用于体内转染肠细胞的非病毒组合物和方法

专利名称：用于体内转染肠细胞的非病毒组合物和方法
技术领域：
本发明涉及基于壳聚糖的纳米颗粒和核酸载体。另外，本发明涉及在体内转染肠细胞的方法。
背景技术：
壳聚糖是无毒的N-乙酰-D-葡糖胺和D-葡糖胺的阳离子共聚物，所述共聚物具有良好的粘膜粘着特性，并已被广泛用于可控的药物递送。壳聚糖的粘膜粘着性被认为延长了相关药物在胃肠道的停留时间，因此增加了其生物利用度。(Kotze AF, Luessen HL, Thanou M，VerhoefJC, de Boer AG, Juninger HE，Lehr CM. Chitosan and chitosanderivatives as absorption enhancers for peptide drugs across mucosal印ithelia(作为用于肽类药物跨粘膜上皮的吸收增强剂的壳聚糖和壳聚糖的 ttj 生物).Mathiowitz E, Chickering DE, Lehr CM, eds. BioadhesiveDrug Delivery Systems (生物粘着药物递送系统).New York, NY =Marcel Dekker ； 1999.)几个团体已经探究了壳聚糖作为DNA递送载体的潜力，且许多壳聚糖/DNA复合物的特性也已被检测以试图确定能良好适合基因转染的组合物。已发现所述复合物在溶解性、聚合倾向、复合物稳定性、颗粒大小、释放DNA的能力以及转染效率的其他特性中是不同的。大分子量的壳聚糖在生理PH下是相对不溶的，但溶于酸性溶液以备用。一旦形成， 含有大分子量的壳聚糖和DNA的复合物是相对稳定的，但已被报道转染效率低下，这可能是由于DNA摄取和释放差导致。低分子量的壳聚糖/DNA复合物在溶液中更为可溶但较不稳定。据报道低分子量的壳聚糖聚合物与DNA形成不稳定的复合物，如在电场中分离(琼脂糖凝胶电泳)所提示的那样。这些复合物在体外也显示了低转染效率和低水平的报告基因表达(例如，Koping-Hoggard et al.，Gene Then，8 1108-1121，2001 ；MacLaughlin, et al., J Control Release. 1998Dec4 ；56(1-3):259-72 ；Sato et al. , Biomaterials, 22:2075-2080,2001 ；US2005/0170355 ；US2005/0164964)。实验也显示，低分子量的壳聚糖 /DNA复合物在用盐或血清刺激的应答中倾向释放DNA，提示它们不能很好地适合许多体内应用。壳聚糖分子量对体外转染效率的影响的研究还不明确。一些研究显示， 对20-200kDa大小范围内的壳聚糖聚合物而言，转染效率对分子量没有明显的依赖 (Koping-Hoggard et al.,上述；MacLaughl in et al,上述)。但其他人(Sato etal·,上述)报道，与>100kDa的壳聚糖聚合物相比，15kDa和52kDa的壳聚糖显示更高的体外报告基因表达，且1.3kDa的壳聚糖聚合物是无效的。而且，体外和体内转染效率之间的不一致经常被报道(例如，Koping-Hoggard et al.，Gene Ther. 20040ct ；11(19) :1441-52 ； US2005/0170355 ；US2005/0164964)。许多研究已经检测了大分子量壳聚糖/DNA复合物转导胃肠道细胞的能力。将合并溶内体(endosomolytic)肽的壳聚糖/DNA复合物直接给予上部的小肠，显示盲肠已在上皮细胞、派尔集合淋巴结(Peyer' spatches)和肠系膜淋巴结产生报告基因表达(MacLaughlin et al.，上述)。另外，已显示口服壳聚糖与编码促红细胞生成素的DNA的复合物产生瞬时的红细胞压积增加(Chen et al.，World J. Gastroenter.，10:112-116， 2004)。在食物过敏模型中，壳聚糖已经被用于口部递送编码花生变应原蛋白Arah2的DNA 以试图使小鼠耐受摄取花生提取物(Roy et al.，Nat. Med.，5:387-391，1999)。总之，相对低转染效率和低水平的转基因表达已被报道，部分由于低的DNA摄取和释放，也部分由于肠道内细胞的迅速更新。肠道上皮是体内更新最迅速的组织之一，上皮细胞每3-5天更新。 重要的是，肠道粘膜细胞的转基因表达由于腔粘膜细胞寿命短的这一事实又是复杂的，一旦它进入细胞核，提供短暂时期的DNA的表达。其他研究组已经以多种方式化学修饰壳聚糖，以试图开发具有改善的转染效率以及诸如转导远端肠道组织的能力的其他所需特性的DNA复合物。Kai等人在他们的报告中指出已经离开胃部且已进入较为中性的十二指肠环境的壳聚糖/DNA组合物失去了具有辅助改变PH的正电荷，并由此倾向释放相关的DNA。Kai等人报道冻干的大分子量的壳聚糖/ DNA复合物的N-乙酰化作用稳定了口部递送的复合物，且增加了远端肠道转导的效率。Kai et al.，Pharm. Res. 21838-843，2004。考虑到腔内肠粘膜细胞的寿命，通过壳聚糖递送到肠粘膜的基因的长期表达还没有被报道可能并不令人吃惊。此外，壳聚糖DNA复合物转染诸如内分泌细胞的较不常见的肠粘膜细胞类型的能力还没有被详细检测。与实现肠内分泌细胞的长期表达和转染相关的困难可由考虑到肠道结构而被理解。胃肠道壁由四层组成。所述肠道最内层是粘膜层，其由与腔接界的被覆上皮组成。 所述上皮是身体与摄取物质相互作用的部位。在影响吸收的胃肠道区域，所述上皮是单层细胞厚度。所述上皮位于基底层，其进一步覆盖固有层。在所述肠道的吸收区域下方，以固有层的长度布满了毛细血管床，而且吸收的食物原料的加工产物是进入这些血管。人小肠由三部分组成十二指肠、空肠和回肠。所述小肠的粘膜广泛折叠，当环状折叠突入肠腔时，使它有一个褶饰边的外观。这种折叠填充了所述小肠腔的大部分面积，且使上皮的吸收表面积增加了几倍。在腔表面，所述小肠粘膜的折叠出现绒毛，所述绒毛是进一步增加吸收面积的粘膜的外翻部分。每一绒毛进一步由一个细胞厚度的上皮覆盖。该上皮绝大多数由吸收性肠细胞构成，该细胞在它们的顶(腔)面分布有数千个短的微小绒毛， 使吸收面积再次增加了许多倍。被称为糖萼的所述微小绒毛的外表面是细丝状的并富有碳水化合物。这个膜区域也富有有助于被消化的物质降解和吸收的多种酶和转运系统。吸收性肠细胞构成了超过90%的所述绒毛的上皮细胞和甚至更大比例的所述腔的表面积。分散在这些细胞之中的是数目相对较小的内分泌细胞，据报道其构成大约0. 3 % 的所述绒毛上皮。与其呈现大的和超结构的复合物顶表面的吸收性肠细胞相比，内分泌细胞有与所述固有层毛细管并列的宽阔的基底表面，且面向腔时变得极窄。比肠道粘膜的内分泌细胞更难以想到的是肠道粘膜的前体细胞。在凸出的绒毛下面，在内衬于隐窝深处的上皮中，存在产生粘膜的主要细胞类型的前体细胞，包括吸收性肠细胞和肠内分泌细胞。所述绒毛上皮层形成大约每三天就更新的短寿命分化上皮细胞的连续层，且上皮的维持需要大量细胞的分裂和分化。所述隐窝的前体细胞产生从所述隐窝迁移出到绒毛并进行分化的子代。通常肠内分泌细胞特征在于对信号或刺激物(“促分泌素”)应答时分泌合成的蛋白进入血液的能力。内分泌细胞的特定实例包括K细胞、L-细胞、S-细胞、G-细胞、D-细胞、I"细胞、Mo-细胞和Gr-细胞。K细胞主要位于胃、十二指肠和空肠。这些内分泌细胞分泌激素GIP，其正常功能是促进餐后胰岛素的释放。肠内分泌细胞通常，且特别是K细胞，是用于转基因递送的有吸引力的细胞靶标。 这些细胞具有加工许多蛋白前体的能力，并且具有提供调节的分泌蛋白进入系统循环响应信号的细胞机制。这些特性以前已被利用(参见Cheung et al.，Science，290 1959-1962， 2000 ；美国专利申请第09/804，409号；通过引用特别并入本文)。用K-细胞特异的葡萄糖反应性胰岛素表达构建体设计的K细胞被观察到表达和分泌胰岛素响应升高的血糖，且能够在糖尿病小鼠模型中恢复正常的葡萄糖耐受。尽管对壳聚糖作为核酸递送的病毒方式的另一选择有普遍的兴趣，但是低转染效率、稳定性和溶解性问题、体内不可预测性以及只能转染短寿命粘膜细胞已经大大阻止了壳聚糖在肠道严格的环境中作为核酸载体的应用。发明概述在一个方面，本发明提供了基于壳聚糖的纳米颗粒，所述纳米颗粒包括表达在肠粘膜细胞时能够发挥治疗效应的治疗性核酸。这些基于壳聚糖的纳米颗粒提供了治疗或防止多种状况和病症的新的非病毒方法。本发明公开的是能够在体内的肠粘膜引起治疗性核酸长期表达的基于壳聚糖的纳米颗粒。所述纳米颗粒对治疗性RNA或治疗性蛋白在肠粘膜中长期产生是有用的。本发明公开的是能够引起由治疗性核酸编码的治疗性蛋白的系统水平增加的基于壳聚糖的纳米颗粒。所述基于壳聚糖的纳米颗粒能够将生理相关水平的治疗性蛋白递送入血液循环系统。本发明公开的是能够在体内转染肠粘膜前体细胞的基于壳聚糖的纳米颗粒。所述纳米颗粒用于肠粘膜内治疗性RNA或治疗性蛋白的长期产生。本发明公开的是能够体内转染肠内分泌细胞前体细胞的基于壳聚糖的纳米颗粒。 所述纳米颗粒提供了在粘膜细胞类型内治疗性蛋白的产生，所述细胞类型能够加工前体蛋白并以调节的或组成性方式分泌治疗性蛋白进入系统循环。在本发明的许多优选实施方案中，基于壳聚糖的纳米颗粒包括编码能够在非肠组织内发挥治疗效应的治疗性蛋白的治疗性核酸。特别优选的是具有系统活性的治疗性蛋白。在本发明的许多优选实施方案中，基于壳聚糖的纳米颗粒被设计用于治疗性核酸在肠粘膜细胞内的非组成性表达。所述纳米颗粒提供治疗性核酸的动态长期表达。在许多优选实施方案中，纳米颗粒被设计以便提供治疗性核酸在肠粘膜细胞内的可调节表达。在许多优选的实施方案中，纳米颗粒被设计以便提供治疗性蛋白从肠内分泌细胞的调节的分泌响应促分泌素。与上述目的一致，在一个方面，本发明提供包含基于壳聚糖的纳米颗粒的组合物。在一个实施方案中，本发明提供包含基于壳聚糖的纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒包含(i)多个具有3kDa至250kDa的平均分子量的壳聚糖聚合物，以及(ii)治疗性构建体，其中所述治疗性构建体包含可操作连接到在肠粘膜细胞内有功能的表达调控区的治
6疗性核酸，其中所述治疗性核酸在表达于肠粘膜细胞时，能够发挥治疗效应，并且其中所述的基于壳聚糖的纳米颗粒能够实现所述治疗性核酸在肠粘膜长于约4天，更优选的是长于约5天，更优选的是长于约6天，更优选的是长于约7天，更优选的是长于约10天，更优选的是长于约2周，更优选的是长于约3周，更优选的是长于约4周，更优选的是长于约6周， 更优选的是长于约8周，更优选的是长于约10周，且最优选的是长于约12周的表达。在一个实施方案中，本发明提供包含基于壳聚糖的纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒能够在体内转染肠粘膜前体细胞。这种纳米颗粒包含(i)多个具有3kDa至250kDa的平均分子量的壳聚糖聚合物，以及(ii)治疗性构建体，其中所述治疗性构建体包括可操作连接到在肠粘膜细胞内有功能的表达调控区的治疗性核酸，其中所述治疗性核酸在肠粘膜细胞表达时，能够发挥治疗效应。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒能够引起治疗性核酸在肠粘膜长于约4天，更优选长于约5天，更优选长于约6天，更优选长于约7天，更优选长于约10天，更优选长于约2周，更优选长于约3周，更优选长于约4周，更优选长于约6周， 更优选长于约8周，更优选长于约10周，且最优选长于约12周的表达。在一个实施方案中，本发明提供包含基于壳聚糖的纳米颗粒的组合物，所述纳米颗粒能够增加治疗性蛋白的所述系统水平。这种纳米颗粒包含(i)多个具有3kDa至250kDa 的平均分子量的壳聚糖聚合物，以及(ii)治疗性构建体，其中所述治疗性构建体包括可操作连接到在肠粘膜细胞内有功能的表达调控区的治疗性核酸，其中所述治疗性核酸在表达于肠粘膜细胞时，能够发挥治疗效应，其中所述治疗性核酸编码从肠粘膜被递送入系统循环的治疗性蛋白。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒能够引起所述治疗性核酸在肠粘膜长于约4天，更优选长于约5天，更优选长于约6天，更优选长于约7天，更优选长于约10 天，更优选长于约2周，更优选长于约3周，更优选长于约4周，更优选长于约6周，更优选长于约8周，更优选长于约10周，且最优选长于约12周的表达。在一个实施方案中，所述纳米颗粒基本上由(i)多个具有3kDa至250kDa的平均分子量的壳聚糖聚合物，以及(ii)治疗性构建体组成，其中所述治疗性构建体包括可操作连接到在肠粘膜细胞内有功能的表达调控区的治疗性核酸，其中所述治疗性核酸在表达于肠粘膜细胞时，能够发挥治疗效应。在优选的实施方案中，本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒的所述表达调控区具有非组成性活性，且所述纳米颗粒能够引起所述治疗性核酸的长期动态表达。在特别的优选实施方案中，所述表达调控区是可调节的，并且所述纳米颗粒能够引起所述治疗性核酸的长期的可调节的表达。所述基于壳聚糖的纳米颗粒的壳聚糖聚合物优选具有小于约250kDa，更优选小于 230kDa，更优选小于220kDa的平均分子量。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒的多个壳聚糖聚合物具有从约3kDa 至约2IOkDa的平均分子量。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒的多个壳聚糖聚合物具有从约IOkDa 至约250kDa的平均分子量。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒的多个壳聚糖聚合物具有从约IOkDa 至约2IOkDa的平均分子量。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒的所述多个壳聚糖聚合物具有从约3kDa至约50kDa的平均分子量。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒的多个壳聚糖聚合物具有从约3kDa 至约6kDa的平均分子量。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒的多个壳聚糖聚合物具有从约200kDa 至约2IOkDa的平均分子量。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒具有从约1:1至约100:1的胺磷酸盐(N:P) 比。在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有约从1:1至约6:1的N:P比。在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约1:1至约4:1的N:P比。
在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有约3 1的N P比。在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约10:1至约90:1的N:P比。在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约10:1至约50:1的N:P比。在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约10:1至约40:1的N:P比。在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约10:1至约30:1的N:P比。在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约60:1至约100:1的N:P比。在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有约70:1至约100:1的N:P比。在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有约20:1的N:P比。在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有约60:1的N:P比。在优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约1:1至约50:1的壳聚糖与核酸的重量比。在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约1:1至约5:1的壳聚糖与核酸
的重量比。在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约1:1至约3:1的壳聚糖与核酸
的重量比。在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有约2:1的壳聚糖与核酸的重量比。在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约5:1至约45:1的壳聚糖与核酸
的重量比。在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约5:1至约25:1的壳聚糖与核酸
的重量比。在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约5:1至约20:1的壳聚糖与核酸
的重量比。在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约5:1至约15:1的壳聚糖与核酸
的重量比。在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约30:1至约50:1的壳聚糖与核
酸的重量比。在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有从约35:1至约50:1的壳聚糖与核酸的重量比。在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有约10:1的壳聚糖与核酸的重量比。在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒具有约30:1的壳聚糖与核酸的重量比。
在优选实施方案中，所述组合物包含在PH为5时，具有+5mV至+50mV的平均ζ 电位的纳米颗粒。在另一优选实施方案中，所述组合物包含在PH为5时，具有+30mV至+50mV的平均ζ电位的纳米颗粒。在另一优选实施方案中，所述组合物包含在PH为5时，具有+30mV至+40mV的平均ζ电位的纳米颗粒。在另一优选实施方案中，所述组合物包含在PH为5时，具有+32mV至+40mV的平均ζ电位的纳米颗粒。在另一优选实施方案中，所述组合物包含在PH为5时，具有+5mV至+25mV的平均 ζ电位的纳米颗粒。在另一优选实施方案中，所述组合物包含在PH为5时，具有+5mV至+SmV的平均 ζ电位的纳米颗粒。在优选的实施方案中，所述组合物包含具有小于225nm的平均直径的纳米颗粒。在另一优选实施方案中，所述组合物包含具有SOnm至225nm的平均直径的纳米颗粒。在另一优选实施方案中，所述组合物包含具有SOnm至175nm的平均直径的纳米颗粒。在优选实施方案中，所述组合物具有约1 μ g/ml至约1. 5mg/ml，更优选约1 μ g/ml 至约lmg/ml，更优选约10 μ g/ml至约lmg/ml，更优选约50 μ g/ml至约lmg/ml，更优选约 100 μ g/ml至约lmg/ml，更优选约150 μ g/ml至约lmg/ml，更优选约200 μ g/ml至约lmg/ ml的DNA浓度。在优选实施方案中，所述组合物的PH小于6. 5，更优选小于6. 0，且最优选约4. 5 至约5. 5。在优选实施方案中，所述纳米颗粒的所述壳聚糖聚合物的脱乙酰化程度大于约 70 %，更优选大于约75 %，更优选大于约80 %，更优选大于约85 %，更优选大于约90 %，更优选大于约95 %，且最优选至少98 %。在优选实施方案中，所述组合物包含低分子量的壳聚糖纳米颗粒，其中所述低分子量纳米颗粒的多个壳聚糖聚合物具有3kD至25kD的平均分子量。在优选实施方案中，低分子量的壳聚糖纳米颗粒具有10 1至90 1的N:P比。在优选实施方案中，低分子量的壳聚糖纳米颗粒在PH为5时，具有+30mV至+50mV的平均ζ电位，更优选+30mV至+40mV。 在优选实施方案中，低分子量壳聚糖纳米颗粒具有小于175nm的平均直径。在另一个优选实施方案中，所述组合物包含高分子量的壳聚糖纳米颗粒，其中所述高分子量纳米颗粒的所述多个壳聚糖聚合物具有25kD至250kD的平均分子量。在优选实施方案中，高分子量的壳聚糖纳米颗粒具有2:1至40:1的N:P比。在优选实施方案中， 高分子量的壳聚糖纳米颗粒在PH为5时，具有+5mV至+25mV的平均ζ电位。在优选的实施方案中，高分子量的壳聚糖纳米颗粒具有小于225nm的平均直径。在优选的实施方案中， 高分子量的壳聚糖纳米颗粒具有1:1至30:1的壳聚糖与核酸的重量比。在特别优选的实施方案中，所述纳米颗粒的多个壳聚糖聚合物具有约3. 9kD的平均分子量，且脱乙酰化程度约98%。在优选的实施方案中，所述组合物包含具有小于175nm的平均直径的纳米颗粒。在优选的实施方案中，所述组合物具有约25μ g/ml至约100μ g/ ml的DNA浓度。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒具有约40:1至约80:1的N:P比，最优选约60:1的N:P比。在优选实施方案中，所述纳米颗粒具有20:1至40:1的壳聚糖与核酸的重量比，最优选30:1的重量比。在另一个优选实施方案中，所述纳米颗粒的所述多个壳聚糖聚合物具有约3. 9kD 的平均分子量，且脱乙酰化程度约98%。在优选的实施方案中，所述组合物包含具有小于 175nm的平均直径的纳米颗粒。在优选的实施方案中，所述组合物具有约200 μ g/ml至约 lmg/ml的DNA浓度。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒具有约10:1至约30:1的N:P比， 最优选约20:1的N:P比。在优选实施方案中，所述纳米颗粒具有5:1至15:1，最优选10 1的重量比的壳聚糖与核酸的重量比。在优选的实施方案中，本发明的纳米颗粒能够转染所述小肠的肠粘膜前体细胞。 在优选的实施方案中，所述纳米颗粒能够转染十二指肠、空肠或回肠的肠粘膜前体细胞。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒能够转染胃的肠粘膜前体细胞。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒能够转染结肠的肠粘膜前体细胞。在优选实施方案中，所述纳米颗粒能够转染肠内分泌细胞前体细胞。在优选实施方案中，所述肠内分泌细胞前体细胞能够产生选自K细胞、L-细胞、S-细胞、G-细胞、D-细胞、I-细胞、Mo-细胞和Gr-细胞的肠内泌细胞。在特别优选的实施方案中，所述肠内分泌细胞前体细胞是K细胞前体细胞。在一个实施方案中，所述纳米颗粒缺乏内吞溶酶体肽。在一个实施方案中，所述纳米颗粒的治疗性核酸编码治疗性RNA。在优选的实施方案中，所述治疗性RNA是siRNA、反义RNA、短发夹RNA或酶性RNA。在优选实施方案中，所述纳米颗粒的所述治疗性核酸编码治疗性蛋白。在特别优选的实施方案中，所述治疗性蛋白是分泌的治疗性蛋白。优选地，所述纳米颗粒能够增加所述分泌的治疗性蛋白的系统水平。优选地，所述纳米颗粒能够引起所述分泌的治疗性蛋白的所述系统水平的长期增加。在一个实施方案中，所述分泌的治疗性蛋白的系统水平的长期增加是静态的。在优选的实施方案中，所述分泌的治疗性蛋白的系统水平的长期增加是动态的。在优选实施方案中，所述纳米颗粒的治疗性核酸编码治疗性蛋白，所述蛋白选自激素、酶、细胞因子、趋化因子、抗体、促有丝分裂因子、生长因子、分化因子、影响血管发生的因子、影响血凝块形成的因子、影响血糖水平的因子、影响葡萄糖代谢的因子、影响脂质代谢的因子、影响血胆固醇水平的因子、影响血LDL或HDL水平的因子、影响细胞凋亡的因子、影响食物摄取的因子、影响能量消耗的因子、影响食欲的因子、影响营养吸收的因子、影响炎症的因子以及影响骨形成的因子。特别优选编码胰岛素、瘦素、胰高血糖素拮抗剂、 GLP-U GLP-2、葛瑞林((ihrelin)、胆囊收缩素、生长激素、凝血因子、PYY、红细胞生成素、炎症抑制因子、IL-10、IL-17拮抗剂、TNFa拮抗剂、生长激素释放激素或甲状旁腺激素的治疗性核酸。在优选的实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是胰岛素。在另一个优选实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是胰岛素类似物。在另一个优选实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是瘦素。在另一个优选的实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是PYY。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒的治疗性核酸编码分泌的治疗性蛋白。在优选实施方案中，所述分泌的治疗性蛋白能够通过调节的分泌从肠内分泌细胞分泌。在优选的实施方案中，所述分泌的治疗性蛋白能够从肠内分泌细胞被分泌响应优选是营养物的促分泌素。在特别优选的实施方案中，所述分泌的治疗性蛋白在应答葡萄糖时能够从肠内分泌细胞被分泌。在一个实施方案中，基于壳聚糖的纳米颗粒包含两种或更多不同的治疗性核酸。在一个实施方案中，所述纳米颗粒的表达调控区不包含CMV启动子。在一个实施方案中，所述纳米颗粒的表达调控区不包含病毒启动子。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒的表达调控区包含非组成性启动子。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒的表达调控区包含肠特异的调控序列。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒的表达调控区包含粘膜细胞特异的调控序列。在优选实施方案中，所述纳米颗粒的表达调控区包含肠内分泌细胞特异的调控序列。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒的表达调控区包含诱导型启动子。在一个实施方案中，所述启动子可通过小分子化合物调节。在另一实施方案中，所述启动子是营养物可调节的启动子。在一个实施方案中，所述营养物可调节的启动子由葡萄糖调节。在特别优选的实施方案中，所述营养物可调节的启动子是GIP启动子。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒的治疗性构建体还包含整合序列。在一个实施方案中，所述治疗性构建体包含单一的整合序列。在另一个实施方案中，所述治疗性构建体包含第一和第二整合序列，所述第一和第二整合序列侧邻着可操作连接到所述治疗性核酸的表达调控区(即，所述表达调控区与治疗性核酸在一起)。在优选实施方案中，所述整合序列是与选自水手(mariner)、睡美人(sleeping beauty)、FLP、Cre、Φ。31、R、λ 的整合元件以及来自诸如AAV、逆转录病毒和慢病毒的整合病毒的整合元件结合起作用的。在优选实施方案中，基于壳聚糖的纳米颗粒除了包括治疗性构建体之外，还包括非治疗性构建体，其中所述非治疗性构建体包含编码可操作连接到第二表达调控区的整合元件的核酸序列，所述第二表达调控区在肠粘膜前体细胞中是有功能的。该第二表达调控区和可操作连接到所述治疗性核酸的表达调控区可以相同或不同。所述编码的整合元件优选选自水手、睡美人、FLP、Cre、Φ031、R、λ、以及来自诸如AAV、逆转录病毒和慢病毒的整合病毒的整合元件。在一个实施方案中，所述纳米颗粒基本上由(i)多个具有3kD至250kD的平均分子量的壳聚糖聚合物，(ii)治疗性构建体以及(iii)非治疗性构建体组成，其中所述治疗性构建体包含可操作连接到在肠粘膜细胞有功能的表达调控区的治疗性核酸，其中所述治疗性核酸表达于肠粘膜细胞内时能够发挥治疗效应，其中所述非治疗性构建体包含编码可操作连接到第二表达调控区的整合元件的核酸序列，所述第二表达调控区在肠粘膜前体细胞是有功能的。在一个方面，所述发明提供能够体内转染肠粘膜前体细胞的基于壳聚糖的纳米颗粒，所述颗粒包括⑴多个壳聚糖聚合物和(ii)非治疗性构建体，其中所述非治疗性构建体包含编码可操作连接到在肠粘膜前体细胞内有功能的表达调控区的整合元件的核酸。所述被编码的整合元件优选选自水手、睡美人41^、0^、0031、1 、λ以及来自诸如AAV、逆转录病毒和慢病毒的整合病毒的整合元件。在一个实施方案中，所述纳米颗粒基本上由(i)多个壳聚糖聚合物和(ii)非治疗性构建体组成，其中所述非治疗性构建体包含编码可操作连接到表达调控区的整合元件的核酸，所述表达调控区在肠粘膜前体细胞内是有功能的。在一个方面，本发明提供用治疗性核酸体内转染肠粘膜细胞的方法，所述方法包括将体内肠粘膜与本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒接触。在优选的实施方案中，所述方法包括接触所述小肠的粘膜。在优选的实施方案中， 所述方法包括将十二指肠、空肠或回肠的粘膜与本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒接触。在优选的实施方案中，所述方法包括将所述胃的粘膜与本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒接触。在优选的实施方案中，所述方法包括将所述结肠的粘膜与本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒接触。在优选的实施方案中，所述基于壳聚糖的纳米颗粒转染所述肠粘膜的肠粘膜前体细胞。在优选的实施方案中，所述肠粘膜前体细胞是肠内分泌细胞前体细胞。在优选的实施方案中，所述肠内分泌细胞前体细胞产生选自K细胞、L-细胞、S-细胞、G-细胞、D-细胞、 I-细胞、Mo-细胞和Gr-细胞的肠内泌细胞。在特别优选的实施方案中，所述肠内分泌细胞前体细胞产生K细胞。在优选的实施方案中，所述肠粘膜前体细胞是所述小肠的粘膜细胞。在优选的实施方案中，所述肠粘膜前体细胞是所述十二指肠、空肠或回肠的粘膜细胞。在优选的实施方案中，所述肠粘膜前体细胞是所述胃的粘膜细胞。在优选的实施方案中，所述肠粘膜前体细胞是所述结肠的粘膜细胞。在优选的实施方案中，所述肠粘膜前体细胞产生表达治疗性核酸的粘膜细胞。在一个实施方案中，所述治疗性核酸编码治疗性RNA。在优选的实施方案中，所述治疗性核酸编码治疗性蛋白。在优选的实施方案中，所述治疗性蛋白是分泌的治疗性蛋白。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒的治疗性核酸编码治疗性蛋白，所述蛋白选自激素、酶、细胞因子、趋化因子、抗体、促有丝分裂因子、生长因子、分化因子、影响血管发生的因子、影响血凝块形成的因子、影响血糖水平的因子、影响葡萄糖代谢的因子、影响脂质代谢的因子、影响血胆固醇水平的因子、影响血LDL或HDL水平的因子、影响细胞凋亡的因子、影响食物摄取的因子、影响能量消耗的因子、影响食欲的因子、影响营养吸收的因子、 影响炎症的因子以及影响骨形成的因子。特别优选编码胰岛素、瘦素、胰高血糖素拮抗剂、 GLP-U GLP-2、葛瑞林、胆囊收缩素、生长激素、凝血因子、PYY、红细胞生成素、炎症抑制因子、11^10、11^-17拮抗剂3顺(1拮抗剂、生长激素释放激素或甲状旁腺激素的治疗性核酸。 在一个优选实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是胰岛素。在另一个优选实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是胰岛素类似物。在另一个优选实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是瘦素。在另一个优选的实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是PYY。在优选的实施方案中，所述治疗性蛋白在肠粘膜细胞内产生并且进入系统循环以致所述治疗蛋白的系统水平增加。在优选的实施方案中，所述治疗性蛋白通过调节的分泌被释放入系统循环。
在优选的实施方案中，所述治疗性蛋白的系统水平的增加长于约4天，更优选长于约5天，更优选长于约6天，更优选长于约7天，更优选长于约10天，更优选长于约2周， 更优选长于约3周，更优选长于约4周，更优选长于约6周，更优选长于约8周，更优选长于约10周，且最优选长于约12周。在一个实施方案中，所述治疗性蛋白的系统水平的增加是静态的。在优选的实施方案中，所述治疗性蛋白的系统水平的增加是动态的。在一个实施方案中，所述方法包括将所述体内肠粘膜与第一基于壳聚糖的纳米颗粒和第二基于壳聚糖的纳米颗粒接触。所述第一基于壳聚糖纳米颗粒能够在体内转染肠粘膜前体细胞并且包含(i)多个壳聚糖聚合物和(ii)治疗性构建体，其中所述治疗性构建体包含治疗性核酸和整合序列，所述治疗性核酸可操作连接到在肠粘膜细胞内有功能的表达调控区。所述第二基于壳聚糖纳米颗粒能够在体内转染肠粘膜前体细胞并且包含(i)多个壳聚糖聚合物和(ii)非治疗性构建体，其中所述非治疗性构建体包含编码可操作连接到其在肠粘膜前体细胞内有功能的表达调控区的整合元件的核酸。不受理论的限制，可以用所述第一和第二纳米颗粒转染在肠粘膜内的肠粘膜前体细胞。所述第二纳米颗粒的核酸被表达在肠粘膜前体细胞内以产生整合元件，由此所述整合元件将可操作连接到由所述第一纳米颗粒提供的表达调控区的治疗性核酸整合入所述肠粘膜前体细胞的基因组。在另一实施方案中，所述方法包括将体内肠粘膜与基于壳聚糖的纳米颗粒接触， 所述纳米颗粒包含(i)多个壳聚糖聚合物、(ii)治疗性构建体以及(iii)非治疗性构建体，其中所述治疗性构建体包含可操作连接到在肠粘膜细胞有功能的表达调控区的治疗性核酸和整合序列，其中所述非治疗性构建体包含编码可操作连接到在肠粘膜前体细胞有功能的表达调控区的整合元件的核酸序列。不受理论的限制，可以使用所述纳米颗粒转染肠粘膜内的肠粘膜前体细胞。所述编码整合元件的核酸被表达在肠粘膜前体细胞内以产生整合元件，由此所述整合元件将可操作连接到表达调控区的所述治疗性核酸整合入所述肠粘膜前体细胞的基因组。应了解取决于预期使用的特定整合元件，用于促进整合的治疗性和非治疗性构建体的最优比可以变化。在没有不适当的实验情况下，治疗性与非治疗性构建体的最优比由本领域的技术人员做出决定。在一个方面，本发明提供实现治疗性核酸在哺乳动物肠粘膜细胞内长期表达的方法。所述方法包括将哺乳动物的所述肠粘膜与本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒接触，其中所述纳米颗粒包括治疗性核酸，且其中所述治疗性核酸被表达在所述哺乳动物的肠粘膜细胞中。在一个实施方案中，所述方法包括本发明的纳米颗粒的所述用途，所述纳米颗粒包括治疗性构建体和非治疗性构建体。在一个实施方案中，所述方法包括本发明的两个纳米颗粒的用途，第一纳米颗粒包含治疗性构建体，且第二纳米颗粒包含非治疗性构建体。在一个方面，本发明提供增加哺乳动物内分泌的治疗性蛋白的系统水平的方法。 所述方法包括将哺乳动物的肠粘膜与本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒接触，其中所述纳米颗粒包括编码分泌的治疗性蛋白的治疗性核酸，其中所述分泌的治疗性蛋白在所述肠粘膜的粘膜细胞内产生，且其中所述在肠粘膜内产生的分泌的治疗性蛋白进入系统循环以致所述分泌的治疗性蛋白的所述系统水平是增加的。在一个实施方案中，所述方法包括本发明的纳米颗粒的用途，所述纳米颗粒包括治疗性构建体和非治疗性构建体。在一个实施方案中，所述方法包括本发明的两个纳米颗粒的用途，第一纳米颗粒包含治疗性构建体，且第二纳米颗粒包含非治疗性构建体。在一个方面，本发明提供治疗患有可由增加治疗性蛋白的所述系统水平治疗的疾病或状况的患者的方法。所述方法包括将患者的肠粘膜与本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒接触，其中所述纳米颗粒包括编码分泌的治疗性蛋白的治疗性核酸，其中所述分泌的治疗性蛋白在所述患者的所述肠粘膜的粘膜细胞内产生，且其中产生在所述粘膜细胞内的分泌的治疗性蛋白进入系统循环以致所述分泌的治疗性蛋白的系统水平增加到治疗有效水平。在优选的实施方案中，所述疾病是代谢性疾病。在优选的实施方案中，所述疾病是糖尿病。在另一个优选的实施方案中，所述状况是病态肥胖。在另一个优选的实施方案中，所述状况是生长缺陷。在优选的实施方案中，经口给予所述基于壳聚糖的纳米颗粒。在优选的实施方案中，通过内窥镜给予所述基于壳聚糖的纳米颗粒。在优选的实施方案中，通过直肠给予所述基于壳聚糖的纳米颗粒。在优选的实施方案中，所述粘膜细胞是肠内分泌细胞。在优选的实施方案中，所述肠内分泌细胞选自K-细胞、L-细胞、S-细胞、G-细胞、D-细胞、I-细胞、Mo-细胞和Gr-细胞。在特别优选的实施方案中，所述肠内分泌细胞是K细胞。在优选的实施方案中，所述粘膜细胞是所述小肠的粘膜细胞。在优选的实施方案中，所述粘膜细胞是十二指肠、空肠或回肠的粘膜细胞。在优选的实施方案中，所述粘膜细胞是胃的粘膜细胞。在优选的实施方案中，所述粘膜细胞是结肠的粘膜细胞。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒的治疗性核酸编码治疗性蛋白，所述蛋白选自激素、酶、细胞因子、趋化因子、抗体、促有丝分裂因子、生长因子、分化因子、影响血管发生的因子、影响血凝块形成的因子、影响血糖水平的因子、影响葡萄糖代谢的因子、影响脂质代谢的因子、影响血胆固醇水平的因子、影响血LDL或HDL水平的因子、影响细胞凋亡的因子、影响食物摄取的因子、影响能量消耗的因子、影响食欲的因子、影响营养吸收的因子、 影响炎症的因子以及影响骨形成的因子。特别优选编码胰岛素、瘦素、胰高血糖素拮抗剂、 GLP-U GLP-2、葛瑞林、胆囊收缩素、生长激素、凝血因子、PYY、红细胞生成素、炎症抑制因子、11^10、11^-17拮抗剂3顺(1拮抗剂、生长激素释放激素或甲状旁腺激素的治疗性核酸。 在优选实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是胰岛素。在另一个优选实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是胰岛素类似物。在另一个优选实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是瘦素。 在另一个优选的实施方案中，所述编码的治疗性蛋白是PYY。在优选的实施方案中，所述分泌的治疗性蛋白通过调节的分泌被从肠内分泌细胞释放。在优选的实施方案中，所述分泌的治疗性蛋白的所述系统水平的增加长于约4 天，更优选长于约5天，更优选长于约6天，更优选长于约7天，更优选长于约10天，更优选
14长于约2周，更优选长于约3周，更优选长于约4周，更优选长于约6周，更优选长于约8周， 更优选长于约10周，且最优选长于约12周。在一个实施方案中，所述方法包括本发明的纳米颗粒的用途，所述纳米颗粒包括治疗性构建体和非治疗性构建体。在一个实施方案中，所述方法包括本发明的两个纳米颗粒的用途，第一纳米颗粒包含治疗性构建体且第二纳米颗粒包含非治疗性构建体。在一个方面，本发明提供包括本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒的药物组合物。在一个实施方案中，本发明提供能够增加所述治疗性蛋白的系统水平的药物组合物。这种药物组合物包含本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含编码分泌的治疗性蛋白的治疗性核酸。在一个实施方案中，所述药物组合物包括本发明的两种或多种不同的治疗性核酸。在一个实施方案中，所述药物组合物包括本发明的第一基于壳聚糖的纳米颗粒， 以及本发明的第二基于壳聚糖的纳米颗粒，其中所述第一和第二纳米颗粒包含不同的治疗性核酸。在一个实施方案中，所述药物组合物包含本发明的治疗性构建体和非治疗性构建体。在一个实施方案中，所述药物组合物包括本发明的第一基于壳聚糖的纳米颗粒和本发明的第二基于壳聚糖的纳米颗粒，其中所述第一纳米颗粒包含治疗性构建体，以及第二纳米颗粒包含非治疗性构建体。在优选的实施方案中，所述药物组合物能够增加所述治疗性蛋白的系统水平长于约4天，更优选长于约5天，更优选长于约6天，更优选长于约7天，更优选长于约10天，更优选长于约2周，更优选长于约3周，更优选长于约4周，更优选长于约6周，更优选长于约 8周，更优选长于约10周，且最优选长于约12周。在优选的实施方案中，可以通过口部给予所述药物组合物。在优选的实施方案中，可以通过内窥镜给予所述药物组合物。在优选的实施方案中，可以通过直肠给予所述药物组合物。在一个方面，本发明提供修饰的肠粘膜细胞，所述修饰的肠粘膜细胞通过根据本文公开的方法将体内的肠粘膜与基于壳聚糖的纳米颗粒接触而产生。在一个方面，本发明提供产生本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒的方法。在一个实施方案中，提供了产生能够引起治疗性核酸在肠粘膜细胞内长期表达的纳米颗粒的方法。 所述方法包括纳米颗粒制备混合物的形成。在优选的实施方案中，使用了具有从约3kDa至约250kDa的平均分子量的壳聚糖聚合物。在另一个优选的实施方案中，使用了具有从约3kDa至约210kDa的平均分子量的壳聚糖聚合物。在另一个优选的实施方案中，使用了具有从约IOkDa至约250kDa的平均分子量的
壳聚糖聚合物。在另一个优选的实施方案中，使用了具有从约IOkDa至约210kDa的平均分子量的壳聚糖聚合物。在另一个优选的实施方案中，使用了具有从约3kDa至约50kDa的平均分子量的壳聚糖聚合物。在另一个优选的实施方案中，使用了具有从约3kDa至约6kDa的平均分子量的壳聚糖聚合物。在另一个优选的实施方案中，使用了具有从约200kDa至约210kDa的平均分子量的壳聚糖聚合物。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约1:1至约100:1的胺磷酸盐(N:P)比。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约1:1至约6:1的 N:P 比。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约1:1至约4:1的 N:P 比。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有约3:1的N:P比。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约10:1至约90:1 的N:P比。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约10:1至约50:1 的N:P比。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约10:1至约40:1 的N:P比。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约10:1至约30:1 的N:P比。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约60:1至约100:1 的N:P比。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约70:1至约100:1 的N:P比。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有约20 1的N:P比。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有约60:1的N:P比。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约1:1至约50:1的壳聚糖与核酸的重量比。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约1:1至约5:1的壳聚糖与核酸的重量比。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约1:1至约3:1的壳聚糖与核酸的重量比。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有约2:1的壳聚糖与核酸的重量比。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约5:1至约45:1的壳聚糖与核酸的重量比。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约5:1至约25:1的
16壳聚糖与核酸的重量比。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约5:1至约20:1的
壳聚糖与核酸的重量比。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约5:1至约15:1的壳聚糖与核酸的重量比。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约30:1至约50:1 的壳聚糖与核酸的重量比。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有从约35:1至约50:1 的壳聚糖与核酸的重量比。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有约10:1的壳聚糖与核酸的重量比。在另一个优选的实施方案中，所述纳米颗粒制备混合物具有约30:1的壳聚糖与核酸的重量比。在一个方面，本发明提供通过本文公开的纳米颗粒制备方法生产的基于壳聚糖的纳米颗粒。在一个方面，本发明提供制备用于治疗可由增加分泌的治疗蛋白的系统水平治疗的疾病或状况的药剂的方法。所述方法包括生产本文公开的基于壳聚糖的纳米颗粒的方法。附图简要说明

图1显示了用包括所标明的多种分子量的壳聚糖聚合物的基于壳聚糖的纳米颗粒体外转染细胞的结果。图2显示用包括所标明的多种分子量的壳聚糖聚合物的基于壳聚糖的纳米颗粒体内转染鼠十二指肠的肠粘膜细胞的结果。图3显示用包括所标明的多种分子量的壳聚糖聚合物的基于壳聚糖的纳米颗粒且以多种Ν:Ρ比在体内转染鼠十二指肠的肠粘膜细胞的结果。图4显示用N:P比为2. 85:1的RC05基于壳聚糖的纳米颗粒在体内转染鼠十二指肠的肠粘膜细胞与用FIV和AAV颗粒转导相比的结果。图5显示用Ν:Ρ比为60:1的Pl基于壳聚糖的纳米颗粒在体内转染(单次给予) 鼠十二指肠的肠粘膜细胞的结果，其中所述纳米颗粒包括EFl α -SEAP的构建体。显示了不同时间点时血中SEAP蛋白的水平。图6显示用Ν:Ρ比为60:1的Pl基于壳聚糖的纳米颗粒在体内转染(单次给予)鼠十二指肠的肠粘膜细胞的结果，其中所述纳米颗粒包含(i)CMV-IacZ整合构建体 (P匪2611-β -gal)，以及(ii)CMV-Mariner 表达构建体(pCMV_C9. gck)。显示了转染后 14 天的基因拷贝数。图7A显示使用的带有水手转座酶的CMV-IacZ整合构建体( 匪沈11_ β -gal)的示意图。图7B显示水手表达构建体(pCMV-C9. gck)的示意图。图8显示在递送后2天壳聚糖介导的基因转移到小鼠十二指肠粘膜细胞的结果， 以及使用OC31时在递送后14天的持续性结果。图9显示单次给予携带GIP-hlNS基因的χΦ-GEMS 以实现人胰岛素在小鼠的长期系统的产生的结果。图10显示用携带GIP-胰岛素基因的基于壳聚糖的纳米颗粒处理的小鼠的葡萄糖和进餐应激结果。图11显示矩阵研究的结果，所述矩阵研究分析用携带GIP-hlNS基因的不同的基于壳聚糖的纳米颗粒处理的小鼠中人C-肽随着时间的产生。图12显示用携带GIP-hlNS基因的基于壳聚糖的纳米颗粒处理的猪十二指肠在递送后7天人胰岛素mRNA测量的结果。图13显示矩阵研究的结果，所述矩阵研究分析用携带GIP-hlNS基因的不同的基于壳聚糖的纳米颗粒处理的猪中人胰岛素的产生。图14显示通过经口递送壳聚糖包裹的DNA多聚物转化胃粘膜细胞。在口服载体后 2天，小鼠胃粘膜的胰岛素和SEAP基因表达的水平。NTC =非处理对照，T =处理的动物。详细说明肠粘膜细胞如本文所使用的“肠粘膜细胞”指所述肠粘膜的细胞。内分泌细胞、非内分泌细胞以及其前体都包括在肠粘膜细胞之中。肠粘膜前体细胞包括干细胞。肠粘膜前体细胞是所述肠粘膜的分化细胞类型的直接或间接的前体。肠粘膜前体细胞包括未分化的肠粘膜细胞。肠粘膜前体细胞产生所述肠粘膜的主要细胞类型，包括内分泌细胞和非内分泌细胞。肠内分泌细胞前体细胞是例如K细胞的肠内分泌细胞的肠粘膜细胞的前体。肠粘膜细胞的特定实例包括诸如K细胞、L-细胞、S-细胞、G-细胞、D-细胞、I-细胞、Mo-细胞、Gr-细胞的内分泌细胞和诸如吸收性肠细胞的非内分泌细胞。内分泌细胞的一般特征是它们分泌合成蛋白进入血液响应信号或刺激物(“促分泌素”)的能力。一般认为非内分泌细胞不会分泌合成蛋白进入血液响应信号或刺激物。用于本发明的特别优选的肠内分泌细胞是K细胞(Sandstrom 0.，El-Salhy M.， Mech. Ageing Dev. 108:39(1999))。几种类型的肠内分泌细胞以及通常由此产生的蛋白的部分目录显示于表1中。表1
细胞类型肽G-细胞胃泌素D-细胞生长抑制素K-细胞葡萄糖依赖性促胰岛素多肽L-细胞GLP-IGLP-2I-细胞胆囊收缩素Mo-细胞促胃动素Gr-细胞葛瑞林基于壳聚糖的纳米颗粒所用“基于壳聚糖的纳米颗粒”或“DNA/壳聚糖颗粒”是指包括多个壳聚糖聚合物和DNA分子的复合物。“多聚物(Polyplex) ”与本文的“基于壳聚糖的纳米颗粒”可交换使用。所述基于壳聚糖的纳米颗粒的壳聚糖聚合物优选具有小于约250kDa的平均分子量。 在所述基于壳聚糖的纳米颗粒中的DNA分子被递送到体内细胞。基于壳聚糖的纳米颗粒在本文中经常被称为纳米颗粒。
如本文中所使用的，壳聚糖聚合物的平均重量指重量平均分子量。在一个实施方案中，壳聚糖通过 Richardson et al. , Int. J. Pharmaceutics, 178:231-243,1999 的方法获得。在一个实施方案中，如下生产高分子量的基于壳聚糖的纳米颗粒。将分别准备的质粒DNA和壳聚糖溶液调整到等于所需终浓度的两倍的浓度。DNA在水中或50mM的硫酸钠溶液中被稀释。所需分子量的壳聚糖聚合物制剂被溶于PH为5. 5的5mM的醋酸钠中，所述壳聚糖聚合物制剂包括优选具有小于250kDa的平均分子量的壳聚糖聚合物。两种溶液在被组合以形成基于壳聚糖的纳米颗粒制剂混合物之前在55°C孵育5分钟。等体积的所述两种溶液被混合且被迅速涡旋30秒以形成DNA/壳聚糖颗粒。该制剂在使用之前可以在多种缓冲液中被进一步稀释。本发明的所述纳米颗粒的生产不需要冻干且在乙酰化反应中不需要使用冻干的产物。在优选实施方案中，如下生产基于壳聚糖的纳米颗粒，特别是低分子量的基于壳聚糖的纳米颗粒。将壳聚糖粉末加入到0. 5%的醋酸水溶液中直至所述壳聚糖工作液的PH 达到4. 8。然后将所述工作液通过膜过滤器(AcrodiscO. 2μπι孔径，Pall Life Sciences) 过滤。质粒A和质粒B的储存DNA溶液(溶于IxTE)以质粒A对质粒B的5 1比混合，在水中稀释，然后通过膜过滤器(AcrodiscO. 2μπι孔径，Pall LifeSciences)过滤以产生所述DNA工作液。进一步的细节参见实验部分。所述基于壳聚糖的纳米颗粒的壳聚糖聚合物优选具有小于约250kDa的平均分子量，更优选小于230kDa，更优选小于220kDa。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒的所述多个壳聚糖聚合物具有从约3kDa至约250kDa的平均分子量。在本发明的优选纳米颗粒中， 壳聚糖聚合物平均分子量的其他范围包括3至6kDa、3至10kDa、3至50kDa、3至210kDa、10 至 210kDa、10 至 250kDa 和 210 至 250kDa。所述基于壳聚糖纳米颗粒制剂混合物中优选的DNA浓度是在约1 μ g/ml至约 1. 5mg/ml的范围，更优选约10 μ g/ml至约lmg/ml，更优选约25 μ g/ml至约lmg/ml，更优选约 50 μ g/ml 至约 lmg/ml，更优选约 100 μ g/ml 至约 lmg/ml。所述基于壳聚糖的纳米颗粒制剂混合物中优选的壳聚糖浓度是在0.001%至 1.0%的重量比的范围内。在优选的实施方案中，所述基于壳聚糖的纳米颗粒具有从约1:1至约100:1的胺 磷酸盐(N:P)比。本发明的优选基于壳聚糖的纳米颗粒的其他N:P比范围包括约1:1至约 6:1，约1:1至约4:1，约10:1至约90:1，约10:1至约50:1，约10:1至约40:1，约10:1至约30:1，约60:1至约100:1，以及约70:1至约100:1。通过改变所述壳聚糖乙酰化的程度可以改变壳聚糖的胺含量。用于本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒的所述壳聚糖聚合物优选具有70 %至100 %，更优选80 %至100 %，更优选90%至100%的脱乙酰化。在优选的实施方案中，所述基于壳聚糖的纳米颗粒具有从约1:1至约50:1的壳聚糖与核酸的重量比。优选的基于壳聚糖的纳米颗粒的其他壳聚糖与核酸的重量比范围包括约1:1至约5:1，约1:1至约3:1，约5:1至约45:1，约5:1至约25:1，约5:1至约20:1，约 5:1至约15:1，约30:1至约50:1，以及约35:1至约50:1。
19
在优选的实施方案中，所述组合物包含在PH为5时具有+5mV至+50mV的平均ζ 电位的纳米颗粒。在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含在PH为5时具有+30mV至+50mV的平均ζ电位的纳米颗粒。在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含在PH为5时具有+30mV至+40mV的平均ζ电位的纳米颗粒。在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含在PH为5时具有+32mV至+40mV的平均ζ电位的纳米颗粒。在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含在PH为5时具有+5mV至+25mV的平均ζ电位的纳米颗粒。在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含在PH为5时具有+5mV至+SmV的平均ζ电位的纳米颗粒。在优选的实施方案中，所述组合物包含具有小于225nm的平均直径的纳米颗粒。在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含具有SOnm至225nm的平均直径的纳米颗粒。在另一个优选的实施方案中，所述组合物包含具有SOnm至175nm的平均直径的纳米颗粒。在优选的实施方案中，所述组合物具有约1 μ g/ml至约1. 5mg/ml，更优选约1 μ g/ ml至约lmg/ml，更优选约10 μ g/ml至约lmg/ml，更优选约50 μ g/ml至约lmg/ml，更优选约 100 μ g/ml至约lmg/ml，更优选约150 μ g/ml至约lmg/ml，更优选约200 μ g/ml至约lmg/ ml的DNA浓度。在优选的实施方案中，所述组合物具有低于6. 5，更优选低于6. 0，且最优选约4. 5 至约5. 5的PH0在优选的实施方案中，所述纳米颗粒的壳聚糖聚合物具有大于约70%，更优选大于约75 %，更优选大于约80 %，更优选大于约85 %，更优选大于约90 %，更优选大于约 95%，且最优选至少98%的脱乙酰化度。在优选的实施方案中，所述组合物包含低分子量的壳聚糖纳米颗粒，其中所述低分子量纳米颗粒的多个壳聚糖聚合物具有3kDa至25kDa的平均分子量。在优选的实施方案中，低分子量纳米颗粒具有10 1至90 1的N:P比。在优选的实施方案中，低分子量的壳聚糖纳米颗粒在PH为5时，具有+30mV至+50mV，更优选+30mV至+40mV的平均ζ电位。 在优选的实施方案中，低分子量的壳聚糖纳米颗粒具有小于175nm的平均直径。在另一个优选实施方案中，所述组合物包括高分子量的壳聚糖纳米颗粒，其中所述高分子量的纳米颗粒的多个壳聚糖聚合物具有25kDa至250kDa的平均分子量。在优选的实施方案中，高分子量壳聚糖纳米颗粒具有2 1至40 1的N:P比。在优选的实施方案中， 高分子量壳聚糖纳米颗粒在PH为5时，具有5mV至25mV的平均ζ电位。在优选的实施方案中，高分子量的壳聚糖纳米颗粒具有小于225nm的平均直径。在优选的实施方案中，高分子量壳聚糖纳米颗粒具有1:1至30:1的壳聚糖与核酸的重量比。在特别优选的实施方案中，所述纳米颗粒的多个壳聚糖聚合物具有约3. 9kDa的平均分子量以及约98%的脱乙酰化度。在优选的实施方案中，所述组合物包括具有小于175nm的平均直径的纳米颗粒。在优选的实施方案中，所述组合物具有约25 μ g/ml至约 100 μ g/ml的DNA浓度。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒具有约40:1至约80:1的N:P 比，最优选约60:1的N:P比。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒具有20:1至40:1的壳聚糖与核酸的重量比，最优选30:1的重量比。在另一优选的实施方案中，所述纳米颗粒的多个壳聚糖聚合物具有约3. 9kDa的平均分子量以及约98%的脱乙酰化度。在优选的实施方案中，所述组合物包括具有小于 175nm的平均直径的纳米颗粒。在优选的实施方案中，所述组合物具有约200 μ g/ml至约 lmg/ml的DNA浓度。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒具有约10:1至约30:1的N:P比， 最优选约20:1的N:P比。在优选的实施方案中，所述纳米颗粒具有5:1至15:1的壳聚糖与核酸的重量比，最优选10:1的重量比。可以被使用或添加以改变转染效率的操作或特征包括溶酶体溶解 (lysosomolytic)试剂在纳米颗粒中的共络合，尽管溶酶体溶解剂不是必需的。包括附加的共络合的治疗剂的组合纳米颗粒是被包括的。这些附加试剂和溶酶体溶解剂可以在络合形成过程中被共络合。另外，所述纳米颗粒的稳定性可以通过交联改变。另外，配体或靶部分可以偶联到或以别的方式连接到纳米颗粒以增强特异性或例如通过受体介导的内吞作用的摄取。在许多优选的实施方案中，本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒能够产生治疗性核酸在肠粘膜细胞内的长期表达。分化的肠粘膜细胞通常是短寿命的。正如本文所使用的，粘膜细胞内的长期表达指一个或多个粘膜细胞内的表达，而且粘膜内的表达优选多于约4天。 不受理论的限制，在本发明中粘膜细胞转染的优选位置的小肠的环境中，本发明的纳米颗粒可以进入所述肠粘膜的隐窝并转染肠粘膜前体细胞。相对于终末分化和短寿命的粘膜细胞的转染，这提供了治疗性核酸的长期表达。另外，在治疗性构建体包含整合序列的实施方案中，所述纳米颗粒提供了所述治疗性核酸进入前体细胞(包括干细胞)的基因组的基因整合，且在优选的实施方案中，提供了治疗性核酸在起源于所述前体细胞的一系列分化的粘膜细胞内的长期表达。因此，如本文使用的，粘膜细胞内的长期表达并不一定指在相同细胞内的持续表达。在一些实施方案中，治疗性构建体的所述表达调控区具有组成性活性，提供治疗性核酸的所述静态表达。在许多优选的实施方案中，治疗性构建体的所述表达调控区不具有组成性活性。这提供了治疗性核酸的动态表达。所用“动态”表达是指随着时间变化的表达。这种随时间的表达可以包括无表达期或检测不到的表达期，在所述无表达或检测不到的表达期间，治疗性核酸存在于粘膜细胞，但没有表达或没有在可检测的水平表达。动态表达可以包括几种这样的由可检测表达期分开的低或无表达期。在许多优选的实施方案中，所述治疗性核酸被可操作连接到可调节的启动子。这提供了所述治疗性核酸的可调节表达。引起治疗性核酸长期表达的能力是许多优选的本发明的基于壳聚糖的纳米颗粒的鉴别特征。所述产生长期表达的能力指优选的纳米颗粒在单次给予后引起长期表达的能力，尽管本文的一些方法包括基于壳聚糖的纳米颗粒的重复给予。特别地，在纳米颗粒能够引起治疗性核酸的长期表达的实施方案中，这种治疗性核酸的长期表达可以是动态的，具有低表达或检测不到的表达期。表达调控区表达调控区包括影响可操作连接的治疗性核酸的表达的诸如启动子和增强子的调节多核苷酸(本文中有时被称为元件)。优选的表达调控区是在肠组织或特定的肠组织细胞类型中选择性活化的那些。在许多优选的实施方案中，治疗性构建体的表达调控区包括肠特异性启动子。肠特异性启动子在肠粘膜细胞及潜在的其他肠细胞内显示活性。在优选的实施方案中，肠特异性启动子在广泛多样的其他组织中并不显示基本活性。在广泛多样的细胞类型中显示活性的诸如CMV启动子的病毒启动子不是肠特异性启动子。肠特异性启动子可以显示组成性或非组成性活性。特别优选的是可调节的肠特异性启动子。例如，胰高血糖素原基因的启动子包括肠特异的元件且可以用于本 M 明(Lee, Y. C, et al. J Biol.Chem.267:10705 (1992) ；Gajic andDrucker, Endocrinol. 1321055(1993)。在许多优选的实施方案中，治疗性构建体的表达调控区包括肠粘膜细胞特异的启动子。肠粘膜细胞特异性启动子在肠粘膜细胞内显示活性。在优选的实施方案中，肠粘膜细胞特异性启动子在其他肠细胞或广泛多样的其他组织中不显示基本活性。在许多优选的实施方案中，治疗性构建体的表达调控区包含肠内分泌细胞特异的启动子。特别优选的是可调节的内分泌细胞特异的启动子。所述GIP启动子是可调节的肠内分泌细胞启动子的具体实例(参见U. S. S. N. 09/804, 409，其整体以引用的方式被清楚地并入本文)。所述GIP启动子是葡萄糖可调节的，并且能赋予可操作连接的治疗性核酸以葡萄糖可调节的内分泌细胞特异的表达。可以被用于本发明的肠特异性启动子的其他实例列于表2中。这些启动子的许多也是可调节的。该列表仅是示例性的，并不意图详尽用于本发明的所有可能的肠特异性启动子。表2用于将蛋白的表达靶向肠内分泌细胞的示例性启动子和增强子
权利要求
1.包含基于壳聚糖的纳米微粒的组合物，所述基于壳聚糖的纳米颗粒包含(i)具有 3kDa至250kDa的平均分子量的多个壳聚糖聚合物和(ii)治疗性构建体，其中所述治疗性构建体包含可操作连接到在肠粘膜细胞内有功能的表达调控区的治疗性核酸，其中所述治疗性核酸表达于所述肠粘膜细胞时能够发挥治疗作用，以及其中所述基于壳聚糖的纳米微粒能够引起所述治疗性核酸在肠粘膜长于4天的表达。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述基于壳聚糖的纳米颗粒能够引起所述治疗性核酸在肠粘膜长于14天的表达。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述基于壳聚糖的纳米颗粒能够引起所述治疗性核酸在肠粘膜长于60天的表达。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述基于壳聚糖的纳米颗粒能够引起所述治疗性核酸的表达产物的系统水平的增加。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述基于壳聚糖的纳米颗粒是低分子量壳聚糖纳米颗粒，其中所述多个壳聚糖聚合物具有小于25kDa的平均分子量。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述基于壳聚糖的纳米颗粒具有10:1至90:1的 N:P 比。
7.如权利要求5所述的组合物，其中所述基于壳聚糖的纳米颗粒具有小于225nm的直径。
8.如权利要求1所述的组合物，其中所述基于壳聚糖的纳米颗粒是高分子量壳聚糖纳米颗粒，其中所述多个壳聚糖聚合物具有大于25kDa的平均分子量。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述基于壳聚糖的纳米颗粒具有2:1至40:1的 N:P 比。
10.如权利要求8所述的组合物，其中所述基于壳聚糖的纳米颗粒具有小于225nm的直径。
11.如权利要求1所述的组合物，其中所述治疗性核酸编码治疗性蛋白。
12.如权利要求1所述的组合物，其中所述表达调控区包含肠特异的调控序列。
13.如权利要求1所述的组合物，其中所述治疗性构建体还包含整合序列。
14.如权利要求13所述的组合物，还包含非治疗性构建体，其中所述非治疗性构建体包含编码整合元件的核酸序列，所述整合元件可操作连接到在肠粘膜前体细胞内有功能的第二表达调控区，并且其中所述第二表达调控区和所述可操作连接到所述治疗性核酸的表达调控区可以相同或不同。
15.包含基于壳聚糖的纳米颗粒的组合物，所述基于壳聚糖的纳米颗粒包含(i)多个壳聚糖聚合物和(ii)非治疗性构建体，其中所述非治疗性构建体包含编码可操作连接到表达调控区的整合元件的核酸，所述表达调控区在肠粘膜前体细胞内有功能。
16.在肠粘膜细胞表达治疗性核酸的方法，所述方法包括将肠粘膜与权利要求1所述的组合物接触，由此将所述治疗性核酸表达于所述肠粘膜的肠粘膜细胞。
17.如权利要求16所述的方法，还包括将所述肠粘膜与权利要求15所述的组合物接触。
18.在肠粘膜细胞表达治疗性核酸的方法，包括将肠粘膜与权利要求14所述的组合物接触，由此将所述治疗性核酸表达于所述肠粘膜的肠粘膜细胞。
19.引起治疗性核酸的表达产物的系统水平增加的方法，包括将肠粘膜与权利要求4 所述的组合物接触，由此将所述治疗性核酸表达于所述肠粘膜的肠粘膜细胞。
全文摘要
本发明提供能保护核酸并将所述核酸递送入肠粘膜细胞的基于壳聚糖的纳米颗粒。提供用于在肠粘膜细胞表达治疗性核酸的组合物和方法。也提供用于从肠粘膜的细胞系统地递送治疗性蛋白的组合物和方法。
文档编号A61K47/36GK102164618SQ200780010950
公开日2011年8月24日 申请日期2007年3月30日 优先权日2006年3月30日
发明者安东尼·T·钟, 艾瑞克·粟 申请人:恩根尼公司