进
行比较研究。
含有SucPG的脂质体所形成的疫苗，按实施例1所述的方法来制作。另 一方面，作为不含SucPG的脂质体所形成的疫苗，通过以DPPC:DOPE的摩 尔比为1:1的脂质组成来封入OVA，从而制作出由多层型的脂质体(OVA-脂 质体)(MLV)所形成的疫苗。
将上述制作的OVA- SucPG-脂质体所形成的疫苗和OVA-脂质体所形成的 疫苗、以及只由OVA所形成的疫苗分别以经鼻的方式接种给BALB/c小鼠， 相隔7天接种2次，每次OVA的用量为lOOitig/只。
免疫原最终接种后的7天后，从眼窝静脉丛采取0.1ml的血液，使用从该 血液回收的血清，通过ELISA法对抗OVA抗体(IgM、 IgG或IgE )的产生进 行研究。另外，最终接种后的7天后，采取肠液，通过ELISA法对抗OVA抗 体(IgM、 IgG或IgE)的产生进行研究。进一步，使用得到的免疫血清，利 用ELISA法对于抗OVA-IgG的亚型进行解析。
结果示于图1~图3中。图1表示针对将OVA- SucPG-脂质体所形成的疫 苗和OVA-脂质体所形成的疫苗、以及只由OVA所形成的疫苗经鼻接种给 BALB/c小鼠时的免疫应答，血清中的抗体类型诱导的结果，黑色柱表示只免 疫OVA的情况(OVA )的结果，灰色柱表示免疫OVA-脂质体的情况(OVA-Upo ) 的结果，白色柱表示免疫OVA-SucPG-脂质体的情况(OVA-SucPG-lipo )的情 况的结果。图2进一步表示血清中诱导的抗OVA-IgG抗体的亚型。图3表示 经鼻免疫时的肠液中的抗体类型诱导的结果。在图2和图3中，关于各柱的免 疫抗原的说明，与图l所述的说明相同。
从图1所示的结果可知，在BALB/c小鼠的鼻腔内免疫各种免疫原时，IgA 和IgG类抗体在体内生成，整体上IgG类抗体的产生量比IgA类抗体多。另 外，对于各类抗体，将疫苗载体的种类和产生的抗体量进行对比后，显示的结 果为与免疫只由OVA形成的疫苗或OVA-脂质体形成的疫苗的情况相比， 采用OVA-SucPG-脂质体得到的疫苗进行免疫时，可以显著有效地诱导抗体产 生(p<0.0027)。
另外，从图2所示的结果可知，采用OVA-SucPG-脂质体形成的疫苗进行
免疫时，不仅可以诱导IgGl，还可诱导IgG2a和IgG3，其中，IgGl是Th2 (体 液免疫)类型的IgG亚型，IgG2a和IgG3是Thl (细胞免疫)类型的IgG亚 型。与此相对，采用OVA-脂质体所形成的疫苗进行免疫时，以及采用只由OVA 所形成的疫苗进行免疫时，基本上只能产生IgGl;关于该IgGl抗体的产生量， 也显示出，使用由OVA-SucPG-脂质体所形成的疫苗进行免疫时，与使用由其 他的疫苗载体所形成的疫苗(由OVA-脂质体所形成的疫苗或只由OVA所形 成的疫苗)进行免疫时相比，可以显著有效地诱导抗体产生(p<0.011)。
此外，图3显示出，当以经鼻腔方式使用由OVA-SucPG-脂质体所形成的 疫苗时，与由OVA-SucPG-脂质体所形成的疫苗相比，可以有效地在肠道中诱 导抗体产生。
因而，通常，将由含有SucPG的脂质体经粘膜接种时，可以对于抗原提 呈细胞有效地进行抗原导入，其结果，可以诱导高水平的血中的抗体产生以及 高水平的肠道中的抗体产生，并且，不仅可以诱导体液免疫，还可以诱导细胞 免疫应答。
实施例3:含有SucPG的脂质体所形成的疫苗经粘膜投用带来的细胞免疫 应答的诱导
在实施例2中，显示出使用含有SucPG的脂质体所形成的疫苗，通过经 粘膜接种抗原来进行免疫，有诱导细胞免疫应答的可能性，因此，在本实施例 中，对使用含有SucPG的脂质体所形成的疫苗时的细胞免疫应答的能力进行 研究。
实施例1制作的OVA- SucPG-脂质体所形成的疫苗经鼻接种给BALB/c小 鼠以，间隔7天接种2次，每次OVA的用量为100吗/只。最终接种后的7天 后，处死小鼠并取出脾脏，通过密度梯度离心法来精制脾脏淋巴细胞。
釆用TRIzol (Invitrogen公司)从精制脾脏淋巴细胞中抽提总RNA，用 RT-PCR法对作为细胞免疫指标的IFN-y和IL-4的mRNA的表达进行调查。
首先，由总RNA来合成cDNA。将总RNA1昭 5吗与寡聚(dT) 12.18引 物500ng、 dNTPMix 10nmol进行混合，使总量为12|il,使其在65。C反应5分 钟，然后在水上迅速冷却。接着，加入4(al的5xFirst-Strand緩冲液(First-Strand Buffer)、 2^1的0.1M DTT、 的RNaseOUT 重组核糖核酸酶抑制剂(40units/|id ) (Invitrogen公司)，在42。C反应2分钟，然后加入200 units的 Superscript II逆转录酶(Invitrogen公司)，进一步在42。C反应50分钟后， 为了1"吏逆转录酶失活，在70。C反应15分钟。
将得到的cDNA 1^1与各引物2.5pmol、 37.5nmol MgCl2、 10nm dNTPMix、 1 unitTaq DNA聚合酶(Invitrogen公司)加入到PCR緩冲液中，使总量为25^1, 用TaKaRaPCR Thermal Cyder MP TP3000(宝生物公司)进行PCR反应。PCR 反应，通过在94。C反应5分钟后，将94。C45秒钟、60°C45秒钟、72。C2分钟 的反应重复35次，然后在72。C反应7分钟来进行。PCR后的样本在2。/。的琼 脂糖凝胶上进行电泳，用溴化乙锭进行染色来实现可视化。
在本实施例中，作为用于扩增小鼠IFN-Y基因的引物，使用 正向引物5，画tgcatcttgg cttgcagctc ttcctcatgg c-3， ( SEQID NO: 1 )，以及 反向引物5，-tggacctgtgggttgttgacctcaaacttggc-3， (SEQIDNO: 2),
并且，作为用于扩增小鼠IL-4基因的引物，使用 正向引物5，-ccagctagttgtcatcctgctcttctttctcg-3， (SEQIDNO: 3), 反向引物5'-cagtgatgtg gacttggact cattcatggt gc-3， ( SEQID NO: 4)(都来自 CLONTEC公司)。用于扩增作为对照的小鼠G3PDH基因的引物，使用 正向引物5'-accacagtcc atgccatcac-3， ( SEQID NO: 5),以及 反向引物5，-tccaccaccctgttgctgta-3， (SEQIDNO: 6)。
图4表示关于IFN-y和IL-4的mRNA的表达的测定结果。在图4中，道 1表示以阳性对照为模板进行RT-PCR的结果，道2表示以来自向腹腔内注射 200^1的生理盐水的阴性对照小鼠的总RNA为模板进行RT-PCR的结果，道3 表示以来自在腹腔内免疫OVA-SucPG-脂质体的阴性对照小鼠的总RNA为模 板进行RT-PCR的结果，道4表示以来自在腹腔内免疫不含OVA的SucPG-脂 质体的阴性对照小鼠的总RNA为才莫板进行RT-PCR的结果。通过图4可知， 在免疫OVA-SucPG-脂质体的小鼠的脾脏淋巴细胞中，作为细胞免疫反应的指 标的IFN-y的mRNA和作为体液免疫反应的指标的IL-4的mRNA这两者都得 到了表达。
另外，在本实施例中，同时用添加OVA的培养基对精制脾脏淋巴细胞培 养5天，对培养基上清液中放出的IFN-y量和IL-4量进行测定作为细胞免疫 和体液免疫的指标。培养基上清液中的IFN-y和IL-4的定量使用各自的定量 试剂盒(Endogen公司)来进行。
图5表示脾脏淋巴细胞培养基上清液中放出的IFN-y量和IL-4量的定量 结果。图5的道1表示来自阴性对照小鼠的脾脏淋巴细胞所产生的IFN-y量和 IL-4量，所述阴性对照小鼠进行了不含OVA的SucPG-脂质体的鼻腔内免疫， 并且，道2表示来自进行了 OVA-SucPG-脂质体鼻腔内免疫的小鼠的脾脏淋巴 细胞所产生的IFN-y量和IL-4量。如图5所示，可以看出在免疫OVA-SucPG-脂质体的小鼠的脾脏淋巴细胞的培养基上清液中，作为细胞免疫反应的指标的 IFN-y和作为体液免疫反应的指标的IL-4这两者，都显著地大量产生 (pO扁l )。
从实施例2和3所示的结果显示出，本发明的含有SucPG的脂质体所形 成的疫苗，通过进行经鼻免疫，不仅能诱导体液免疫，还能诱导细胞免疫，本 发明的含有SucPG的脂质体作为经粘膜疫苗的抗原载体是有用的。
实施例4:由琥珀酰化聚缩水甘油(SucPG)脂质体所形成的疫苗的非经 粘膜接种时的免疫应答的研究
本实施例的目的是，对于将在实施例1中制作的含有SucPG的脂质体所 形成的疫苗进行非粘膜接种时的免疫应答，与不含有SucPG的脂质体所形成 的疫苗进行比较研究。
含有SucPG的脂质体所形成的疫苗，按实施例1所述的方法制作。另一 方面，作为不含SucPG的脂质体所形成的疫苗，以摩尔比1:1的DPPC:DOPE 所形成的脂质组成来封入OVA,从而，制作出多层型的脂质体(OVA-脂质体) (MLV)所形成的疫苗。
将上述制作的OVA- SucPG-脂质体所形成的疫苗和OVA-脂质体所形成的 疫苗、以及只由OVA所形成的疫苗以腹腔接种的方式接种给BALB/c小鼠， 间隔7天接种2次，每次OVA的用量为100j^g/只。
免疫原最终接种后的7天后，从眼窝静脉丛采取0.1ml的血液，使用从该 血液回收的血清，通过ELISA法对抗OVA抗体(IgM、 IgG或IgE )的产生进 行研究。进一步，采用得到的免疫血清，利用ELISA法对于抗OVA-IgG的亚 型进行解析。
结果示于图6和图7中。图6表示针对将OVA- SucPG-脂质体所形成的疫 苗和OVA-脂质体所形成的疫苗、以及只由OVA所形成的疫苗，对BALB/c 小鼠以腹腔免疫时的免疫应答的结果，黑色柱表示只免疫OVA的情况(OVA) 的结果，灰色柱表示免疫OVA-脂质体的情况(OVA-lipo)的结果，并且，白 色柱表示免疫OVA-SucPG-脂质体的情况(OVA-SucPG-lipo )的结果。图7是 表示抗OVA-IgG抗体的亚型的结果，关于各柱的免疫抗原的说明，与图6所 述的说明相同。
从图6所示的结果可知，在BALB/c小鼠的腹腔内免疫各种免疫原时，在 体内生成IgM和IgG类抗体，总体上IgG类抗体的产生量比IgM类抗体多。 另外，对于各类抗体，对比疫苗载体的种类和产生的抗体量可以看出，与免疫 只由OVA所形成的疫苗的情况相比，免疫由OVA-SucPG-脂质体所形成的疫 苗时的抗体产生量多，但是作为t检验结果，并不存在显著性差异，另一方面， 对免疫由OVA -脂质体所形成的疫苗所得情况与采用由OVA-SucPG-脂质体所 形成的疫苗进行免疫的情况相比较，采用由OVA-SucPG-脂质体所形成的疫苗 进行免疫的情况可以显著地有效诱导抗体产生(p<0.019 )。
另外，图7所示的结果显示出，采用由OVA-SucPG-脂质体所形成的疫苗 进行免疫的情况中，不仅可以诱导作为Th2 (体液免疫)类型的IgG亚型的 IgGl,还可以诱导作为Thl (细胞免疫)类型的IgG亚型的IgG2a和IgG3。 与此相对，釆用由OVA-脂质体所形成的疫苗进行免疫的情况，和采用只由 OVA所形成的疫苗进行免疫的情况中，基本上只产生IgGl;关于该IgGl抗 体的产量，也显示出采用由OVA-SucPG-脂质体所形成的疫苗进行免疫的情况， 与采用由其他的疫苗载体所形成的疫苗(由OVA-SucPG-脂质体所形成的疫苗 或只由OVA所形成的疫苗)进行免疫的情况相比，可以显著有效地诱导抗体 产生。
因而，通常将由含有SucPG的脂质体所形成的疫苗进行非经粘膜接种时， 对抗原提呈细胞可以实现高效的抗原导入，结果显示出，可以诱导高的抗体产 生，并且不仅是体液免疫，还有进行细胞免疫应答的诱导的可能性。
实施例5:通过由含有SucPG的脂质体所形成的疫苗的非经粘膜接种，来 诱导细胞免疫应答
在实施例4中显示出，通过采用含有SucPG的脂质体来免疫抗原，存在
进行细胞免疫应答的诱导的可能性，因此，在本实施例中，对采用含有SucPG
的脂质体时的细胞免疫应答能力进行研究。
将实施例1中制作的OVA- SucPG-脂质体以腹腔接种的方式接种给 BALB/c小鼠，间隔7天接种2次，每次OVA的用量为100昭/只。最终接种 后的7天后，处死小鼠并取出脾脏，通过密度梯度离心法来精制脾脏淋巴细胞。 对这样制备的脾脏淋巴细胞，如实施例3所述的那样，用RT-PCR法测定IFNi 和IL-4的mRNA表达，用ELISA法测定培养基上清液中放出的IFN-y量和IL-4 量。
图8表示对IFN-y和IL-4的mRNA表达的测定结果。在图8中，道1表 示以来自在腹腔内免疫OVA- SucPG-脂质体的小鼠的总RNA为模板进行 RT-PCR的结果，道2表示以阳性对照为模板进行RT-PCR的结果，道3表示 以来自阴性对照小鼠的总RNA为模板进行RT-PCR的结果，所述阴性对照小 鼠是指在腹腔内免疫不含OVA的SucPG-脂质体的小鼠，道4表示以来自在腹 腔内注射200W的生理盐水的阴性对照小鼠的总RNA为模板进行RT-PCR的 结果。如图8所示，可以看出在免疫OVA-SucPG-脂质体的小鼠的脾脏淋巴细 胞中，作为细胞免疫反应指标的IFN-y的mRNA和作为体液免疫指标的IL-4 的mRNA这两者都得到了表达。
另外，图9表示在脾脏淋巴细胞培养基上清液中放出的IFN-y量和IL-4 量的定量结果。图9的道1表示来自阴性对照小鼠的脾脏淋巴细胞所产生的 IFN-y量和IL-4量，所述阴性对照小鼠是指在腹腔内免疫不含OVA的SucPG-脂质体的小鼠，道2表示来自在腹腔内免疫OVA- SucPG-脂质体的小鼠的脾脏 淋巴细胞所产生的IFN-y量和IL-4量。如图9所示，可以看出在免疫OVA-SucPG-脂质体的小鼠的脾脏淋巴细胞的培养基上清液中，作为细胞免疫反应 指标的IFN-y和作为体液免疫指标的IL-4这两者都显著大量产生(p<0,0001 )。
从实施例4和5所示的结果显示出，本发明的由含有SucPG的脂质体所 形成的疫苗，即使进行非经鼻免疫时，也与进行经鼻免疫时同样，不仅诱导体 液免疫，还诱导细胞免疫，本发明的含有SucPG的脂质体，作为非经粘膜疫 苗的抗原载体也是有用的。
实施例6:利用沙门氏菌抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗，对鸡进行滴 眼(经粘膜)免疫
本实施例的目的为将含有肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis )抗原作 为免疫原的含有SucPG的脂质体所形成的疫苗对鸡进行滴眼(经粘膜)接种， 对此时的免疫应答进行研究。
在本实施例中使用的免疫原、肠炎沙门氏菌抗原按以下所述制备。首先， 将肠炎沙门氏菌(1227抹)接种于心浸液培养基(日水制药)，在37。C培养 14小时后，采取7xlO"CUF的肠炎沙门氏菌。对取得的该肠炎沙门氏菌用过 量的福尔马林进行变性，使其灭活，除去福尔马林之后，进一步通过超声波处 理来制备抗原液。这样制备的含有肠炎沙门氏菌抗原的含SucPG的脂质体所 形成的疫苗(由肠炎沙门氏菌抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗)，基本上按照 实施例1所述的方法来制作。
将如上述制作的肠炎沙门氏菌抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗，对5只 出生3周龄的鸡(白色来亨鸡)进行一次滴眼接种，肠炎沙门氏菌抗原的用量 为10(Vg/只。
在给与免疫原后的14天之后(2周(5周龄))，以及35天后(5周(8 周龄))，从翼下静脉采取2.0ml血液，使用从该血液中回收的血清，用ELISA 法对于抗肠炎沙门氏菌抗原抗体(IgG或IgA)的产生进行研究。作为对照， 使用从用肠炎沙门氏菌抗原免疫前(pre (3周龄))的鸡个体所得到的血清。
结果示于图IO中。在图IO中，黑色柱表示针对IgG抗体的抗体效价的结 果(图10A),并且，白色柱表示针对IgA抗体的抗体效价的结果(图IOB)。 与免疫前(0天)的鸡个体中的抗体的抗体效价进行比较，对于存在显著性差 异(p<0.0001 )的情况，标上*记号。数据表示平均土标准误差。
从图IO所示的结果可知，将肠炎沙门氏菌抗原-SucPG-脂质体所形成的疫 苗，对鸡滴眼接种来进行免疫时，与"pre(3周龄)"的情况相比，IgG和IgA 类的抗体这两者在体内都显著地生成，但从长期(免疫原最终接种后的5周(8 周龄))来看，具有IgG类抗体的产生量比IgA类抗体的产生量多的倾向。
该结果显示出，通过将肠炎沙门氏菌抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗进 行滴眼(经粘膜)^接种来免疫鸡时，可以诱导血中的高水平的抗体产生。
实施例7:通过锥虫抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗，对小鼠进行经鼻 (经粘膜)免疫
本实施例的目的为将含有锥虫(trypanosoma brucei)抗原作为免疫原的 含有SucPG的脂质体所形成的疫苗对小鼠进行经鼻(经粘膜)接种，对此时 的免疫应答进行研究。
为了得到在本实施例中使用的免疫原、锥虫抗原，首先，采集锥虫原虫。 采集的方法4姿照文献记载的方法(Lanham， S. M., Nature, 218， 1273-1274 (1968 ))进行。具体地，将锥虫原虫(1 x 105个)接种于Wistar大鼠(日本 SLC)的腹腔内，4天后从心脏回收全血。回收的血液用肝素(10units/ml)来 防止凝固，通过离心(1300xg, 10分钟)处理来回收血沉棕黄层。从回收的 血沉棕黄层，通过DE52纤维素(Whatman公司)抹来精制.采取原虫。通过 将取得的锥虫原虫进行超声波处理，得到锥虫抗原。含有如上述方法得到的锥
虫抗原的含有SucPG的脂质体所形成的疫苗(锥虫抗原-SucPG-脂质体所形成 的疫苗)，基本上按照实施例1记载的方法来制作。
将如上所迷制作的锥虫抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗，对5只出生后 6周龄的Balb/c小鼠(日本SLC)进行经鼻接种，锥虫抗原的用量为100吗/ 只，2周后进一步用等量的锥虫抗原进行经鼻免疫。
免疫原初次接种后的14天后(14天)，以及最终接种后的7天后(21天)， 从眼窝静脉丛采取O.lml的血液，使用从该血液回收的血清，用ELISA法对 抗锥虫抗原抗体(IgG或IgM)的产生进行研究。作为对照，使用从用锥虫抗 原免疫前(0天)的小鼠个体所得到的血清。
结果示于图11中。在图11中，黑色柱表示针对IgM抗体的抗体效价的 结果，白色柱表示针对IgG抗体的抗体效价的结果。与免疫前(0天)的小鼠 个体中的抗体效价相比较，对存在显著性差异(p<0.0012 )的情况标记#记号， 对存在显著性差异(p<0.0006 )的情况标记$记号，对存在显著性差异 (p<0.0001 )的情况标记*记号。数据表示平均士标准误差。
从图11所示的结果可知，将锥虫抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗对小 鼠进行经鼻接种来免疫时，与0天的情况相比，IgM和IgG类的抗体在体内显 著生成，作为整体，具有IgG类抗体的产生量比IgM类抗体多的倾向。
从该结果显示出，通过将锥虫抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗进行经鼻
(经粘膜)接种来免疫小鼠时，可以诱导血中的高水平的抗体产生。
实施例8:利用金黄色葡萄球菌-SucPG-脂质体所形成的疫苗，对奶牛进 行经鼻(经粘膜)免疫
本实施例的目的为将含有金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的 抗原作为免疫原的含有SucPG的脂质体所形成的疫苗疫苗对牛进行经鼻(经 粘膜)接种，对此时的免疫应答进行研究。
本实施例中使用的免疫原、金黄色葡萄球菌抗原如下制备首先将金黄色 葡萄球菌(Cowan I林)接种于LB培养基(日水制药)，在37。C培养14小 时后，收取金黄色葡萄球菌细菌。将收取的该金黄色葡萄球菌细菌用过量的福 尔马林进行变性，使其灭活，除去福尔马林后，进一步通过超声波处理来制备 抗原液。含有这样制备的金黄色葡萄球菌抗原的含有SucPG脂质体所形成的 疫苗(金黄色葡萄球菌抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗)，基本上按照实施 例1所述的方法来制作。
将如上所述制作的金黄色葡萄球菌抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗，对 3头荷斯坦奶牛进行经鼻接种，金黄色葡萄球菌抗原的用量为5mg/头，14天 后进一步用等量的金黄色葡萄球菌抗原进行经鼻接种来免疫。
在免疫原初次接种后的第14天(14天)、免疫原最终接种后的第7天(21 天)和第14天(28天)，从颈静脉采取5ml的血液，使用从该血液回收的血 清，用ELISA法对于抗金黄色葡萄球菌抗原抗体(IgA或IgG)的产生进行研 究。作为对照，使用从用金黄色葡萄球菌抗原免疫前(0天)的奶牛个体所得 到的血清。
结果示于图12中。在图12中，黑色柱表示针对IgA抗体的抗体效价的结 果，白色柱表示针对IgG抗体的抗体效价的结果。与免疫前(O天)的奶牛个 体中的抗体效价相比，对存在显著性差异(p<0.018)的情况标注#记号，对 存在显著性差异(p<0.039)的情况标注&记号，对存在显著性差异(p<0.0076) 的情况标注*记号，对存在显著性差异(p<0.0001 )的情况标注@记号，对存 在显著性差异(p<0.0017)的情况标注卞记号。数据表示平均士标准误差。
从图12所示的结果可知，将金黄色葡萄球菌抗原-SucPG-脂质体所形成
的疫苗对奶牛进行经鼻接种来免疫时，与0天的情况相比，在血中显著生成大 致相同程度的IgG和IgA类的抗体。
另外，在免疫原初次接种后的第14天(14天)、免疫原最终接种后的第7 天(21天)和第14天(28天)，收集乳汁，用ELISA法对于抗金黄色葡萄球 菌抗原抗体(IgG或IgA)的产生进行研究。作为对照，使用从用金黄色葡萄 球菌抗原免疫前(0天)的奶牛个体所得到的乳汁。
结果示于图13中。在图13中，黑色柱表示针对IgA抗体的抗体效价的结 果，白色柱表示针对IgG抗体的抗体效价的结果。并且，与免疫前(0天)的 奶牛个体中的抗体效价相比，对存在显著性差异(p<0.0046)的情况标记#记 号，对存在显著性差异(p=0.054 )的情况标记&记号，对存在显著性差异 (pO.Oll)的情况标记*记号，对存在显著性差异(p0.02)的情况标记@记 号，对存在显著性差异(p<0.025)的情况标记卞记号。数据表示平均士标准误 差。
从图13所示的结果可知，将金黄色葡萄球菌抗原-SucPG-脂质体所形成 的疫苗,对奶牛进行经鼻接种来免疫时，与0天的情况相比，在乳汁中显著地 生成IgG和IgA类的抗体，从整体来看，具有IgA类抗体的产生量比IgG类 抗体多的倾向。
从这些结果显示出，将金黄色葡萄球菌抗原-SucPG-脂质体所形成的疫 苗，进行鼻腔(经粘膜)接种来免疫奶牛时，在血中和乳汁中都可以显著地诱 导高的抗体产生。
实施例9:利用杀鲑气单胞菌抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗，对鲤鱼 进行经口免疫。
本实施例的目的为将含有杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)抗原 作为免疫原的含有SucPG的脂质体所形成的疫苗对鲤鱼进行经口 (经粘膜) 接种，对此时的免疫应答进行研究。
在本实施例中使用的免疫原、杀鲑气单胞菌抗原如下制备首先将杀鲑气 单胞菌(T1031株)接种于心浸液培养基中，在20。C培养24小时后，收集杀 鲑气单胞菌细菌，将收集的该杀鲑气单胞菌细菌用过量的福尔马林进行变性， 使其灭活，除去福尔马林后，进一步进行超声波处理来制备。这样制备出的杀
鲑气单胞菌抗原的 一部分直接作为免疫原，另 一部分制成含有杀鲑气单胞菌抗 原的含有SucPG的脂质体所形成的疫苗。含有灭活的杀鲑气单胞菌抗原的含
有SucPG的脂质体所形成的疫苗(杀鲑气单胞菌抗原-SucPG-脂质体所形成的
疫苗)，基本上按照实施例1所记载的方法来制作。
将如上制作的杀鲑气单胞菌抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗，对6尾鲤 鱼(由大阪府农业和渔业综合技术中心.水性生物中心获得)以2周为间隔， 经口接种3次进行免疫，杀鲑气单胞菌抗原的量为200吗/尾。另一方面，作为 对照，对4尾鲤鱼以2周为间隔，经口接种3次进行免疫，杀鲑气单胞菌抗原 的量为200昭/尾。
在免疫原初次接种时(0天)、第2次接种时(1 4天)、第3次接种时(28 天)和最终4矣种后的14天后(42天)，从尾部采集lml血液，使用从该血液 回收的血清，用ELISA法针对抗杀鮭气单胞菌抗原抗体的产生进行研究。作 为对照，使用从只用杀鲑气单胞菌抗原免疫的鲤鱼个体所得到的血清。
结果示于图14中。在图14中，黑圈( )表示通过杀鲑气单胞菌抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗进行经口免疫的鲤鱼的抗体的抗体效价的结果，黑三角
(▲)表示只通过杀鲑气单胞菌抗原进行经口免疫的鲤鱼的抗体的抗体效价的 结果。与只通过杀鲑气单胞菌抗原进行经口免疫的鲤鱼的抗体的抗体效价相 比，对存在显著性差异"<0.01)的情况标注*标记。数据表示平均士标准误差。 从图14所示的结果可知，将杀鲑气单胞菌抗原-SucPG-脂质体所形成的疫 苗，对鲤鱼进行经口接种来免疫时，与只通过杀鲑气单胞菌抗原进行经口免疫 的鲤鱼相比，在血中的抗体的抗体效价显著地提高。
基于该结果，在杀鲑气单胞菌抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗的最终接 种后的14天后(42天)，从鲤鱼采集肠液和胆汁，用ELISA法针对抗杀鲑气 单胞菌抗原抗体的产生进行研究。作为对照，使用从未免疫的鲤鱼个体得到的 肠液和3旦汁。
结果示于图15中。在图15中，显示了针对肠道粘膜中的抗体的抗体效价 的结果(图15A)，针对胆汁中的抗体的抗体效价的结果(图15B)。在各图中， 黑色柱表示针对未免疫的鲤鱼个体的抗体的抗体效价的结果，白色柱表示将杀 鲑气单胞菌抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗进行接种的鲤鱼个体的抗体的抗
体效价的结果。与未免疫的鲤鱼个体的抗体的抗体效价相比，对存在显著性差 异(p<0.01)的情况标注*标记。数据表示平均士标准误差。
从图15所示的结果可知，将杀鲑气单胞菌抗原-SucPG-脂质体所形成的疫
苗，对鲤鱼进行经口接种来免疫时，在肠液中和胆汁中，抗体的抗体效价显著 地提高。
进一步，在杀鲑气单胞菌抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗的最终接种后 的14天后，将6尾鲤鱼在杀鲑气单胞菌菌液(lxl06cfii/ml)中浸渍60分钟， 由杀鲑气单胞菌进行攻击，然后记录存活率的变化。
结杲示于图16中。在图16中，黑圈(*)表示通过杀鲑气单胞菌抗原-81^ 0-脂质体所形成的疫苗进行经口免疫的鲤鱼存活率的变化，黑三角(A)表示未
免疫的鲤鱼的存活率的变化。结果显示出，通过杀鲑气单胞菌抗原-SucPG-脂 质体所形成的疫苗进行经口免疫的鲤鱼存活率，比未免疫的鲤鱼的存活率高。 从这些结果显示出，在作为鱼类的鲤鱼中，将杀鲑气单胞菌抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗，进行经口 (经粘膜)接种来免疫时，在血中可诱导高的 抗体产生。
实施例10:利用鸡毒支原体抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗，对小鼠进 行经鼻(经粘膜)免疫
本实施例的目的为将含有鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)抗原 作为免疫原的含有SucPG的脂质体所形成的疫苗对小鼠进行经鼻(经粘膜) 接种，对此时的免疫应答进行研究。
在本实施例中使用的免疫原、鸡毒支原体抗原如下制备首先将鸡毒支原 体(S6株)接种于添加新鲜酵母浸出粉的Fray培养基(Difco)中，在37°C 培养48小时以上，然后，收集3.58xlO"CFU的鸡毒支原体细菌。将该收集的 鸡毒支原体细菌用过量的福尔马林变性，使其灭活，除去福尔马4木后，进一步 进行超声波处理，从而制备出抗原液。含有这样制备的鸡毒支原体抗原的含有 SucPG的脂质体所形成的疫苗(鸡毒支原体抗原-SucPG-脂质体所形成的疫 苗)，基本上按照实施例1所记载的方法来制作。
将如上制作的鸡毒支原体抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗，对5只出生 后5周龄的Balb/c小鼠(日本SLC)进行经鼻接种，鸡毒支原体抗原的用量
为100jlg/只，在2周后，用等量的鸡毒支原体抗原进一步进行经鼻接种来免疫。
在免疫原的最终接种后的7天后(21天)，从眼窝静脉丛釆集0.1ml血， 使用从该血液回收的血清，用ELISA法针对抗鸡毒支原体抗体(IgG和IgA ) 的产生进行研究。作为对照，使用从用鸡毒支原体抗原免疫前的小鼠个体所得 到的血清(0天)。
结果示于图17中。图17表示针对将鸡毒支原体抗原-SucPG-脂质体所 形成的疫苗对小鼠进行经鼻接种来免疫时的免疫应答，血清中的抗体类型诱导 结果。黑色柱表示针对IgG抗体的抗体效价的结果，白色柱表示针对IgA抗体 的抗体效价的结果。
从图17所示的结果可知，将鸡毒支原体抗原对小鼠进行经鼻接种来免疫 时，IgG类和IgA类抗体这两者都在体内生成，整体上，IgG类抗体的产生量 比IgA类抗体多。并且，与从用鸡毒支原体抗原免疫之前的小鼠个体所得到的 血清(0天)的抗体的抗体效价相比，对存在显著性差异(p<0.0063 )的情况 标注#标记，对存在显著性差异(p<0.0003 )的情况标注*标记。数据表示平 均士标准误差。
因而，显示出通过含有SucPG的脂质体形成的鸡毒支原体抗原的疫苗经 粘膜接种时，可诱导在血中有高的抗体产生，并且，不仅诱导体液免疫，还具 有诱导细胞免疫应答的可能性。
实施例ll:利用新城疫病毒抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗，对小鼠进 行经鼻(经粘膜)免疫
本实施例的目的为将含有新城疫病毒的抗原作为免疫原的含有SucPG 的脂质体所形成的疫苗疫苗对小鼠进行经鼻(经粘膜)接种，对此时的免疫应 答进行研究。
在本实施例中使用的免疫原、新城疫病毒抗原，是通过对市售的新城疫病 毒活疫苗进行超声波处理，使其灭活来制备抗原液。含有这样制备的新城疫病 毒抗原的含有SucPG的脂质体所形成的疫苗(新城疫病毒抗原-SucPG-脂质体 所形成的疫苗)，基本上按照实施例l记载的方法来制作。
将如上述制作的新城疫病毒抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗，对5只出 生后5周龄的Balb/c小鼠(日本SLC)进行经鼻接种，新城疫病毒抗原的用
量为100jlg/只，2周后用等量的新城疫病毒抗原进一步进行经鼻接种来免疫。
在免疫原最终接种后的7天后(2天1)，从眼窝静脉丛采集0.1ml血液， 使用从该血液回收的血清，用ELISA法针对抗新城疫病毒抗原抗体(IgG或 IgA)的产生进行研究。作为对照，使用从用新城疫病毒抗原免疫前(0天) 的小鼠个体所得到的血清。
结果示于图18中。在图18中，黑色柱表示针对IgG抗体的抗体效价的结 果，白色柱表示针对IgA抗体的抗体效价的结果。与免疫前(0天)的小鼠个 体的抗体效价相比，对存在显著性差异(p<0.0027)的情况标注#标记，对存 在显著性差异(p<0.00122)的情况标注*标记。数据表示平均土标准误差。
从图18所示的结果可知，将新城疫病毒抗原-SucPG-脂质体所形成的疫 苗，对小鼠进行经鼻接种来免疫时，与0天的情况相比，IgG类和IgA类的抗 体在体内显著地生成，从整体来看，具有IgG类抗体的增加率比IgA类抗提高 的倾向。
从该结果显示出，将新城疫病毒抗原-SucPG-脂质体所形成的疫苗进行经 鼻(经粘膜)接种来免疫小鼠时，可以诱导在血中有高的抗体产生。 工业上的应用性
使用上述由含有琥珀酰化聚缩水甘油的脂质体所构成的疫苗载体，来制作 疫苗，与使用由以往的脂质体所构成的疫苗载体的情况相比，可以得到能显著 提高抗体效价的高效疫苗。另外，利用使用上述疫苗载体制作的疫苗，不仅能 诱导体液免疫，还能诱导细胞免疫。
权利要求
1. 一种疫苗载体，其由含有琥珀酰化聚缩水甘油的脂质体构成。
2. 根据权利要求1所述的疫苗载体，其中，含有10 40重量％的琥珀酰 化聚缩水甘油。
3. 根据权利要求2所述的疫苗载体，其中，含有30重量°/。的琥珀酰化聚 缩水甘油。
4. 根据权利要求1~3中任一项所述的疫苗载体，其中，构成脂质体的脂 质由二油基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、 二棕榈 酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、 二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、 二硬脂酰磷脂酰胆 碱(DSPC)、 二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、蛋黄磷脂酰胆碱(egg PC) 或胆固醇中的任一种，或者它们的任一组合构成。
5. 根据权利要求1~4中任一项所述的疫苗载体，其中，脂质体由二油基 磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)的组合构成。
6. 根据权利要求1 5中任一项所述的疫苗载体，其特征在于，能够将脂 质体中含有的免疫原在抗原提呈细胞中内在化。
7. 根据权利要求1 6中任一项所述的疫苗载体，其用于将脂质体中含有 的免疫原进行经粘膜接种。
8. 根据权利要求1 6中任一项所述的疫苗载体，其用于将脂质体中含有 的免疫原进行非经粘膜接种。
9. 一种疫苗，其特征在于，在由含有琥珀酰化聚缩水甘油的脂质体所构 成的疫苗载体中，含有为免疫化而应接种的免疫原。
10. 根据权利要求9所述的疫苗，其用于诱导对免疫原的细胞免疫。
11. 根据权利要求IO所述的疫苗，其还用于诱导对免疫原的体液免疫。
12. 根据权利要求9~11中任一项所述的疫苗，其中，在疫苗载体中含有 10~40重量％的琥珀酰化聚缩水甘油。
13. 根据权利要求12所述的疫苗，其中，在疫苗载体中含有30重量°/0的 琥珀酰化聚缩水甘油。
14. 根据权利要求9 13中任一项所述的疫苗，其中，构成疫苗载体的脂 质体的脂质由二油基磷脂酰乙醇胺(DOPE )、 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE )、 二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)、 二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、 二硬脂酰磷 脂酰月旦碱(DSPC)、 二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、蛋黄磷脂酰胆碱(egg PC)或胆固醇中的任一种，或者它们的任一组合构成。
15. 根据权利要求9~14中任一项所述的疫苗，其中，疫苗栽体中的脂质 体由二油基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)的组合 构成。
16. 根据权利要求9 15中任一项所述的疫苗，其能够使脂质体中含有的 免疫原在抗原提呈细胞中内在化。
17. 根据权利要求9 16中任一项所述的疫苗，其用于将免疫原进行经粘 膜接种。
18. 根据权利要求9~16中任一项所述的疫苗，其用于将免疫原进行非经 粘膜接种。
19. 根据权利要求9~18中任一项所述的疫苗，其中，免疫原选自来源于 细菌、病毒、原虫中的任一种的抗原。
20. 根据权利要求19所述的疫苗，其中，细菌选自沙门氏菌、金黄色葡 萄球菌、气单胞菌、支原体。
21. 根据权利要求19所述的疫苗，其中，病毒是新城疫病毒。
22. 根据权利要求19所述的疫苗，其中，原虫是锥虫。
全文摘要
本发明的课题是制作新型疫苗载体，该新型疫苗载体可用于制造能高效诱导体液及细胞免疫应答的疫苗。另外，本发明的课题还在于提供能高效诱导体液及细胞免疫应答的疫苗。本发明的发明人等发现，通过使用含有琥珀酰化聚缩水甘油的脂质体，可以解决上述课题，从而完成本发明。即，本发明通过提供由含有琥珀酰化聚缩水甘油的脂质体所构成的疫苗载体，可以解决上述课题。
文档编号A61K39/00GK101378777SQ20078000464
公开日2009年3月4日 申请日期2007年2月7日 优先权日2006年2月7日
发明者河野健司, 渡来仁 申请人:日本生物学的制剂有限公司