专利名称：用于癌症治疗的粘液瘤病毒突变体的制作方法
用于癌症治疗的粘液瘤病毒突变体
背景技术：
WO 04/078206 (Robarts Research Institute)公开了某些经遗传修饰的 粘液瘤病毒在癌症治疗中的应用。
发明内容
本发明涉及选自由M11L、 M063、 M136、 M-T4禾n M-T7组成的组 中的粘液瘤病毒蛋白的活性缺陷的粘液瘤病毒(Myxoma virus, MV)。所述 病毒用于抑制癌细胞的方法和用于制造抑制癌细胞的药物，所述方法包 括对细胞施用有效量的粘液瘤病毒。所述病毒还用于治疗患有癌症的人 类对象的方法和制造用于治疗患有癌症的人类对象的药物，其包括对所 述患者施用有效量的粘液瘤病毒。本发明还提供了包含所述粘液瘤病毒 和药用载体的药物组合物，以及包含所述粘液瘤病毒与说明书的用于治 疗癌症患者的试剂盒。
图l:在人类神经胶质瘤细胞中的内源活化Akt水平。
图2:在人类神经胶质瘤细胞系中不同vMyx-hrKO和对照病毒的病 毒复制效率。
图3:早期分泌和晚期分泌病毒基因表达表明一些vMyx-hrKO不能 从早期基因表达转入晚期基因表达。 图4:经过选择的单步生长曲线。 图5:基于细胞的细胞毒性测试。
具体实施例方式
WO 04/078206 (Robarts Research Institute)公开了某些经遗传修饰的粘液瘤病毒在癌症治疗中的应用。此发明通过为此类应用提供更具特 异性的经修饰的粘液瘤病毒而代表着一种进步。其中所公开的技术普遍
适用于本发明的粘液瘤病毒，并且在此将WO 04/078206的内容通过参照 的方式引入本文。
本文所用的给定粘液瘤病毒蛋白的"活性缺陷"是指所述病毒的所 述活性小于野生型粘液瘤病毒的活性。给定病毒蛋白"基本无活性"是 指所述病毒不具有可检测水平的所述活性。基本不具有给定病毒蛋白的 活性的粘液瘤病毒的例子包括该蛋白的基因被删除或者敲除的突变体。
根据本发明，任何种类的癌症或癌细胞都可被抑制或治疗。在本发 明的--个具体实施方式
中，所述癌细胞是哺乳动物癌细胞。在一个更具 体的实施例中，癌细胞是人类癌细胞。所述人类癌细胞的例子包括神经 胶质瘤。
已表明当把野生型粘液瘤病毒(vMyxgfp)瘤内注射到被植入至鼠脑 中的人神经胶质瘤时，该病毒能够实现具有增殖性的长寿命的感染，并 破坏和清除所植入的肿瘤组织(Lun等，2005， Cancer Research 65: 9982-9990)。还有，对NCI-60参考库(reference collection)的筛查表明， MV可有效地感染所测试的人肿瘤细胞中的大多数细胞(15/21) (Sypula 等.2004 Gene Ther. Mol. Biol. 8: 103-114)。为扩大对MV在癌症细胞中的 向性的了解，对此前测试过野生型MV允许性的一系列人神经胶质瘤细 胞(U87、 U118、 U251、 U343、 U73)进行了筛査。这些发现在随后的例子 中通过检测数种MV病毒的感染和复制而得以扩展，所述病毒中，被鉴 定为具有限定MV在兔细胞中的向性的作用的特异性宿主范围基因己被 删除。这些病毒被统称为宿主范围敲除病毒(vMyx-hrKO)。已经观察到 不同vMyx-hrKO在人神经胶质瘤细胞中的复制和传播能力有差异。 vMyxT2(U251)、 vMyxT4KO (U87、 U118、 U251和U373)和vMyxT5KO (U251、 U373)对特定人神经胶质瘤表现出了一些限制。相反，vMyx63KO 和vMyxl35KO在若干种神经胶质瘤中显现出了更有效的复制和杀伤。
通过参考下列实施例将可以更好地理解本发明，这些实施例用于阐 述而不是用于限定本文所记载的发明。实施例 实施例1
使用抗在苏氨酸308位置(P-Akt T308)和丝氨酸473位置(P-Akt S473)磷酸化的Akt的抗体或抗全Akt(total Akt)的抗体对50微克全细胞 裂解液进行探测。基于活化Akt的水平，预计U87和U343具备感染性， 而U118、 U251和U373对MV感染的抵抗力更强(图l)。
实施例2
使用多种神经胶质瘤细胞以及作为对照的BGMK或RK13细胞对病 毒储存液(virus stock)进行滴定。将由神经胶质瘤得到的病毒滴度与对照 水平进行比较，估算病毒复制效率值。根据这些结果发现，没有一种神 经胶质瘤细胞支持病毒生长到在对照系中所观察到的水平。然而， 一些 病毒(vMyxl35KO、 vMyx63KO禾卩vMyxl36KO)比其它敲除病毒更有 效率。还有， 一些神经胶质瘤细胞系支持更多的复制(U87、U343和U373) (图2)。
实施例3
用一系列vMyx-hrKO感染不同的人神经胶质瘤细胞。感染后(hpi) 20小时，收集感染上清液并浓縮10倍。将50微升浓縮上清液在12% SDS-PAGE凝胶上分离，并用anti-Serpl (mAB;晚期MV基因产物)探 测。将印迹剥离并以anti-M-T7 (pAB;早期MV基因产物)对早期基因表 达进行探测。这些结果提示，包括vMyxT2KO、 vMyxT4KO和vMyxT5KO 在内的若干种vMyx-hrKO在从早期基因表达到晚期基因表达的转变中受 到限制。而在两种神经胶质瘤细胞系(U87和U37)中，vMyxT4KO甚 至不经历早期基因表达(图3)。
将细胞接种于48孔板，在所示时间收集被感染的细胞。从收集的细 胞沉淀中释放病毒并反滴定到BGMK细胞上。虽然所测试的病毒发生复 制，但最佳扩增出现在U87和U343细胞中(图4)。
实施例5
通过细胞毒性测试，检测了不同vMyx-hrKO和对照病毒在人神经胶质瘤组中具有杀死效应的能力。将适当的细胞接种于96孔板，24小时后， 用不同感染复数(MOI)的病毒感染。感染后72小时，使用WTS试剂 (Roche)处理被感染的细胞，以测定细胞的存活率。在4小时中每60分 钟测量450nm处的颜色变化。未感染的对照孔用来测定正常的增殖，而 空白孔作为背景对照(图5)。
权利要求
1. 一种抑制癌细胞的方法，所述方法包括对所述细胞施用有效量的粘液瘤病毒，所述粘液瘤病毒为粘液瘤病毒蛋白活性缺陷的粘液瘤病毒，所述粘液瘤病毒蛋白选自由M11L、M063、M136、M-T4和M-T7组成的组中。
2. 如权利要求l所述的方法，其中所述粘液瘤病毒基本不具有选自 由M11L、 M063、 M136、 M-T4禾B M-T7组成的组中的粘液瘤病毒蛋白 的活性。
3. 如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物癌细胞。
4. 如权利要求3所述的方法，其中所述细胞是人类癌细胞。
5. 如权利要求4所述的方法，其中所述细胞是神经胶质瘤细胞。
6. —种治疗患有癌症的人类对象的方法，所述方法包括对患者施用 有效量的粘液瘤病毒，所述粘液瘤病毒为粘液瘤病毒蛋白活性缺陷的粘 液瘤病毒，所述粘液瘤病毒蛋白选自由M11L、 M063、 M136、 M-T4和 M-T7组成的组中。
7. 如权利要求6所述的方法，其中所述粘液瘤病毒基本不具有选自 由M11L、 M063、 M136、 M-T4和M-T7组成的组中的粘液瘤病毒蛋白 的活性。
8. 如权利要求6所述的方法，其中所述癌症为神经胶质瘤。
9. 有效量的粘液瘤病毒在抑制癌细胞中的应用，其中所述粘液瘤病 毒具有选自由M11L、 M063、 M136、 M-T4禾卩M-T7组成的组中的粘液 瘤病毒蛋白的活性缺陷。
10. 有效量的粘液瘤病毒在制造用于抑制癌细胞的药物中的应用， 其中所述粘液瘤病毒具有选自由M11L、 M063、 M136、 M-T4和M-T7 组成的组中的粘液瘤病毒蛋白的活性缺陷。
11. 如权利要求9或10所述的应用，其中所述粘液瘤病毒基本不具 有选自由M11L、 M063、 M136、 M-T4和M-T7组成的组中的粘液瘤病 毒蛋白的活性。
12. 如权利要求9或10所述的应用，其中所述细胞是哺乳动物癌细胞。
13. 如权利要求12所述的应用，其中所述细胞是人类癌细胞。
14. 如权利要求13所述的应用，其中所述细胞是神经胶质瘤细胞。
15. 有效量的粘液瘤病毒在治疗患有癌症的人类对象中的应用，其 中所述粘液瘤病毒具有选自由M11L、 M063、 M136、 M-T4和M-T7组 成的组中的粘液瘤病毒蛋白的活性缺陷。
16. 有效量的粘液瘤病毒在制造用于治疗患有癌症的人类对象的药 物中的应用，其中所述粘液瘤病毒具有选自由M11L、 M063、 M136、 M-T4 和M-T7组成的组中的粘液瘤病毒蛋白的活性缺陷。
17. 如权利要求15或16所述的应用，其中所述粘液瘤病毒基本不 具有选自由M11L、 M063、 M136、 M-T4和M-T7组成的组中的粘液瘤 病毒蛋白的活性。
18. 如权利要求15或16所述的应用，其中所述癌症为神经胶质瘤。
19. 一种用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含粘液瘤病毒和药用载体，其中所述粘液瘤病毒具有选自由M11L、 M063、 M136、 M-T4和M-T7组成的组中的粘液瘤病毒蛋白的活性缺陷。
20. 如权利要求19所述的药物组合物，其中所述粘液瘤病毒基本不 具有选自由M11L、 M063、 M136、 M-T4和M-T7组成的组中的粘液瘤 病毒蛋白的活性。
21. 如权利要求19所述的药物组合物，其中所述癌症为神经胶质瘤。
22. —种用于治疗癌症患者的试剂盒，所述试剂盒包含粘液瘤病毒 和说明书，其中所述粘液瘤病毒具有选自由M11L、 M063、 M136、 M-T4 和M-T7的粘液瘤病毒蛋白的活性缺陷。
23. 如权利要求22所述的试剂盒，其中所述粘液瘤病毒基本不具有 选自由M11L、 M063、 M136、 M-T4和M-T7组成的组中的粘液瘤病毒 蛋白的活性。
全文摘要
选自由M11L、M063、M136、M-T4和M-T7组成的组中的粘液瘤病毒蛋白的活性缺陷的粘液瘤病毒可用于治疗癌症。
文档编号A61K39/275GK101460194SQ200780020288
公开日2009年6月17日 申请日期2007年6月1日 优先权日2006年6月1日
发明者格兰特·麦克法登, 约翰·W·巴雷特 申请人:罗巴斯研究机构