专利名称：利用聚乙二醇的磁共振造影剂及磁共振成像方法
技术领域：
本发明涉及利用聚乙二醇的磁共振造影剂，更详细而言，涉及用于
以60秒以下(优选1秒以下、更优选250毫秒以下、特别优选100毫 秒以下)的重复时间(repetition time)施加激发脉冲而连续获得》兹共振 信号的磁共振造影剂。本发明还涉及使用所述磁共振造影剂的磁共振信 号的获得方法及磁共振成像方法。
背景技术：
最近，作为利用造影剂的图像诊断，正在实际应用使用正电子或 放射线标记造影剂的成像技术(PET、 SPECT等)或利用磁共振现象 的MRI(磁共振成像magnetic resonance imaging )。利用PET或SPECT 成像技术不是不能得到病变部位的定量信息，但另一方面，由于存在 放射能的半衰期问题，所以具有不能稳定地保存造影剂的缺点。另夕卜， 放射性化合物存在给人体带来不良影响的危险，这一点对受试者来说 也是不理想的。而MRI由于测定稳定的同位素核，所以对人体而言 是安全的成像技术，具有能消除由放射性同位素不稳定性引发的上述 缺点的优点。因为这个原因人们认为MRI成像技术的利用将在今后 逐步扩大。
现有的MRI中通常使用1H作为磁共振的对象核，作为其造影剂， 已知有作为钆(Gd)配位化合物的Gd造影剂、利用氧化铁微粒的超 顺磁性氧化铁胶体制剂(SPIO)等。上述造影剂的原理如下在受试 者体内通过缩短周围存在的水分子的1H的弛豫时间(relaxation time),间接地使其存在可视化。但是，利用1H作为磁共振的对象 核的MRI中，由于用IH得到的磁共振信号和造影剂浓度的线性不完 全，所以存在难以获得能在分子成像等中进行定量分析的图像的缺
4点。另外，为了将质子以外的核种类中与质子大致相同灵敏度的19F
核应用到利用MRI的分子成像中，进行了研究，但由于含氟原子的 化合物的合成困难等，未能达到实用化。进而，每次使用利用氧化铁 或钆的造影剂、或利用氟等原子的造影剂时，都不得不考虑一定程度 的毒性。
另一方面，使含有13C的分子存在于受试体内，通过测定13C 磁共振信号，也能进行MRI成像，由此可知能够使用含有13C的分 子作为MRI用造影剂。该13C磁共振信号，与1H的情形相比，由于 在受试体内的背景值低，所以认为对于获得用于定量评价的图像是有 用的。但是，13C磁共振信号具有易受该分子结构影响的缺点。因此， 为了增强13C磁共振信号而在单一分子中导入多个13C时，有时产 生分子内各13C的化学位移分散而降低测定精度的问题。另外，使导 入了 13C的分子与抗体等分子量比较大的蛋白质结合时，有时也发生 3C磁共振信号减弱的不良情况。
另外，MRI成像中，为了减轻受试者的负担等而要求在短时间获 得磁共振图像，人们认为利用Tl弛豫(纵弛豫)时间适度缩短的分 子作为MRI用造影剂是有效的。但是，在利用含有13C的分子获得 磁共振信号时，Tl弛豫时间主要依赖于其分子结构等，所以现状是 不知道什么样结构的分子的Tl弛豫时间短、对以短时间连续获得-兹 共振图像有用。
人们迫切希望以上述现有技术为背景，开发出安全性高、也能用 于定量评价、且能在短时间内连续获得磁共振信号的技术。
发明内容
本发明的目的在于提供具备安全性和定量性、同时能以较短的重 复时间连续获得磁共振信号的造影剂，及使用该造影剂的磁共振信号 的获得方法及磁共振成像方法。
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，发现使用含有 以天然丰度以上的比例含有13C的聚乙二醇、或被该聚乙二醇标记的化合物的造影剂，将重复时间设定在60秒以下(优选1秒以下、更
优选100毫秒以下)，反复施加激发脉沖，能连续定量地测定13C^兹 共振信号，并能在短时间内获得能用于定量分析的磁共振图像。本发 明是基于上述认识并经反复改良而完成的。 即，本发明提供下述造影剂。
项1. 一种磁共振造影剂，用于以60秒以下的重复时间施加激发 磁场的脉冲而连续获得磁共振信号并将其图像化，其特征在于，
所述磁共振造影剂含有聚乙二醇或被该聚乙二醇标记的化合物， 所述聚乙二醇以天然丰度(natural abundance )以上的比例含有13C。
项2.如项i所述的磁共振造影剂，其中，所述聚乙二醇的nc
的比例为总碳原子的20~ 100%。
项3.如项1所述的磁共振造影剂，其中，所述聚乙二醇的重均 分子量为470 ~ 10000000。
项4.如项1所述的磁共振造影剂，其中，所述化合物为被聚乙 二醇标记的抗体，所述聚乙二醇以天然丰度以上的比例含有13C。
本发明还提供下述磁共振成像方法。
项5. —种磁共振成像方法，其特征在于，以60秒以下的重复时 间对给与了磁共振造影剂的受试体施加激发磁场的脉冲，由此连续获 得磁共振信号，进行图像化，所述磁共振造影剂含有聚乙二醇或被该 聚乙二醇标记的化合物，所述聚乙二醇以天然丰度以上的比例含有 13C。
项6.如项5所述的；兹共振成像方法，其中，所述聚乙二醇的13C 的比例为总碳原子的20~ 100%。
项7.如项5所述的磁共振成像方法，其中，所述聚乙二醇的重 均分子量为470 ~ 10000000。
项8.如项5所述的磁共振成像方法，其中，所述化合物为被聚 乙二醇标记的抗体，所述聚乙二醇以天然丰度以上的比例含有13C。
本发明还提供下述磁共振信号的获得方法。
项9. 一种磁共振信号的获得方法，其特征在于，以60秒以下的重复时间对给与了磁共振造影剂的受试体施加激发磁场的脉沖，由此 连续获得磁共振信号，所述磁共振造影剂含有聚乙二醇或被该聚乙二
醇标记的化合物，所述聚乙二醇以天然丰度以上的比例含有13C。 项10.如项9所述的方法，其中，所述聚乙二醇的13C的比例为
总碳原子的20 ~ 100% 。
项11.如项9所述的方法，其中，所述聚乙二醇的重均分子量为
470~ 10000000。
项12.如项9所述的方法，其中，所述化合物为被聚乙二醇标记 的抗体，所述聚乙二醇以天然丰度以上的比例含有13C。
或被该聚乙二醇标记的化合物的应用。
项13.以天然丰度以上的比例含有13C的聚乙二醇或被该聚乙 二醇标记的化合物在制备磁共振造影剂中的应用，所述磁共振造影剂 用于以60秒以下的重复时间施加激发》兹场的脉冲，乂人而连续获得^兹
共振信号。
项14.如项13所述的应用，其中，所述聚乙二醇的13C的比例 为总碳原子的20~ 100% 。
项15.如项13所述的应用，其中，所述聚乙二醇的重均分子量 为470~ 10000000。
项16.如项13所述的应用，其中，所述化合物是纟皮以天然丰度 以上的比例含有13C的聚乙二醇标记的抗体。
项17.以天然丰度以上的比例含有13C的聚乙二醇或被该聚乙 二醇标记的化合物在制备磁共振造影剂中的应用，所述磁共振造影剂 用于以60秒以下的重复时间施加激发磁场的脉冲，从而连续获得磁 共振信号，进行图像化。
项18.如项17所述的应用，其中，所述聚乙二醇的13C的比例 为总碳原子的20~ 100%。
项19.项17所述的应用，其中，所述聚乙二醇的重均分子量为 470~ 10000000。项20.项17所述的应用，其中，所述化合物为被以天然丰度以 上的比例含有13C的聚乙二醇标记的抗体。
利用本发明的造影剂，即使将重复时间设定为60秒以下(优选1 秒以下、更优选250毫秒以下、特别优选100毫秒以下)，反复施加 激发脉冲，也能得到高精度的磁共振信号，所以对高速获得清晰的磁 共振图像是有用的。
用于本发明的造影剂的聚乙二醇即使含有多个13C，各13C的化 学位移也不分散，集中于一点，所以能获得高精度的磁共振信号。另 外，本发明的造影剂由于利用13C磁共振信号，所以与1H的情况相 比，受试体内的背景值低，能获得可定量评价的图像。
进而，以天然丰度以上的比例含有13C的聚乙二醇即使结合在蛋 白质等高分子量的其他化合物上，也几乎不影响该磁共振信号。因此， 根据本发明，能在短时间内实施以下(1) (4)所示的诊断、判定、可 视化等。
(1) 在特异性识别特定的病灶部位的抗体上结合上述聚乙二醇，将 其用作造影剂，由此将病灶部位可视化，进行诊断。
(2) 在特异性识别特定的细胞的抗体上结合上述聚乙二醇，将其用 作造影剂，由此使该细胞的体内动态可视化。
(3) 使脂质体制剂等DDS制剂中含有上述聚乙二醇或结合了该聚 乙二醇的化合物，通过给与该制剂，判定制剂在目标部位的蓄积度。
(4) 直接将含有13C的聚乙二醇给与人体，通过使其在特定的脏 器或部位蓄积一定时间，使特定脏器或部位可视化。
进而，本发明的造影剂使用13C,所以与用于PET或SPECT等的 含有放射性化合物的造影剂相比，不仅安全性高，而且经时稳定，所以 也具有有足够时间进行磁共振成像的优点。
具体实施例方式
本发明的造影剂含有以天然丰度以上的比例含有13C的聚乙二 醇(以下标记为"13C-PEG")、或被该13C-PEG标记的化合物。用于本发明的13C-PEG只要是以天然丰度以上的比例(即总碳 原子的约1%以上)含有13C的13C-PEG即可。从提高磁共振信号的 检测灵敏度的观点来看，13C占总碳原子的比例为20~ 100% ,优选 为50~ 100% ,更优选为90 ~ 100% ,特别优选为大致100%的13C-PEG 是理想的。聚乙二醇由-CH2CH20-的重复结构构成，所有碳原子的 化学环境相同，所以即使在同一分子内含有多个13C,各13C的化学 位移也不分散，集中于一点，所以具有磁共振信号被增强而检出的优 点。
另外，作为用于本发明的13C-PEG的分子量，没有特别限定， 基于13C的含有比例等适当设定。例如，13C的含有比例低时， 13C-PEG的分子量优选为高者,另外，13C的含有比例高时，13C-PEG 的分子量可以为低者。作为用于本发明的13C-PEG之一例，可以举 出重均分子量为470 ~ 10000000、优选为6000 ~ 2000000的13C-PEG。
本发明中可以直接使用上述13C-PEG， ^旦也可以使用被上述 13C-PEG标记的化合物(以下标记为"13C-PEG修饰化合物")。此处， 所谓13C-PEG修饰化合物是指13C-PEG直接或通过成为连接体的基 团结合在化合物上得到的13C-PEG修饰化合物。在上述13C-PEG修 饰化合物中，作为成为13C-PEG的标记(结合)对象的化合物，例 如可以举出单克隆抗体、多克隆抗体等抗体；所述抗体的Fab片段； 白蛋白、转铁蛋白等血清蛋白质；干扰素、红细胞生成素、白细胞介 素、M-CSF、 G-CSF、胰岛素、脂肪素(adipokine)等药理活性蛋 白质；EP-1873 (EpixPharma)、依文氏蓝(Evans Blue)、冈'J果纟工、 硫磺素-S、 (E,E)-1-溴-2,5-双(3-羟基羰基-4-羟基)苯乙烯基苯(BSB)、 (E，E)-1-氟-2,5-双(3-羟基羰基-4-羟基)苯乙烯基苯(FSB)等低分子化 合物；构成能在内部封入药物的脂质体的化合物等。例如，利用结合 了能特异地结合在特定的病灶部位(例如癌、动脉硬化、炎症等部位) 的抗体的13C-PEG修饰化合物，能使该特定病灶部位可视化。另外， 例如如果使用结合了药理活性蛋白质的13C-PEG修饰化合物，则能 判定该药理活性蛋白质在治疗目标部位的蓄积度。
9通过用公知的方法使上述13C-PEG和成为标记对象的化合物结 合来制备上述13C-PEG修饰化合物。作为优选例，如果作为标记对 象的化合物具有氨基(具体而言是抗体或药理活性蛋白质)，则可以 举出用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)将上述聚乙二醇进行活性酯化，使 其与成为标记对象的化合物形成酰胺键的方法。
在上述13C-PEG修饰化合物中，作为结合在成为标记对象的化 合物上的上述13C-PEG的数量，以不损害成为标记对象的化合物所 希望的活性为限度，没有特别限定。例如，上述13C-PEG f务饰化合 物，对于成为标记对象的化合物，可以结合一个13C-PEG,也可结合 2个以上13C-PEG。
本发明的造影剂如下调制，将上述13C-PEG或13C-PEG修饰化 合物溶解在药学或化学上允许的溶剂例如生理盐水、等渗磚酸緩冲液 等中进行调制。本发明的造影剂中，上述聚乙二醇或13C-PEG修饰 化合物的浓度可以根据图像形成方式、测定方式、测定部位等适当设 定。作为一例，可以举出相对于本发明造影剂的总量，上述13C-PEG 或13C-PEG修饰化合物的浓度达到0.0001 ~ 100重量％ 、优选0.001 ~ 50重量％、更优选0.01 ~ 10重量％ 。
进而，本发明的造影剂除含有上述成分之外，还可以含有适量的 增溶剂、乳化剂、粘度调节剂、緩冲剂等添加剂。
本发明的造影剂通过静脉内注射、皮下注射、肌肉内注射、口服 给药或其他方法给与受试者。根据上述13C-PEG或13C-PEG修饰化 合物的13C的含有量、磁共振图像的测定部位等适当设定本发明的造 影剂的给与量。例如，本发明的造影剂的给与量可以设定为在测定部 位上述13C-PEG或13C-PEG修饰化合物的13C原子数为每lcn^为 lxl(T12mol以上，优选为lxl(T8mol以上，更优选为lxl(r6mol以上。
本发明的造影剂用于通过以60秒以下的重复时间施加激发磁场 (RF波)的脉沖，连续获得磁共振信号。此处，所谓重复时间(time of repetition: TR )是指一个脉沖序列所需的总时间。换言之，TR表 示在累积测定中从 一 个脉冲序列的最初至下 一 脉沖序列的最初的时间间隔。本发明的造影剂中所用的上述13C-PEG或13C-PEG修饰化 合物由于具有T1弛豫时间适当縮短的优点，所以能在将该重复时间 如上所述设定为较短的情况下，连续地获得磁共振图像。用本发明的 造影剂时，从更高速地连续获得磁共振信号的观点来看，能将重复时 间优选设定为1秒以下，更优选为250毫秒以下，特别优选为60~100 毫秒。由此，本发明的造影剂能将重复时间设定为较短时间，并能连 续获得磁共振信号，所以优选用于高速图像化。
使用本发明的造影剂获得的磁共振信号能直接用于诊断等。另 外，也可以将该磁共振信号进行图像化获得磁共振图像，将其用于各 种诊断。
使用本发明的造影剂获得磁共振信号时的其他条件、例如激发磁 场的脉沖的持续时间、磁共振信号的测定方法等，可以由获得磁共振 信号通常所采用的条件适当设定。另外，针对磁共振信号的图像化方 法，可以由获得磁共振图像通常所采用的条件适当设定。
因此，本发明的造影剂能适用于公知的成像方法，具体而言为化 学位移成像法、质子检测13C化学位移成像法、快速自旋回波法、梯 度回波法等成像方法。实施例
以下，基于实施例详细说明本发明，但本发明并不限定于此。需 要说明的是，以下，附在标记"13C-PEG，，前的比例(％ )表示在该 3C-PEG中13C相对于总碳原子的比例。另外，附在标记"13C-PEG" 后面的数值表示该13C-PEG的分子量。
实施例1
为了研究13C-PEG的NMR光谱特性进行了以下试验。将几乎所 有碳原子均为13C的13C-PEG6000 [以下标记为99% 13C-PEG6000, 从Cambridge Isotope Laboratories, Inc ( CIL公司)购得]以浓度2.2 mg/ml溶解在重水(D20)中，将其作为样品，测定NMR光谱。另 外，将具有天然丰度(1% )的13C的13C-PEG6000 (以下标记为1 % 13C-PEG6000)以浓度22 mg/ml溶解在重水(D20 )中，将其作为样品，测定NMR光镨。
需要说明的是，NMR光谱的装置及测定条件如下所示
装置:高分辨率NMR装置
仪器台(Console) : Varian Unity INOVA
磁铁Oxford 300 MHz
测定条件:在观测频率75MHz、测定温度23。C、单脉冲法(质 子去偶)、延迟时间1秒、45。脉沖下测定
所得的结果示于图1。 99%13C-PEG6000尽管为高分子，但显示 非常尖锐的NMR信号(参见图la)。另外，99%13C-PEG6000中， 由于所有碳原子均处于相同的化学环境，所以化学位移集中于一点， 达到较强的信号强度。而浓度被设定为99% 13C-PEG6000的10倍的 高浓度l % 13C-PEG6000显示了 99% 13C-PEG6000的大致十分之一的 信号强度，所以确认了基于13C的信号强度与13C的数量对应，并 且定量性极高。
实施例2
将99%13C-PEG6000以浓度2.5mg/ml溶解在重水(D20 )溶剂 中，将其用作样品，研究在以下测定条件下即缩短照射脉冲(90。脉 沖)、获得FID (1.3秒)之后的延迟时间(回波收集结束后至下一 ;敫发为止的时间；1亭顿时间；acquisition delay; dead time )的间隔时 对信号强度的影响。另外，作为比较，将13C-丙酮酸[丙酮酸钠 (1-13C，99%)、 CIL公司]以浓度25mg/ml溶解在重水中得到的液体和 将l位碳原子为13C的葡萄糖[D-葡萄糖(1-13C,99%)、 CIL公司制] (以下标记为13C-葡萄糖)以浓度2.2mg/ml溶解在重水中得到的液 体分别作为样品，相同地进行试-验。
装置:高分辨率NMR装置
仪器台Varian Unity INOVA
磁铁Oxford 300 MHz
测定条件:在观测频率75MHz、测定温度23。C、单脉冲法(质 子去偶)、90。脉冲下测定。
12所得的结果示于图2及3。如图2a所示，用13C-丙酮酸时，将 延迟时间设定为60秒以下时，信号强度急剧减小。该现象是13C-丙 酮酸的Tl弛豫时间非常长(质子未直接结合的碳原子的Tl弛豫时间 延长)导致的。与此相对，关于99%13C-PEG6000，如图2b及图3b 所示，即使将延迟时间缩短至20msec左右，也几乎未观测到信号强 度的减小。认为该现象是由于99%13C-PEG6000的Tl弛豫时间在一 定程度上缩短。
另外，关于13C-葡萄糖，虽然观测到葡萄糖的a型、(3型异构体 的两种碳的信号，但其均与质子直接共价键合，所以与丙酮酸的情况 相比，它们的Tl时间縮短。因此，即-使缩短延迟时间，也未7见察到 像在丙酮酸中观测到的60秒以下的急剧减小。但是，其中需要说明 的是，a型、(3型的1位碳均确认伴随延迟时间间隔缩短信号强度减 小(参见图3a)。葡萄糖的a型、(3型异构体的两种碳的信号强度之 和在延迟时间间隔从200秒变成20毫秒时信号强度减小21%,而 99%13C-PEG6000的情况下，信号强度减小仅仅为3.9%。由此可认 为，在99%13C-PEG6000中，即使缩短延迟时间间隔至20毫秒，信 号强度也不减小的现象是来自13C-PEG特有的Tl弛豫时间。
实施例3
将99%13C-PEG6000以浓度2.5mg/ml溶解在重水(D20 )溶剂 中，将其作为样品，使用磁场强度7特斯拉的MRI装置，研究在以 下的测定条件下、即以重复时间为60~ 200毫秒施加脉冲时对信号强 度的影响。另外，作为比较，将13C-葡萄糖以浓度2.2mg/ml溶解在 重水中，得到的溶液作为样品，同样地进行试验。
装置:MRI装置(磁场强度7特斯拉)
仪器台Varian Unity INOVA
磁铁JASTEC7T
测定条件:在观测频率75MHz、测定温度23。C、单脉沖法(质 子去偶)、40。脉冲下测定
所得的结果示于图4。如图4明确可知，在40。脉冲下测定时，葡萄糖的信号在脉沖间隔从200毫秒变成100毫秒时，减小约30% ， 与此相对，在99%13C-PEG6000的情况下，即使缩短至100毫秒，也 只观察到信号强度减小约4 %左右。由以上结果可知，在MRI装置中， 也能利用13C-PEG6000能缩短重复时间的特征。 实施例4
使用在1%13C-PEG的 一 个末端的羟基上键合NHS的 1%13C-PEG5000NHS及1%13C-PEG20000NHS (日本油脂公司制)， 标记IgG。标记反应后，利用凝力交过滤和蛋白A柱进^"纯化处理，由 此除去未反应的1%13C-PEG(参见图5a)。由图5a所示的SDS-PAGE ^M月显可确认，可在高分子侧确-i人多条带，实际上可确认1%13C-PEG 以共价键被IgG标记。
将由此得到的1%13C-PEG5000标记IgG以浓度14.1 mg/ml溶解 在重水中，将1%13C-PEG20000标记IgG以浓度5.1 mg/ml溶解于重 水中，分别作为样品，进行NMR光谱的测定。需要说明的是，NMR 光错的装置及测定条件如下所示
装置:高分辨率NMR装置
仪器台Varian Unity INOVA
磁铁Oxford 300 MHz
测定条件:在观测频率75MHz、测定温度23。C、单脉冲法(质 子去偶)、延迟时间1秒、45。脉冲下测定
所得的结果示于图5b及图6。由图5b可明确地确定，1%13C-PEG 5000及1%13C-PEG20000即使结合在IgG上，与未结合在IgG上的 情况相同，化学位移集中于一点，并显示非常尖锐的信号。进而，如 图6可知，在1%13C-PEG5000中，信号的半峰宽也基本不受与IgG 结合的影响。由该结果可判明，与IgG之类高分子蛋白质结合不引起 PEG的信号强度减小或光谱变宽等不良情况。
实施例5
使用具有天然丰度(1%)的13C的PEG研究PEG的分子量增加时 NMR信号的强度及半峰宽如何变化。所用的PEG的平均分子量为35000、 500000、 2000000的3种。使用高分辨率核^t共振装置测定 NMR光语。需要说明的是，测定条件如下所示。
装置:日本电子JNM-ECA500
磁铁Oxford (11.7 Tesla,500MHz)
测定条件
观测频率125 MHz 溫度25°C ^见测幅度31 KHz 数据点32 K 脉冲序列单脉冲去偶 偏转角(flip angle) : 45° 延迟时间2秒 数据读取时间1秒
结果示于图7。所有分子量的PEG的浓度均为0.5 mg/ml (溶剂 为D20 ),将0.5 mM的13C-丙氨酸(CIL公司、羧酸的碳为13C。) 添加到各样品中作为内部对照，进行测定。在176.5 ppm的位置观测 到13C-丙氨酸的羧酸的碳信号，所有分子量的PEG的信号均在69.5 ppm附近(因分子量不同，有时偏离0.1 ppm左右)^f皮^见察到。所有 PEG信号均是非常尖锐的信号，测定各个PEG的NMR信号的半峰宽 的结果为，PEG35000、PEG500000、PEG2000000的半峰宽分别为2.99、 3.03、 3.25Hz，分子量即使增大，也基本未见半峰宽变化。另外，以 信号的高度评价各PEG的NMR信号的信号强度时，以13C-丙氨酸 的羧酸的信号为1时，所有PEG中的信号强度(峰的高度)均为8~ 10左右，相同重量浓度的PEG溶液样品中，未见因分子量不同而信 号强度(峰的高度)有较大差异(图7a、 b、 c )。也就是说，PEG 分子量即使大至2000000左右，也完全不发生分子内碳的NMR信号 强度减弱的情况，这可以由该试验判明。将各PEG的浓度换算为摩 尔浓度时，PEG35000、 PEG500000、 PEG2000000的样品为14.2 (iM、 1.0 pM、 0.25 jiM。如果在此种情况下评价每个PEG单分子的信号高度，则以13C-丙氨酸为1时，分别计算为283、 4000、 19400,结果 为信号强度(峰的高度)大致与PEG的分子量成比例地增大。由以 上结果明确，在溶液的粘性不成问题时，PEG的NMR信号的信号强 度(峰的高度)大致与PEG的分子量成比例地变大。 实施例6
将99%13C-PEG6000溶解在纯水(1120)中，达到33mg/ml,作为 样品。将0.1ml该样品注射给与大鼠(从日本CLEA购得、雄性SD大 鼠、14周龄)侧头肌，在以下条件下获得MRI图像。
装置MR仪器台Varian Unity INOVA、磁铁JASTEC 7T
脉冲序列质子去偶13C2D化学位移成像(无切片选取(no slice selection ))
位相编码8x8
成像视野(FOV): 50 x50 mm2
重复时间l秒
矩阵32x32
累积测定次凄t: 8次
总测定时间8分32秒
所得的结果示于图8。由该结果确认，利用99%13C-PEG6000, 即使以l秒的短重复时间，也能将大鼠的侧头肌清晰地图像化，进而
可视化。
实施例7
将99%13C-PEG6000溶解在生理盐水中，达到0.05mg/ml、 0.5mg/ml或5mg/ml,将lml各个溶液添加在lem方形比色杯中。针 对添加了各个99%13C-PEG6000的比色杯，用以下的条件获得MRI 图像。另外，作为比较，使用含有10重量％的13C-葡萄糖的生理盐 水、或单独使用生理盐水，同样地获得MRI图像。
装置MR仪器台Varian Unity INOVA、磁铁JASTEC 7T
脉冲序列质子去偶13C2D化学位移成像(无切片选fO
位相编码8x8
16成像视野(FOV): 50 x50 mm2 矩阵32x32 重复时间250毫秒 累积测定次数128次 总测定时间34分钟
所得的结果示于图9。由图9可知，在装入lcm方形的比色杯的 5mg/ml和0.5mg/ml的99%13C-PEG6000能以充分的对比度可视化。 另一方面，在0.05 mg/ml的情况下，可观察到SN比(信号杂音比) 显著降低，但其中需要说明的是，99%13C-PEG6000的比色杯的位置 能可视化至能充分确认的程度。
实施例8
使用99%13C-PEG6000的水溶液，用几种成像方法获得MRI图 像，并比较图像。具体而言，将99。/。13C-PEG6000溶解在纯水(H20) 中，达到30 mg/ml或5 mg/ml,将其填充在各个1cm3的比色杯中， 进行图像化。作为成像方法，使用13C化学位移成像(13C-CSI)、 质子检测13C化学位移成像(lH-detected 13C-CSI) 、 13C梯度回波 (13C-GRE) 、 13C快速自旋回波(13C-FSE)的4种成像方法。各 成像在下面所示的条件下进行。
13C-CSI;矩阵8><8， FOV: 50 x50 mm2,重复时间1秒，测定时 间128秒
lH-detected 13C-CSI;矩阵8x8, FOV: 50 x50 mm2,重复时间1 秒，测定时间128秒
13C-GRE;矩阵64x64, FOV: 50 x50 mm2，重复时间30毫秒， 测定时间123秒，质子去偶
13C-FSE;矩阵32x32， FOV: 50 x50 mm2,重复时间l秒，回波 链8,回波间期(echo space ): 5毫秒，中央采集(centric acquisition ), 测定时间64秒，质子去偶
结果示于图10。图10中，a表示利用13C化学位移成像法 (13C-CSI)成像得到的图像，b表示利用质子检测13C化学位移成像法(1H-detected 13C-CSI)成像得到的图像，c表示利用13C梯度 回波法(13C-GRE )成像得到的图像，以及d表示利用13C快速自旋 回波法(13C-FSE)成像得到的图像。图10的a d的图像中，上面 配置有填充了 99%13C-PEG6000的5mg/ml溶液的比色杯，下面配置 填充了 99%13C-PEG6000的30mg/ml溶液的比色杯。
填充有99%13C-PEG6000的5mg/ml或30mg/ml溶液的比色杯中 的任一个均被可视化，但在这样短时间的成像条件下，确认30mg/ml 的比色杯能被明确可视化。另夕卜，比较13C-CSK图10a)和1H-detected 13C-CSI(图10b)时，二者在SN比或析像度等方面均未见较大差别。 另一方面，利用13C-GRE及13C-FSE成像得到的图像能明确识别比 色杯的正方形形状。另外，由本结果确认，通过利用13C-GRE及 13C-FSE测定，与13C-CSI或1H-detected 13C-CSI比较,能以相同程 度的累积时间或更短时间的累积时间获得高析像度的图像。以上情况 表示存在下述可能性，即以13C-PEG作为造影剂时，如果适当地应 用13C-GRE或13C-FSE等，则也能够以更短时间获得高析像度的图
图1表示实施例1中测定的99%13C-PEG6000 ( 2.2 mg/ml) 和1%13C-PEG6000(22 mg/ml)的13C-NMR光谱图。
图2表示实施例2中测定的结果，即13C-丙酮酸及99%13C -PEG6000的13C-NMR信号强度和延迟时间(Acquisition delay)的
关系的图。
图3表示实施例2中测定的结果，即13C-葡萄糖及 99%13C-PEG6000的13C-NMR信号强度和延迟时间(Acquisition delay)的关系的图。
图4表示实施例3中测定的结果，即用40。的脉沖、将重复 时间设定为60~ 960毫秒时的13C-葡萄糖及99%13C-PEG6000的 13C-NMR信号强度的图。图5图5中，a为各纯化工序中得到的1%13C-PEG20000标 记IgG的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的照片。a中，从 左列开始表示分子量标记物(marker)、标记前IgG(图中记为IgG )、 标记反应后经凝胶过滤(Sephacryl S-200 、 Pharmacia )的 1%13C-PEG20000标记IgG(图中记为gelfilt)、凝胶过滤后用蛋白A 柱进行亲和纯化得到的1%13C-PEG20000标记IgG (图中标记为 ProA)。另外，图5中，b是在实施例4中1%13C-PEG5000标记IgG 及1%13C-PEG20000标记IgG的13C-NMR光谱的测定结果。
图6表示99%13C-PEG6000和1%13C-PEG5000标记IgG的
信号半峰宽的比较图。
图7表示实施例5中得到的NMR光i普图。a为1%13C-PEG 35000 0.5 mg/ml( 14.2 )的NMR光语。b为1%13C-PEG500000 0.5 mg/ml ( 1.0 fiM)的NMR光谱。c为1%13C-PEG2000000 0.5 mg/ml (0.25 !iM)的NMR光i普。
图8表示实施例6中得到的MRI图像的图。图8中，a为质 子图像；b为99%13C-PEG6000的13C-化学位移图像，用蓝色表示； c为存在于大鼠的侧头肌内的脂肪的13C-化学位移图像，用红色表 示；d为在质子图像上叠加99%13C-PEG6000的13C-化学位移图像 及内在脂肪的13C-化学位移图像后所表示的图像；e为质子图像上叠 加99%13C-PEG6000的13C-化学位移图像后所表示的图像；f是在 质子图像上叠加内在脂肪的13C-化学位移图像后所表示的图像。
图9表示实施例7得到的MRI图像的图。a为5 mg/ml的 99%13C-PEG6000的图像[上面的照片质子图^f象。左上比色杯加有 10重量％ 13C-葡萄糖，右上比色杯加有为5mg/ml的13C-PEG6000, 下面的比色杯加有生理盐水。下面的照片13C-PEG6000的CSI图 像]。b为0.5 mg/ml的99%13C-PEG6000的图像[上面的照片质 子图像。左边的比色杯加有生理盐水，右边的比色杯加有0.5 mg/ml 的13C-PEG6000。下面的照片13C-PEG6000的CSI图像]。c为 0.05 mg/ml的99%13C-PEG6000的图像[上面的照片质子图像。左边的比色杯加有生理盐水，右边的比色杯加有0.05 mg/ml的 99%13C-PEG6000。中间的照片99%13C-PEG6000的CSI图像。下 面的照片经过图像处理切掉了中间图像的噪音得到的图像。可以明 确识别0.05 mg/ml的99%13C-PEG6000的存在。]。
图10表示实施例8得到的MRI图像的图。图10中，a是利用 13C化学位移成像法(13C-CSI)成像得到的图像；b为利用质子检测13C 化学位移成像法UH-detectedl3C-CSI)成像得到的图像；c为利用13C 梯度回波法(13C-GRE)成像得到的图像；及d为13C快速自旋回波法 (13C-FSE)成像得到的图像。需要说明的是，a-d的图像中，上面放置 5 mg/ml的99%13C-PEG6000的比色杯，以及下面i文置30 mg/ml的 99%13C-PEG6000的比色杯，2个比色杯纵向配置。
权利要求
1、一种磁共振造影剂，用于以60秒以下的重复时间施加激发磁场的脉冲而连续获得磁共振信号，其特征在于，含有聚乙二醇或被所述聚乙二醇标记的化合物，所述聚乙二醇以天然丰度以上的比例含有13C。
2、 如权利要求1所述的磁共振造影剂，其中，所述聚乙二醇的 13C的比例为总碳原子的20~ 100% 。
3、 如权利要求1所述的磁共振造影剂，其中，所述聚乙二醇的 重均分子量为470 ~ 10000000。
4、 如权利要求1所述的磁共振造影剂，其中，所述化合物为被 以天然丰度以上的比例含有13C的聚乙二醇标记的抗体。
5、 一种》兹共振成像方法，其特征在于，以60秒以下的重复时间 对给与了磁共振造影剂的受试体施加激发磁场的脉冲，由此连续获得磁共振信号，进行图像化，所述磁共振造影剂含有聚乙二醇或被所述 聚乙二醇标记的化合物，所述聚乙二醇以天然丰度以上的比例含有 13C。
6、 如权利要求5所述的磁共振成像方法，其中，所述聚乙二醇 的13C的比例为总碳原子的20~ 100% 。
7、 如权利要求5所述的磁共振成像方法，其中，所述聚乙二醇 的重均分子量为470 ~ 10000000。
8、 如权利要求5所述的磁共振成像方法，其中，所述化合物为 被以天然丰度以上的比例含有13C的聚乙二醇标记的抗体。
9、 一种磁共振信号的获得方法，其特征在于，以60秒以下的重 复时间对给与了磁共振造影剂的受试体施加激发磁场的脉沖，由此连 续地获得磁共振信号，所述磁共振造影剂含有聚乙二醇或被所述聚乙 二醇标记的化合物，所述聚乙二醇以天然丰度以上的比例含有13C。
10、 以天然丰度以上的比例含有13C的聚乙二醇或被所述聚乙二 醇标记的化合物在制备磁共振造影剂中的应用，所述磁共振造影剂用于以60秒以下的重复时间施加激发》兹场的脉冲而连续获得/磁共振信
11、以天然丰度以上的比例含有13C的聚乙二醇或被所述聚乙二 醇标记的化合物在以60秒以下的重复时间施加激发》兹场的脉沖而连 续获得磁共振信号中的应用。
全文摘要
本发明的目的在于提供具备安全性及定量性、能以较短重复时间连续获得磁共振图像的技术。使用含有以天然丰度以上的比例含有13C的聚乙二醇或被该聚乙二醇标记的化合物的磁共振造影剂，以60秒以下的重复时间施加激发脉冲，连续获得磁共振信号。
文档编号A61K49/00GK101448529SQ200780017678
公开日2009年6月3日 申请日期2007年5月14日 优先权日2006年5月17日
发明者三浦岩, 铃木良和, 饭田满 申请人:大塚制药株式会社