含有血凝素和基质蛋白的流感疫苗的制作方法

专利名称：：含有血凝素和基质蛋白的流感疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明属于保护免受流感病毒感染的疫苗领域，具体涉及包含基质蛋白的疫苗。
背景技术：
：目前可以获得各种形式的流感病毒疫苗(例如参见参考文献1的第17和18章)。疫苗通常基于活病毒或灭活病毒。灭活疫苗可能基于完整病毒颗粒，'裂解'病毒颗粒，或者基于纯化的表面抗原。血凝素(HA)是灭活流感疫苗的主要免疫原，参照HA水平(一般通过单径向免疫扩散(SRID)实验测定)标准化疫苗剂量。在现有疫苗中，一般每剂量含有约15吗HA/毒株。除了含有流感HA外，疫苗还可含有其它流感病毒蛋白。例如，所有现有疫苗都含有神经氨酸酶(NA)。参考文献2报道，欧洲流感疫苗也可含有大量其它流感病毒蛋白。例如，裂解疫苗、而非纯化的表面抗原疫苗中也可发现基质(M)蛋白。除流感病毒抗原外，参考文献2报道，疫苗也可含有鸡蛋衍生的蛋白，如卵清蛋白。出现这些蛋白的原因是在疫苗生产过程中培养流感病毒的标准方法采用含胚的鸡蛋，由鸡蛋内容物(尿囊液)纯化病毒。
发明内容与疫苗生产中使用鸡蛋培养病毒相比，提出了在细胞培养物中培养病毒。在研究这种技术的过程中，本发明者出乎意料地检测到基质序列。具体说，虽然参考文献2在鸡蛋培养的病毒颗粒制备的纯化表面抗原疫苗中没有发现基质蛋白，但本发明者在细胞培养物中培养的病毒颗粒制备的纯化表面抗原疫苗中检测到基质蛋白。5因此，本发明提供一种由细胞培养物培养的病毒制备的含有流感病毒血凝素和基质蛋白的免疫原性组合物。本发明也提供了一种含有流感病毒血凝素和基质蛋白而不含卵清蛋白的免疫原性组合物。该组合物也可不含其它鸡蛋蛋白(如卵类粘蛋白)和鸡DNA。本发明也提供了一种制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤(i)在细胞培养物中培养流感病毒；(ii)由步骤(i)培养的病毒制备抗原组合物，其中所述抗原组合物含有血凝素和基质蛋白；和(iii)将所述抗原组合物与药物载体混合，得到所述免疫原性组合物。观察到的具体基质蛋白是M1的片段。全长M1蛋白是27.8kDa的蛋白，但观察到的片段在低分子量SDS-PAGE凝胶上的分子量约为5kDa(见下)。它包含高度保守的氨基酸序列LSYSXGALA(SEQIDNO:1)，其中X是A或T。因此，本发明提供一种含有流感病毒血凝素和基质蛋白的免疫原性组合物，其中所述基质蛋白的分子量小于20kDa，并包含与SEQIDNO:1至少50%(如至少60%、70%、80。/。、85%、90%、95%或更多)相同的氨基酸序列。观察到的另一种M1片段长度约75aa，缺少全长Ml序列的N末端甲硫氨酸(例如，它含有氨基酸序列SEQIDNO:28或SEQIDNO:29)。因此，本发明提供一种含有流感病毒血凝素和基质蛋白的免疫原性组合物，其中所述基质蛋白是缺少天然Ml序列的N末端甲硫氨酸的Ml蛋白。所述基质蛋白可含有与SEQIDNO:28或SEQIDNO:29至少50。/。(例如至少60。/。、70%、80%、85%、90%、95%或更多)相同的氨基酸序列。除缺少N末端甲硫氨酸外，该片段还可缺少N末端甲硫氨酸下游的一个或多个其它氨基酸。虽然优选由细胞培养物中培养的病毒制备这些组合物，但是也可通过其它方式来制备，例如将基质蛋白加入鸡蛋衍生的疫苗中，使用纯化方法处理鸡蛋产生的病毒颗粒导致产生和存在基质蛋白，将基质蛋白与重组表达的HA(和任选的其它重组表达蛋白)混合等方式。抗原组分的制备本发明不使用完整病毒颗粒(WV)抗原，即不包括使用活病毒或完整灭活病毒颗粒的疫苗。然而，本发明抗原是非wv抗原，如裂解病毒颗粒或纯化的表面抗原。本发明组合物包含至少两种流感病毒抗原血凝素和基质。它们还可包含其它流感病毒抗原，如神经氨酸酶。一般由流感病毒颗粒(优选在细胞培养物中培养的病毒颗粒)制备抗原，但在一些实施方式中，可以在重组宿主(如使用杆状病毒载体的昆虫细胞系)中表达抗原，并以纯化形式使用该抗原[3，4]。然而通常，抗原来自病毒颗粒。在由病毒颗粒制备非WV抗原的过程中，可以使病毒颗粒灭活。灭活病毒的化学方法包括用有效量的以下一种或多种物质处理去污剂、甲醛、|3-丙内酯、亚甲蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)、二乙胺、乙酰乙烯亚胺、或其组合。本领域已知病毒灭活的非化学方法，例如UV射线或Y射线辐射。可通过各种方法由含病毒液体收获病毒颗粒。例如，纯化方法可包括用线性蔗糖梯度溶液(含有去污剂以破坏病毒颗粒)进行区带离心。任选稀释后，可通过渗滤纯化抗原。获得裂解病毒颗粒的过程包括用去污剂(如乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、三正丁基磷酸盐、TritonX-IOO、TritonNlOl、溴化十六烷基三甲铵、TergitolNP9等)处理纯化的病毒颗粒以产生亚病毒颗粒制剂，包括'吐温-醚'裂解方法。裂解流感病毒的方法是本领域熟知的，例如参见参考文献5-10等。。一般使用破坏性浓度的裂解剂通过破坏或片段化完整病毒来裂解病毒，无论该病毒有无感染性。这种破坏导致病毒蛋白的完全或部分溶解，改变病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子型和离子型(例如阳离子型)表面活性剂，如烷基糖苷、垸基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N,N-二垸基-葡糖酰胺、Hecameg、垸基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季铵化合物、肌氨酰、CTAB(溴化十四烷基三甲铵)、三正丁基磷酸酯、塞塔隆(Cetavlon)、十四烷基三甲铵盐、脂质转染试剂、利非他明(lipofectamine)和DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如Triton表面活性剂，如TritonX-100或TritonNlOl)、聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂解方法使用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，最初病毒颗粒纯化过程中(例如在蔗糖密度梯度溶液中)发生裂解。因此，裂解过程可包括使含病毒颗粒的物质澄清(以去除非病毒颗粒物质)，浓縮收获的病毒颗粒(例如使用吸附法，如CaHP04吸附)，将完整病毒颗粒与非病毒颗粒物质分离开，通过密度梯度离心步骤用裂解剂裂解病毒颗粒(例如使用含有裂解剂如脱氧胆酸钠的蔗糖梯度)，然后过滤(如超滤)以去除不需要的物质。可将裂解的病毒颗粒重悬于磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。BEGRIVACTM、FLUARIXtm、FLUZONEtm和FLUSfflELDTM产品是裂解疫苗。纯化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，一般还包含神经氨酸酶。制备纯化形式的这些蛋白质的方法是本领域熟知的。FLUVIRINtm、AGRIPPALtm和INFLUVACTM产品是亚单位疫苗。流感抗原也可以病毒体(无核酸的病毒样脂质体颗粒)的形式存在[ll]，例如INFLEXALVTM和INVAVACTM产品，但本发明优选不使用病毒体。因此，在一些实施方式中，流感抗原不是病毒体的形式。可使流感病毒减毒。流感病毒可以是温度敏感型。流感病毒可以是冷适应性病毒。使用活病毒作为抗原时这三种特征特别有用。疫苗中使用的流感病毒毒株随季节而变。在目前的大流行间期，疫苗一般包含两种流感A毒株(H1N1和H3N2)和一种流感B毒株，一般是三价疫苗。本发明也可使用来自大流行毒株(即疫苗接受者和普通人群未曾免疫接触的毒株)的HA，如H2、H5、H7或H9亚型毒株(尤其是流感A病毒毒株)，大流行毒株的流感疫苗可以是单价疫苗，或者可基于补充有大流行毒株的正常三价疫苗。然而，根据季节和疫苗中包含的抗原特性，本发明可保护免受一种或多种流感A病毒HA亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14、H15或H16的感染。本发明可保护免受一种或多种流感A病毒NA亚型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9的感染。除了适合免疫对抗大流行间期毒株，本发明组合物也特别适用于免疫对抗大流行毒株。可能引起大流行爆发的流感毒株的特征是(a)与目前流通的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即数十年没有在人群中发现的血凝素(如H2)，或者从未在人群中发现的血凝素(如H5、H6或H9，通常只出现在鸟群体中)，以至于人群未曾免疫接触过该毒株的血凝素；(b)它能够在人群中水平传播；和(c)它能使人致病。含有H5血凝素类型的病毒优选用于获得对大流行流感，如H5N1毒株的免疫。其它可能的毒株包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，以及任何其它可能出现的大流行毒株。在H5亚型内，病毒可能属于HA进化枝1、HA进化枝l'、HA进化枝2或HA进化枝3[12]，进化枝1和3特别相关。其抗原可有用地包含在本发明组合物中的其它毒株是对抗病毒治疗有抗性(例如对奥塞米韦[13]和/或扎那米韦有抗性)的毒株，包括抗性大流行毒株[14]。本发明组合物可包含一种或多种(如1、2、3、4或更多种)流感病毒毒株，包括流感A病毒和/或流感B病毒的抗原。不优选单价疫苗，当疫苗包含一种以上流感毒株时，一般单独培养不同毒株，收获病毒后将它们混合在一起，然后制备抗原。因此，本发明方法可包括混合一种以上流感毒株的抗原的步骤。因此，本发明方法可包括混合一种以上流感毒株的抗原的步骤。优选三价疫苗，其包含来自两种流感A病毒毒株和一种流感B病毒毒株的抗原。在本发明的一些实施方式中，该组合物可包含来自一种流感A毒株的抗原。在一些实施方式中，该组合物可包含来自两种流感A毒株的抗原，前提是这两种毒株不是H1N1和H3N2。在一些实施方式中，该组合物可包含来自两种以上流感A毒株的抗原。流感病毒可能是再造病毒，可通过逆向遗传学技术获得该病毒。逆向遗传学技术[如15-19]能够用质粒在体外制备含有所需基因组区段的流感病毒。该技术一般包括表达(a)例如，由poll启动子编码所需病毒RNA分子的DNA分子，和(b)例如，由polII启动子编码病毒蛋白的DNA分子，这两种类型的DNA在细胞中的表达导致组装成完整的感染性病毒颗粒。该DNA优选提供所有病毒的RNA和蛋白质，但也可能使用辅助病毒来提供一些RNA和蛋白质。优选采用不同质粒产生各病毒RNA的基于质粒的方法[20-22]，这些方法也包括使用质粒来表达所有或一些病毒蛋白(例如，仅PB1、PB2、PA和NP蛋白)，在一些方法中使用12种质粒。为了减少所需的质粒数量，近期方法[23]将多个RNA聚合酶I转录盒(用于合成病毒RNA)合并到同一质粒上(如编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种流感AvRNA区段的序列)，并且将多个蛋白编码区与RNA聚合酶II启动子合并到另一个质粒上(如编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种流感AmRNA转录物的序列)。参考文献23方法的优选方面包括(a)PBl、PB2和PAmRNA编码区在同一质粒上；和(b)所有8个vRNA编码区段在同一质粒上。一个质粒上包含NA和HA区段而另外六个区段位于另一质粒上也可能是有利的。作为使用poll启动子来编码病毒RNA区段的替换方式，可使用噬菌体聚合酶启动子[24]。例如，可方便地使用SP6、T3或T7聚合酶的启动子。由于poll启动子的物种特异性，噬菌体聚合酶启动子可能较适合许多细胞类型(如MDCK)，但也必须用编码外源性聚合酶的质粒转染细胞。在其它技术中，可使用poll和polll双启动子由一个模板同时编码病毒RNA和可表达的mRNA[25,26]。因此，流感A病毒可包含来自A/PR/8/34病毒(一般是来自A/PR/8/34的6个区段，HA和N区段来自疫苗毒株，即6:2再造毒株)的一个或多个RNA区段。也可包含来自A/WSN/33病毒，或用于产生疫苗制剂的再造病毒的任何其它毒株的一个或多个RNA区段。本发明一般保护免受能够在人之间传播的毒株的感染，因此该毒株的基因组通常包含起源于哺乳动物(如人)流感病毒的至少一个RNA区段。它可包含起源于禽流感病毒的NS区段。通常在细胞培养物上培养用作抗原来源的病毒，但在一些实施方式中，可以在鸡蛋上培养它们。目前标准的流感病毒培养方法采用无特定病原(SPF)含胚鸡蛋，由鸡蛋内容物(尿囊液)纯化病毒。然而从更近期来看，已在动物细胞培养物中培养病毒，并且由于速度和患者过敏的原因，优选这种培养方法。如果使用基于鸡蛋的病毒培养，则可将一种或多种氨基酸与病毒一起引入鸡蛋尿囊液中[IO]。细胞基底层一般是哺乳动物来源的细胞系。合适的哺乳动物细胞来源包括但不限于仓鼠、牛、灵长动物(包括人和猴)和犬细胞。可采用各种细胞类型，例如肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。合适的仓鼠细胞的例子是称为BHK21或HKCC的细胞系。合适的猴细胞是(例如)非洲绿猴细胞，例如肾细胞，如Vero细胞系。合适的犬细胞是(例如)肾细胞，例如MDCK细胞系。因此，合适的细胞系包括但不限于MDCK、CHO、293T、BHK、Vero、MRC-5、PER.C6、WI-38等。使用哺乳动物细胞意味着疫苗可不含鸡DNA，以及不含鸡蛋蛋白质(如卵清蛋白和卵类粘蛋白)，从而降低变应原性。用于培养流感病毒的哺乳动物细胞系优选包括MadinDarby犬肾来源的MDCK细胞[27-30];非洲绿猴肾(Cerco/油ec^ae决Zo戸)来源的Vero细胞[31-33];或人胚视网膜母细胞来源的PER.C6细胞[34]。这些细胞系可由各种来源获得，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)[35]、Coriell细胞库[36]或欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC供应各种不同Vero细胞，目录号为CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586和CRL-1587，还供应MDCK细胞，目录号为CCL-34。PER.C6可获自ECACC，保藏号96022940。代替哺乳动物细胞系的较不优选的方式是，在禽细胞系，包括鸭(如鸭视网膜)或母鸡来源的细胞系上培养病毒[如参考文献37-39]。禽细胞系的例子包括禽胚胎干细胞[37,40]和鸭视网膜细胞[38]。合适的禽胚胎干细胞包括衍生自鸡胚胎干细胞的Ebx细胞系、EB45、EB14和EB14-074[41]。也可使用鸡胚成纤维细胞(CEF)。用于培养流感病毒的最优选的细胞系是MDCK细胞系。原始MDCK细胞系可购自ATCC(CCL-34)，但也可利用该细胞系的衍生细胞系。例如，参考文献27公开了适合悬浮培养的MDCK细胞系('MDCK33016'，保藏号DSMACC2219)。相似地，参考文献42公开了在无血清培养基('B-702'，保藏号FERMBP-7449)中悬浮培养的MDCK衍生细胞系。参考文献43公开了非致瘤性MDCK细胞，包括'MDCK-S'(ATCCPTA-6500)、'MDCK-SF101'(ATCCPTA-6501)、'固CK-SF102'(ATCCPTA-6502)和'MDCK-SF103'(PTA-6503)。参考文献44公开了非常易于感染的MDCK细胞系，包掛MDCK.5F1'细胞(ATCCCRL-12042)。可使用任何这些MDCK细胞系。细胞生长培养物，以及用于启动培养的病毒接种物优选不含(即经测试且得到阴性污染结果)单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、双RNA病毒、环病毒和/或细小病毒[45]。特别优选不存在单纯疱疹病毒。可以在悬浮[46]或贴壁培养的细胞中培养病毒。在一个实施方式中，细胞可能适合悬浮培养。一种适合悬浮培养的MDCK细胞系是MDCK33016(保藏号DSMACC2219)。或者，可采用微载体培养。优选在无血清培养基和/或无蛋白培养基中培养支持流感病毒复制的细胞系。在本发明中，如果培养基中没有人或动物来源的血清添加剂，则称为无血清培养基。无蛋白应理解为在不含蛋白质、生长因子、其它蛋白添加剂和非血清蛋白质的情况下发生细胞增殖的培养物，但可任选包含诸如胰蛋白酶和其它蛋白酶等可能是病毒生长所必需的蛋白质。在这类培养物中培养的细胞在天然情况下本身含有蛋白质。在病毒复制过程中，支持流感病毒复制的细胞系优选在37°C以下[47](如30-36。C)培养。在培养细胞中增殖病毒的方法通常包括以下步骤用待培养的菌株接种培养的细胞，将感染细胞培养所需时间以使病毒增殖，例如通过病毒效价或抗原表达来确定所需时间(如接种后24-168小时)，然后收获增殖的病毒。用1:500-1:1，优选1:100-1:5，更优选1:50-1:10的病毒(由PFU或TCID50测定):细胞比接种培养的细胞。将病毒加入细胞悬液中，或施加于细胞单层，在25-40°C，优选28-37'C下，使病毒吸附于细胞至少60分钟，但通常小于300分钟，优选90-240分钟。可通过冻融或酶作用去除感染的细胞培养物(如单层)，以提高收获的细胞上清液的病毒含量。然后，可灭活或冷冻储存收获的液体。可以约0.0001-10、优选0.002-5、更优选0.001-2的感染复数("m.o.i.")感染培养的细胞。更优选地，以约0.01的m.o丄感染细胞。可以在感染后30-60小时收获感染的细胞。优选在感染后34-48小时收获细胞。更优选在感染后38-40小时收获细胞。通常在细胞培养期间加入蛋白酶(一般是胰蛋白酶)，以使病毒释放，可以在培养的任何合适的阶段加入蛋白酶D血凝素(HA)是目前灭活流感疫苗的主要免疫原，参照一般由SRID测定的HA水平来标准化疫苗剂量。现有疫苗一般含有约15pgHA/毒株，但较低剂量.可用于(例如)儿童，或者在大流行情况下使用，或者在使用佐剂时。采用了分数剂量如1/2(g卩7.5吗HA/毒株)、1/4和1/8[89,90]，以及较高剂量(如3x或9x剂量[48,49])。因此，疫苗可包含0.1-150吗HA/流感毒株，优选0.1-50吗，例如0.1-20吗、0.1-15吗、O.l-降g、0.1-7.5吗、0.5-5吗等。具体剂量包括例如，约45、约30、约15、约IO、约7.5、约5、约3.8、约1.9、约1.5吗等/毒株。在活疫苗中，利用组织培养感染剂量中值(TCID5o)而非HA含量来测定剂量，TCID5Q—般为106-108(优选为1065-1075)/毒株。本发明所用HA可以是天然HA，如病毒中发现的天然HA，或者可以是经修饰的HA。例如，已知修饰HA以去除导致病毒在禽类动物中具有高度致病性的决定簇(如HA1和HA2之间切割位点周围的超碱性区域(hyper-basicregion)),因为这些决定簇可导致病毒不能在鸡蛋中生长。基质蛋白除包含血凝素外，本发明组合物还包含基质蛋白。流感A病毒的区段7编码Ml和M2多肽。Ml位于病毒脂质双层之下，而M2是提供金刚胺抑制的离子通道的整合膜蛋白。由剪接mRNA表达M2。流感B病毒的区段7编码Ml禾PBM2多肽。本发明组合物中所含的基质蛋白一般是来自流感A病毒的M1蛋白。来自PR/8/34流感A病毒的全长252aaMl序列可获自数据库中的GI:138817，它是本文中的SEQIDNO:2:QAAEAMEVASQARQMVQAMRTIGTHPSSSAGLKNDLLENLQAYQKRMGVQMQRFK本发明组合物中包含的基质蛋白优选包含长度至少为m个氨基酸的Ml氨基酸序列，而所述m个氨基酸与SEQIDNO:2至少n。/。相同。这m个氨基酸一般包含SEQIDNO:2的至少p个连续氨基酸的片段。m的值可以是(例如)，7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更高。n的值可以是(例如)，70(如75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更高)。p的值可以是(例如)，5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更高。当n<100时，p小于m。与SEQIDNO:2相比，m个氨基酸的序列可包含一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)保守氨基酸取代，即一个氨基酸被另一具有相关侧链的氨基酸所取代。遗传编码的氨基酸通常分为四类(l)酸性，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；以及(4)不带电荷的极性氨基酸，即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一起称为芳族氨基酸。通常，这些家族中的单个氨基酸的替换不会对生物活性产生重要影响。相对于SEQIDNO:2，这m个氨基酸也可含有一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)单个氨基酸的缺失。相对于SEQIDNO:2，这m个氨基酸也可含有一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)插入氨基酸(如l、2、3、4或5个氨基酸)。本发明组合物中包含的基质蛋白优选包含Ml的表位。该表位可以是T细胞和/或B细胞表位。可凭经验(例如用PEPSCAN[50,51]或相似方法)鉴定T和B细胞表位，或者可预测这些表位(例如使用Jameson-Wolf抗原性指数[52]、基于基质的方法[53]、TEPITOPE[54]、神经网络[55]、OptiMer和EpiMer[56,57]、ADEPT[58]、Tsites[59]、亲水性[60]、抗原性指数[61]或参考文献62所述的方法等)。通过这些方法，已经鉴定了流感A病毒M1蛋白中的T细胞表位，包括[63]:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>Ml中的其它T细胞表位包括SLLTEVETYV(SEQIDNO:15;SEQIDNO:2的残基2-11);SLLTEVETYV(SEQIDNO:16;SEQIDNO:2的残基14-21);和LEDVFAGK(SEQIDNO:17;SEQIDNO:2的残基28-35)。首先在细胞培养物制备的疫苗中检测到的具体基质蛋白是含有N末端序列EISLSYSAGALA(SEQIDNO:18;SEQIDNO:2的残基U4曙125)的5kDa蛋白。该多肽的N末端残基和大小与M1的胰蛋白酶片段相一致，在这种情况下全长多肽可具有以下氨基酸序列之一SEQIDNO:19-EISLSYSAGALASCMGLIYNRMGAVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHRSHRSEQIDNO:20-EISLSYSAGALASCMGLIYNRMGAVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHRSEQIDNO:19包含可能产生锌亲和力的完整的Cys-Cys-His-His基序(SEQIDNO:2的残基148-162)[72]。因此，本发明所用的基质蛋白还可包含锌离子。SEQIDNO:18序列包含序列LSYSXGALA(SEQIDNO:1)，它在流感A病毒毒株之间的保守性非常高，其中第5个残基'X'是Thr(LSYSTGALA，SEQIDNO:21)或Ala(LSYSAGALA,SEQIDNO:22)。此保守性9单位的变异是已知的(例如在A/Swine/Ontario/01911-2/99(H4N6)中此9单位是L^YSTGALA[GI:10442678;SEQIDNO:23〗，在A/swine/England/191973/92(HlN7)中它是LQYSTGALA[GI:1835734;SEQIDNO:24]，在A/Chicken/Pennsylvania/13609/93(H5N2)中它是LSYSTGAL工[GI:4584948;SEQIDNO:25〗，在A/WSN/33中它是FSYSAGALA[GI:324407;SEQIDNO:26])，但SEQIDNO:1是最常见的序列。在所有这些序列中核心YSXGAL(SEQIDNO:27)是共同特征。可以在www.flu.lanl.gov的流感序列数据库aSD)中方便地定位流感病毒的序列[73]。其它序列可参见参考文献74。因此，本发明组合物中包含的基质蛋白优选包含一种或多种以下氨基酸序列SEQIDNO:1、21、22、23、24、25、26和/或27。虽然全长Ml蛋白是27.8kDa的蛋白，然而，本发明组合物中包含的基质蛋白的分子量〈20kDa，例如^15kDa、Sl2kDa、^10kDa、S9kDa、^8kDa、^7kDa、S6kDa、^5.5kDa或约为5kDa。基质蛋白的分子量优选落入2-8kDa的范围，例如3-7kDa、4-6kDa，或者约为5kDa。基质蛋白的N末端可能是Glu-Ile-Ser，后接氨基酸序列SEQIDNO:1、19、20、21、22、23或24之一。组合物中的基质蛋白可形成寡聚体(例如二聚体，如同源二聚体)。如果基质蛋白包含氨基酸137(按照SEQIDNO:2编号)，那么此氨基酸可以是Ala(如SEQIDNO:2)或Thr(如致病性H5N1人病毒)。基质蛋白的含量可变，但一般为1吗/ml-15吗/ml，例如2-l化g/ml、3-13吗/ml、4-12pg/ml、5-11叫/ml、6-10叫/ml、7-9吗/ml等。也可采用小于1吗/ml的浓度。除血凝素外还包含这些基质蛋白，本发明组合物获益于存在的任何T细胞表位，它们可能提高疫苗引发的交叉保护(不仅在同一HA类型内，而且在不同HA类型之间)[75]。基质蛋白可能由于组合物制剂而内源性存在(例如可与HA共同纯化)，或者可以作为外源性组分加入，例如，以改进不含基质组分的疫苗，包括鸡蛋衍生的疫苗。如果不希望受理论束缚，本发明者相信基质蛋白可结合于疫苗中的HA以形成稳定复合物。如果该复合物的稳定性高于单独的HA，则可延长该疫苗的储存寿命，特别是在冰箱外长期储存的能力。Ml中SEQIDNO:1周围区域可用作脂质结合区[76]。因此，如果基质蛋白中包含此区域，则该蛋白易于与脂肪佐剂相互作用，如下详述。当组合物包含来自一种以上流感A毒株的HA时，它通常也包含来自一种以上毒株的基质蛋白。虽然各毒株的HA通常互不相同，然而，基质蛋白可能相同。如果它们相同，那么在最终产物中，可能无法区分这两种基质蛋白，但它们的来源不同。除包含HA和基质外，本发明组合物还可包含神经氨酸酶和/或核蛋白。组合物包含来自流感B病毒的HA时，它还可包含来自流感B病毒的Ml蛋白。宿主细胞DNA用细胞系培养病毒时，标准实践是最大程度减少最终疫苗中残留的细胞系DNA的含量，以尽可能降低这些DNA的致癌活性。疫苗中包含流感病毒基质蛋白时这种安全性措施特别重要，因为基质蛋白可结合于核酸(包括RNA和双链DNA)[77]，从而比现有HA基疫苗更容易地留存DNA。因此，本发明组合物优选含有小于10ng(优选小于1ng，更优选小于100pg)残留的宿主细胞DNA/剂量，但可能存在痕量宿主细胞DNA。任何残留宿主细胞DNA的平均长度优选小于500bp，例如小于400bp、小于300bp、小于200bp、小于100bp等。通常，需要从本发明组合物中排除的宿主细胞DNA是长度大于100bp的DNA。现在，残留宿主细胞DNA的测定是生物制品的常规管理要求，并且在技术人员的普通能力范围内。用于测定DNA的实验一般是验证实验[78,79]。可通过数学和可以量化的条件来描述验证实验的性能特征，并鉴定可能的误差来源。通常测试该实验的某些特征，如精确性、准确性、特异性。一旦校正(例如用已知标准量的宿主细胞DNA校正)并检验了某个实验，则可按常规进行定量DNA测定。可釆用三种DNA定量的基本技术杂交方法，如Southern印迹或狭线印迹[80];免疫测定法，如ThreshokFM系统[81];和定量PCR[82]。本领域技术人员熟悉这些方法，但各方法的准确特征，例如杂交探针的选择、引物的选择和/或用于扩增的引物等可能取决于所研究的宿主细胞。来自分子设备公司(MolecularDevices)的ThresholdTM系统是皮克水平的总DNA的定量实验，己用于监测生物药品中污染DNA的水平[81]。典型实验包括生物素化ssDNA结合蛋白、脲酶偶联的抗ssDNA抗体和DNA之间以非序列特异性方式形成反应复合物。购自生产商的总DNA测定试剂盒(TotalDNAAssayKit)中包含所有实验组分。多个商业生产商均提供了用于检测残留宿主细胞DNA的定量PCR实验，例如AppTecTM实验室服务公司(AppTecTMLaboratoryServices)、BioRelianceTM公司奥西科技公司(AltheaTechnologies)等。用于测定人病毒疫苗的宿主细胞DNA污染的化学发光杂交实验和总DNAThreshold系统的比较参见参考文献83。在疫苗制备过程中可采用标准纯化方法，如层析法等去除污染的DNA。可通过核酸酶处理，例如DNA酶处理来改进对残留宿主细胞DNA的清除效果。参考文献84和85公开了一种减少宿主细胞DNA污染的方便方法，该方法包括两步处理，第一步是在病毒生长期间使用DNA酶(如Benzonase)处理，然后是在病毒颗粒破裂期间使用阳离子去污剂(如CTAB)进行处理。也可利用烷化剂如(3-丙内酯处理来去除宿主细胞DNA，该方法也宜用于灭活病毒颗粒[86]。优选每15吗血凝素中宿主细胞DNA含量〈10ng(如"ng、〈100pg)的疫苗，以及每0.25ml体积中宿主细胞DNA含量<10ng(如〈ng、〈100pg)的疫苗。更优选每50吗血凝素中宿主细胞DNA含量<10ng(如〈1ng、〈100pg)的疫苗，以及每0.5ml体积中宿主细胞DNA含量<10ng(如4ng、〈100pg)的疫苗。佐剂本发明组合物宜包含佐剂，佐剂可用于在接受该组合物的患者中提高所引发的免疫应答反应(体液或细胞免疫应答)。曾经描述过将佐剂与流感疫苗一起使用。参考文献87和88中使用了氢氧化铝，参考文献89中使用了氢氧化铝和磷酸铝的混合物。参考文献90也描述了铝盐佐剂的应用。希龙疫苗公司(ChironVaccines)的FLUADTM产品包含水包油乳液。可用于本发明的佐剂包括但不限于，包含钙盐和铝盐(或其混合物)的含矿物质组合物。钙盐包括磷酸钙(如参考文献91公开的"CAP"颗粒)。铝盐包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等，所述盐取任何合适的形式(如凝胶、晶体、无定形态等)。优选吸附于这些盐。也可将含有矿物质的组合物制成金属盐的颗粒[92]。下面开始更详细地描述铝盐佐剂。细胞因子诱导剂(详述见下)皂苷[参考文献128第22章]，皂苷是在许多种类的植物的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的来自皂树(2"///0&^po朋n'a)Molina树皮的皂苷。皂苷也可购自丽花菝葜(S柳7axomato)(墨西哥菝葜)、满天星((^y;wop/n7/a/am'cwtoa)(婚纱花)和肥皂草(Sa/7o朋n'ao^"'a加fe)(皂根)。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21以及脂质制剂如ISCOM。QS21以商标StimulonTM出售。已采用HPLC和RP-HPLC来纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术纯化的特定组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。皂苷优选QS21。制备QS21的方法参见参考文献93。皂苷制剂也可包含甾醇，如胆固醇[94]。皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献128的第23章]。ISCOM通常也含有磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。ISCOM中可采用任何已知的皂苷。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献94-96中进一步描述了ISCOM。任选地，ISCOM可不含其它去污剂[97]。开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献98和99。，含有水包油乳液的脂肪佐剂(详述见下)。*细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌(Eco/z')不耐热肠毒素"LT"、霍乱毒素"CT"或百日咳毒素"PT")及其脱毒衍生物，如称为LT-K63和LT-R72的突变毒素[100]。参考文献101中描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，参考文献102中描述了将其用作胃肠道外佐剂。*生物粘附剂和粘膜粘附剂，如酯化透明质酸微球[103]或壳聚糖及其衍生物网。*由可生物降解和无毒材料(例如聚0-羟酸)、聚羟基丁酸、聚正酯、聚酐、聚己酸内酯等)，优选丙交酯-乙交酯共聚物形成的微粒(即直径约100nm-150|Lim，更优选约200nm-30(xm，最优选约500nm-10pm的颗粒)，任选处理以具有带负电表面(如用SDS处理)或带正电表面(例如用阳离子去污剂如CTAB处理)。，脂质体(参考文献128第13和14章)。适合用作佐剂的脂质体制剂的例子见参考文献105-107所述。*聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂[108]。这种制剂还包括聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂和辛苯糖醇[109]以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂和至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯糖醇[110]的混合物。优选的聚氧乙烯醚选自聚氧乙烯-9-月桂醚(laureth9)、聚氧乙烯-9-固醇醚(steorylether)、聚氧乙烯-8-固醇醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。*胞壁酰肽，例如N-乙酰胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(去甲MDP)、N-乙酰葡萄糖胺酰-N-乙酰胞壁酰-L-A1-D-异谷氨酰-L-Ala-二棕榈酰丙酰胺("DTP-DPP"或"Theramide")和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-511-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(1^-￡)。*由第一种革兰阴性菌制备的外膜蛋白蛋白酶体制剂与第二种革兰阴性菌产生的脂多糖制剂的组合，其中所述外膜蛋白蛋白酶体和脂多糖制剂形成稳定的非共价佐剂复合物。这类复合物包括"IVX-908"，它是由脑膜炎奈瑟球菌(A^'we〃'amem力g/"'flfa)外膜蛋白和脂多糖组成的复合物。已将它们用作流感疫苗佐剂[lll]。.聚氧镎(polyoxidonium)聚合物[112,113]或其它N-氧化的聚乙烯-哌嗪衍生物。*甲基肌苷5'-单磷酸酯("MIMP")[114]。*多聚羟化吡咯双烷类化合物[115]，如下式化合物:式中R选自氢，直链或支链、未取代或取代、饱和或不饱和的酰基、烷基(如环烷基)、烯基、炔基和芳基，或这些化合物药学上可接受的盐或衍生物。例子包括但不限于木麻黄(casuarine)、木麻黄-6-a-D-吡喃葡萄糖、3-表-木麻黄、7-表-木麻黄、3，7-二表-木麻黄等。，CDld配体，如a-糖基神经酰胺[116-123](如a-半乳糖基神经酰胺)、含植物鞘氨醇的a-糖基神经酰胺、OCH、KRN7000[(2S，3S，4R)-l-0-(a-D-吡喃半乳糖基)-2-(N-二十六烷酰氨基)-l,3,4-十八垸三醇]、CRONY-101、3"-0-磺基-半乳糖基神经酰胺等。菊糖[124]或其衍生物，如algammulin。参考文献128和129中更详细地讨论了这些和其它佐剂活性物质。组合物可包含两种或多种所述佐剂。例如，它们宜同时包含水包油乳液和细胞因子诱导剂，因为这种组合提高了流感疫苗引发的细胞因子应答，如干扰素-Y应答，与该乳液或药剂单用时相比，它们联用时引发的应答高得多。组合物中的抗原和佐剂一般形成混合物。水包油乳液佐剂发现水包油乳液特别适用于含佐剂的流感病毒疫苗。多种这类乳液是已知的，它们一般包含至少一种油和至少一种表面活性剂，油与表面活性剂是可生物降解(可代谢)和生物相容性的。乳液中油滴的直径通常小于5(Lim，甚至可以是亚微米级，用微流化床实现这种小尺寸以提供稳定的乳液。优选小于220nm的液滴，因为它们可进行过滤除菌。本发明可使用的油诸如动物油(如鱼油)或植物油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷粒。坚果油中最常见的是花生油、大豆油、可可油和橄榄油。也可使用获自(例如)霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻油等。在谷粒油中，最常见的是玉米油，但也可采用其它谷类如小麦、燕麦、裸麦、稻、画眉草、黑小麦等的油。可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适的物质来制备6-10碳脂肪酸甘油酯和1,2-丙二醇，虽然这些物质不是种籽油中天然产生的。来自哺乳动物乳汁的脂肪和油是可代谢的，因此可用于实施本发明。由动物来源获得纯油的过程中必需的分离、纯化、皂化和其它步骤是本领域众所周知的。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油如鲸蜡代表了可用于本发明的几种鱼油的例子。通过生化途径用5-碳异戊二烯单元合成许多支链油，它们总称为萜类。鲨鱼肝油含有支链不饱和类萜，称为鲨烯2，6，10,15，19,23-六甲基-2,6，10，14,18,22-二十四碳六烯，本文特别优选此类萜。鲨烯的饱和类似物鲨垸也是优选的油。鱼油，包括鲨烯和鲨垸，易于从商业来源购得，或可通过本领域已知方法获得。其它优选油是生育酚(见下)。可采用油的混合物。可根据'HLB'(亲水/亲脂平衡值)对表面活性剂进行分类。本发明优选的表面活性剂的HLB至少为10，优选至少15，更优选至少16。可用于本发明的表面活性剂包括但不限于聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80;以商品名DOWFAXTM出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和成环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-l,2-乙二基)基团数量不同的辛苯聚糖，特别感兴趣的是辛苯聚糖9(TritonX-100，或t-辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPALCA-630/NP-40);磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬酚乙醇酯，如TergitolTMNP系列；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽表面活性剂)，如三乙二醇单月桂基醚(苄泽30);以及去水山梨糖醇酯(通常称为司盘)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子型表面活性剂。乳液中包含的优选表面活性剂是吐温80(聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和TritonX-IOO。可使用表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物。也适合采用聚氧乙烯去水山梨糖醇酯如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚糖如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(TritonX-100)的混合物。另一种有用的混合物包含聚乙二醇单月桂醚9和聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚糖。表面活性剂的含量(重量％)优选为聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐温80)0.01-1%，具体为约0.1%;辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如TritonX-IOO，或Triton系列的其它去污剂)0.001-0.1%，具体为0.005-0.02%;聚氧乙烯醚(如聚乙二醇单月桂醚9)0.1-20%，优选0.1-10%，具体是0.1-1%或约0.5%。本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于*鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。该乳液的体积组成可以是约5%鲨烯、约0.5%聚山梨酯80和约0.5%司盘85。以重量计，这些比例变为4.3%鲨烯、0.5%聚山梨酯80和0.48%司盘85。此佐剂称为'MF59'[125-127]，如参考文献128的第10章和参考文献129的第12章所详述。MF59乳液宜包含拧檬酸根离子，如lOmM柠檬酸钠缓冲液。，鲨烯、生育酚和吐温80的乳液。该乳液可包含磷酸盐缓冲盐水。它也可含有Span85(如1%)和/或卵磷脂。这些乳液可含有2-10%鲨烯、2-10%生育酚和0.3-3%吐温80，鲨烯:生育酚的重量比优选^，因为这能使乳液更稳定。鲨烯和吐温80的体积比可以约为5:2。可通过下述方法制备一种这样的乳液将吐温80溶解于PBS得到2%溶液，然后将90ml该溶液与5gDL-a-生育酚和5ml鲨烯的混合物混合，然后使该混合物微流体化。得到的乳液可含有(如)平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。'鲨烯、生育酚和Triton去污剂(如TritonX-100)的乳液。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。该乳液可含有磷酸盐缓冲液。，含有聚山梨酯(如聚山梨酯80)、Triton去污剂(如TritonX-100)和生育酚(如琥珀酸a-生育酚)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75:11:10(如750|ig/ml聚山梨酯80,110pg/mlTritonX-100和100[ig/ml琥珀酸a-生育酚)，这些浓度应包括抗原中这些组分的贡献。该乳液还可包含鲨烯。该乳液也可包含3d-MPL(见下)。水相可含有磷酸盐缓冲液。*鲨烯、聚山梨酯80和泊洛沙姆401("普流罗尼克TML121")的乳液。可以用磷酸盐缓冲盐水，pH7.4配制该乳液。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，已知与用"SAF-I"佐剂(0.05-l。/。Thr-MDP、5%鲨烯、2.5%PluronicL121和0.2%聚山梨酸酯80)配的苏氨酰基-MDP—起使用[130]。也可不与Thr-MDP一起使用，例如用"AF'佐剂(5。/。鲨烯、1.25%PluronicL121和0.2%聚山梨酸酯80)[131]。优选微流体化。*含有0.5-50%油、0.1-10%磷脂和0.05-5%非离子型表面活性剂的乳液。如参考文献132所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴大小。不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂体偶联物(如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GPI-OIOO，参见参考文献133)、二甲基二-十八烷基溴化铵和/或N,N-二-十八烷基-N,N-双(2-羟乙基)丙二胺。，皂苷(如QuilA或QS21)和固醇(如胆固醇)结合成螺旋胶束的乳液[134]。可以在递送时将该乳液与抗原临时混合。因此，在包装或出售的疫苗中该佐剂和抗原可分开保存，使用时配制成最终制剂。抗原通常是水性形式，以便最终通过混合两种液体制备疫苗。混合的两种液体的体积比可变(例如5:1-1:5)，但通常约为1:1。将抗原与佐剂混合之后，血凝素抗原通常保留在水溶液中，但其本身可分布于油/水界面附近。通常，血凝素很少(如果有)会进入该乳液的油相。当组合物包含生育酚时，可使用a、p、、、5、s或g生育酚中任何一种，但优选a-生育酚。生育酚可采取不同形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，例如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。D-a-生育酚和DL-a-生育酚均可使用。用于老年患者(如年龄大于60岁或更大的患者)的疫苗中宜包含生育酚，因为据报道维生素E在此患者群体中对免疫应答有正面作用[135]。它们也具有抗氧化特性，这种特性有助于稳定该乳液[136]。优选的a-生育酚是DL-a-生育酚，这种生育酚的优选盐是琥珀酸盐。发现琥珀酸盐在体内能与TNF相关配体协作。而且，已知琥珀酸a-生育酚与流感疫苗相容，并且是有用的替代含汞化合物的防腐剂[9]。细胞因子诱导剂给予患者时包含在本发明组合物中的细胞因子诱导剂能够引发免疫应答，以释放细胞因子，包括干扰素和白细胞介素。已知细胞因子应答参与针对流感病毒感染的宿主防御的早期和决定阶段[137]。优选药剂可引发以下一种或多种物质的释放干扰素Y;白细胞介素-l;白细胞介素-2;白细胞介素-12;TNF-a;TNF-P;和GM-CSF。优选的药剂引发与Thl型免疫应答有关的细胞因子释放，如干扰素Y、TNF-a、白介素-2。优选刺激千扰素i和白细胞介素-2。因此，接受本发明组合物的结果是，用流感抗原刺激时，患者的T细胞以抗原特异性方式释放所需细胞因子。例如，由血液纯化的T细胞在体外接触流感病毒血凝素时释放Y干扰素。本领域已知测定外周血单核细胞的这类应答的方法，包括ELISA、ELISPOT、流式细胞术和实时PCR。例如，参考文献138报道了监测针对破伤风类毒素的抗原特异性T细胞介导的免疫应答，特别是Y干扰素应答的一项研究，发现ELISPOT是区分抗原特异性TT诱导的应答与自发性应答的最灵敏的方法，但通过流式细胞术检测胞浆内细胞因子则是检测再剌激作用的最有效方法。合适的细胞因子诱导剂包括但不限于*免疫刺激性寡核苷酸，例如含有CpG基序的寡核苷酸(含有通过磷酸键连接于鸟嘌呤的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)、或双链RNA、或含有回文序列的寡核苷酸、或含有聚(dG)序列的寡核苷酸。.*3-0-脱酰化单磷酰脂质A('3dMPL'，也称为'MPIJM')[139-142]。'咪唑喹啉化合物，如咪喹莫特("R-837")[143,144]、瑞喹莫德("R-848")[145]和其类似物，以及它们的盐(如盐酸盐)。有关免疫刺激性咪唑喹啉的其它细节可参见参考文献146-150。縮氨基硫脲化合物，如参考文献151所述的化合物。参考文献151中也描述了配制、制备和筛选活性化合物的方法。縮氨基硫脲在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-a方面特别有效。色胺酮化合物，如参考文献152所述的化合物。参考文献152中也描述了配制、制备和筛选活性化合物的方法。縮氨基硫脲在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-a方面特别有效。核苷类似物，如(a)艾沙托立宾(Isatorabine)(ANA-245;7-硫杂-8-氧代鸟苷)及其前药(b)ANA975;(c)ANA-025-l;(d)ANA380;(e)参考文献153-155所述的化合物；(f)具有下式的化合物Rf、NR4式中R!和R2各自独立地是氢、卤素、-NRaRb、-OH、Cw烷氧基、取代的Cw垸氧基、杂环基、取代的杂环基、0:6.1()芳基、取代的Cw。芳基、Cl6院基或取代的Cl6焼基；R3不存在，或者是H、Cl6院基、取代的dv垸基、(36.1()芳基、取代的<:6.1()芳基、杂环基或取代的杂环基；R4和Rs各自独立地是氢、卤素、杂环基、取代的杂环基、-C(O)-Rd、d.6垸基、取代的Cl6院基，或结合在一起形成5元环，如114.5:在^所示的化学键处实现结合，X!和X2各自独立地是N、C、O或S;R8是氢、卤素、-OH、Cm垸基、C2.6烯基、C2.6炔基、-OH、-NRaRb、-(CHA-O-R^-0-((:1.6烷基)、-S(O)pRe或-C(O)-Rd;R9是氢、Cl6焼基、取代的Cl6焼基、杂环基、取代的杂环基或R^，其'x2中R9a是:在^w所示的化学键处实现结合，RK)和Ru各自独立地是氢、卤素、CL6垸氧基、取代的CL6垸氧基、-NRaRb或-OH;Ra和Rb各自独立地是氢、Cw烷基、取代的cv6烷基、-C(O)Rd、Cwo芳基；Re各自独立地是氢、磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、Cw垸基或取代的C"6院基；Rd各自独立地是氢、卤素、d，6烷基、取代的Cl6院基、CL6烷氧基、取代的Cw垸氧基、-NH2、-,(<:1.6烷基)、-NH(取代的Cw垸基)、-N(C1.6垸基)2、-N(取代的CL6烷基)2、C6.u)芳基或杂环基；&各自独立地是氢、Cl6院基、取代的Cl6院基、cvu)芳基、取代的<:6.10芳基、杂环基或取代的杂环基；Rf各自独立地是氢、Cw烷基、取代的Cl6院基、-C(O)Rd、磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯基；n各自独立地是0、1、2或3;p各自独立地是0、l或2;或者(g)(a)-(f)中任一项的药学上可接受的盐，(a)-(f)中任一项的互变异构体，或互变异构体的药学上可接受的盐。*洛索立宾(7-烯丙基-8-氧代鸟苷)[156]。，参考文献157所述化合物，包括酰基哌嗪化合物、吲哚二酮化合物、四氢异喹啉(THIQ)化合物、苯并环二酮化合物、氨基氮杂乙烯基化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮(ABIQ)化合物[l58,159]、水合酞酰胺(hydrapthalamide)化合物、苯并苯基酮化合物、异嚼唑化合物、固醇化合物、喹唑啉酮(quinazilinone)化合物、吡咯化合物[160]、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、吡唑并喷啶化合物和吲哚化合物[161]。，参考文献162所述化合物。.氨垸基氨基葡糖苷磷酸衍生物，如RC529[163，164]。*磷腈，如参考文献165和166中所述的聚[二(羧酸苯氧基)磷月青](poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene]，"PCPP，，)。H、分子免疫增强剂(SMIP)，例如N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；N2，N2-二甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-乙基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；l-(2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2，4-二胺；N2-丁基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-丁基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-戊基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；l-(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫代]-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺；1-(2-甲基丙基)-2-(丙硫基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺；2-[[4-氨基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙醇；2-[[4-氨基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙酸乙酯；4-氨基-l-(2-甲基丙基)-l,3-二氢-2H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮；N2-丁基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-双(苯基甲基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4,N4-双(苯基甲基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-双(苯基甲基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2,N2-二甲基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-双(苯基甲基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；1-{4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-111-咪唑并[4,5《]喹啉-1-基}-2-甲基丙-2-醇；l-[4-氨基-2-(丙基氨基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-l-基]-2-甲基丙-2-醇；N4,N4-二,基-l-(2-甲氧基-2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺。用于本发明的细胞因子诱导剂可以是Toll样受体(TLR)的调节剂和/或激动剂。例如，它们可以是人TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9蛋白中一种或多种的激动剂。优选试剂是TLR7激动剂(如咪唑并喹啉)和/或TLR9激动剂(如CpG寡核苷酸)。这些试剂可用于激活先天性免疫途径。可以在本发明组合物生产过程的各个阶段加入细胞因子诱导剂。例如，可将其加入抗原组合物中，然后将此混合物加入水包油乳液中。或者，可将其加入水包油乳液中，在这种情况下可以在乳液组分乳化之前加入该试剂，或者可以在乳液乳化后加入该试剂。相似地，该试剂可以凝聚在乳液液滴中。细胞因子诱导剂在最终组合物中的位置和分布将取决于其亲水/亲脂特性，例如该药剂可位于水相、油相和/或油水界面上。该细胞因子诱导剂可偶联于另一种试剂，如抗原(如CRM197)。参考文献167中提供了有关小分子偶联技术的综述。或者，佐剂可与其它试剂非共价(例如通过疏水作用或离子相互作用)结合。两种优选的细胞因子诱导剂是(a)免疫刺激性寡核苷酸和(b)3dMPL。免疫刺激性寡核苷酸可包含核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，可以是双链或(除RNA外)单链。参考文献168、169和170公开了可能的类似取代，例如用2'-脱氧-7-脱氮鸟苷代替鸟苷。参考文献171-176中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。CpG序列可能导向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[177]。CpG序列可特异性诱导Thl免疫应答，例如CpG-AODN(寡脱氧核糖核苷酸)，或更特异地诱导B细胞应答，例如CpG-BODN。参考文献178-180中讨论了CpG-A和CpG-BODN。CpG优选CpG-AODN。优选构建CpG寡核苷酸时使其5'端可为受体所识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3'端相连接形成"免疫聚体"。参见例如，参考文献177和181-183。游泳的CpG佐剂是CpG7909，也称为ProMune(科雷制药集团公司(ColeyPharmaceuticalGroup,Inc.))。或者，或此外，除使用CpG序列外，也可使用TpG序列[184]。这些寡核苷酸可以不含未甲基化的CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸可能富含嘧啶。例如，它可能含有一个以上连续的胸腺嘧啶核苷酸(例如，参考文献184所公开的TTTT)，和/或它的核苷酸组成中可能含有>25%胸腺嘧啶(例如>35%、>40%、>50%、>60%、>80%等)。例如，它可能含有一个以上连续的胞嘧啶核苷酸(例如，参考文献184所公开的CCCC)，和/或它的核苷酸组成中可能含有>25%胞嘧啶(例如>35%、>40%、>50%、>60%、>80%等)。这些寡核苷酸可以不含未甲基化的CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸一般含有至少20个核苷酸。它们可含有少于100个核苷酸。3dMPL(也称为3脱-O-酰化单磷酰脂质A或3-0-脱酰化-4'-单磷酰脂质A)是单磷酰脂质A的还原性末端葡糖胺的3位脱酰化的佐剂。3dMPL可由明尼苏达沙门菌0^/附0恥///m'"M^oto)的无庚糖突变体制备，在化学上类似于脂质A，但缺少酸-不稳定性磷酰基和碱-不稳定性酰基。它能激活单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞，并刺激几种细胞因子的释放，包括IL-I、IL-12、TNF-a和GM-CSF(也参见参考文献185)。参考文献186最先描述了3dMPL的制备。3dMPL可以采取酰基化不同的相关分子(如具有3、4、5或6个酰基链，它们的长度可以不同)的混合物的形式。两个葡糖胺(也称为2-脱氧-2-氨基-葡萄糖)单糖在其2-位(即2和2'位)碳上N-酰基化，3'位上也有O-酰基化。连接于碳2的基团具有下式-NH-CO-CHrCRiR1:连接于碳2'的基团具有下式-NH-CO-CH2-CR2R2'。连接于碳3'的基团具有下式-0-CO-CH2-CR3R3'。代表性结构为基团R1、R2和R3各自独立地是-(CH2VCH3。n值优选为8-16，更优选为9-12，最优选为10。基团R1,、W和R3'各自独立地是(a)-H;(b)-OH;或(c)-O-CO-R4，其中R4是-H或-(CH2)m-CH3，其中m值优选为8-16，更优选为10、12或14。在2位上，m优选为14。在2'位上，m优选为10。在3'位上，m优选为12。因此基团R"、R"和RS'优选为来自十二烷酸、十四垸酸或十六烷酸的-O-酰基。R"、W和RS'均为-H时，3dMPL仅含有3条酰基链(2、2'和3'位置上各有一条)。R、R2'和R3'中仅有两个是-H时，3dMPL可含有4条酰基链。R、R2'和RS'中仅有一个是-H时，3dMPL可含有5条酰基链。R"、W和113'中没有一个是-H时，3D-MPL可含有6条酰基链。本发明所用的3dMPL佐剂可以是含有3-6条酰基链的这些形式的混合物，但混合物中优选包含具有6条酰基链的3dMPL，具体说，保证6条酰基链的形式占3dMPL总重的至少10%，例如^20%、230%、240%、三50%或更多。发现具有6条酰基链的3dMPL是佐剂活性最高的形式。因此，本发明组合物包含的3dMPL的最优选形式具有下式(IV)。以混合物的形式使用3dMPL时，提到3dMPL在本发明组合物中的含量或浓度，指混合物中的混合3dMPL物质。在水性条件下，3dMPL可形成不同大小，如直径〈150nm或〉500nm的胶束聚集体或颗粒。其中一种或两者都可用于本发明，可通过常规实验选择更好的颗粒。本发明优选使用小颗粒(如小到足以产生澄清的3dMPL水悬液)，因为它们活性高[187]。优选颗粒的平均直径小于220nm，更优选小于200nm，小于150nm，或小于120nm，它们的直径甚至可以小于100nm。然而在大多数情况下，平均直径不小于50nm。这些颗粒足够小，以便适合过滤除菌。可用揭示平均粒径的常规技术动态光散射评价粒径。据称颗粒的直径为xnm时，粒径通常分布在此平均值附近，但至少50数量％(例如^60%、270%、^80%、290%或更多)颗粒的直径在灶25%的范围内。3dMPL宜与水包油乳液联合使用。基本上所有3dMPL均位于该乳液的水相中。3dMPL可以独自使用，或者与一种或多种其它化合物联用。例如，已知将3dMP与以下物质联用QS21皂苷[188](包含在水包油乳液中[189])、免疫刺激性寡核苷酸、QS21和免疫刺激性寡核苷酸、磷酸铝[190]、氢氧化铝[191]或磷酸铝和氢氧化铝。脂肪佐剂可用于本发明的脂肪佐剂包括上述水包油乳液，还包括例如:式i、n或m的化合物或其盐<formula>formulaseeoriginaldocumentpage32</formula>，1如参考文献192所述，如'ER803058'、'ER803732'、'ER804053'、'ER804058'、'ER804059'、'ER804442'、'ER804680'、'ER804764'、'ER803022'或'ER804057'，如<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula>ER-8(B022:大肠杆菌(^sc/2w/c/n'aco/Z)的脂质A的衍生物如OM-174(如参考文献193和194所述)。阳离子脂质与(通常为中性讲脂质(co-lipid)的制剂，如氨基丙基-二甲基-肉豆蔻烯酰氧基-溴化丙铵-二植酰基磷脂酰-乙醇胺("VaxfectinTM")或氨基丙基-二甲基-双十二垸基氧基-溴化丙铵-二油酰基磷脂酰-乙醇胺("GAP-DLRIE:DOPE")的制剂。优选含有(士)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(顺-9-四癸烯氧基)-l-丙铵盐的制剂[195]。3-0-脱酰化单磷酰脂质A(见上)。含有连接于含磷酸开环主链的脂质的化合物，如TLR4拮抗剂E5564[196,197]:铝盐佐剂可使用称为氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。这些名称是常规名称，但仅为方便使用，因为它们都不是所代表的实际化合物的准确描述[例如参见参考文献128的第9章]。本发明可采用通常用作佐剂的任何"氢氧化物"或"磷酸盐"佐剂。称为"氢氧化铝"的佐剂一般是羟基氧化铝盐(通常至少部分为晶体)。可采用红外(IR)光谱将式A10(0H)代表的羟基氧化铝与其它铝化合物，如氢氧化铝Al(OH)3区别开，具体区别是1070cm'1处存在吸收条带和3090-3100cm"处存在强肩峰[参考文献128的第9章]。半高时衍射条带的宽度(WHH)反映出氢氧化铝佐剂的结晶度，结晶差的颗粒由于结晶较小而谱线增宽较大。随着WHH增加，表面积增大，观察到WHH值较高的佐剂具有较大的抗原吸附能力。纤维形态(如透射电镜照片中所见)是氢氧化铝佐剂的典型形态。氢氧化铝佐剂的pl一般约为ll,即该佐剂本身在生理pH下表面带正电荷。据报道，pH7.4时氢氧化铝佐剂的吸附容量为1.8-2.6毫克蛋白质/毫克Ar\称为"磷酸铝"的佐剂一般是羟基磷酸铝，也常常含有少量硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。它们可通过沉淀获得，沉淀期间的反应条件和浓度都会影响该盐中磷酸取代羟基的程度。羟基磷酸盐的P04/A1摩尔比通常为0.3-1.2。可以通过是否存在羟基将羟基磷酸盐与严格的A1P04区别开。例如，3164cm"处的IR谱带(例如加热到20(TC)表明存在结构羟基[参考文献128的第9章]。磷酸铝佐剂的P04/A产摩尔比通常为0.3-1.2，优选为0.8-1.2，更优选为0.95±0.1。磷酸铝通常是无定形的，尤其是羟基磷酸盐。典型的佐剂是P04/A1摩尔比为0.84-0.92的无定形的羟基磷酸铝，每毫升包含0.6mgA产。磷酸铝通常是颗粒(如在透射电子显微镜照片上观察到的板状形态)。抗原吸附后颗粒直径一般是0.5-20pm(如约5-l(^m)。据报道，pH7.4时磷酸铝佐剂的吸附容量为0.7-1.5毫克蛋白质/毫克A广+。磷酸铝的零电荷点(PZC)与磷酸对羟基的取代程度逆相关，这种取代程度可能取决于用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度。也可通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根=偏酸性PZC)或加入缓冲液如组氨酸缓冲液(使PZC偏碱性)来改变PZC。本发明所用的磷酸铝的PZC通常为4.0-7.0，更优选为5.0-6.5，例如约为5.7。用于制备本发明组合物的铝盐悬浮液可以，但不一定含有缓冲液(如磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲液)。该悬浮液优选无菌且无热原。该悬浮液可含有游离的水性磷酸根离子，如浓度为1.0-20mM，优选5-15mM，更优选约10mM的磷酸根离子。该悬浮液也可含有氯化钠。本发明可使用氢氧化铝和磷酸铝的混合物[89]。在这种情况下，磷酸铝比氢氧化铝多，例如重量比为至少2:1，例如S:1、26:1、27:1、28:1、29:1等。给予患者的组合物中Af^的浓度优选小于10mg/ml，例如^5mg/ml、mg/ml、S3mg/ml、￡2mg/ml、Slmg/ml等。优选范围是0.3-1mg/ml。最大值优选为0.85毫克/剂量。除包含一种或多种铝盐佐剂外，佐剂组分还可包含一种或多种其它佐剂或免疫刺激剂。其它这类组分包括但不限于3-0-脱酰化单磷酰脂质A佐剂('3d-MPL');和/或水包油乳液。3dMPL也称为3脱-O-酰化单磷酰脂质A或3-0-脱酰化-4'-单磷酰脂质A。该命名表明单磷酰脂质A的还原性末端葡糖胺的3位脱酰化。它是由明尼苏达沙门菌(S.m/""Moto)的无庚糖突变体(heptoselessmutant)制备，在化学上类似于脂质A，但缺少酸-不稳定性磷酰基和碱-不稳定性酰基。它能激活单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞，并刺激释放几种细胞因子，包括IL-I、IL-12、TNF-a和GM-CSF。最初在参考文献186中描述了3d-MPL的制备，该产品由考科萨公司(CorixaCorporation)生产并以商品名MPIJM出售。其它详情可参见参考文献139-142。药物组合物本发明组合物优选为药学上可接受的组合物。除抗原外，它们通常还包含其它组分，例如它们一般包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。对这类组分的充分讨论参见参考文献198。该组合物通常是水性形式。该组合物可含有防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗优选应基本不含(即小于5吗/ml)汞物质，如不含硫柳汞[9，199]。更优选不含汞的疫苗。特别优选不含防腐剂的疫苗。为了控制张力，优选包含生理性盐如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，它的浓度可以是l-20mg/ml。可以存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、二水合磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。组合物的渗透压通常为200-400mOsm/kg，优选为240-360mOsm/kg，更优选为290-310mOsm/kg。虽然以前报道过渗透压对疫苗接种引起的疼痛无影响[200]，但优选将渗透压保持在此范围内。组合物可含有一种或多种缓冲剂。缓冲剂一般包括磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(特别是与氢氧化铝佐剂联用时)；或柠檬酸盐缓冲剂。包含的缓冲剂的浓度一般是5-20mM。组合物的pH通常为5.0-8.1，更一般为6.0-8.0，例如6.5-7.5，或者7.0-7.8。因此，本发明方法可包括在包装前调整本体疫苗pH的步骤。该组合物优选无菌。该组合物优选无热原，如每剂量含量〈1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量O.IEU。该组合物优选不含谷蛋白。本发明组合物可包含去污剂，如聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(称为'吐温')、辛苯聚糖(如辛苯聚糖-9(TritcmX-100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、溴化十六烷基三甲铵('CTAB')或脱氧胆酸钠，特别适用于裂解疫苗或表面抗原疫苗。去污剂可仅以痕量存在。因此，疫苗中辛苯聚糖-10和聚山梨醇酯80各自的含量可以小于lmg/ml。其它痕量残留组分可以是抗生素(如新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。该组合物可含有一次免疫的物质，或者可含有多次免疫的物质(即多剂量药盒)。采用多剂量方式时优选含有防腐剂。作为多剂量组合物中包含防腐剂的替代方案(或除此之外)，该组合物可包装具有在用于取出物质的无菌接头的容器中。流感疫苗的典型给药体积约为0.5ml，但也可将一半剂量(即约0.25ml)给予儿童。组合物和药盒优选储存于2-8。C。不应被冷冻。理想地，应避光保存。本发明药盒递送时，特别是使用佐剂时，可以临时制备本发明组合物。因此，本发明提供了包含各种易混组分的药盒。该药盒可将佐剂和抗原单独保存，直到使用。使用水包油乳液佐剂时这种安排特别有用。在药盒中各组分在物理上互相分离，可通过各种方式实现这种分离。例如，这两种组分可以装在两个不同的容器，如药瓶中。可通过(例如)取出一个药瓶的内容物并将其加入另一个药瓶，或者分别取出两个药瓶的内容物并在第三个容器中将它们混合在一起，来混合两个药瓶的内容物。在优选的安排中，药盒的一种组分在注射器中，另一种组分在容器如药瓶中。可使用该注射器(例如装有针头的注射器)将其内容物注入第二个容器中混合，然后将该混合物抽回注射器中。然后，一般通过新的无菌针头将该注射器中的混合成分给予患者。将一种组分包装到注射器中使得不需要另外准备注射器进行给药。在另一优选的安排中，这两种药盒组分在同一注射器，例如双室注射器(如参考文献201-208等所述)中分开保存。当注射器致动时(例如给予患者时)，则这两室中的内容物混合。这种安排避免了使用时的单独混合步骤。该药盒组分通常是水性形式。在一些安排中，组分(一般是抗原组分而非佐剂组分)是干燥形式(例如冻干形式)，而另一组分是水性形式。可将这两种组分混合以重新活化干燥组分，得到给予患者的水性组合物。冻干组分一般装在药瓶中而非注射器中。干燥组分可包含稳定剂，例如乳糖、蔗糖或甘露醇，及其混合物，如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。一种可能的安排是将水性佐剂组分装在预填装的注射器中，而将冻干的抗原组分装在药瓶中。组合物或药盒组分的包装适用于本发明组合物(或药盒组分)的容器包括药瓶、注射器(如一次性注射器)、鼻喷雾等。这些容器应无菌。组合物/组分位于药瓶中时，该药瓶优选由玻璃或塑料材料制成。在将组合物加入药瓶之前，优选对其进行消毒。为了避免胶乳敏感型患者的问题，优选用无胶乳的塞子密封药瓶，优选所有包装材料中不含胶乳。药瓶可包括单一剂量的疫苗，或者可以包括一个以上剂量('多剂量'药瓶)，如10个剂量。优选的药瓶由无色玻璃制成。药瓶可以有适合的帽(如路厄锁)，以便将预填装注射器插入该帽，将注射器的内容物推入药瓶(如在其中重建冻干物质)，并将药瓶的内容物吸回注射器中。从药瓶中拔出注射器后，可连上针头，并将该组合物给予患者。该帽优选位于封口或盖子内侧，以便在封口或盖子打开后才能接触到该帽。药瓶，特别是多剂量药瓶装有瓶帽，以便无菌地取出其内含物。某组分包装在注射器中时，该注射器可连有针头。如果未连接针头，可随注射器提供单独的针头以便组装和使用。这种针头可装在护罩中。优选安全性针头。一般是l-英寸23-号、l-英寸25-号和5/8-英寸25-号针头。可提供有剥离标签的注射器，该标签上可打印上批号、流感季节和过期日期，以帮助记录保存。注射器的活塞优选带有抑止装置，以防止活塞在吸出时偶然脱出。注射器可以有胶乳橡胶帽和/或活塞。一次性注射器含有单一剂量的疫苗。注射器通常带有顶帽，以在连接针头前密封顶端，顶帽优选由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装，那么针头优选装有丁基橡胶护罩。优选的注射器是以商品名"Tip-Lok"TM销售的注射器。容器可标注有半剂量体积，以便递送给儿童。例如，含有0.5ml剂量的注射器可标有0.25ml体积的标记。采用玻璃容器(如注射器或药瓶)时，优选采用由硼硅酸盐玻璃，而非钠,丐玻璃制成的容器。可将药盒或组合物与单页宣传品包装在一起(在同一个箱子中)，所述单页宣传品包括疫苗的详细情况如给药说明书、疫苗内所含抗原的详情等。说明书也可包含警告，(例如)准备好肾上腺素溶液以应对疫苗接种后发生过敏反应的情况等。在本发明的一些实施方式中，所述单页宣传品上记载该疫苗包含基质蛋白。治疗方法和疫苗的给药本发明组合物适合给予人类患者，本发明提供了在患者中产生免疫应答的方法，该方法包括将本发明组合物给予患者的步骤。本发明也提供用作药物的本发明药盒或组合物。本发明也提供(i)由细胞培养物培养的病毒制备的含有血凝素和基质蛋白的流感病毒抗原制剂在制备引发患者免疫应答的药物中的应用。这些方法和应用引发的免疫应答通常包括抗体应答，优选保护性抗体应答。评价接种流感病毒疫苗后抗体应答、中和能力和保护作用的方法是本领域众所周知的。人体研究表明，对人流感病毒血凝素的抗体效价与保护作用相关联(约30-40的血清样品血凝反应-抑制效价对同源病毒感染产生约50%保护作用)[209]。一般通过血凝反应抑制、微量中和、单径向免疫扩散和/或单径向溶血(SRH)来测定抗体应答。本领域熟知这些测定技术。可以各种方式给予本发明组合物。最优选的免疫途径是肌内注射(如注射到上肢或下肢)，但其它可用的途径包括皮下注射、鼻内[210-212]、口服[2B〗、皮内[214,215]、经皮、透皮[216]等。可采用按照本发明制备的疫苗来治疗儿童和成年人。目前，推荐将流感疫苗用于年龄>6个月的儿童和成年人免疫。因此，患者可以小于l.岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受该疫苗的优选患者是老年人(例如^50岁、260岁，优选S65岁)、年轻人(如S5岁)、住院患者、健康护理工作人员、军队服务人员和军人、妊娠妇女、慢性疾病患者、免疫缺陷患者、在接受该疫苗前7天接受过抗病毒化合物(如奥塞米韦或扎那米韦化合物；见下)的患者、对鸡蛋过敏的人和出国旅行者。然而，该疫苗不只适用于这些人群，还可以在更广泛的人群中使用。就大流行毒株而言，优选给予所有年龄的人。本发明优选组合物满足CPMP的功效标准1、2或3。在成年人(18-60岁)中，这些标准是(1)270%血清保护；(2)三40%血清转化；和/或(3)GMT增加^2.5倍。在老年人(>60岁)中，这些标准是(1)^60%血清保护；(2)S0。/。血清转化；和/或(3)GMT增加^2倍。这些标准基于至少50位患者的开放标记研究。可以通过单剂量方案或多剂量方案进行治疗。多剂量可用于初免方案和/或加强免疫方案。在多剂量方案中，可通过相同或不同途径给予各种剂量，例如初免采用胃肠外途径而加强免疫采用粘膜途径，或者初免采用粘膜途径而加强免疫采用胃肠外途径等。给予一个以上剂量(一般是两个剂量)特别可用于免疫未曾免疫接触的患者，例如从未接受过流感疫苗的人，或者用于免疫对抗新的HA亚型(如大流行爆发中的亚型)。多剂量的给予一般至少间隔1周(例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等)。可将本发明产生的疫苗与其它疫苗基本上同时给予患者(在对健康护理专业人员或疫苗接种中心的同一次用药咨询或访问期间)，例如与麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶联的B型流感嗜血杆菌疫苗、脊髓灰质炎病毒灭活疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联疫苗(如四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞病毒疫苗、肺炎球菌偶联疫苗等同时给药。在老年患者中特别有用的是与肺炎球菌疫苗和/或脑膜炎球菌疫苗基本上同时给药。相似地，可将本发明疫苗与抗病毒化合物，具体是对流感病毒有活性的抗病毒化合物(如奥塞米韦和/或扎那米韦)基本上同时给予患者(在对健康护理专业人员的同一次用药咨询或访问期间)。这些抗病毒化合物包括神经氨酸酶抑制剂，如(3R,4R,5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(l-乙基丙氧基)-l-环己烯-l-羧酸或5-(乙酰基氨基)-4-[(氨基亚氨基甲基)-氨基]-2，6-脱水-3,4,5-三脱氧-D-甘油-D-半乳糖壬-2-烯酮酸，包括它们的酯(如乙酯)和盐(如磷酸盐)。优选的抗病毒化合物是(311,411,58)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-l-羧酸的乙酯和磷酸盐(l:l)，也称为磷酸奥塞米韦(TAMIFLUTM)。实验为了鉴定流感疫苗，可能需要测定存在的基质蛋白的含量。因此，本发明提供分析流感疫苗的实验，其中分析疫苗样品以确定是否存在基质蛋白。该实验特别适用于检测M1蛋白的片段。流感疫苗可包含来自流感A和/或流感B病毒的抗原。本发明提供了分析含有来自流感B病毒的抗原的疫苗的实验，其中分析疫苗样品以确定是否存在流感B病毒基质蛋白。流感疫苗可包含来自各种HA亚型的抗原。本发明提供分析含有来自流感A病毒的抗原的疫苗的实验，其中分析疫苗样品以确定是否存在流感A病毒基质蛋白，所述流感A病毒所含的血凝素亚型选自H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14、H15或H16。流感疫苗可包含细胞培养物培养的抗原。本发明提供分析细胞培养物上培养的疫苗的实验，其中分析疫苗样品以确定是否存在流感病毒基质蛋白。该流感疫苗可包含佐剂。本发明提供分析含佐剂流感疫苗的实验，其中分析疫苗样品以确定是否存在流感病毒基质蛋白。本发明也提供分析不含佐剂的流感疫苗的实验，其中分析不含佐剂的疫苗样品以确定是否存在流感病毒基质蛋白，然后将佐剂加入疫苗中。这些实验一般是免疫实验，例如Western印迹或ELISA。免疫实验可采用多克隆或单克隆抗体。在一些实施方式中，使用单克隆抗体时，抗体不是鼠抗体，如鼠IgGl抗体。本实验可采用识别Ml片段的抗体，包括识别本文所述Ml片段的抗体，例如识别分子量为10kDa或更低(如^5kDa)的片段的抗体、识别缺少N末端甲硫氨酸的片段的抗体、识别含有SEQIDNO:15N末端序列的片段的抗体、识别SEQIDNO:28和/或29的抗体、识别包含SEQIDNO:30的片段的抗体、识别含有共价修饰的N末端残基的片段的抗体等。该实验特别适用于检测Ml蛋白的片段，如分子量为10kDa或更低(如S5kDa)的片段，和/或本文所述片段(如缺少全长Ml序列的N末端甲硫氨酸的片段)。优选实验可区分全长M1蛋白与M1蛋白的片段，也可区分不同片段。这些实验是定性、半定量或定量的。本发明也提供以此方式测定的疫苗。本发明其它方面本发明也提供一种含有(i)流感病毒血凝素和基质蛋白，和(ii)佐剂的免疫原性组合物。由细胞培养物或鸡蛋培养的病毒制备流感病毒蛋白。如上所述，该组合物也可包含其它组分，如流感病毒神经氨酸酶蛋白、药学载体/赋形剂等。本发明也提供一种制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤(i)培养流感病毒；(ii)由步骤(i)培养的病毒制备抗原组合物，其中所述抗原组合物包含血凝素和基质蛋白；以及(iii)将所述抗原组合物与佐剂混合得到所述免疫原性组合物。本发明提供一种含有(i)流感病毒血凝素和基质蛋白的免疫原性组合物，其中血凝素具有选自下组的亚型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14、H15或H16。本发明也提供了一种制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤(i)培养流感病毒；(ii)由步骤(i)培养的病毒制备抗原组合物，其中所述抗原组合物含有血凝素和基质蛋白，其中血凝素具有选自下组的亚型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14、H15或H16;和(iii)将所述抗原组合物与佐剂混合得到所述免疫原性组合物。本发明提供一种含有(i)流感病毒血凝素和基质蛋白的免疫原性组合物，所述组合物中血凝素的浓度为29吗/ml或更低(例如28吗/ml、《7ng/ml、S26[ig/ml、S25)ig/ml、S24吗/ml、S23|ig/ml、S22吗/ml、S21jig/ml、S20ixg/ml、Sl9jig/ml、Sl8jig/ml、Sl7(ig/ml、Sl6吗/ml、￡15pg/ml、^14fxg/ml、^13pg/ml、Sl2昭/ml、Sllng/ml、SlO吗/ml、S9吗/ml、^8吗/ml、^7pg/ml、^6pg/ml、S5昭/ml、S4吗/ml、S3pg/ml、《pg/ml)。该组合物可包含来自一种以上流感毒株的血凝素，在这种情况下所述浓度是每种毒株的浓度(即每种毒株^29ng/ml)。本发明提供一种含有(i)流感病毒血凝素和基质蛋白的免疫原性组合物，所述组合物中血凝素的浓度为31吗/ml或更高(例如232吗/ml、S3吗/ml、>34pg/ml、S35pg/ml、^40吗/ml、245ng/ml、^50吗/ml、^55pg/ml、^60ng/ml、270吗/ml、280|ig/ml、^90吗/ml、SlOOiig/ml等，但一般<200吗)。该组合物可包含来自一种以上流感毒株的血凝素，在这种情况下所述浓度是每种毒株的浓度(即每种毒株231pg/ml)。本发明也提供一种含有流感病毒M2基质蛋白，但基本不含上述流感病毒基质蛋白Ml的免疫原性组合物。目前正在开发含M2的疫苗[217]。在天然情况下，M2也由编码M1的病毒区段编码。因此，在重组表达系统中，Ml蛋白可能作为副产物表达。根据本发明，可避免这种副表达，或者可由含有M2的组合物中去除M1基质蛋白。M2蛋白可以是全长蛋白，或者可以(例如)是M2片段，如M2胞外域(本领域称为'M2e')。可将M2蛋白偶联于另一种抗原，例如乙型肝炎病毒抗原。该疫苗也可不含HA和/或NA。概述术语"含有"包括"包含"以及"由......组成"，例如"含有"x的组合物排他性地由X组成或者可包含其他物质，例如X+Y。术语"基本上"不排除"完全"，如"基本上不含"Y的组合物可能完全不含Y。必要时，可从本发明定义中删去术语"基本上"。与数值x相关的术语"约"表示，例如乂±10%。除非另有说明，包括混合两种或多种组分的步骤的方法不要求任何特定的混合顺序。因此，可以任何顺序混合这些组分。有三种组分时，两种组分可以相互混合，然后将混合的组分再与第三种组分混合等。将动物(具体是牛)材料用于培养细胞时，它们应获自未患传染性海绵状脑病(TSE)，特别是未患牛海绵状脑病(BSE)的来源。总之，优选在完全不含动物来源物质的情况下培养细胞。当某化合物作为组合物的一部分给予人体时，该化合物可选地由合适的前药所替换。当使用细胞底物进行病毒再造或逆向遗传学方法时，优选批准用于人类疫苗生产的细胞底物，例如欧洲药典总纲5.2.3所述的细胞底物。优选通过MPSRCH程序(牛津分子科技公司(OxfordMolecular))执行的Smith-Waterman同源性搜索算法，利用仿射缺口搜索测定多肽序列之间的相同性，其中参数为缺口开放罚分=12、缺口延伸罚分=1。附图简要说明图1是各种疫苗制剂的SDS-PAGE。'M'泳道是分子量标记(kDa)。泳道1是MDCK培养的疫苗。泳道2-6是现有的巿售疫苗。箭头显示了(a)HA,(b)HA2(c)本发明Ml片段。图2显示采用5kDa基质蛋白片段免疫的兔抗血清测定分级的(fractionated)流感病毒颗粒的Western印迹分析结果。左图是利用免疫前血清获得的印迹，右图中使用免疫后血清。本发明实施方式虽然研究的是在MDCK细胞中培养病毒颗粒后纯化的流感病毒表面抗原疫苗，但观察到用CTAB裂解流感A病毒后SDSPAGE可检测到大量低分子量多肽。在进一步抗原纯化期间以及最终的表面抗原制剂中也存在此种低分子量多肽。为了研究此种多肽，利用能够鉴定小至2kDa的缓冲体系(英杰公司(Invitrogen)的NuPAGENovexBis-Tris凝胶)进行检测。使用此种体系，能鉴定表观分子量约5kDa的多肽条带。在目前的INFLEXALV、INFLUSPLIT、MUTAGRIPtm、VAXIGRIPtm、BEGRIVACTM、FLUARIXTM、INFLUVAC或FLUVIRINTM疫苗(均由鸡蛋培养的病毒颗粒制备)中没有观察到这一多肽条带。令人惊讶的是，在一些批次的AGRIPPALTM中检测到这一多肽条带，但以前未曾认识到它的存在。用此种5kDa条带免疫兔，诱导能够检测天然M1蛋白的抗体。图2显示兔抗血清测定各分级的(fractionated)流感病毒颗粒的Western印迹分析结果，显示对病毒颗粒M1蛋白的反应性很强。因此，该5kDa条带中的多肽携带有免疫原性并且可导致产生结合于相应的天然Ml蛋白的抗体的表位。对两种不同病毒(H1N1病毒和H3N2病毒)产生的5kDa条带进行N末端氨基酸序列分析显示出一种含有N末端序列EISLSYSAGALA(SEQIDNO:15)的多肽。这一氨基酸序列是流感病毒M1蛋白的片段，与SEQIDNO:l的氨基酸位置114-125相同。用MS分析胰蛋白酶水解片段的进一步研究揭示，缺少SEQIDNO:1的N末端甲硫氨酸的含有N末端氨基酸序列SEQIDNO:28的片段丰度较高，该片段为VPSERGI)QRfS￡!3TO恥28)此片段的C末端可含有一个额外的Arg残基(即SLL...QRR,SEQIDNO:29)。可共价修饰(如乙酰化)N末端丝氨酸。此片段的N末端12个单位(SLLTEVETYVLS;SEQIDNO:30)在各毒株之间非常保守。本发明组合物可含有这两个片段，接近N末端的片段(如SEQIDNO:28)丰度较高。应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可在本发明的范围和构思内进行修改。参考文献(将其内容纳入本文作参考)Vaccines(疫苗)，(Plotkin和Orenstein编)，第4版，2004，ISBN:0-7216-9688-0。Chaloupka等(1996)EurJClinMicrobiolInfectDis15:121-7。W096/37624。W098/46262。WO02脂22。WO02/067983。WO02顯336。WO01/2115LWO02/097072。WO2005/113756。WorldHealthOrganisation(世界卫生组织)(2005)EmergingInfectiousDiseases(新兴的传染病)11(10):1515-21。Herlocher等(2004)JInfectDis190(9):1627-30。Le等(2005)Nature437(7062):1108。Hoffmann等(2002)Vaccine20:3165-3170。Subbarao等(2003)Virology305:192-200。Liu等(2003)Virology314:580-590。Ozaki等(2004)J.Virol.78:1851-1857。Webby等(2004)Lancet363:1099-1103。WO00細50。WO01/04333。美国专利6649372。Neumann等(2005)ProcNatlAcadSciUSA102:16825-9。[24]WO2006/0672U。WOO1/83794。Hoffmann等(2000)Virology267(2):310-7。WO97/37000。Brands等(1999)DevBiolStand98:93-100。Halperin等(2002)Vaccine20:1240-7。Tree等(20(H)Vaccine19:3444-50。Kistner等(1998)Vaccine16:960-8。Kistner等(1999)DevBiolStand98:101-110。BrvM等(2000)Vaccine19:1149-58。Pau等(2001)Vaccine19:2716-21。http:〃www.atcc.org/http:〃locus.umdnj.edu/WO03/076601。WO2005/042728。WO03趣415。WO01/85938。WO2006/108846。EP陽A-1260581(WOO1/64846)。WO2006節563。WO2005/113758。WO2006/027698。WO97/37000oWO97/37001。Treanor等(1996)JInfectDis173:1467-70。Keitel等(1996)ClinDiagnLabImmunol3:507-10。Geysen等(19M)PNASUSA81:3998-4002。Carter(1994)MethodsMolBiol36:207-23。Jameson,BA等1988，CABIOS4(1):181-186。[53]Raddrizzani&Hammer(2000)BriefBioinform1(2):179-89。[54]DeLalla等(1999)J.Immunol.163:1725-29。[55]Brusic等(1998)Bioinformatics14(2):121-30。[56]Meister等(1995)Vaccine13(6):581-91。[57]Roberts等(1996)AIDSResHumRetroviruses12(7):593-610。[58]Maksyutov和Zagrebelnaya(1993)ComputApplBiosci9(3):291-7。[59]Feller和delaCruz(1991)Nature349(6311):720-1。[60]Hopp(1993)PeptideResearch6:183-190。[61〗Welling等(1985)FEBSLett.188:215-218。[62]Davenport等(1995)Immunogenetics42:392-297。[63]Textbookoflnfluenza(流感教科书)(KarlNicholson,RobertWebster,AlanHay禾卩NancyCox编)。Gotch等(1988)JExpMed168(6):2045-57。[65]Gianfrani等(2000)HumanImmunol61:438-452。[66]Vitiello等(1996)JImmunol157(12):5555-62。[67]Dong等(1996)EurJImmunol26(2):335-339。[68]Andersen等(1999)TissueAntigens54(2):185-190。[69]Adler等(1994)FEBSLett352(2):167-170。[70]Rothbard等(1988)Cell52(4):515-523。[71]Evans等(1999)JImmunol162(7):3970-3977。[72]Elster等(1994)JGenVirol75:37-42。Macken等(2001)，刊于OptionsfortheControlofInfluenzaIV(控制流感IV的选择)(Osterhaus等编)。Spackman等(2005)VirusRes114(l-2):89-100。[75]Webster和Hinshaw(1977)InfectImmun17:561-6。[76]Huietal.(2003)JGenVirol84:3105-13[77]Elster等(1997)JGenVirol78:1589-96。Lundblad(2001)BiotechnologyandAppliedBiochemistry34:195-197。[79]GuidanceforIndustry:BioanalyticalMethodValidation.(生物分析验证方法的工业指南)U.S.DepartmentofHealthandHumanServicesFoodandDrugAdministrationCenterforDrugEvaluationandResearch(CDER)CenterforVeterinaryMedicine(CVM)(美国卫生和人类服务部，兽药药物评价和研究中心的食品药品管理中心(CDER)).2001年5月。Ji等(2002)Biotechniques.32:1162-7。Briggs(1991)JParenterSciTechnol.45:7-12。US5948410。2006年11月1日提交的题为"CELL-DERIVEDVIRALVACCINESWITHLOWLEVELSOFRESIDUALCELLDNA"(含有低水平残留细胞DNA的细胞产生的病毒疫苗)的国际专利申请，其要求US-60/732786的优先权。美国专利6,372,223。网WO00/I5251。WOO1/22992。Hehme等(20(H)VirusRes.103(1-2):163-71。美国专利6355271。WO00/23105。US5,057,540。EP-A曙O109942。W096/11711。WO00/07621。Barr等(1998)AdvancedDrugDeliveryReviews32:247-271。Pizza等(2000)IntJMedMicrobiol290:455-461。W095/17211。W098/42375。Singh等(2001)JContRelease70:267-276。[104]WO99/27960。US6,090,406。US5,916,588。EP-A-0626169。W099/52549。WOO1/21207。WOO1/21152。WO02/072012。Dyakonova等(2004)IntImmunopharmacol4(13):1615-23。FR-2859633。Signorelli和Hadden(2003)IntImmunopharmacol3(8):1177-86。WO200德4715。DeLibero等，NatureReviewsImmunology,2005，5:485-496。美国专利5,936,076。Oki等，J.Clin.Investig，113:1631-1640。US2005/0192248。Yang等，Angew.ClientInt.Ed.，2004，43:3818-3822。WO2005脂049。Goff等，J.Am.Chem.，Soc，2004，126:13602-13603。WO03/105769Cooper(1995)PharmBiotechnol6:559-80。WO90/14837。Podda和DelGiudice(2003)ExpertRevVaccines2:197-203。Podda(2001)Vaccine19:2673-2680。VaccineDesign:TheSubunitandAdjuvantApproach浪苗设计亚基和佐剂方法)(Powell和Newman编)PlenumPress(普莱努出版社)1995(ISBN0-306-44867-X)。《疫苗佐剂制备方法和研究方案》(VaccineAdjuvants:PreparationMethodsandResearchProtocols)(分子药物方法系列的第42巻)，ISBN:1-59259-083-7，O'Hagan编。Allison和Byars(1992)ResImmunol143:519-25。Hariharan等(1995)CancerRes55:3486-9。WO95/11700。美国专利6,080,725。WO2005/097181。Han等(2005)ImpactofVitaminEonImmuneFunctionandInfectiousDiseasesintheAged(维生素E对老年人免疫功能和传染病的影响)，Nutrition,ImmuneflmctionsandHealthEuroConference,Paris(巴黎举行的欧洲营养、免疫功能和卫生大会)，2005年6月9-10日。US-6630161。Hayden等(1998)JClinInvest101(3):643-9。[138]Tassignon等(2005)JImmunolMeth305:188-98。[139]Myers等(1990)Cellularandmolecularaspectsofendotoxinreactions(内毒素反应的细胞和分子方面)的第145-156页。Ulrich(2000)参考文献129的第16章(第273-282页)。Johnson等(1999)JMedChem42:4640-9。Baldrick等(2002)RegulatoryToxicolPharmacol35:398-413。US4,680,338。US4,988,815。W092/15582。Stanley(2002)ClinExpDermatol27:571-577。Wu等(2004)AntiviralRes.64(2):79-83。Vasilakos等(2000)CellImmunol.204(l):64-74。美国专利4689338、4929624、5238944、5266575、5268376、5346905、5352784、5389640、5395937、5482936、5494916、5525612、6083505、6440992、6627640、6656938、6660735、6660747、6664260、6664264、6664265、6667312、6670372、6677347、6677348、6677349、6683088、6703402、6743920、6800624、6809203、6888000和6924293。[150]Jones(2003)CurrOpinInvestigDrugs4:214-218。WO2004細308。WO2004/064759。US6,924,271。US2005層0556。US5,658,731。美国专利5,011,828。US6,605,617。WO02/18383。WO2004/018455。WO03緩272。WO2006纖422。Johnson等(1999)BioorgMedChemLett9:2273-2278。Evans等(2003)ExpertRevVaccines2:219-229。Andrianov等(1998)Biomaterials19:109-115。Payne等(1998)AdvDrugDeliveryReview31:185-196。Thompson等(2003)MethodsinMolecularMedicine94:255-266。Kandimalla等(2003)NucleicAcidsResearch31:2393-2400。WO02/26757。W099/62923。McCluskie等(20Q2)FEMSImmunologyandMedicalMicrobiology32:179-185。[173]W098/40100。美国专利6,207,646。Kandimalla等(2003)BiochemicalSocietyTransactions(生化协会学报)31(第3部分):654-658。Blackwell等(2003)JImmunol170:4061-4068。[179]Krieg(2002)TrendsImmunol23:64-65。[180]WOO1/95935。Kandimalla等(2003)BBRC306:948-953。[182]Bhagat等(2003)BBRC300:853-861。[183〗WO03/035836。[184]WOO1/22972。Thompson等(2005)JLeukocBiol78:'Thelow-toxicityversionsofLPS，MPLadjuvantandRC529，areefficientadjuvantsforCD4+Tcells'(LPS、MPL⑧佐剂和RC529的低毒变体是CD4+T细胞的有效佐剂)。英国专利申请GB-A-2220211。WO94/21292。W094麵53。WO95/17210。W096/26741。WO93/19780。WO03/011223。Meraldi等(20(B)Vaccine21:2485-2491。[194]Pajak等(2003)Vaccine21:836-842。[195]US-6586409。Wong等(2003)JClinPharmacol43(7):735-42。[197]US2005/0215517。Ge皿aro(2000)Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(雷明顿药物科学和实践).第20版，ISBN:0683306472。[199]Banzhoff(2000)ImmunologyLetters71:91-96。[200]Nony等(2001)Vaccine27:3645-51。[201]WO2005膽837。[202]美国专利6,692,468。[203]WO00/07647。[204]WO99/17820。[205]美国专利5,971,953。[206]美国专利4,060,082。[207〗EP-A-0520618。[208]WO98/01174。Potter和Oxford(1979)BrMedBull35:69-75。〖210〗Greenbaum等(2004)Vaccine22:2566-77。Zurbriggen等(2003)ExpertRevVaccines2:295-304。Piascik(2003)JAmPharmAssoc(华盛顿特区).43:728-30。Mann等(2004)Vaccine22:2425-9。Halperin等(1979)AmJPublicHealth69:1247-50。Herbert等(1979)JInfectDis140:234-8。Chen等(2003)Vaccine21:2830-6。DeFilette等(2005)Virology337(1):149-61。权利要求1.一种免疫原性组合物，其包含由细胞培养物培养的病毒制备的非完整病毒颗粒形式的流感病毒血凝素和基质蛋白。2.—种含有非完整病毒颗粒形式的流感病毒血凝素和基质蛋白的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物不含卵清蛋白。3.—种含有流感病毒血凝素和基质蛋白的免疫原性组合物，其特征在于-所述基质蛋白的分子量小于20kDa，并包含与SEQIDNO:1至少50%相同的氨基酸序列。4.一种含有流感病毒血凝素和基质蛋白的免疫原性组合物，其特征在于-所述基质蛋白的分子量小于20kDa，并包含与SEQIDNO:28至少75%相同的氨基酸序列。5.—种制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤(i)在细胞培养物中培养流感病毒；(ii)由步骤(i)培养的病毒制备抗原组合物，其中所述抗原组合物含有非完整病毒颗粒形式的血凝素和基质蛋白；和(iii)将所述抗原组合物与药物载体混合，得到所述免疫原性组合物。6.如前述任一项权利要求所述的组合物或方法，其特征在于，所述基质蛋白包含与SEQIDNO:2至少80%相同的20个氨基酸的序列。7.如前述任一项权利要求所述的组合物或方法，其特征在于，所述基质蛋白包含流感病毒M1蛋白的T细胞表位。8.如前述任一项权利要求所述的组合物或方法，其特征在于，所述基质蛋白包含以下一种或多种氨基酸序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27。9.如前述任一项权利要求所述的组合物或方法，其特征在于，所述基质蛋白含有作为全长M1基质蛋白氨基酸序列的片段的氨基酸序列。10.如前述任一项权利要求所述的组合物或方法，其特征在于，所述基质蛋白缺少天然M1序列的N末端甲硫氨酸。11.如权利要求10所述的组合物或方法，其特征在于，所述基质蛋白含有N末端序列SLLTEVETYVLS(SEQIDNO:30)。12.如权利要求ll所述的组合物或方法，其特征在于，SEQIDNO:30的N末端丝氨酸被共价修饰，如乙酰化。13.如权利要求1-9中任一项所述的组合物或方法，其特征在于，所述基质蛋白具有N末端序列EISLSYSAGALA(SEQIDNO:18)。14.如前述任一项权利要求所述的组合物或方法，其特征在于，所述组合物包含(i)含有N末端序列SLLTEVETYVLS(SEQIDNO:30)的第一种基质蛋白；和(ii)含有N末端序列EISLSYSAGALA(SEQIDNO:18)的第二种基质蛋白。15.如前述任一项权利要求所述的组合物或方法，其特征在于，所述基质蛋白的含量为1^ig/ml-15吗/ml。16.如前述任一项权利要求所述的组合物或方法，其特征在于，包括裂解流感病毒或纯化的流感表面抗原。17.如前述任一项权利要求所述的组合物或方法，其特征在于，所述血凝素来自H1、H2、H3、H5、H7或H9流感A病毒亚型。18.如前述任一项权利要求所述的组合物或方法，其特征在于，所述流感病毒蛋白是由宿主细胞培养物上培养的流感病毒制备的，所述组合物中所述宿主细胞的DNA的含量小于10ng。19.如前述任一项权利要求所述的组合物或方法，其特征在于，所述组合物含有0.1-20吗血凝素/病毒毒株。20.如前述任一项权利要求所述的组合物或方法，其特征在于，所述组合物含有佐剂。21.如权利要求20所述的组合物或方法，其特征在于，所述佐剂包含一种或多种铝盐。22.如权利要求20所述的组合物或方法，其特征在于，所述佐剂包含水包油乳液。23.—种免疫原性组合物，其含有(i)非完整病毒颗粒形式的流感病毒血凝素和基质蛋白，和(ii)佐剂。24.—种含有非完整病毒颗粒形式的流感病毒血凝素和基质蛋白的免疫原性组合物，其特征在于，所述血凝素具有选自下组的亚型H2、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14、H15或H16。25.—种含有流感病毒血凝素和基质蛋白的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物中血凝素的浓度为29Hg/ml/毒株或更低。26.—种分析流感疫苗的免疫试验，其特征在于，分析所述疫苗的样品以确定是否存在Ml基质蛋白的片段。全文摘要一种含有流感病毒血凝素和基质蛋白的免疫原性组合物。它们可来自细胞培养物、而非鸡蛋中培养的流感病毒。所述基质蛋白可以是全长病毒基质蛋白的片段，例如分子量小于20kDa的基质M1片段。该组合物可以是含有纯化的表面糖蛋白的亚单位疫苗。文档编号A61K39/145GK101472608SQ200780007324公开日2009年7月1日申请日期2007年1月26日优先权日2006年1月27日发明者H·科斯特,M·布鲁克申请人:诺华疫苗和诊断有限两合公司