活的无毒的革兰氏阴性细菌的制作方法

专利名称：：活的无毒的革兰氏阴性细菌的制作方法
技术领域：
：本发明提供无毒的革兰氏阴性细菌。特别地，本发明提供在外膜内实质上缺乏脂多糖(LPS，内毒素)的活的革兰氏阴性细菌(例如，大肠杆菌"co7/))。本发明进一步提供活的无毒的革兰氏阴性细菌的产生方法及其用途。本发明还提供诱导免疫应答以及研究和开发治疗剂的纟且合物和方法。
背景技术：
：脂多糖(LPS,内毒素)是革兰氏阴性细菌的主要抗原。LPS是由抗原性、大小可变的、共价连接到脂质A上的糖链组成的糖磷脂，保守的疏水区结构上定义为N,O-酰基0-l，6-D-葡糖胺I,4'-二磷酸。LPS的毒性由脂质A通过与哺乳动物免疫系统的B细胞和巨噬细胞相互作用来表达，该过程导致促炎性细胞因子的分泌，主要是TNF，它对于宿主可具有致命后果。脂质A还"在体外，，活化人T淋巴细胞(Th-l)以及"在体内"活化鼠CD4+和CD8+T细胞，这一特性让宿主的免疫系统对LPS的大小可变糖链产生特异性的回忆型IgG抗体应答。在这些基础上，近来已经将LPS认作"体内，，T细胞依赖型抗原。为了完全表达毒性，LPS必须通过若干单位的糖磷脂单体的关联形成脂质A结构来保持它的超分子结构。该分子的这种构象重排也是完全表达免疫原特性的基础。脓毒症和脓毒性休克是由细菌和由LPS引发的定义明确的临床状况，所述LPS是由导致上述病理的细菌制造的内毒素。脓毒症和脓毒性休克的临床体征根据存在内毒素的量以及病程经历时间而有所不同。感染的最早期临床体征可以是发热，轻度抑郁，和缺乏食欲。病程进一步发展，患者将会呈现更加明显的休克体征，包括心率提高，脉压弱，脱水，齿龈变暗，脚耳发冷，低于正常体温，呼吸速率加快，或腹泻。一旦患者呈现内毒素休克体征，应当认为是紧急情况并应当立即联系医生。尽管正确使用了抗生素和其它治疗措施，但由内毒素相关的病症带来的死亡率仍然是显著的问题。细菌的抗生素抗性，潜在疾病过程的严重性，支持性治疗施用不足部分导致了常规治疗的失败。需要加深了解引发内毒素相关病症的革兰氏阴性细菌。此外，还需要改进对于内毒素相关病症的治疗。发明概述本发明提供无毒的革兰氏阴性细菌。特别地，本发明提供在外膜内实质上缺乏脂多糖(LPS,内毒素)的活的革兰氏阴性细菌(例如，大肠杆菌)。本发明进一步提供活的无毒的革兰氏阴性细菌的产生方法及其用途。本发明还提供诱导免疫应答以及研究和开发治疗剂的组合物和方法。本发明的实施方案提供釆用缺失LPS的革兰氏阴性细菌(例如，大肠杆菌)的广泛的方法和组合物。以下在发明概述、发明详述和下面的实施例部分中描述了示例性实施方案。本发明并不限于这些示例性实施方案。所述缺失LPS的革兰氏阴性细菌可以通过任何机制生成。本文描述了生成这种细菌的多种不同机制。例如，在一些实施方案中，将涉及KD0合成的基因进行突变(例如，减少或消除功能性蛋白质的表达)。在一些实施方案中，将涉及KD0与脂质IV,的关联的基因进行突变。在一些实施方案中，将涉及脂质IV,合成的基因进行突变。在一些实施方案中，将涉及LPS生产或呈现的其它基因进行突变。本发明并不限于基因突变。在一些实施方案中，利用RNA干扰或其它技术改变表达。在一些实施方案中，通过提供抑制剂(例如，合成的或天然的竟争性或非竟争性配体，抗体等)来改变蛋白质功能。在一些实施方案中，根据为影响LPS状态所做的改变，对经修饰的细菌进一步提供营养物质，其它修饰，或对于维持健康、生长等有用的其它组分。本发明的实施方案并不限于这些机制，除非另外指定。本发明证明缺失LPS的细菌是可以存活的，可以通过多种途径来制备，并且发现了在多种情形下的用途。LPS层对于革兰氏阴性细菌的外膜的形式和功能都是必需的。除了是革兰氏阴性菌致病机理的主要介质之外，至少由KD0广脂质A[2-酮3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸(KDO)]组成的LPS(内毒素)结构长期以来被认为是大肠杆菌持续生长所必需的最小结构。在一些实施方案中，本发明提供缺失KDO的活的革兰氏阴性细菌菌林，尽管其特别制造了无内毒素活性的LPS前体脂质IVA，一种已知的人体内LPS-诱导的脓毒症的拮抗剂。在一些实施方案中，本发明提供缺失D-阿拉伯糖5-磷酸异构酶(API)表达的活的革兰氏阴性细菌。在一些实施方案中，所述活的革兰氏阴性细菌包含突变，从而使得菌林实质上不含KDO。在一些实施方案中，所述突变包括在一种或多种涉及KD0合成或修饰的基因中的一种或多种突变。在一些实施方案中，所述活的革兰氏阴性细菌包含这样的突变，其中所述突变在LPS生物合成途径中阻止KD02和脂质IVA之间的关联，从而使脂质IVA单独转运到外膜。在一些实施方案中，KDO合成基因中的一种或多种突变，或LPS生物合成途径中的一种或多种突变，包括但不限于，在基因gutQ，kdsD(yrbH),kdsA,kdsB,waaA，msbA和yhjD，或任何其它生物合成、加工或运输基因中的突变。在一些实施方案中，所述菌林缺乏或实质上缺乏KDO蛋白质的合成。在一些实施方案中，活的革兰氏阴性细菌的外膜表达脂质IVa。在一些实施方案中，所述革兰氏阴性细菌是大肠杆菌。在某些实施方案中，本发明提供生产脂质IVa的方法，包括从活的革兰氏阴性细菌中提取脂质IVa。在某些实施方案中，本发明提供治疗内毒素相关病症的方法，包括向患有内毒素相关病症的受试者施用包含分离自革兰氏阴性细菌的脂质IVa的组合物。在某些实施方案中，本发明提供外膜疫苗或其它组合物用来诱导针对革兰氏阴性细菌的免疫应答，所述组合物包含本发明的活的革兰氏阴性细菌的外膜。这种组合物可以用来在研究、药物篩选和治疗情境中诱导免疫应答。在某些实施方案中，本发明提供包含分离自革兰氏阴性细菌的脂质IVa的佐剂。在某些实施方案中，本发明提供活的革兰氏阴性细菌，所述革兰氏阴性细菌缺失gutQ,kdsD(yrbH),kdsA，kdsB,waaA，msbA，和/或yhjD中一种或多种基因的表达，或任何其它与外膜LPS呈递有关联的生物合成、加工或运输基因的表达。本发明的细菌，或其部分(例如，膜部分)可用于研究和治疗应用中。附图简述图1给出了从KPM22中提取的LPS样品的表征。图1A:来自透析后酚抽提物的LPS的内核-脂质A糖组成。GlcN-D-葡糖胺；KD0-2-酮3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸；L-^磁-D-甘露-庚糖-庚糖。图1B:来自蛋白酶K处理的全细胞裂解物的LPS的SDS-PAGE分析。上面的图是经过银染的，而中间和底部的图是利用针对脂质A的非糖基化1，4'-双磷酸化P-1，6-连接的GlcN二糖主链的mABA6而显色的免疫印迹。中间图的膜用1°/。醋酸处理以便在免疫反应前释放脂质A。泳道l-5是不同LPS化学型的肠沙门氏菌G^/边o/2e7he/z"r/ca)血清变型参照菌林[1.3749(Ra);2.3750(Rb2);3.3748(Rb3);4.3769(Rdl),5.1102(Re)]，6.野生型BW30270,7.KPM22,8.KPM25，9.在生长培养基中具有A5P的KPM22,10.KPM31，11.KPM34,12.在生长培养基中具有A5P的KPM31,13.KPM40，14.KPM42,15.在生长培养基中具有A5P的KPM40，16.200ng化学合成的脂质IVa(化合物406)。图2给出了在KPM22中的LPS前体的表征。纯化LPS样品的负离子模式的电荷解巻积电喷射离子化傅立叶变换离子回旋(ESIFT-ICR)质镨。给出的质量数指的是中性分子的单同位素质量。图2A:BW30270(插图:糖形I的同位素分布；3915.71u)。图2B:KPM22(插图脂质IVa的结构；1404.86u)。图2C:KPM25(插图野生型LPS,描述了KDO「脂质A(Re内毒素)的化学结构并通过箭头表示庚糖附着点。红色、蓝色和绿色峰标记分别对应于糖形I，IV，和II的峰族(参见，例如，S.Miiller-Loennies，B.Lindner,H.Brade,/.扁/.C力復278,34090(2003);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。各个结构峰指配列在表9中。PE-磷脂酰乙醇胺；f磷酸；尸-^萨磷酸乙醇胺；LAtri，LAtetra，LApenU，IAexa-月旨质A的跣化状态。图3代表野生型BW30270(a)和KPM22(b)的内膜和外膜的蔗糖梯度分离。对级分测定总蛋白质含量(X)，外膜磷脂酶A(OMPLA)(O)，和内膜NADH氧化酶(A)。在还原性条件下进行蛋白质样品的SDS-PAGE凝胶(12。/。)电泳。分子质量蛋白质标记(kDa)列在每个胶的左侧。箭头指示OMP蛋白质的位置(~35kDa)[Q2]。图4给出KPM22的表征。野生型BW30270(图A和B)和KPM22(图C和D)的透射电子显微镜(TEM)照片。箭头指示KPM22的OM表面处的外膜嚢泡(OMV)(图C)。IM-内膜，OM-外膜,PG-肽聚糖。标尺条-50nm。图5给出KPM22的表征。图5A:估测荚膜异多糖酸产生，以pg曱基戊糖(L-岩藻糖)/mL/OD混悬细胞培养物表示。图5B:利用mAb898抗体进行的肠道细菌共同抗原(ECA)的免疫印迹分析。泳道1(BW30270)，泳道2(KPM22)，泳道3(KPM25)。图6给出酚相抽提物的ESIFT-ICR质谱。来自BlO0n0(A),KPM22(B)，和KPM25(C)的酚相的电荷解巻积负离子ESIFT-ICR质谱。通过逐滴加入水来将LPS从粗制酚抽提物中沉淀。通过离心澄清后，将酚上清液透析并如上所述进行处理。注意在此过程中脂质IVa并未通过水从酚相中沉淀(B)。ECA。yc-环状肠道细菌共同抗原(ECA)。图7给出LPS制品的hTNFa细胞因子诱导能力。用各种浓度的如上所述分离的LPS制品攻击人单核细胞(MNC)。利用基于ELISA的测定来量化hTNFot释放。一式两份收集数据点。(阴影条块-BW30270，空白条块-KPM22，阴影线条块-KPM25)。图8显示gutQ对于D-葡糖醇利用和LPS生物合成的作用。C4)BW30270(口),BW3O27O(A-0(〇),和BW30270(pT7-gutQ)(△)的二次生长曲线。将在添加了1lug/mL石克胺和10mMD-葡萄糖的M9基本培养基中生长的过夜培养物稀释至新鲜培养基中，所述新鲜培养基具有2mMD-葡萄糖和2mMD-葡糖醇作为双重碳源。通过测定600nm的浊度来监测细胞生长。(历银染的蛋白酶K-处理的全细胞裂解物的曲辛(tricine)SDS-PAGELPS凝胶，所述细胞裂解物来自BW30270(WT)，BW30270(A^//^,和BW30270(Air^y^。在对数早期收获等量的细菌细胞，所述细菌细胞生长在有(+)或无(-)D-葡糖醇(10mM)的基本培养基(O.2%甘油)中，并如实验过程中所述进行处理。图9显示AAPI菌林BW30270(A^/^Air^y幼中的生长和LPS合成。(力在MOPS基本培养基中的大肠杆菌BW30270(A^/^A7^历的生长曲线，所述基本培养基具有硫胺(lug/mL)和甘油(0.1%)作为单一碳源。在培养基中补充糖磷酸和10|liMG6P(A),15jiMA5P(口)，或二者(〇)。(历用A5P滴定LPS。将已经停止分裂的生长在MOPS基本培养基(O.2%甘油，5pMA5P，10pMG6P)中的静止期培养物稀释到新鲜培养基中并振荡6小时，所述新鲜培养基包含GW(1(^M)和不同浓度的A5P(0.1，1,10,50,和100pM)。基于OD由相同数目的细胞制备LPS样品并通过曲辛SDS-PAGE和银染进行分析。(O由野生型BW30270(泳道1和2)和BW30270(A^/^Ai^y")(泳道3和4)制备样品的LPS曲辛SDS-PAGE和(幼^/^的定量RT-PCR分析。用10jiMG6P和5pMA5P预诱导BW30270(A^/^Airf/^),沉淀，重悬于新鲜MOPS基本培养基(O.2%甘油)中，所述基本培养基只有所示的AW和10mMD-葡糖醇，并在收获进行分析之前再振荡4小时。S-O.l-lkbDNA分子量标记；Con-基因组DNA为模板。图10显示大肠杆菌K-12MG1655的gW操纵子。利用Yamada和Saier的逆转录酶作图来确定转录起始位点(参见，例如，Yamada,M.&Saier，M.H.，Jr.(1988)JMolBiol203，569-83;在此将其全部内容通过参考引用并入本文)，并通过箭头表示。图11显示Kdo的生物合成和掺入LPS。涉及的酶是(1)D-阿拉伯糖5-磷酸异构酶(KdsD/GutQ),(2)Kdo8P合酶(KdsA)，(3)Kdo8P磷酸酶(KdsC)，和(4)CMP-Kdo合成酶(KdsB)。在大肠杆菌中，随后在逐步加入仲酰基链(6)月桂酸酯(LpxL)和(7)肉豆蔻酸酯(LpxM)之前通过(5)Kdo转移酶(WaaA)将两分子活化Kdo顺序转移到脂质IVa上。定义为了有利于理解本发明，下面对多种术语进行定义。本文所用的，术语"受试者"和"患者"指任何动物，诸如哺乳动物像狗、猫、鸟、家畜，优选人。本文所用的，术语"LPS相关病症"，"与内毒素相关的病症"，"内毒素相关病症"，"内毒素-相关病症"，"脓毒症"，"脓毒症相关病症"，或类似的术语，描述了与LPS相关联的任何病症，例如与菌血症或脂多糖导入血流中或胃肠外勦膜表面上(例如肺)相关联的病症。这些病症包括，但不限于，内毒素相关休克，内毒素相关弥散性血管内凝血，内毒素相关贫血症，内毒素相关血小板减少症，内毒素相关成人呼吸窘迫综合征，内毒素相关肾衰竭，内毒素相关肝病或肝炎，由于革兰氏阴性菌感染导致的系统性免疫应答综合征(SIRS)，革兰氏阴性菌新生儿脓毒症，革兰氏阴性菌脑膜炎，革兰氏阴性菌肺炎，由于革兰氏阴性菌感染导致的嗜中性白细胞減少症和/或白细胞减少症，血液动力学休克和内毒素相关热病(pyresis)。术语，"活的无毒的革兰氏阴性细菌，，指包含实质上不含LPS的外膜的活的革兰氏阴性细菌菌林。本文可以互换使用的术语"细胞"和"宿主细胞"和"重组宿主细胞",指的是能够或已经转化了载体，典型的是表达载体的细胞。本文所用的宿主细胞优选是革兰氏阴性细菌。要理解这些术语并不仅仅指特定受试者细胞，还指这种细胞的后代或潜在后代。由于突变或环境影响某些修饰可能在后代中发生，这种后代可能实际上与亲本细胞并不完全相同，但仍然包括在本文所用的术语范围内。术语"培养基"是本领域所认可的，通常指用来培养活的细胞的任何物质或制品。所用的术语"源自"，例如，在源自革兰氏阴性细菌菌林的脂质IVa上下文中，指的是可以获自所述细菌或蛋白质的脂质IVa，并且意欲包括蛋白质的片段或部分。关于基因或基因表达，本文所用的术语"缺陷的"，意指基因并非野生型基因并且生物并不具有野生型基因型和/或野生型表型。缺陷的基因、基因型或表型可能是在该基因中突变的结果，或调控该基因的表达(例如，转录或转录后)使其正常表达被破坏或压制的基因的结果。"被破坏的基因表达"意欲包括完全抑制和低于野生型基因表达的基因表达下降(例如，如在渗漏突变中)两种情况。术语"革兰氏阴性细菌"是本领域所公认的，一般指不保留革兰氏染色的细菌(例如，结晶紫和碘之间的有色复合物的沉积)。在示例性革兰氏染色中，首先通过加热将细胞固定在载玻片上并用碱性染料(例如，结晶紫)染色，染料被所有细菌(即，革兰氏阴性和革兰氏阳性的)摄取。随后用碘-KI混合物对载玻片进行处理以固定菌抹，用丙酮或乙醇洗涤，最后用不同颜色的较浅染料(例如，番红精)进行复染。革兰氏阳性生物保留最初的紫色染色，而革兰氏阴性生物被有机溶剂脱色，因此显示复染色。示例性的革兰氏阴性细菌和细胞系包括，但不限于，埃希氏菌属(細Ae"'c力/aspp.)，志贺菌属(脂ge"a柳.)，沙门氏菌属(^迈謹7/aspp.),弯曲杆菌属(C,y/c^a"er柳.)，奈瑟氏菌属(jVe/sser/aspp.)，嗜血杆菌属(細卿力""sspp.),气单胞菌属(Jer歸層spp.),弗朗西斯菌属(spp.),耶尔森菌属(fers/z7/aspp.)，克雷4白菌属(i7e6s/e//aspp.),包特氏菌属(脸d""/aspp.)，军团菌属(Ze^7one//aspp.)，棒杆菌属(Co，e6a"er/aspp.),柠檬酸杆菌属(。'"Ma"erspp.),衣原体属(C力/啤^spp.),布鲁氏菌属(5ryce"sspp.)，假单胞菌属(户se油/csspp.)，螺杆菌属("e"cc^"erspp.)和弧菌属(r/6r/0spp.)。本文所用的术语"突变体革兰氏阴性细菌""LPS突变体革兰氏阴性细菌"，"kdsD和gutQ突变体革兰氏阴性细菌"，"API突变体革兰氏阴性细菌"或类似的术语，包括本发明的革兰氏阴性细菌，其在例如gutQ，kdsD，kdsA，kdsB，waaA，msbA,yhjD基因或4壬4可其它生物合成、加工或运输基因中的一种或多种中已经突变一次或多次，由此产生实质上缺乏LPS蛋白质表达的外膜。"分子的免疫原性部分"指的是该分子中能够在受试者中引发针对该分子的免疫反应的部分。如对于LPS或脂质IVa分子所用的术语"分离的"，指的是已经与其它细菌组分分离(例如，部分或全部分离)特别是从外膜中分离的LPS或脂质IVa。本文所用的，术语"部分"，当参照序列(例如，蛋白质的氨基酸序列，基因的核酸序列)使用时，表示任何量的所指序列(例如，氨基酸序列或核酸序列的0.001%,0.1%,1%,10%，30%，50%,75%，80%，85%，90%，95%，98%,99.999%)。本文所用的术语"调节"指的是上调(即，活化或刺激(例如，通过激动或加强))和下调(即，抑制或压制(例如，通过拮抗，下降或抑制))。术语"可诱导的/诱导型"特别指这样的基因表达，其并非组成性的但其响应刺激(例如，温度，重金属或其它培养基添加物)而发生。术语"非人动物"包括可以在测试本发明中被处理或使用的任何动物，包括哺乳动物诸如非人灵长类，啮齿动物，羊，狗，.牛，猪，鸡，以及两栖动物，爬行动物等。优选的非人动物选自灵长科或啮齿科(例如，大鼠和小鼠)。术语"核酸"指的是多核苷酸或寡核苷酸诸如脱氧核糖核酸(DNA)，和，当合适时，核糖核酸(RM)。该术语还应当被理解为包括由核苷酸类似物制得的MA或DNA的类似物，作为等同物；以及可适用于所描述的实施方案，包括单链(有义或反义)和双链多核苷酸。术语"可药用的"意指一种在生物学或在其它方面没有不良影响的物质，即所述物质可以与选定的化合物一起对个体施用，不会引发任何不希望的生物学效应或以有害的方式与它所处的药物组合物中的其它化合物相互作用。术语"致热的"或"致热原性"指的是当施用给受试者时，化合物诱导发热或发热应答的能力。这种发热应答一般由宿主促炎性细胞因子IL-1，IL-6和/或TNF-a所介导，其分泌由例如LPS所诱导。具有"减弱致热原性"的物质或"减弱致热性衍生物"指的是具有比对应物质低的致热活性的物质，例如，相对于对应物质小于大约80%致热原性，优选小于大约70%致热原性，更加优选小于大约60%致热原性，更加优选小于大约50。致热原性，更加优选小于大约40%致热原性，还要更加优选小于大约30%致热原性。换句话说，如本文所述或本领域7>知的任何测定法所测，具有减弱致热原性的物质比相应物质少至少大约20%，30°/。，歌50%，60%，或70%致热原性。"实质上减弱的致热原性"或"实质上减弱的致热性衍生物"指的是这样的物质(例如，由活的无毒的革兰氏阴性细菌所产生的)，其已被改变从而使得它相对于野生型物质具有少于20%的致热原性，优选相对于野生型物质少于10%致热原性，优选少于1%致热原性，优选少于IOI致热原性，优选少于IOI致热原性，优选少于10l致热原性，优选少于1(T、致热原性，优选少于IOI致热原性，最优选少于101致热原性。换句话说，如本文所述或本领域公知的任何测定法所测，具有实质上减弱的致热原性的物质相对于相应未改变物质，致热原性要少至少大约90%,99%,IO倍，大约10-2倍，大约10—3倍，至少大约10—4倍，至少大约1(T倍，至少大约10—6倍。本文所用的，术语"转染"意指核酸通过核酸介导的基因传递导入受体细胞中(例如，通过表达载体)。本文所用的"转化"指这样的过程，其中作为细胞摄取外源DNA或RNA的结果细胞的基因型改变。在例示性实施方案中，经转化的细胞是表达kdsD和gutQ基因中一种或多种的突变体形式的细胞。经转化的细胞还可以是表达核酸的细胞，所述核酸干扰gutQ,kdsD,kdsA，kdsB，waaA，msbA,ynjD基因或任何其它生物合成、加工或运输基因的表达。本文所用的，术语"转基因"意指已被导入细胞中的核酸(例如，突变体kdsD，gutQ,kdsA,kdsB，waaA，msbA,ynjD基因或4壬何其它生物合成、加工或运输基因，或其反义转录物)。转基因可以是部分或完全异源的，即相对于它所导入的转基因动物或细胞是外来的，或可以与它所导入的生物或细胞的内源基因同源，但它被设计用于被插入或被插入动物或细胞的基因组中，插入的方式改变了其所插入的细胞的基因组。转基因还可以附加体的形式存在于细胞中。本文所用的术语"治疗"受试者的状况或疾病，意欲包括治愈，以及改善所述状况或疾病的至少一种症状。术语"栽体"指能够转送其所连接的另一种核酸的核酸分子。能够指导其所可操作连接的基因的表达的载体在本文中称作"表达栽体"。本文所用的术语"表达系统"指在一定条件下的表达载体，所述条件使得mRNA可以进行转录和/或mRNA可以;陂翻译成蛋白质，结构RNA，或其它细胞组分。所述表达系统可以是体外表达系统，其可以商购或容易根据本领域已知技术制作，或可以是体内表达系统，诸如包含表达载体的真核或原核细胞。一般来说，在重组DAN技术中使用的表达载体通常是"质粒，，的形式，其一般指以其载体形式不结合到染色体上的环形双链DNA环。在本说明书中，"质粒"和"载体"可以互换使用，因为质粒是最常用形式的载体。不过，本发明意欲包括这类其它形式的表达载体，其发挥等同的功能并且是本领域公知的，或以后将成为本领域公知的(例如，粘粒，嗜菌粒和噬菌体载体)。发明详述本发明提供无毒的革兰氏阴性细菌。特别地，本发明提供在外膜内实质上缺乏脂多糖(LPS，内毒素)的活的革兰氏阴性细菌(例如，大肠杆菌)。本发明进一步提供活的无毒的革兰氏阴性细菌的产生方法及其用途。本发明还提供诱导免疫应答以及研究和开发治疗剂的组合物和方法。革兰氏阴性细菌在肽聚糖周围具有不对称的脂质双层-外膜(0M)。0M内叶主要是由各种甘油磷脂组成，而外叶主要包含独特的两亲性大分子-脂多糖(LPS)。在大肠杆菌和其它密切相关的肠道细菌中，有~106LPS分子/细胞覆盖接近75%的整个细胞表面区域，占0M总重的~30%(参见，例如，S.M.Galloway，C.R.Raetz，J.Biol.Chem.265，6394(1990);L.Leive，Ann.N.Y.Acad.Sci.235，109(1974);H.Nikaido，EscherichiacoliandSalmonellatyphimurium:cellularandmolecularbiology,F.C.Neidhardt，Ed.(AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,D.C.，1987)，vol.1,pp.29-47;在此将每篇的全部内容通过参考引用并入本文)。在细菌细胞和含水环境之间的界面处暴露的位置呈递LPS作为主要的OM相关表面抗原。LPS涉及多种与宿主免疫应答相关联的病理和生理活性(参见，例如，A.Wiese，等人，Biol.Chem.380，767(1999);H,Heine,等人，Mol.Biotechnol.19,279(2001);在此将每篇的全部内容通过参考引用并入本文)。LPS是一种免疫刺激/炎性分子，公认为革兰氏阴性菌发病机理和全身炎症的介质，由此术语内毒素经常可与LPS互换使用。LPS层对于革兰氏阴性细菌的0M的形式和功能都是必需的。因而，除了在革兰氏阴性菌发病机理中发挥关键作用之外，LPS还是细菌存活的关键决定因素。各种革兰氏阴性细菌的LPS符合共同的结构，概念性地分成三个区0M-埋植脂质A,寡糖核心，然后是由肠杆菌科中的z"重复单位或某些细菌中的短分枝寡糖组成的0-特异性亲水多糖链，所述细菌包括人翁膜病原体，如脑膜炎奈瑟氏菌(L/z7e"i/^i〃V/s)，'淋病态瑟氏菌(义goooiT力oeae)，^危感嗜血杆菌(〃ae边o/7力/7i/si/7/7we/7么ae)，百曰咳杆菌(胁d"e"apert證/s)，和衣原体属(C力/輝d/aspp)。在革兰氏阴性细菌属中脂质A是最保守的LPS结构域，是负责宿主内生物学活性的结构组分，代表LPS的内毒素原理。在肠道细菌中，脂质A由P-1，6-连接的D-葡糖胺二糖主链组成，其被四个0)-3-羟基-肉豆蔻酸以酯-(3，3，)或酰胺-(2，2')键所酰化。大肠杆菌野生型菌抹的成熟脂质A分子一般包含两个额外的酰基链，主要是月桂酸酯和肉豆蔻酸酯，附于非还原性葡糖胺的W)-3-羟基肉豆蔻酰基基团上以形成脂质A的特征性酰氧基酰基单位。寡糖核心将脂质A连接到高变的多糖链上，进一步分成内部和外部寡糖核心区。尽管外部核心并不十分保守，糖组成和糖苷键都有所变化，但大部分革兰氏阴性细菌都制成包含至少一个2-酮3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸(KDO)分子的内部核心。KD0是LPS的基本组分，它是在几乎所有LPS结构中发现的保守残基(参见，例如，0.Holst，TrendsGlycosci.Glycotechnol.14，87(2002);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。大肠杆菌生长所需的最小LPS结构是附于脂质A上的两个KD0残基(KD0厂脂质A或Re内毒素)(参见，例如，C.R.Raetz，C.Whitfield，A匪.Rev.Biochem.71，635(2002);S.Gro丽，H.Brade,J.EndotoxinRes.7，3(2001);在此将每一篇的全部内容通过参考引用并入本文)，着重强调KDO在维持细菌细胞的完整性和生存能力中的重要性。L-API由大肠杆菌K-12中的i^y"基因所编码(参见，例如，Meredith,T.C.&Woodard，R.W,(2003)JBiolChem278，32771-7;在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。LPS结构内KD0的遍在性质已经促进对其生物合成的研究。该途径由酶d-阿拉伯糖5-磷酸(A5P)异构酶(API)所起始，所述酶将戊糖途径中间产物D-核酮糖5-磷酸转变成A5P。随后，A5P与磷酸烯醇丙酮酸缩合形成Kdo8-磷酸(Kdo8P)(KdsA),水解成Kdo(KdsC)，在最后从CMP-Kdo转移至受体脂质IVA(WaaA)之前，活化成糖核苷酸CMP-KdoOCdsB)(图11)。后面的酰基转移酶LpxL和LpxM接下来分别将脂肪酸月桂酸和肉豆蔻酸转移至Kdo2-脂质IVA以形成六酰化Kdo-脂质A的特征性酰氧基酰基单位。在大肠杆菌K-12中，有两种API基因U&"和gi/^入基于同源性研究，据推测其它API可能存在于大肠杆菌中。特别地，葡糖醇操纵子gutQ的最终开放阅读框与kdsD(以前称为yrbH)具有显著的同源性(45%同一性)。G-API是g""^^!柳。操纵子的最后基因产物，所述操纵子包含七种集中(convergently)转录的基因(图10)。如表1中所示，gutQ和kdsD共有类似的生化特性。表1.1&"和^/^的生化特性—特性^Dagut^a数据来自Yamada，M.，Yamada，Y.&Saier，M.H.，Jr.(1990)"^&《1，141-5;在此将其全部内容通过参考引用并入本文。b通过31PNMR测量的；由Haldane关系(Ru5P/A5P)计算。。见测试底物的实验过程。d通过高分辨率电感耦合等离子体质镨测定的Zn2+当量/单体。6少于5%的活性残留。f作为分离的酶，用l(VMEDTA。8通过电喷射离子化质镨测定的；由蛋白质序列计算的。h通过凝胶过滤测定的。葡糖醇操纵子表达负责由环境中协同吸收和代谢D-葡糖醇的磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸转移酶系统(PTS)(参见，例如，T.C.Meredith，R.W.Woodard,J.Biol.Chem.278,32771(2003);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。该操纵子最初由Lengeler(参见，例如，C.Galanos,等人，Eur.J.Biochem.9，245(1969);S,Mtiller-Loennies，等人，J.Biol.Chem.278，34090(2003);在此将每一篇的全部内容通过参考引用并入本文)研究，随后由Saier(参见，例如，K.A.Brozek,C.R，Raetz,J.Biol.Chem.265，15410(1990);H,Nikaido，Microbiol.Mol.Biol.Rev.67，593(2003);在此将每一篇的全部内容通过参考引用并入本文)研究，已知由七种集中转录的基因^/"A^^i^组成。EII^复合物由guU(EIICl结构域)，gutE(EIIBC2结构域)，和gutB(EIIA结构域)形成，并将D-葡糖醇作为D-葡糖醇6-磷酸转运穿过内膜到细胞中。随后通过gutD(—种NADH依赖型脱氲酶)将D-葡糖醇6-磷酸进一步代谢为糖酵解的中间产物D-果糖6-疋(A5P)^(Ru5P)KA5PtoRu5P)irc"(Ru5PtoA5P)4(calc.)b最适pH对A5P/Ru5P特异性Zn"/亚单位的当量d10jaMZn2+的抑制eEDTA的活化f亚单位MW(calc.)g天然MWh0.61±0.06mM0.35±0.08mM157土4secf1255土16sec—10.47(0.35)1.(35104Da(35196Da)122土5kDa(四聚体)1.2±0.lmM0.64±0.08mM218±4sec_1242±llsec—10.47(0.48)33909Da(34031Da)133土4kDa(四聚体)是4:一是是11一是w是是磷酸。gW操纵子的表达由复杂的多组分调控系统紧密控制，除了cAMP-CAP(环磷酸腺苷-分解代谢产物激活蛋白)介导的调控之外，所述系统还由转录抑制剂(gutR)和转录激活剂(gutM)组成(参见，例如，C.J.Belunis，等人，J.Biol.Chem.270，27646(1995);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。不过，gutQ的功能仍然不了解(参见，例如，R.C.Goldman,W.E.Kohlbre画r,LBacteriol.163,256(1985);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。在本发明实施方案的开发过程中进行的实验中，构建实质上缺乏外膜LPS表达的活的革兰氏阴性细菌，尽管其特殊地产生无内毒素活性的LPS前体脂质IVa，一种人体中LPS诱导的脓毒症的已知拮抗剂。本发明并不限于构建实质上缺乏外膜LPS表达的活的革兰氏阴性细菌的特定方法(例如，通过抑制API表达；通过突变gutQ和/或kdsD基因；通过抑制KD0表达；通过抑制KDO和脂质1^之间的关联；通过kdsA，和/或kdsB，和/或waaA和/或msbA和/或yhjD基因，或其它生物合成、加工或运输基因的突变；通过抑制脂质IVA表达；通过lpxM基因，或其它脂质IVa的生物合成、加工或运输基因的突变)。本发明考虑任何类型革兰氏阴性细菌菌林在构建实质上缺乏外膜LPS表达的活的革兰氏阴性细菌中的用途。可用于本发明的革兰氏阴性细菌的实例包括，但不限于，埃希氏菌属，志贺菌属，沙门氏菌属，弯曲杆菌属，奈瑟氏菌属，嗜血杆菌属，气单胞菌属，弗朗西斯菌属，耶尔森菌属，克雷伯菌属，包特氏菌属，军团菌属，棒杆菌属，柠檬酸杆菌属，衣原体属，布鲁氏菌属，假单胞菌属，螺杆菌属和弧菌属。在优选的实施方案中，使用大肠杆菌。可以使用的埃希氏菌属菌祙的实例包括，但不限于，大肠杆菌菌林DH5a，HB101,HS-4，4608-58，1-184-68，53638-C-17，13-80，和6-81(参见，例如，Sambrook,等人，(Eds.)，1993:MolecularCloning,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.);Grant,等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA,87:4645;Sansonetti，等人，1982，Ann.Microbiol.(Inst.Pasteur)，132A:351)，产肠毒素的大肠杆菌(Evans，等人，1975,Infect.I咖un.，12:656)，肠致病性大肠杆菌(Donnenberg，等人，1994，J.Infect.Dis，，169:831;在此将每一篇的全部内容通过参考引用并入本文)和肠出血性大肠杆菌(参见，例如，McKee和O'Brien,1995,Infect.Immiin.,63:2070)。本发明并不限于突变体革兰氏阴性细菌菌林(例如，在kdsD和/或gutQ，kdsA,kdsB，waaA,msbA，ynjD基因，或其它生物合成、加工或运输基因中具有突变的革兰氏阴性细菌菌林)生长的特定培养条件。为了示例性的目的，利用适于所生长的细菌菌林的常规培养技术，可以将细菌生长在任何适于细菌生长的标准液体培养基中，如LB培养基(Difco，DetroitMich.),营养肉汤(Difco)，胰蛋白酶大豆肉汤(Difco)，或M9基本肉汤(Difco)(Miller,1991,同上)。或者，可以将细菌培养在固体培养基上，诸如L-琼脂(Difco)，营养球脂(Difco)，胰蛋白酶大豆琼脂(Difco)，或M9基本琼脂(Difco)。对于革兰氏阴性细菌菌林，其中所述菌抹包含突变kdsD和/或gutQ，将外源D-阿拉伯糖5-磷酸源用于细菌生长和存活(Meredith等人，2006,ACSChem.Biol.1:33-42;将其全部内容并入本文作为参考)。或者，在开发本发明一些实施方案过程中进行的实验显示，包含kdsD和/或gutQ突变的菌林中msbA基因的过表达是补充D-阿拉伯糖5-磷酸用于细菌生长和存活的一种备选方案。在一些实施方案中，本发明提供具有在gutQ,kdsD(yrbH),kdsA，kdsB，waaA,msbA，和/或yhjD基因中的突变，或在任何其它生物合成、加工或运输基因中的突变的活的革兰氏阴性细菌。在一些实施方案中，gutQ和kdsD基因的突变抑制细菌菌林内的API表达，这会抑制KD0表达，继而抑制外膜LPS表达。在一些实施方案中，本发明提供在kdsA基因中具有突变的活的革兰氏阴性细菌。在一些实施方案中，本发明提供在kdsB基因中具有突变的活的革兰氏阴性细菌。在一些实施方案中，本发明提供在waaA基因中具有突变的活的革兰氏阴性细菌。在开发本发明实施方案过程中进行的实验显示，kdsA,kdsB,和/或waaA的突变通过阻止KD0的产生或KD02和脂质IVA之间的关联来抑制LPS生物合成途径，从而将单独的脂质IVA运输到外膜。细菌细胞存活并且不含LPS并且是无毒的。在一些实施方案中，本发明提供在gutQ,kdsD，kdsA，kdsB，和/或waaA基因中具有突变的活的革兰氏阴性细菌，并且进一步包含msbA基因中的突变。在一些实施方案中，本发明提供在gutQ,kdsD，kdsA，kdsB或waaA基因中具有突变的活的革兰氏阴性细菌，并且进一步包含yhjD基因中的突变。本发明考虑使用在革兰氏阴性细菌内导入遗传突变的任何技术。这些技术包括，但不限于，非特异性诱变，利用化学剂诸如N-曱基-N'-硝基N-亚硝基胍，吖啶橙，溴化乙锭，或非致命性暴露于紫外光线下(参见，例如，Miller(Ed.)，1991:AShortCourseinBaterialGenetics,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.;在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。或者，可以利用TnlO诱变，噬菌体介导的转导，入噬菌体介导的等位基因交换，或接合转移，或利用重组DNA技术的定点诱变来导入突变(参见，例如，Miller(Ed.)，1991，同上；Hone，等人，1987，J.Infect.Dis.,156:167;Noriega,等，1994，Infect.Immun.，62:5168;Hone，等人，1991,Vaccine,9:810;Chatfield，等人，1992,Vaccine,10:53;Pickard，等人，1994，Infect.Immun.，62:3984;Odegaard，等人，1997,J.Biol.Chem.,272:19688;Lee，等人，1995,J.Biol.Chem.，270:27151;Garrett，等人，1998,J.Biol.Chem.,273:12457;在此将每一篇的全部内容通过参考引用并入本文)。可以使用任何导入突变的方法并且可以联合一种或多种附加的突变来导入突变。例如，在一些实施方案中本发明提供具有一种以上突变如在gutQ，kdsD,kdsA,kdsB，waaA，msbA，yhjD基因中的突变，或在任何其它生物合成、加工或运输基因中的突变的活的革兰氏阴性细菌。在一些实施方案中，在革兰氏阴性细菌内的突变(例如，gutQ，kdsD(yrbH)，kdsA，kdsB，waaA,msbA，和/或yhjD基因的突变，或4壬何其它生物合成、加工或运输基因的突变)可组成性表达或在诱导型启动子控制下，所述诱导型启动子诸如，例如，温度敏感型热激家族的启动子，或厌氧诱导型nirB启动子(参见，例如，Harborne，等人，1992，Mol.Micro.，6:2805;在此将其全部内容通过参考引用并入本文)，或在阻遏型启动子控制下，诸如uapA(参见，例如，Gorfinkiel，等人，1993，LBiol.Chem.，268:23376;在此将其全部内容通过参考引用并入本文)或gcv(参见，例如，Stauffer，等人，1994，J.Bact,176:6159;在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。选择合适的启动子将取决于宿主细菌菌林并且对于本领域熟练技术人员来说将是显而易见的。在一些实施方案中，本发明提供缺失API表达的活的革兰氏阴性细菌(例如，大肠杆菌)。本发明并不限于抑制API表达的特定方法。在一些实施方案中，通过抑制KDO蛋白质表达来抑制API表达。本发明并不限于抑制KDO蛋白质表达的特定方法。在一些实施方案中，通过例如，gutQ基因，kdsD基因，kdsA基因或kdsB基因的突变，或在任何其它KDO生物合成基因中的突变来抑制KDO蛋白质表达。在一些实施方案中，本发明提供活的无毒的(例如，无内毒素的)革兰氏阴性细菌(例如，大肠杆菌)。本发明并不限于提供活的无毒的革兰氏阴性细菌的特定方法。在一些实施方案中，通过抑制外膜中LPS表达来提供活的无毒的革兰氏阴性细菌。本发明并不限于抑制外膜中LPS表达的特定方法。在一些实施方案中，通过抑制API蛋白质表达来抑制LPS表达。本发明并不限于抑制API表达的特定方法。在一些实施方案中，通过抑制KDO蛋白质表达来抑制API表达。本发明并不限于抑制KDO蛋白质表达的特定方法。在一些实施方案中，通过例如，gutQ基因和kdsD基因的突变来抑制KDO蛋白质表达。在一些实施方案中，由于KDO蛋白质不与脂质IV,相关联，外膜上的KDO蛋白质表达不发生，从而只有脂质IVa逸送到外膜。例如，gutQ,kdsD，kdsA,kdsB，waaA，msbA,和/或yhjD基因中的突变或任何其它生物合成、加工或运输基因的突变消除了KDO广脂质IVA复合物的形成或膜呈递，导致，例如，只有脂质IVA分子被运送到外膜并且没有随后的LPS形成。在一些实施方案中，可以通过对于本领域熟练技术人员来说已知的克隆方法来对活的无毒的革兰氏阴性细菌进行遗传工程改造(见Sambrook等人，MolecularCloning;ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress;将其全部内容并入本文作为参考)以表达，产生和呈现非天然蛋白质和肽，诸如，但不限于，来自其它细菌生物的LPS，独特的脂质衍生物，人蛋白质或肽生产，非人蛋白质或肽生产，疫苗生产，等等。这些产生的产物可用于多种应用，包括但不限于，临床治疗和基础研究努力。在一些实施方案中，本发明提供包含表达脂质IVa的外膜的活的革兰氏阴性细菌(例如，大肠杆菌)。本发明并不限于提供包含表达脂质IVa的外膜的活的革兰氏阴性细菌的特定方法。在一些实施方案中，通过抑制API蛋白质表达来得到包含表达脂质IVa的外膜的活的革兰氏阴性细菌。本发明并不限于抑制API蛋白质表达的特定方法。本发明并不限于抑制API表达的特定方法。在一些实施方案中，通过抑制KD0蛋白质表达来抑制API表达。本发明并不限于抑制KD0蛋白质表达的特定方法。在一些实施方案中，通过例如，gutQ，kdsD，kdsA，kdsB,waaA,msbA，和/或yhjD基因的突变或4壬4可其它生物合成、加工或运输基因的突变来抑制KD0蛋白质表达。在一些实施方案中，通过抑制KD0和脂质iva之间的关联，从而只有脂质IVa被逸送到外膜(例如，无KD0)，来得到无LPS的包含表达脂质iva的外膜的活的革兰氏阴性细菌。本发明并不限于抑制KDO和脂质iva之间关联的特定方法。在一些实施方案中，通过例如，gutQ，kdsD，kdsA，kdsB,waaA，msbA和/或yhjD基因中的突变，或任何其它生物合成、加工或运输基因的任何突变来抑制KDO和脂质iva之间的关联。在一些实施方案中，本发明提供分离自活的无毒的革兰氏阴性细菌(例如，大肠杆菌)的脂质IVa。脂质IVa用于例如研究哺乳动物脓毒性休克信号传递途径，和作为LPS型分子合成中的构件。目前分离脂质IVa的方法包括传统的全有机合成，成熟LPS的降解，或由条件突变体纯化，所述条件突变体产生包含所需脂质IVa级分的异源LPS层。这些方法的缺点包括脂质IVa产量低并且花费劳动多。从本发明的活的无毒的革兰氏阴性细菌中分离脂质IVa代表了超越这些方法的显著改进，因为外膜存在脂质IVa。在一些实施方案中，本发明提供分离自活的无毒的革兰氏阴性细菌(例如，大肠杆菌)外膜嚢泡。脂质IVa是脓毒性休克信号传递途径的拮抗剂，治疗急性脓毒症患者的一种可行方法是阻断涉及LPS的信号传递途径。在一些实施方案中，使用来自包含表达脂质IVa的外膜的活的革兰氏阴性细菌的分离的外膜嚢泡来治疗或预防性阻止脓毒症相关病症。由本发明的活的无毒革兰氏阴性细菌(例如，AAPI菌抹)制备的外膜嚢泡包含脂质IVa作为LPS拮抗剂。在一些实施方案中，将分离自活的革兰氏阴性细菌(例如，大肠杆菌)的外膜嚢泡用于改进基于外膜嚢泡的疫苗的目的。经常通过严苛化学处理去掉LPS来对基于OMV的疫苗进行"解毒"。不过，去除方法对于OMV疫苗的蛋白质组分具有有害作用，所述蛋白质组分可以是抗体靶向的良好候选物，特别是来自其它革兰氏阴性病原体的克隆的外膜蛋白质。对于AAPI突变体菌林作为宿主，解毒不是必需的，因为其提供了额外的安全水平。在一些实施方案中，本发明提供革兰氏阴性细菌，所述细菌包含具有脂质IVa和LPS表达的外膜。将LPS的毒性与免疫刺激特性分离是开发基于LPS的佐剂或基于LPS的疫苗的主要挑战。由于厶API菌林中的阻断是在LPS途径的早期，可以使用来自其它细胞的酶(其用磷酸基团，乙醇胺，L-4-脱氧阿拉伯糖，不同的酰基链长度等修饰LPS)和具有改变活性的突变酶来生成LPS分子阵列，其在细胞内具有独特的生物学活性。在大肠杆菌中进行这种遗传操作的许多方法已经存在。另外，通过在生长培养基中包含D-阿拉伯糖5-磷酸可以恢复成熟LPS合成，允许控制和优化LPS衍生物与成熟LPS的量和比例。这种LPS"混合物"可以实现免疫刺激活性同时保留可接受的低水平的潜在毒性之间的所需平衡。在一些实施方案中，使用活的无毒的革兰氏阴性细菌作为宿主来生产无内毒素的治疗性分子。本发明并不限于特定的治疗性分子。传统上，在革兰氏阴性细菌中生产治疗性分子，不管它是用于疫苗的OM嚢泡，用作佐剂的LPS型分子(诸如单磷酰基脂质A(MPLA)),重组药物蛋白质，大分子，或用于哺乳动物细胞转染/基因治疗的DNA，受到来自细菌宿主的内毒素存在的干扰。治疗性分子污染内毒素是一个问题，因为LPS的免疫原性潜力已被充分证明。目前减少内毒素污染的生产策略包括各种纯化技术，诸如市场上出售用来纯化无内毒素的DM质粒的试剂盒，随后通过各种测定法来测量内毒素水平。由于AAPI菌株并不产生内毒素，不需要这种纯化步骤。由此，本发明的活的无毒的革兰氏阴性细菌菌林(例如，AAPI菌林)提供改进的方法分离无内毒素的治疗性分子(例如，脂质IVa)。例如，预期AAPI菌林是宿主，用来在无内毒素的环境中利用充分研究的革兰氏阴性细菌生产商业上重要的治疗性分子。此外，包含gutQ，kdsD，kdsA，kdsB,waaA，msbA，yhjD基因中的突变，或任何其它生物合成，加工，或运输细菌基因中的突变的菌林可以作为宿主，用来在无内毒素的环境中利用革兰氏阴性细菌生产商业上重要的治疗性分子。在一些实施方案中，活的无毒的革兰氏阴性细菌可以用来生产刺激免疫应答的疫苗或其它组合物。例如，利用如本文所述的革兰氏阴性细菌生产针对伤寒的弱毒疫苗。由于在疫苗制品中存在的内毒素，目前的伤寒疫苗引发副作用。考虑利用本文所述的活的无毒的革兰氏阴性细菌或其部分，其中在外膜上不呈现LPS(例如，内毒素)，回避了由包含内毒素的疫苗制品引发的副作用。本发明可以用于任何通常发现内毒素污染的疫苗制品或其它组合物中。因为它们的LPS缺陷表型，本发明的活的无毒的革兰氏阴性细菌还可用作活的减毒疫苗。由此，本发明可用于开发不含内毒素污染的OM疫苗和其它組合物来诱导免疫应答，其可以为了免疫和研究的目的施用给受试者。例如，可以利用如在US专利申请2005/0013831或US专利6，558，677中所述的方案制备减毒的或OM疫苗，在此将上述专利文本的全部内容作为参考并入本文。例如，这种疫苗可用于对受试者进行免疫，所述受试者处于发生脓毒性休克的危险(例如，由大肠杆菌)，诸如手术患者。另外，可以开发用于针对例如百日咳(例如，包特氏菌(Bordetellasp.))，布鲁杆菌病或内毒素休克(例如，布鲁菌(》ruce/7asp.)),肺和呼吸系统感染(例如，假单胞菌属(Pseudomonassp.)，嗜血杆菌(肠卿力/7i/5"sp.)，莫拉氏菌(船me"ssp.)),霍乱(例如，弧菌(P76"'osp.))，肺炎(例如，克雷伯氏菌U/由/e/7asp.)，嗜血杆菌(^seiZ7o;7力/7yisp.))，胃溃疡(例如，螺杆菌(Ve//co&cfersp.))，脑膜炎(例如，奈瑟氏菌(vVe/"eWasp.)，嗜血杆菌(^3e迈一/7wssp.))，中耳炎(例如，嗜血杆菌(&^o;7A//i/ssp.)，莫拉氏菌(#orajre//asp.))，痢疾和腹竭(例如，志贺菌(M/ge77asp.)，义廯并霧，弧菌(P76r/osp.)，弯曲杆菌(C,y/函"ersp.)，耶尔森菌(7e"e"/asp.))，肠热病(例如，沙门氏菌(&7迈o刀e/7ssp.))，沙眼和性传播疾病(例如，衣原体(C力/a/z^d/asp.)),土拉菌病(例如，弗朗西斯菌(尸w/c"ce77asp.)),和鼠疫(例如，耶尔森菌(Few/zz/asp.))的免疫的无内毒素的减毒或0M疫苗。在一些实施方案中，本文所述的无毒的活的革兰氏阴性'细菌可用于生成治疗性抗体来进行治疗和研究应用。例如，在一些实施方案中利用无毒的革兰氏阴性细菌或其部分(例如，膜制品)对受试者进行主动免疫，随后使用由人超免疫血清制备的抗体来被动保护受试者免受细菌感染和脓毒症。不过，治疗性抗体的生成在宿主动物中更加常规地得以实现，所述宿主动物诸如，但不限于，灵长类，兔，狗，豚鼠，小鼠，大鼠，绵羊，山羊等。例如利用无毒的活的革兰氏阴性细菌作为免疫原本身在宿主动物中生成抗体来生成治疗性抗体，用于施用于人受试者。此外本文所迷的无毒的活的革兰氏阴性细菌还可用作宿主来呈现外源抗体(例如，免疫原性肽或蛋白质)，其被用来在宿主动物中生成治疗性抗体。例如，无毒的活的革兰氏阴性细菌，除了实质上是LPS缺陷型之外，可以进行遗传操作(例如，通过对于本领域熟练技术人员来说已知的确立的克隆方法)以表达非天然蛋白质和肽，所述蛋白质和肽可用作免疫原进行抗体生产。这些免疫原包括，但不限于，使抗体乾向针对癌细胞和其它引发疾病的细胞的肽，用于病毒细胞靶向的病毒外壳蛋白，等等。在一些实施方案中，本发明提供无毒的活的革兰氏阴性细菌，其可用于呈递免疫原性蛋白质来生成治疗性抗体。针对免疫原性蛋白质的抗体可以是任何单克隆或多克隆抗体，只要它能够识别抗原性蛋白来生^抗体。.5、.''、''在一些实施方案中，将包含表达脂质IVa的外膜的活的革兰氏阴性细菌(例如，大肠杆菌)用于药物筛选的目的(例如，筛选解热剂)。△API突变体菌林具有非常低的透性屏障，使得它对于大的疏水药物分子特别易感，所述大的疏水药物分子正常情况下不能穿透OM。对化合物文库的全细胞生物测定正常情况下使用透化剂诸如甲苯，EDTA,阳离子肽等通过促进穿透OM来帮助鉴定命中结果(hits)。一旦制成母体先导有效物质，就可以使用药物化学来改进溶解性，分配，大小等以生产抗生素。从这些筛选遗漏了许多潜在的有效物质，因为所述化合物不能接近其0M内的蛋白质靼标。在这些筛选中利用例如AAPI突变体菌林通过降低透性屏障而不需要提供其它试剂緩解了0M透过性问题。类似地，在生成DNA文库过程中，当用DNA质粒转化例如厶API突变体菌林时，AAPI的这种低OM透过性是一种优势。高转化效率细胞对于所有重組DNA技术都是必需的，对于这些应用来说AAPI菌林是一种有用的宿主。实施例实施例I本实施例描述了△API突变体TCM15和KPM22。构建G-API和L-API都缺失的营养缺陷型厶API突变体TCM15，根据对于大肠杆菌确立的KD0「脂质A定理，它的生长依赖于外源A5P。在不包括A5P的情况下，TCM15不能在固体培养基上形成菌落，无论生长培养基、温育温度或时间如何。当在具有0.2%甘油作为唯一碳源的液体MOPS基本培养基中培养时，尽管缺乏A5P，细胞分裂照常在32"8小时迟滞后继续。显示大肠杆菌KPM22菌林为非条件性AAPI突变体，其能够在富营养培养基中于37。C持续生长而无最初的迟滞期，尽管在细胞提取物中仍然没有可测量的API活性。如表2中所示，在LB培养基中倍增时间增加到亲本野生型菌株的近两倍。表2.在不同温度下LB培养基中的世代时间<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>a.2-3代后，生长速率为非指数型。在变化到非容许温度(42。C)后，指数生长速度在2-3代后不再维持。编码ir&"的质粒(KPM25)在升高的温度恢复ICPM22的生长，提示由于KDO合成中的阻抑，细胞被膜有缺陷。为了进一步研究KPM22，利用酚-氯仿-石油醚(PCP)抽提方法从细胞中抽提LPS样品(参见，例如，C.Galanos，等人，Eur.J.Biochem.9，245(1969);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。测定LPS抽提物的糖组成以确定内部核心糖组分[KDO和L-甘油-D-甘露-庚糖(庚糖)]和脂质A[D-葡糖胺(GlcN)](见图1A)。野生型BW30270[1GlcN:0.9KDO:2.2庚糖]和KPM25[1.0GlcN:1.0KDO:2.5庚糖]的比例都与大肠杆菌K-12制造的优势LPS种类(糖形I)的比例[l.0GlcN:1.0KDO:2.O庚糖]相一致(参见，例如，S.Milller-Loennies，等人，J.Biol.Chem.278,34090(2003);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。相比之下对于KPM22只检测到痕量的KD0或庚糖，尽管GlcN仍然存在，提示脂质A主链完整。对制备自蛋白酶K处理的全细胞裂解物的LPS样品进行银染SDS-PAGE分析对KPM22未检测出条带(见，图IB;上部的图)。在用mAbA6抗体进行探查之前用酸处理印迹膜以切割糖核，所述抗体识别脂质A的非糖基化的1，4'-双磷酸化p-l，6-连接的GlcN二糖主链。来自KPM22的单一条带被抗体所识别，所述条带比Re内毒素标准迁移得快，但与合成的脂质IVa处于同一水平(图IB,中间图，分别是泳道6和16)。当省略了酸水解步骤时，只有制备自KPM22的LPS样品和合成的脂质IVa被mAbA6识别，证实天然脂质A结构是非糖基化的(图1B，下部图)。利用纯化的LPS样品通过负离子模式的电喷射离子化傅立叶变换离子回旋(ESIFT-ICR)质谱测定ICPM22中LPS前体的化学型(见，图2，表3)。表3.ESIFT-ICRMS峰列表观察到的计算的质质量"量8化学组成标记703.52703.517磷脂，PB(33:1)(例如1*16:0+1*17:1)PE1178.671178,.6612*GlcN,2*P,3*卿-14:0LAtri1360.831360..8282*GlcN，2*户，3*卿-14:0，1*12:0LAtetr1404.861404,,8542*GlcN，2*户，4*,-14:0脂IVa'质1527.871527..8632*GlcN,2*尸，4*,-14:0，1587.021587..0212*GlcN，2*尸，4*(OH)-14:0，1*12:0TA1797.221797,,2192*GlcN,2*户，4*(OH)--14:0，1*12:0,1*14:0LAhexa3813.753813.,734LAhexa+l*Gal，3*Glc,4*Hep,2*KD0,2*^糖形I3893.723893..700LAhexa+l*Gal,3*Glc，4*Hep，2*KD0,3*糖形I3915.713915.,699LAhexa+l*Gai,3*Gic,+l*Na4*Hep,2*跳3*,,糖形I3995.633995.,653Uhexs+l*Gal，3*Glc，+l*Na4*Hep,2*KD0,4*户，糖形I4017.664017,6"LAhexa+l*Gal,3*Glc，+2*Na4*Hep,2*固，4*尸，糖形I4038.694038.,697LAhexa+l*Gal,3*Glc，4*Hep，2*跳5*尸，糖形I3927.683927.689Uhexa+l*Gal,2*Glc,3*Hep，l*Rha，3*KD0，糖形IV4007.674007.655LAhexa+l*Gal,2*Glc,3*Hep，l*Rha,3*KD0,糖形IV4029.644029.654LAhexa+l*Gal，2*Glc,3*Hep，l*Rha，3*KD0,糖形IV4050.704050.,698LAhexa+l*Gal，2*Glc,3P+1丰尸-層，+l*Na3*Hep，l*Rha,3*KD0,糖形IV4140.674140.722LAhexa+l*GlcNAc，l*Gal，3*Glc，4*Hep，2*KD0,3*尸，+2*Na糖形II4198.744198.735LAhexa+l*GlcMc，l*Gal，3*Glc,4*Hep，2*KD0，4*尸，+l*Na糖形II4220.734220.724LAhexa+l*GlcNAc,l*Gal,3*Glc，4*Hep，2*KD0,4*尸,+2*Na糖形II4300.684300.698"，，Mc,K"，3*Glc，4*Hep,2*KD0,糖形n5*尸，+2*Na4241.814241,778LUa+^kMc，"G"，^"c，OHep，2化D0，糖J*尸，7*户一^f1*Na43H.734321.745LA《G!cNAc，刚，雨C，兩,"43.74"41"4LA+1*GlcNAc^Ga丄》G丄c,柯ep》KD0，a.给出的质量数指的是中性分子的单同位素质量，其是在电荷解巻积化后由LPS级分的负离子ESIFT-ICR质谦推导出来的。b.粗体的峰以文字标记在图4上。c.缩写PE-磷脂酰乙醇胺；GlcN-D-葡糖胺；i2"磷酸；户-Wf磷酸乙醇胺；Ga卜D-半乳糖；Glc-D-葡萄糖；Hep-L-#磁-D-甘露-庚糖；KD0-2-酮3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸；Rha-鼠李糖；GlcNAc-A^乙酰基D-葡糖胺；LAtri，tetra5perita》hexa脂质A的酰化状态。在成熟大肠杆菌K-12LPS核心的不同糖形的特征质量范围内[~3900到~4300u]，野生型BW30270和KPM25的质镨都显示类似的峰模式和不均一性(见，图2A，C)。在KPM22中的一个LPS相关峰具有1404.86u的分子质量，与1，4，-双磷酸化的四酰化脂质A(脂质IVa，计算的质量1404.854u)的结构相符(见，图2B)。脂质IVa是LPS途径中的中间产物，其充当顺序添加两个KD0残基的受体以形成KDO广脂质IVa，其中后面的酰基转移酶LpxL和LpxM接下来分别将脂肪酸月桂酸和肉豆蔻酸转移至KDO广脂质IVa，形成六酰化KD02-脂质A。Raetz与合作者已经显示来自大肠杆菌的这两种酶都显示对于脂质底物中KD0的绝对底物需要，以便具有活性(参见，例3口，K.A.Brozek，C.R.Raetz,J.Biol.Chem.265，15410(1990);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)，这解释了在来自KPN!"的脂质A中仲酰基链的缺乏。为了确定脂质IVA的亚细胞定位并确定它是否运送至KPM22的0M，使用不连续蔗糖梯度离心来将OM与内膜(IM)分离(见，图3)。两种膜都很好分辨，尽管KPM22的OM并未与野生型迁移地一样远，提示浮力密度下降。除了在OM中积聚减少的情况下保持定位在IM中的0M孔蛋白(OMP)蛋白(~35kDa)的量增加以外，通过SDS-PAGE分析的整体总蛋白质含量和构成类似。已经显示许多OM蛋白依赖于LPS的分子伴倡特性进行其折叠和产生功能(参见，例如，H.deCock，J.Tommassen，EmboJ.15，5567(1996);P.V.Bulieris,等人，J.Biol.Che迈.278，9092(2003);K.Sen,H.Nikaido,J.Bacteriol.173，926(1991);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)，0MP的减少可以反映KPM22的蛋白质运输速率和/或插入0M效率的降低。对分离的0M级分测定3-羟基肉豆蔻酸(3-0HC14:0)-—种特征性LPS/脂质IVA脂肪酸标记的存在。野生型和KPM22的0M分别包含11.7和31.ljig的3-0HC14:0每mg干膜，提示事实上在KPM22的0M中存在至少等于野生型中LPS量的显著量的脂质IVA。另外，ESIFT-ICR质镨分析揭示了在KPM22的0M和IM中的脂质IVA的峰，而在来自野生型的两种膜级分中都未检测到属于脂质IVA的峰。总之，这表明尽管脂质IVA被运送至KPM22的0M上，但脂质IVA运送速率已经与其合成速率脱节了。仲酰基链涉及通过提高酰基链数目来维持0M内的低度流动性(参见，例如，H.Nikaido，Microbiol.Mol.Biol.Rev.67，593(2003);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)，所述低度流动性是功能所需的条件。饱和酰基链的紧密包装诱导疏水相互作用网络，其通过范德华力维持0M外叶的完整性。尽管只包含四个酰基链并且没有内部糖核，在KPM22中脂质IVa仍被运输并且随后能够支持0M生物合成。KPM22的0M中的脂质IVa层的空前性质重新定义了肠杆菌科中存活所必需的LPS结构。正常情况下KD0被认为是功能性LPS层的基本组分，因为到目前为止只构建了大肠杆菌中KD0生物合成酶的条件突变体(参见，例如，C.J.Belunis，等人，J.Biol.Chem.270，27646(1995);R.C.Goldman,W.E.Kohlbrenner，J.Bacteriol.163,256(1985);P.D.Rick，M.J.0sborn，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.69，3756(1972);在此将每一篇的全部内容通过参考引用并入本文)。这归因于KDO(并且可争辩地部分归因于附于KD0远侧的其它糖)在脂质双层内维持低度流动性的作用(参见，例如，H.Nikaido，Microbiol.Mol.Biol.Rev.67，593(2003);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。据信二价阳离子，即Mg2+和Ca、与负电荷形成离子桥，所述负电荷是由磷酸化脂质A主链和KD0的羧酸酯二者贡献的，使得静电排斥最小并促进强烈的侧向相互作用。另外，0M表面上的KD0定位将KD0置于接近0M蛋白处，许多OM蛋白质的折叠和功能依赖于包含核心的LPS的分子伴侣特性(参见，例如，H.deCock,J.Tommassen，EmboJ.15，5567(1996);P.V.Bulieris，等人，J.Biol.Chem.278，9092(2003);K.Sen，H.Nikaido，J.Bacteriol.173，926(1991);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。为了确证在KPM22中KD0的非必需性质，破坏编码KD0生物合成中第一个关键步骤(ir&力和最后步骤(附a力的基因。与KPM22/KPM25(图1B，泳道8，9)相比，外源性A5P或质粒携带的API分别在KPM31/KPM40(泳道12，15)或KPM34/KPM42(泳道11，14)中都未恢复成熟LPS合成，这与KPM22在没有完整KD0途径的情况下存活的能力相一致。通过透射电子显微镜(TEM)检查KPM22的细胞形态。总体上，KPM22的结构与亲本菌林非常相似(图4)。通过TEM并未观察到显而易见的的分裂缺陷并且细胞维持正常的杆状。对于KPM22辨别出两种清晰的膜(图4D),以及在两种膜之间的代表外周胞质的区域。与野生型相比外周胞质体积被均一地压缩。出现在KPM22表面上的小膜嚢泡提示0M的不稳定性(图4C)。外膜嚢泡(OMV)形成可能是由邻近脂质IVa分子的1，4，-GlcN磷酸之间的静电排斥作用引发的(其并不被糖核的稳定化相互作用所补偿)，提高膜曲率和导致嚢泡由细菌表面挤出。考虑到ESI-MS分析未检测到4-氨基-4-脱氧-L-阿拉伯糖并且只检测到最小限度的磷酸乙醇胺修饰，电荷排斥对于KPM22特别相关，所述4-氨基-4-脱氧-L-阿拉伯糖和磷酸乙醇胺都作用来减少净负电荷的量(参见，例如，C.R.Raetz，C.Whitfield,Annu.Rev.Biochem.71，635(2002);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。KPM22中适应由于极端LPS截短导致的OM完整性丧失的补偿机制引发与其它0M结合糖脂的稳定化作用。在来自脑膜炎奈瑟氏菌(^/zze/7/邱/"V/s)的LPS缺陷型突变体中，据报道荚膜多糖合成对于生存能力是绝对必需的(参见，例如，P.vanderLey,L.Steeghs,J.Endotoxin.Res.9，124(2003)。大肠杆菌K-12并不合成荚膜多糖，但是除了LPS之外还有两种其它的细胞表面多糖，即应激诱导的粘液外泌多糖荚膜异多糖酸(M-抗原)(参见，例如，A.Markovitz，SurfacecarbohydratesoftheprokaryoticcellI.W.Sutherland,Ed.(AcademicPress,Inc.,NewYork,N.Y.,1977)，vol.I,pp.415-462);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)和磷酸甘油酯连接的肠道细菌共同抗原(ECA)(参见，例如，H.M.Kuhn,等人，FEMSMicrobiol.Rev.4，195(1988);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。不可透析的甲基戊糖的水平没有区别(图5A)，其是荚膜异多糖酸的组成糖标记(参见，例如，S.Gottesman等人，J.Bacteriol.162，1111(1985);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。细胞裂解物的免疫印迹分析揭示甘油磷脂酰基结合的ECA的量事实上在KPM"中减少(图5B)，这与环状ECA从酚抽提物的KPM22谱中消失相一致，所述环状ECA包含四个三糖重复单位(2429.89u)(图6)。因而，除了脂质IVa之外，KPM22的0M包含痕量水平的ECA和同等低的野生型水平的荚膜异多糖酸。总之，KPM22被膜代表了在大肠杆菌中报道的能够保持生存能力的最低的OM糖脂含量。LPS层的一个主要功能是充当大的疏水分于和防御素(多聚阳离子肽)二者扩散进入细胞的渗透屏障，以及保持外周胞质间隔区的内容物。除了提供针对宿主应答的非特异性防御的措施之外，在OM内邻近LPS分子之间的强侧向相互作用使得LPS层特别适于这种功能。通过外膜孔蛋白(0MP)蛋白通道实现小的亲水性分子、营养物和抗生素的选择性渗透。针对KPM22篩选一组抗生素和去污剂以测量脂质IVa作为渗透屏障的有效性(见表4)。表4.KPM22的渗透屏障特性最小抑菌浓度(pg/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>a74，000单位/g.b'胆酸钠和脱氧胆酸盐的混合物。e.勦菌素；20，261单位/mgKPM22对于多种大的疏水抗生素超级易感，所述抗生素一般仅对革兰氏阳性细菌具有相当的效力。正常情况下被OM排斥接近它们的作用位点，这些化合物在KPM22中接近细胞内靶标。糖核未阻止接近膜表面，进一步促进了分配和随后穿过受损的脂质双层。不过，小的(〈600Da)，相对亲水性的化合物的最小抑菌浓度(MIC)最多得到适度的降低，所述化合物得以穿越OM主要是通过OMP。值得关注的例外是带正电荷的氨基糖苷卡那霉素。有人提出氨基糖苷卡那霹素得以进入主要是通过吸收的自我促进机制，涉及不依赖于OMP的与LPS的起始电荷配对相互作用(参见，例如，R.E.Hancock,等人，Antimicrob.Agents.Chemother.35,1309(1991);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。KPM22对于去污剂特别敏感，对于十二烷基硫酸钠MIC降低超过4000倍。由于人肠道中的胆汁盐(胆固醇代谢物)浓度为4到16mM(~1650-6650fig/mL)(参见，例如，B.Borgstrom，ActaMed.Scand,196，1(1974);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)，KPM22受损的OM将不再适于保护细胞免受其宿主环境侵害。令人吃惊的是，多粘菌素E(黏菌素)(一种具有去污剂样作用机制的阳离子肽)的MIC，在KPM22中只降低了~4倍。多粘菌素在膜表面上积聚至临界集聚浓度与在薄层状双层内形成微胞损伤有关，所述损伤随后充当通过0M的自我促进运输的通道(参见，例如，A.Wiese等人，J.Membr.Biol.162，127(1998);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。与LPS相比脂质IVa具有降低的电荷/表面积比，突出了带负电荷的内核残基在多粘菌素结合中的作用。由于所选择的抗生素具有多种作用机制，在疏水性化合物之间MIC的变化有可能是渗透性变化的结果，其与一般性适应或药物流出机制的反映相反。KPM22的渗透特性证明KDO生物合成抑制通过降低OM屏障的固有抗性作为扩大现存抗生素活性镨的手段的潜力。细菌内毒素是引发人体内先天免疫应答的强促炎性分子，即使是当仅有痕量存在的时候(参见，例如，E.S.VanAmersfoort,等人，CIin.Microbiol.Rev.16，379(2003);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。革兰氏阴性细菌诱导的脓毒性休克是由不平衡的失调免疫应答造成的。部分地，这一病理生理级联是由LPS活化巨噬细胞触发的，其继而分泌一批炎性介质。由巨噬细胞释放的最早细胞因子中的一种是多效性的细胞因子TNFi(肿瘤坏死因子)。利用基于ELISA的测定由受刺激的人单核细胞分泌的hTNF-a来测量LPS制品的内毒素潜力(图7)。在高达ljig/mL的浓度上来自KPM22的制品无内毒素活性，这与利用色谱纯化的脂质IVa的较早研究相一致(参见，例如，D.T.Golenbock,等人，J.Biol.Che迈.266，19490(1991);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。在大肠杆菌和相关细菌中，KD0抑制不仅提高细菌对宿主应答和抗生素的易感性，还具有通过降低内毒素负载来减少脓毒症风险的潜力。将LPS从细胞质翻转到IM周质面上的内膜ABC(ATP结合盒)转运蛋白在体外对于六酰化LPS/脂质A底物是高度选择性的(参见，例如，ZhouZhou，Z.，等人，J.Biol.Chem.273，12466-12475(1998);Doerrler，W.T.，等人，/.胁/.C力e迈."7，36697-36705(2002);在此将每一篇的全部内容通过参考引用并入本文)。MsbA最初被鉴定为LpxL(HtrB)温度敏感性表型的多拷贝阻抑基因(参见，例如，Polissi，A.，andGeorgopoulos，C.Mol.Microbiol.20，1221-1233(1998);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。用KPM22基因组DNA的粘粒文库补偿营养缺陷型TCM15菌林揭示MsbA是△Kdo表型的多拷贝阻抑基因。分离十七个包含iz^^位点的粘粒克隆。正如A5P营养缺陷型的丧失和在固体琼脂培养基上形成菌落能力的恢复所表明的那样，包含只具有与野生型相同的完整野生型釕^序列的3.5kb插入片段的粘粒亚克隆(P固W52)，能够直接拯救TCM15而不需要开发推测的阻抑基因突变(表5)。TCM15(pMMW52)的生长速率类似于KPM22(表2和5)。这些结果表明尽管脂质IVA在体外是不良底物(见，Doerrler，W.T.和Raetz,C.R.，/.C力e瓜277，36697-36705(2002);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)，但当脂质IVa以高浓度存在时其通过简单的质量作用成为体内MsbA的底物。表5.MsbA对TCM15营养缺陷型的多拷贝抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>(33)aCfu值对应于直接铺平板(TCM15)或电转化后；b在可测量的情况下，于37。C的世代时间(min)列在括号中；。15pMA5P,10jiMG6P。d对于携带质粒的菌林包括Amp(lOOjugmL-l);6克隆载体；f包含淑W的亚克隆。实施例II此实施例描述了用在涉及KPM22和TCM15的研究中的细菌菌林，质粒，和引物。用在涉及KPM22和TCM15的研究中的细菌菌林，质粒，和引物列于表6中。表6.细菌菌林，质粒，和引物菌林/质粒/引物描述来源或参考文献BW30270SL3749SL3750SL3748SL3769SL1102TCM15KPM22KPM25KPM31KPM34KPM40KPM42Pl大肠杆菌K-12MG1655;r;7/f/V2/肠沙门氏菌鼠伤寒血清变型fi1.e/2f"/cssv.TyphimuriumJ(rAi^W，LPS的Ra化学型)肠沙门氏菌鼠伤寒血清变型(r/a/W7，LPS的Rb2化学型)肠沙门氏菌鼠伤寒血清变型(r/a""，LPS的Rb3化学型)肠沙门氏菌鼠伤寒血清变型6V7/，LPS的Rdl化学型)肠沙门氏菌鼠伤寒血清变型LPS的Re化学型)BW30270(A^/^A^"幼；A5P营养缺陷型TCM15MOPS基本培养基衍生物具有pT7ir&Z的KPM22KPM22(A她力具有pT7ir&"的KPM31KPM22(A具有pT7i^"的KPM40具有大肠杆菌K-12i:^"的pT7-7;Amp*GCTGCATTAATTAATCGACATTTTACTCAAGATTAAGGCGATCCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQIDNO:9)大肠杆菌品种保藏中心(CGSC#7925)沙门氏菌品种保藏中心(SGSC#228)沙门氏菌品种保藏中心(SGSC#229)沙门氏菌品种保藏中心(SGSC#227)沙门氏菌品种保藏中心(SGSC#231)沙门氏菌品种保藏中心(SGSC#258)T.C.Meredith和R.W.Woodard，J.Bacteriol.，出版中，(2005);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)在本发明过程中所进行的实验在本发明过程中所进行的实验在本发明过程中所进行的实验在本发明过程中所进行的实验在本发明过程中所进行的实验在本发明过程中所进行的实验T.CMeredith和R.W.Woodard,J.Biol.Chem.,278,32771(2003);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)InvitrogenP2GTCTTAACGCAGAACGCTAATACTTTATTTTTCAAGCAAAAAAGAATTCCGGGGATCCGTInvitrogenCGACC(SEQIDNO:10)P3ACAGCTAAATACATAGAATCCCCAGCACATCCATAAGTCAGCTATTTACTGTGTAGGCTGMWGBiotechGAGCTGCTTC(SEQIDNO:11)P4TAATGGGATCGAAAGTACCCGGATAAATCGCCCGTTTTTGCATAACAACCCATATGAATAMWGBiotech_TCCTCCTTAG(SEQIDNO:12)_a对同源区作下划线。将所有菌林都生长在标准Luria-Bertani培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl)或MOPS-基本培养基(参见，例如，F.C.Neidhardt,P.L.Bloch，D.F.Smith,J.Bacteriol.119，736(1974);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)中，所述培养基含0.2°/。甘油作为唯一碳源。将大肠杆菌菌林KPM22用作宿主，根椐Datsenko和Wanner的方案利用噬菌体入Red重组酶系统进行染色体和,j基因破坏(参见，例如，K.A.Datsenko,B.Wanner，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，6640(2000);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。分别使用15jag/mL和100^ig/mL的卡那霉素和氨节西林。分别使用以pKDl3(ira")或pKD4(ira")作为模板的引物对Pl/P2或P3/P4以构建KPM31和KPM40的插入盒。如所述那样利用FLP重组酶系统切除抗生素抗性标记(参见，例如，K.A.Datsenko,B.L.Wanner,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，6640(2000);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)，不同的是将所有质粒都在37。C进行处理。实施例III本实施例描述了KPM22的生长。KPM22的生长包括在37°CTCM15在MOPS-基本培养基中的指数分裂培养物，该培养基添加了1(^MD-葡萄糖6-磷酸和15pMD-阿拉伯糖5_磷酸，将所述培养物稀释(l:200v/v)入缺少糖磷酸补充物的相同培养基中。在持续24-32小时的初始迟滞后，生长重新开始并将培养物在LB琼脂平板上进行菌落纯化。实施例IV本实施例描述了对于涉及KPM22的实验所进行的生长速率测定。将过夜培养物生长在30X:下并用来接种新鲜预热的LB培养基(30C37。C,或42。C)至OD一等于0.05-0.1。通过测量OD綱腿的变化来监测生长，并在OD达到~0.7时稀释培养物以维持指数生长。倍增时间列于表7中。表7.在不同温度下LB培养基中的世代时间<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>a.2-3代后，生长速率为非指数型。实施例V本实施例描述了对于涉及KPM22和TCM15的实验的LPS纯化。通过将500mL每种菌林生长在LB培养基中来常规地制备样品，所述培养处于37。C、恒定通风、250rpm。通过离心(10min，8000x《，4'C)收集静止期培养物的细胞，在蒸馏水中洗涤，并再次离心。如以往所述通过用乙醇(95%),丙酮，和二乙醚处理对生物质进行脱水(参见，例如，U.Zahringer等人,J.Biol.Chem.279，21046(2004);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。根据酚-氯仿-石油醚方法通过干燥细胞的抽提来进行LPS的分离(参见，例如，C.Galanos，0.Ltideritz，O.Westphal，Eu.rJ.Biochem.9，245(1969);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。相对于蒸馏水对将要分析糖組成的等份粗制酚抽提物(图lA)进行充分透析(MWCO-1000Da)，并通过冻干法收集。通过逐滴加入水沉淀由粗制酚相纯化用于质镨分析和测量人TNFa细胞因子稀放的LPS样品。只对BW30270和KPM25形成了絮状沉淀，通过离心对其进行收集，接下来用80%苯酚洗涤并且随后用丙酮洗涤。将沉淀物溶于水中，并分别由其各自的酚相母液中透析。冻干后，将样品重悬于緩冲液(20mMTris-HCl,pH=7.5，10mMNaCl，10mMMgCh)中,用DNA酶I(2(Vg/mL)和RNA酶A(20jig/mL)于37"C处理8小时，随后用蛋白酶K(100^ig/mL)处理16小时。通过超速离心(SW41Ti悬篮式转子，200，OOOxg，2小时，15C)收集LPS样品，用蒸馏水洗涤三次，并在冻干前相对于水进行充分透析。代表性的LPS纯化产率列于表8中。表8.LPS纯化总结菌林最终OD600nm湿细胞质量(g)干细胞质量(g)观察到的Ppt.a酚溶性(mg)LPSPPt.(mg)纯化的产量b(mg)%产率cBW302705.272.500.56+7.013.512.12.1KPM223.611.880.43一13.3N/A7.21.7KPM255.752.580.65+9.115.713.02.0a.Ppt.-沉淀物。b.在DNA酶I/RNA酶A/蛋白酶K处理后。c.基于干细胞质量。实施例VI本实施例描述了对于涉及KPM22和TCM15的实验的糖类组成分析。利用比色化学测定法对来自粗制酚抽提物的LPS样品的D-葡糖胺(GlcN),2-酮3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸(KDO)，和L-甘油-D-甘露-庚糖(庚糖)含量进行测定。通过在500jliL的4MHC1中于IOO'C将LPS样品(lmg)水解18小时来测定GlcN含量。利用乙酰基氨基糖测定法来量化释放的GlcN(参见，例如，J.L.Strominger，J.T.Park，R.E.Thompson,J.Biol.Chem.234，3263(1959);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。利用LPS适用的硫代巴比妥酸测定法测量KDO含量(参见，例如，Y.D.Karkhanis，J.Y.Zeltner,J.J.Jackson,D.J.Carlo,Anal.Biochem.85，595(1978);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)，同时利用改进的半胱氨酸-硫酸测量法估计庚糖的量(参见，例如，M.J.0sborn，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.50,499(1963);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。实施例VII本实施例描述对于涉及KPM22和TCM15的实验的SDS-PAGE电泳和脂质A/ECA免疫印迹。才艮据Hitchcock和Brown的方法通过SDS-PAGE分析全细胞裂解物的LPS模式(参见，例如，P.J.Hitchcock,T.M.Brown,J.Bacteriol.154，269(1983);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。简言之，从LB琼脂平板上刮取每种样品的菌落并在Dulbecco磷酸盐緩冲盐水中混悬至相同的浊度。通过离心收集洗涤过的细胞沉淀，加入裂解緩冲液(50]nl62.5mMTris-HCl，pH6.8，2%SDS，5%2-巯基乙醇，10%甘油，0，002%溴酚蓝)，将样品在沸水浴中加热10分钟。向每种全细胞裂解物中加入蛋白酶K(25pg，10^12.5mg/ml)并于56。C温育1小时。将相同体积加样到13柳S-PAGE凝胶上，随后以恒定电流(15mA)跑电泳。将凝胶银染进行LPS分析(参见，例如，P.J.Hitchcock,T.M.Brown,J.Bacteriol.154,269(1983);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)，或如所述利用Tris-甘氨酸緩冲液(2OmMTris,15OmM甘氨酸，pH8.3，20%甲醇)以恒定电压(26V)由凝胶电转移至聚偏二氟乙烯膜(参见，例如，H.Towbin,T.Staehelin,J.Gordon,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76，4350(1979);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。在将印迹与mAbA6—起温育之前，将膜在1%的醋酸中煮沸1小时以便在通过常规免疫方法显色(参见，例如，R.Pantophlet,L.Brade，H.Brade,J.EndotoxinRes.4，89(1997);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)之前切割a2，6-KD0-GlcN键，所述mAbA6识别脂质A的非糖基化的1，4'-双磷酸化P1，6-连接的GlcN二糖主链(参见，例如，L.Brade,O.Holst,H.Brade，Infect.Immun.61,4514(1993);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。将真正的合成脂质IVa(化合物406)用作标准(参见，例如，M.Imoto等人，Bull.Chem.Soc.Japan60，2197(1987);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。利用mAb898对肠道细菌共同抗原(ECA)免疫印迹进行探测(参见，例如，H.Peters等人，Infect.Immun.50，459(1985);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。将免疫印迹与碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠IgG(H+L)—起温育并在氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-丐l咮基磷酸底物存在时进行显色。实施例VIII本实施例描述了在本发明过程中所进行的实验中所用的电喷射离子化傅立叶变换离子回旋质谱(ESIFT-ICRMS)。在负离子模式下利用APEXII仪(BrukerDaltonics，Billerica，USA)来进行ESIFT-ICRMS，所述APEXII仪装备了7Tesla自动屏蔽磁铁和Apollo离子源。利用厂商提供的标准实验序列获得质谱。将样品以10ng/jal的浓度溶于2-丙醇，水，和三乙胺的50:50:0.001(v/v/v)混合物中，并以2pl/min的流速喷雾。毛细入口电压设置为3.8kV，干气温度设置为150。C。镨形是电荷解巻积化的并且给出的质量数指的是中性单同位素质量。在以往发表过的来自大肠杆菌K-12菌林W3100的LPS的详细结构分析的基础上解释峰指配(参见，例如，S.Miiller-Loennies，B.Lindner,H.Brade，J.Biol.Chem.278,34090(2003);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。只将丰度最大的离子总结于表9中，因为有一些分子种类具有重叠同位素峰，其不能被明确鉴定。表9.ESIFT-ICRMS峰列表观察到的质计算的质量a,b量a703.:52703.5171178..671178.6611360..831360.8281404.,861404.8541527.,871527.8631587.,021587.0211797.,221797.2193813.,753813.7343893.,723893.7003915.,713915.6993995.,633995.6534017.,664017.6454038.,694038.6973927.683927.6894007.674007.6554029.64術9.6544050.704050.698化学组成c标记c磷脂，PE(33:1)(例如1*16:0+1*17:1)2*GlcN,2*GlcN,2*GlcN，2*GlcN,2*GlcN，2*GlcN,1*14:02*P,3*(OH)—14:02*户，3*(OH)—14:0,1*12:02*尸，4*卿-14:02*户，4*(OH)-14:0，2*P，4*(OH)-14:0，1*12:02*尸，4*(OH)—14:0,1*12:0LAhexa+l*GalLAheXa+l*GalLAhexa+l*Gal+l*NaUl*Gal+l*NaLAhex,+l*Gal+2*NaLAhexa+l*Gall*Pl*NaLAhexa+l*Gal，2*Glc，3*Hep,l*Rha,3*KD0,3*/M*NaLAhexa+l*Gal，2*Glc,3*Hep，l*Rha,3*KD0,LAhexa+l*Gal,2*Glc，3*Hep，l*Rha，3*KD0，4*A2*NaLAhexa+l*Gal，2*Glc，3*Hep,l*Rha，3*KDO,3*Glc,4*Hep,2*KD0,2*糖形3*Glc,4*Hep,2*KDO,糖形3*Glc，4*Hep,2*跳3*,，糖形3*Glc，4*Hep,2*KDO，4*,糖形3*Glc，4*Hep,2*KD0，4*,,糖形3*Glc，4*Hep,2*KDO,5*户，糖形PELAtetra脂质IVaLApentaLAheXaIIIIII糖形糖形糖形糖形IVIVIVIV3P+1丰尸一麟+l*Na4140.674140.722LAhexa+P2*跳'GlcNAc，l*Gal，3*户，+2*Na3*:Glc，4*Hep,糖形II4198.744198.735LAhexa+l*GlcNAc,l*Gal，2*KD0，4*尸，+l*Na3*Glc，4:*Hep,糖形II4220.734220.724LAhexa+l'2*KD0，*GicNAc，l*Gal，4*户，+2*Na3*Glc，4:*Hep,糖形II4300.684300.6982*KD0,'GlcNAc，l*Gal，5*,,+2*Na3*Glc,4:*Hep,糖形II4241.814241.778IAexa+l'2*KD0，'GlcNAc，l*Gal，>肿3*NaGlc，4'*Hep，糖形II4321.734321.745LAhexa+l*2*KD0，'GlcNAc,l*Gal，—尸，3**NaGlc,4'*Hep,糖形II4343.744343.734LAhexa+l*2*KD0,'GlcNAc，l*Gal，化3*Glc,4'Hep,糖形IIa.给出的质量数指的是中性分子的单同位素质量，其是在电荷解巻积化后由LPS级分的负离子ESIFT-ICR质镨推导出来的。b.粗体的峰以文字标记在图4上。c.缩写PE-磷脂酰乙醇胺；GlcN-D-葡糖胺；卜磷酸；户-^舲磷酸乙醇胺；Gal-D-半乳糖；Glc-D-葡萄糖；Hep-L-伊磁-D-甘露-庚糖；KD0-2-酮3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸；Rha-鼠李糖；GlcNAc-^"乙酰基D-葡糖胺；LAtri，tetra，penu，hexa-脂质A的酰化状态。实施例IX本实施例描述了涉及KPM22和TCM15的实验中荚膜异多糖酸的量化。通过Kang和Markovitz所报道方法的改进来评估荚膜异多糖酸(参见，例如，S.Kang,A.Markovitz,J.Bacteriol.93,584(1967);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。刮取来自LB琼脂平板的菌落并重悬于10mL蒸馏水中至相同浊度(OD,J，浸在沸水浴中15分钟以释放细胞外多糖，并通过离心(10min，8000xg)澄清。通过特异性比色反应利用真正的L-岩藻糖作标准，对上清液测定荚膜异多糖酸的组分甲基戊糖(L-岩藻糖)，(参见，例如，Z.Dische，L.B.Shettles，J.Biol.Chem.175,595(1948);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。将BW30270勦液样分离物包括进来作为阳性对照。实施例X本实施例描述了在本发明过程中所进行的实验中所用的透射电子显微方法(TEM)。将于37C生长在LB培养基中早期对数期的细胞培养物于室温固定在2%四氧化锇中90分钟。在与2%乙酸双氧铀造影溶液一起于室温温育1小时之前，将细胞用蒸馏水洗涤3次。将细胞用蒸馏水再洗涤3次，随后通过一系列逐渐升高的乙醇洗涤(30%，50%，70%，90%和无水乙醇，每一种于室温15min)脱水。将脱水细胞于室温在环氧丙烷中浸浴两次每次15min，随后浸入环氧丙烷/Epon混合物(1:1，v/v)中于4。C过夜温育。随后于60。C过夜进行聚合作用。将块切成超薄切片(80-100nm),放在格子上，并在柠檬酸铅溶液中造影。在PhilipsCM-IOO透射电子显微镜上获得图像，所述透射电子显微镜装备了自动compustage和Kodak1.6Megaplus高分辨率数码相机。实施例XI本实施例描述了在本发明过程中所进行的实验中所用的最小抑菌浓度(MIC)测定。除了获自MicroSourceDiscoverySystems的头孢噻啶之外，所用的抗生素都来自Sigma。基于其不同的作用模式和对细胞的进入性来选择抗生素。在LB培养基中利用所述的标准连续微量稀释方法测量所有研究的抗生素和药物的MIC(参见，例如，R.Vuorio，M.Vaara，Antimicrob.AgentsChemother.36，826(1992);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。刮取来自LB琼脂平板的菌落并混悬于具有不同浓度抗生素的培养基中(1(T细胞/mL)。将培养物于37nC振荡(200rpm)孵育18小时，此时通过目测评估生长。将报告的MIC值解释为药物完全抑制生长的最低浓度。实施例XII本实施例描述了在本发明过程中所进行的实验中所用的人TNFa细胞因子测定。利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测量如上所述分离的LPS制品对于人单核细胞(MNC)的胂瘤坏死因子(TNF)a细胞因子诱导能力。通过剧烈涡旋将LPS样品重悬于Hanks'平衡盐溶液并于4。C过夜陈化，随后在使用前即刻进行超声处理/涡旋。将抽自健康供体的肝素化血液直接与等体积的Hanks，平衡盐溶液混合并根据厂商的说明书利用Leucosep系统以Lymphoprep培养基(来自GreinerBio—0ne)通过差速梯度离心进行分离。用RPMI1640(3mML-谷氨酰胺，IOO单位/mL青霉素，100pg/mL链霉素)将MNC洗涤两次并转移至96孔平板中(7.5xl()5细胞/孔)。如之前所述的那样进行MNC的刺激(参见，例如，M.Mueller等人，J.Biol.Chem.279，26307(2004);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)，将上清液于4C保存过夜。如Copeland等人所述通过ELISA测定hTNFa产生(参见，例如，S,Copeland,H.S.Warren，S.F.Lowry，S.E.Calvano，D.Remick,CIin.Diagn.Lab.Immunol.12,60(2005);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。在三次独立实验中一式两份收集数据，代表性数据集在图7中报告。实施例XIII本实施例描述了KPM22粘粒文库的构建。如厂商(Stratagene)所述，通过用Sa〃3A部分消化，连接入SuperCosl中，并利用GigapackIIIXL包装提取物进行包装，由KPM22基因组DM构建粘粒文库。通过在LB培养基中生长来制备用于噬菌体感染的TCM15，所述LB培养基包含0.2。/。(w/v)麦芽糖和10mMMgS04以及另外添加了A5P和G6P。选捧转化体在缺少补充糖磷酸的LB平板上的生长，以及粘粒载体抗生素抗性标记(100^gmL-lAmp)。通过部分Saw3A消化，随后连接入中等拷贝数pMBL19克隆载体的化/nHI位点来对粘粒进行亚克隆(参见，例如，Nakano，Y.,等人，Gene162，157-158(1995);在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。实施例XIV本实施例描述了在涉及gutQ基因的实验中所用的材料。引物由Invitrogen合成。基因组大肠杆菌K-12MG1655DM购自美国典型培养物保藏中心(ATCC700926D)。利用PromegaWizardDNA纯化试剂盒进行质粒纯化。对宿主质粒和蛋白质表达分别使用化学感受态大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene)和大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)。菌林BW30270Cr/A+，大肠杆菌K-12MG1655的衍生物，获自大肠杆菌品种保藏中心(CGSC并7925)。糖和糖磷酸购自Sigma-Aldrich，除了D-葡糖醇6-磷酸是由D-葡萄糖6-磷酸的四硼氢化钠还原制备的(参见，例如，Bigham,E.C.，等人，(1984)JMedChem27，717-26;在此将其全部内容通过参考引用并入本文)，通过阴离子交换色谱(AGMP-1，Bio-Rad)进4亍纯化并通过凝胶过滤脱盐(Bio-GelP-2，Bio-Rad)。利用Bio-Rad蛋白质测定试剂以BSA作为标准测定蛋白质浓度。实施例XV本实施例描述了gutQ基因的克隆、过表达和纯化。利用标准PCR方法用F-R引物对(表IO)扩增gz/^基因，用和&边贝进行限制性酶切，并直接连接入类似限制性酶切的线性化pT7-7表达载体中，所述表达载体已经用小牛碱性磷酸酶进行过处理。表10_引物的核香酸序列_引物序列(5'-3')(SEQIDNO:l)GGTGCTAGAATTCATATGAGTGMGCACTACTGAACffR(SEQIDNO:2)GMTTCGGATCCAAGTTAAATAATCCCGGCCTGATAGAAATCCTGCbGQF(SBQIDN0:3)GATCGATGTGATCATAACCGGAGAGAGCAATGAGTGAAGCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGQR(SEQIDN0:4)CGGCTGGCGAAACGTCTGGGATTGAAGGATTAAATAATCCATTCCGGGGATCCGTCGACCKDF(SEQIDNO:5)GCGATGTTGTACTGGTTATCGCCAATACTCGTTGAATAACTGGAAACGCATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGKDR(SEQIDN0:6)GCGACGCACCTGCTTTGCTCArTGTTGTTTATCCTTGAATCTTTACACTACGGATATGMTATCCTCCTTAGGDF(SEQIDN0:7)ATGAATCAGGTTGCCGTTCTCGDR(SEQIDN0:8)CACCAGATTCACCTGTAGCG_Uel位点下划线。Wa迈M位点下划线。使用连接混合物转化化学感受态大肠杆菌XL1-Blue细胞，通过限制性分析和DNA测序来鉴定具有pT7-gutQ质粒的转化体。用质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，通过限制性分析复查，并保存于-8QX:。将大肠杆菌BL21(DE3)/pT7-gutQ细胞于37。C振荡(250rpm)生长于包含氨千西林(100mg/L)的2xYT培养基中。一旦培养物到达对数生长中期(0D6。。~0.7-0.9),让培养物冷却至18°C,随后用最终浓度0.4mM的异丙基-P-D-硫代半乳糖苷进行诱导。于181C生长16小时后，通过离心(6，500xg,15min,4"C)收获细胞。将细胞沉淀物混悬于20mL緩冲液A(20mMTris-HC1;lmMDL-二硫苏糖醇(DTT);pH=8.0)中，随后在冰上超声波裂解(5x30秒；脉冲之间2分钟间歇)。通过离心(29，000xg，40min，4'C)去除细胞碎片并将上清液滤过0.22^MMillex⑧滤器。将溶液加样到HiLoad(16/10)QSepharose快流柱上，所述柱已经用緩冲液A进行预平衡。经120分钟利用緩冲液A中的Q-900mM梯度的NaCl来洗脱蛋白质。合并通过SDS-PAGE测定主要包含重组蛋白质(33kDa)的级分。于室温在搅拌的同时緩慢加入硫酸铵饱和溶液，直到达到15%饱和度。通过离心(29，OOOxg，30min,22。C)澄清溶液，并将上清液提高到30%饱和度。通过离心(29，000xg，30min，22°C)收集蛋白质沉淀，重悬于緩沖液A，并相对于2L的緩冲液A于rC过夜透析。通过SDS-PAGE判断，制品大于~95°/。同质性，产率为180mggutQ/L细胞培养物。实施例XVI方法。l还原性条件下于'12%聚丙烯酰胺凝^上对蛋白质样品(:5-10ing)进行SDS-PAGE，并用0.25。/。考马斯亮兰R250溶液进行染色。通过曲辛-SDSPAGE分析LPS样品(叠加4%T,3%C;分离16.5°/。T，6%C)(参见，例如，Lesse，A.J.，等人，(1990)JImmunolMethods126,109-17;在此将其全部内容通过参考引用并入本文)，并通过银染显现》见察(参见，例如，Hitchcock,P.J.&Brown,T.M.(1983)JBacterio1154,269-77;在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。实施例XVII本实施例描述了在本发明过程中所进行的实验中所用的酶测定。如以往所述(参见,例如，Meredith,T.C.&Woodard，R.W.(2003)JBiolChem278,32771-7;在此将其全部内容通过参考引用并入本文)，通过不连续半胱氨酸-^唑比色测定法来测定API活性(参见，例如，Dische,Z.，Borenfreund，E.(1951)JBiolChem192，583-587;在此将其全部内容通过参考引用并入本文)，所述测定适于96-孔微板。所有培养板都包含内部Ru5P标准和适当的A5P对照一式三份。一个单位的酶活性定义为于37C每分钟转化lpmol糖磷酸。开发出第二种更加敏感的偶联测定法来测定粗制细胞提取物中的API活性，其利用来自拟南芥(JraWdo;^"Ma7/a/7a)的3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸8-磷酸合酶(kdsA)。这种酶催化不可逆的A5P和PEP的立体定向缩合以形成3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸8-磷酸(KD08P)和无机磷酸。将包含5|nL纯化kdsA溶液(3mg/mL;10U/mg)，10mMRu5P，6mMPEP，和于40uLlOOmMTris-HCl(pH-8.25)中的lmMEDTA的反应混合物于37。C孵育3分钟。通过加入10pL细胞提取物来起始反应。5分钟后，通过加入50jliL的10%(w/v)三氯乙酸来结束反应。通过Aminoff高碘酸-硫代巴比妥酸测定法(参见，例如，Sheflyan，G.Y.，等人，(1998)JournaloftheAmericanChemicalSociety120，11027-11032;在此将其全部内容通过参考引用并入本文)测定产生的KD08P。在这些条件下，kdsA在KD08P的形成中不是限速的。通过于340nm监测NADH的形成利用连续的分光光度测定来测量D-葡糖醇6-磷酸脱氢酶(gutD)活性。在通过加入终浓度为20mM的D-葡糖醇6-磷酸来起始反应之前，将酶溶液(100mMTris-HC1，pH=8.7，5mMNAD+)于25。C预温育2分钟。实施例XVIII本实施例描述了gutQ的表征。根据对于ksdD报道的方法来类似地进行gutQ的表征(参见，例如，Meredith,T.C.&Woodard，R.W.(2003)JBiolChem278，32771-7;在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。简言之，对于底物特异性，将酶样品稀释在100mMTrizma-HCl緩冲液(pH-8.25)中并通过用底物(15nMgutQ,10mM糖，lmMEDTA)起始反应进行测定。于37°C10分钟后，包含潜在替代底物D-阿拉伯糖，D-核糖5-磷酸，D-葡萄糖6-磷酸(G6P)，D-葡萄糖l-磷酸，D-葡糖胺6-磷酸，或D-甘露糖6-磷酸的反应被终止并测定酮醣的存在。通过"PNMR测定D/L-甘油醛3-磷酸，D-赤藓糖4-磷酸，和D-果糖6-磷酸的产物出现。于37。C利用不连续的微板测定法来测定动力学常数并通过添加底物来启动。浓度一般为0.2(-10Jn。2分钟后，终止反应(50mMTris-HCl，pH=8.25，5nMgutQ,lmMEDTA)，此时消耗了大约少于10。/。的底物。一式三份测定起始速率(r。)并利用非线性最小方差回归拟合标准Michaelis-Menten方程式以4更对Ru5P的形成和消失测定&和t,值。如对kdsD所述的那样利用31PNMR测定平衡常数(X)(参见，例如，Meredith,T.C.&Woodard，R.W.(2003)JBiolChem278，32771-7;在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。通过将酶稀释在不同pH值(pH-6.25-10，于37。C进行调节)的BTP緩冲液中来测定gutQ的pH最适值。以3分钟的反应时间如上面所述测量活性，一式三份(100mMBTP，15nMgutQ，10mMA5P，1mMEDTA)。将分离的gutQ酶样品稀释在100mMTri纖-HCl緩冲液(pKh8.25)中并与不同的二价金属或EDTA—起于4'C温育30分钟。随后以3分钟的反应时间一式三份在饱和底物条件下于37。C测定剩余活性(15nMgutQ，10mMA5P，IOjaM金属或EDTA)。实施例XIX本实施例描述对于涉及gutQ的实验的大肠杆菌菌林构建和生长条件。将大肠杆菌菌林BW30270用作宿主，根据Datsenko和Wanner的方法利用噬菌体入Red重组酶系统进行染色体guW和ir^"基因破坏(参见，例如，Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.(2000)ProcNat1AcadSciUSA97，6640-5;在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。使用50pg/mL的卡那霉素和氯霉素。分别使用引物对GQF-GQR和KDF-KDR,以pKD13(h力)或pKD3(c")作为模板，来构建BW30270(A^/^;:h/7)和BW30270(A^/^7.'.'cW)，其列在表10中。随后如所述利用FLP重组酶系统切除抗性标记(参见，例如，Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.(2000)ProcNatlAcadSciUSA97，6640-5;在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。利用GQF-GQRPCR产物插入片段由BW30270(△1&历类似地构建BW30270(△^z/^Air&A，所不同的是培养基和平板在所有时间都添加了G6P(1(^M)和ASP(1华M)，以便随后在电转化之后进行操作。对所有使用菌林进行菌落纯化，测试所有抗生素抗性的丧失，并对相关基因座进行测序以确认预期的缺失位点。将培养物于37。C振荡(250rpm)生长在添加了硫胺(ljig/mL)和指定碳源的M9基本培养基(26)或MOPS基本培养基中(参见，例如，Neidhardt，F.C.，Bloch，P.L&Smith,D.F.(1974)JBacteriol119，736-47;在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。将BW30W0(A^/^Ai:^")培养物另外添加G6P(1(^M)和A5P(5-5(^M)。向携带pT7-7(AmpR)质粒的那些菌林添加氨苄西林(1OOjig/mL)。实施例XX本实施例描述了细胞提取物的制备，用于酶测定、LPS分析和RT-PCR。过夜培养物生长在基本培养基中，所述基本培养基具有甘油(0.2W作为唯一碳源和指定添加剂。将培养物稀释(1:20v/v)入新鲜基本培养基中并于37。C振荡两小时以便让细菌恢复指数生长。在此时期通过添加A5P(5pM)和G6P(10pM)预i秀导BW30270(△^/^Air^幼的培养物以便上调己糖磷酸转运系统("力i)。通过离心将细胞沉淀以除去微量G6P(6，500xg，5min，22°C),随后接种入新鲜培养基。当指出时，向培养物中加入10mMD-葡糖醇，再继续生长四到六小时以便让gW操纵子上调，此时所有培养物都在对数生长的早期到中期。通过离心(6，500xg，5min,4'C)收获细胞。用水冷的l%NaCl溶液洗涤用于测定API和gutD活性的级分两次，并接着重悬在緩冲液(20mMTris-HC1,ImMDTT,pH=8.O)中。将细胞用超声处理破裂，通过离心(29，000xg，20min，4。C)澄清，并冷冻。用Dulbecco磷酸盐緩冲盐水洗涤用于LPS分析的样品2次，将沉淀重新悬浮在裂解緩冲液G00mMTris(pH=6.8)，2%SDS,4%2-巯基乙醇，10%甘油)中。根据Hitchcock和Brown的方法处理基于OD綱咖等数目的细胞(参见，例如，Hitchcock,P.J.&Brown,T.M.(1983)JBacteriol154，269-77;在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。根据生产商手册将待分析RNA的细胞沉淀快速重新悬浮在最大细菌增量试剂(MaxbacterialEnhancementreagent)中并利用TRIzol(Invitrogen)进行提取。通过用无RNA酶的DNA酶消化来进一步纯化RNA样品并利用RNeasymini试剂盒(Qiagen)进行分离。通过琼脂糖电泳检查RNA的质量并利用在260nm的UV吸光度定量。利用SuperscriptII一步RT-PCR系统(Invitrogen),才艮据指导，用lpg纯化的总RNA作为模板和GDF-GDR引物(0.2pM)扩增^/M基因的最开始的342个碱基对，来进行定量RT-PCR。实施例XXI本实施例描述了gutQ的纯化和表征。利用Q-Sepharose阴离子交换层析法随后进行硫酸铵沉淀，以两步完成纯化到均质。通过SDS-PAGE,所述蛋白质表现为单一的清晰的高分子量条带(~33kDa),并且比活性是329U/mg。确定gutQ的生化特性类似于kdsD的生化特性。动力学参数，pH最适值，辅因子需求的缺乏和四级结构都是相当的。将与A5P享有共同的官能度的单糖作为gutQ的潜在备选底物进行测试。在半胱氨酸-味唑比色测定中，2-酮己糖和2-酮戊糖形成紫红色的生色团，其在540nm吸收光(参见，例如，Dische,Z.,Borenfreund，E.(1951)JBiolChem192，583-587;在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。可以通过测量样品与对照在A"^吸光度的比率的增加来观察醛糖向酮糖的转化。所测试的糖都没有被转化为它们各自的酮糖形式。短链磷酸化醛糖D/L-甘油醛3-磷酸和D-赤藓糖4-磷酸以及D-果糖6-磷酸作为通过"P-NMR确定的备选底物。在检测限内，显示gutQ是A5P和Ru5P的特异性糖磷酸醛醇-酮醇异构酶。实施例XXII本实施例证明gutQ能够维持脂多糖生物合成。为了评估gutQ作为API在体内发挥功能的能力，利用入Red(Y，P，"0)同源重组系统构建BW3O27O(A^^0和BW30270(Ai:&幼(参见,例如，Datsenko，K丄&Wa画r，B丄(2000)ProcNatlAcadSciUSA97,6640-5;在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。没有一个突变是致死的，示意其他API编码基因的存在，所述其他API编码基因可以提供基本的LPS生物合成所需要的足够量的A5P。不管gut操纵子是否被诱导，LPS凝胶显示几乎等量的野生型K-12LPS核心(见，图8A),提示A5P合成在这些生长条件下在任何菌林中都不是限速的。在BW30270(Aird^)中基础水平的gutQ足以提供足够的A5P来维持存活力并且制造功能性LPS层，强烈提示gutQ在细胞内作为API发挥功能。实施例XXIII本实施例描述了在AAPI菌林BW30270(AgutQAkdsD)中的LPS生物合成。通过利用G6P诱导型己糖磷酸转运蛋白(w力/;)提供外源A5P来破坏在BW30270中的i7/^和ir^"基因。A5P是高度亲和性的(尽管是不可诱导的)己糖磷酸转运系统(y力/)的底物(参见，例如，Kadner，R丄，Murphy，G.P.&Stephens,C.M.(1992)JGenMicrobiol138(PtlO)，2007—14;Rick，P.D.&Osborn，M.J.(1972)ProcNat1AcadSciUSA69，3756-60;Eidels，L.，Rick,P.D.,Stimler，N.P.&Osborn,M.J.(1974)JBacteriol119，138-43;在此将每一篇的全部内容通过参考引用并入本文)。将具有低浓度的无机磷酸(l.3mM)的M0PS-基本培养基用于防止无机磷酸抑制介导的转运(参见，例如，Shattuck-Eidens，D.M.&Kadner，R.J.(1981)JBacteriol148，203-9;在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。转运蛋白的天然底物G6P是A5P有效诱导并转运到细胞中所需要的。单独的A5P或G6P不能恢复生长，因为在研究进程中不存在可检测到的生长，除非A5P和G6P都包含在培养基中(见，图9A)。因此，gutQ和kdsD是对于KD0合成的唯一细胞内A5P来源。在培养基中用A5P补充培养物，从而使脂多糖生物合成能够进行。通过利用其中耗尽了培养基中的A5P的过夜培养物作为接种物和延长温育时间，在BW30270(A^/^AU^)中合成的成熟LPS的量取决于包含在培养基中的A5P的量(图9B)。实施例XXIV本实施例描迷了gut操纵子的表达。将BW30270，BW30270(厶gW0,和BW30270(pT7-gutQ)培养在包含双重碳源-D-葡萄糖和D-葡糖醇的M9基本培养基中。所有的三种菌林以几乎相同速率生长并且在D-葡萄糖从培养基中耗尽后显示约40分钟的特征性的通常长的二次生长迟滞时间(参见，例如，Lengeler,J.&Lin，E.C.(1972)JBacteriol112，840-8;在此将其全部内容通过参考引用并入本文)。在这些条件下，诱导不受gutQ的影响。将菌林BW30270，BW30270(Ag"/^，和BW30270(△i^^培养在包含甘油作为碳源的M9基本培养基中。甘油是B类碳源并且不导致明显的分解代谢产物阻遏(参见，例如，Lengeler，J.W.(1986)MethodsEnzymol125,473-85;在此将其全部内容通过参考引用并入本文)，通过升高的cAMP水平促进D-葡糖醇对^^操纵子的诱导。在所有的三种菌林中测量总API(kdsD和/或gutQ)和gutD比活性(表11)。表11.^勿應炎參參哞^/^和^V^^活遂义應^f麥菌林a葡糖醇bgutD活性11API活性"WT->114±3+242±1448±5——>113±3+374±1315±2△她"——>12±1+581±4846±5pT7-gutQ——>12573±78+323±282457±117a菌林培养在具有0.2%甘油作为碳源的M9基本培养基中。b在收获前4小时，将D-葡糖醇以10mM加入显示(+)的培养物中。。以nmoles/min/mg报道比活性。d值包括kdsD和/或gutQ活性。BW3O27O(A^^0和BW30270(AircTs^的^/t操纵子保持可i秀导，当与亲本BW30270菌林比较时，在通过gutD活性估计的诱导程度上仅有两倍的差异。当将D-葡糖醇加入培养基中时，在BW30270和BW30270(Air^幼中总的API活性水平都增加，显示gutQ与gutD—起被上调。在加入D-葡糖醇后，在BW30270(A^/^)中观察到的API水平没有改变，尽管菌林保持能够上调gutD。在缺失山梨糖醇的培养基中，大部分的API活性归因于kdsD，证实了鉴定kdsD为组成型表达的LPS生物合成酶。将BW30270(pT7-gutQ)用于研究升高的API水平对gW操纵子的作用(表10)。API水平的基础水平在BW30270(pT7-gutQ)中增加了~250倍,尽管在gutD水平中观察不到明显的差异，因为操纵子保持被阻遏，除非在培养基中提供D-葡糖醇。实施例XXV本实施例显示了A5P对于gut操纵子的上调是重要的。因为当单一的API基因被破坏时在调节中没有观察到差异，不能直接观察到表型可能是由于API的第二拷贝的抑制作用。在BW30270(△^z/^Air&^中研究gW操纵子的可诱导性。将过夜培养物培养在MOPS基本培养基(0.2%甘油，15pMA5P，10^MG6P)中,并且稀释到新鲜培养基(0.2%甘油，5pMA5P，10pMG6P)中，以将细胞回复到指数生长。在振荡2小时后，收获细胞并且将其用于接种仅包含甘油和A5P的培养基。因为细胞对于"力p转运蛋白基因进行了预先诱导，没有加入G6P。选择两个浓度的A5P(5和5(^M)从而使LPS水平和生长速率方面的差异在研究进程中最小化。在50jaMA5P,gutD保持可诱导到接近野生型水平(表12)。表12.在△Ji7/细胞提取物中的弄gz^f;的比活性义濕许萝菌林a葡糖醇bA5P0iM)gutD活性。gutQ活性cAg一AMy"H^JIN.D.d"~+50278±33N.D.d—5〉1N,D.d+59.8±1N.D.dAgu丰胁"—5>11366±180pT7-gutQ+5356±27976±101a菌林培养在包含0.2°/。甘油的MOPS基本培养基中并且用1OpMG6P/5jiMA5P进行预先诱导b在收获前4小时，将D-葡糖醇以10mM加入到显示(+)的培养物中。c以nmoles/min/mg才艮道的比活性。dN.D.-没有检测到活性.gutQ蛋白质产物本身对于表达不是必需的。当A5P浓度减少到5pM时，在D-葡糖醇培养的细胞中在gutD活性上具有显著的和可再现的减少。然而，在比较时，LPS的水平仅是稍微减少(图9C)。这说明在A5P水平和gutD的量之间存在直接的关联，并且差异不是由于由消耗LPS层导致的多效作用的后果。gutD基因的表达水平的分析显示gutD的测量的比活性的减少与mRNA的量相关(图9D)。当由编码gutQ的质粒补偿时，^/f操纵子在相同的生长条件下保持可诱导。实施例XXVI本实施例显示当过量表达时，基因msbA使AKDO大肠杆菌细菌细胞在不包含D-阿拉伯糖5-磷酸培养基补充的琼脂上生长。最初将MsbA鉴定为LpxL(HtrB)温度敏感性表型的多拷贝阻抑基因(Polissi等人，1996,Mol.Microbiol.20:1221-1233，完全作为参考并入本文)。用KPM22基因组DNA的黏粒文库补偿营养缺陷型TCM15(义J^^熟菌林揭示msbA是AKdo表型的多拷贝阻抑基因。分离包含msb^基因座的17个单独的勦粒克隆。包含仅具有与野生型相同的完整野生型ms^序列的3.5kb插入物的黏粒亚克隆(p丽W52)能够直接拯救TCM15，如通过A5P营养缺陷型的丧失和在固体琼脂上菌落形成能力的恢复来判断。TCM15(pMMW52)的生长速率惊人地类似于KPM22大肠杆菌菌林(Meredith等人，2006,ACSChem.Biol.1:33-42，完全作为参考并入本文)。特此，将上述说明书中提及的所有的出版物和专利通过参考引用并入本文。尽管本发明结合具体的优选实施方案进行了描述，应该理实际上，对于相关领域的技术人员显而易见的进行本发明所述方式的各种改进意欲落在后附的权利要求的范围内。权利要求1.一种组合物，其包含实质上缺乏脂多糖的活的大肠杆菌的外膜。2.权利要求l的组合物，其包含实质上缺乏脂多糖的活的大肠杆菌。3.—种组合物，其包含具有KD0广脂质IVA生物合成途径中的破坏的活的革兰氏阴性细菌。4.权利要求3的组合物，其中所述活的革兰氏阴性细菌缺乏D-阿拉伯糖5-磷酸异构酶(API)表达。5.权利要求3的组合物，其中所述活的革兰氏阴性细菌包含突变从而使所述菌林实质上不含KD0。6.权利要求5的组合物，其中所述突变选自由突变的gutQ基因和突变的kdsD基因组成的组。7.权利要求3的组合物，其中所述活的革兰氏阴性细菌包含突变从而使所述突变消除在KD02和脂质IVA之间的关联。8.权利要求7的组合物，其中所述突变包含突变的msbA基因和突变的kdsA基因。9.权利要求7的组合物，其中所述突变包含突变的msbA基因和突变的kdsB基因。10.权利要求7的组合物，其中所述突变包舍突变的msbA基因和突变的waaA基因。11.权利要求7的组合物，其中所述突变包含突变的yhjD基因和突变的kdsA基因。12.权利要求7的组合物，其中所述突变包含突变的yhjD基因和突变的kdsB基因。13.权利要求7的组合物，其中所述突变包含突变的yhjD基因和突变的waaA基因。14.权利要求3的组合物，其中所述活的革兰氏阴性细菌的外膜表达脂质IVa。15.生产脂质IVA的方法，其包括从权利要求14的所述活的革兰氏阴性细菌中提取脂质IVA。16.—种用于诱导免疫应答的组合物，其包含权利要求l的组合物。17.—种组合物，其包含缺乏gutQ和kdsD基因表达的活的革兰氏阴性细菌。18.权利要求17的组合物，其还包含外源D-阿拉伯糖5-磷酸。19.权利要求17的组合物，其中所述革兰氏阴性细菌还过量表达msbA。20.—种组合物，其包含含有外膜的活的无毒的革兰氏阴性细菌，其中所述外膜包含脂质IVA。21.权利要求20的组合物，其中所述外膜实质上无LPS表达。22.—种用于在受试者中诱导免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用权利要求1的组合物，从而使所述施用诱导免疫应答。全文摘要本发明提供无毒的革兰氏阴性细菌。特别地，本发明提供在外膜内实质上缺乏脂多糖(LPS，内毒素)的活的革兰氏阴性细菌(例如，大肠杆菌(E.coli))。本发明进一步提供活的无毒的革兰氏阴性细菌的产生方法及其用途。本发明还提供用于诱导免疫应答和用于研究和开发治疗剂的组合物和方法。文档编号A61K39/00GK101472604SQ200780008031公开日2009年7月1日申请日期2007年1月19日优先权日2006年1月19日发明者P·阿加沃尔,R·W·伍达德,T·C·梅瑞迪斯申请人:密歇根大学董事会